KR102360990B1 - 혈관장해의 예방 또는 치료제 - Google Patents

Abstract

생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포(Muse 세포)를 포함하는, 대동맥류 등의 혈관장해를 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제.

Description

혈관장해의 예방 또는 치료제

본 발명은 재생 의료에 있어서의 세포 제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 장해가 생긴 혈관의 수복 및 재생에 유효한 다능성 줄기세포를 함유하는 세포 제제에 관한 것이다.

동맥류는 동맥벽의 약해진 부분이 부풀어 오르는 병태로, 동맥이 내막·중막·외막의 3층 구조를 유지한 채로 확대되는 진성 동맥류와, 동맥벽의 중막이 찢어져 동맥 해리를 초래한 후에 확대되는 해리성 동맥류가 알려져 있다. 이들 장해는 직접 죽음으로 이어질 위험이 있는 질환이다. 특히, 대동맥류는 동맥 경화나 고혈압에 의한 혈관 벽의 장해가 원인이 되어서 발생한다고 오랫동안 생각되어 왔으나, 최근의 연구에 의해 혈관벽, 특히 중막, 외막에 발생하는 염증, 산화 스트레스 등도 그 요인으로 간주되고 있다(예를 들어, 비특허문헌 1 ~ 3).

상기 요인으로 의해, 동맥벽에 림프구, 단구/대식세포를 중심으로 한 염증 세포가 침윤하고, 매트릭스 메탈로 프로테이나아제(MMPs : Matrix metalloproteinases) 등의 각종 단백질 분해 효소가 활성화된 결과, 중막, 외막의 엘라스틴 섬유나 콜라겐 섬유로 이루어지는 세포외 기질의 분해·단열이 일어나며, 또한 동시에 혈관내피세포의 감소 및 기능 장해, 평활근 세포의 아포토시스(apoptosis) 등에 의해 대동맥 벽의 비박화(菲薄化)·취약화를 초래하고, 불가역적으로 확장하여 유화(瘤化)되는 것으로 생각되고 있다(예를 들어, 비특허문헌 4 ~ 7).

또한, 대동맥 해리도 동맥경화나 고혈압 등에 의해 생긴 동맥벽의 열화를 한 원인으로 하여 대동맥 벽 내막에 균열을 일으킴으로써, 그 균열로 혈류가 흘러들어 중막의 수준에서 진강(true lumen)과 위강(false lumen)의 2강으로 해리됨으로써 생긴다. 만성기에는 대동맥 벽의 취약성이나 배경으로 하는 동맥경화의 다양한 위험 인자로부터 많은 증례에서 유화(瘤化)를 초래한다.

대동맥류는 동맥의 파열이나 해리가 생길 때까지는 증상이 나타나지 않고, 정기 건강진단이나 다른 목적으로 실시된 건강 진단이나 화상 진단으로 발견되는 경우가 많다. 통상, 대동맥류의 직경이 약 5센티미터 이상인 경우는, 동맥류를 수복하기 위해 수술에 의해 인공 혈관으로 치환하거나 스텐트 그래프트 내삽술(서혜부의 작은 절개 창에서 대동맥에 접어서 포개는 방식의 그래프트를 삽입하는 방법)을 실시하는 등의 치료가 이루어지고 있다.

그러나 진성 동맥류나 해리성 동맥류는 조기에 발견하는 것은 어려우며, 또한 대동맥류도 직경이 약 5센티미터 미만인 경우 파열되는 일은 좀처럼 없기 때문에, 이러한 초기의 병태의 경우에는 강압제를 사용하여 심박수와 혈압을 내리고, 또한 금연하는 등에 의해 동맥류의 진행이나 파열 위험을 저감시키기 위한 예방적인 치료가 이루어지고 있는 것에 불과하다.

따라서, 진성 동맥류나 해리성 동맥류 및 그에 연결되는 혈관장해의 초기 단계에서의 혈관 재생 등의 근본적인 치료가 요망되고 있다.

최근, 대동맥류에 있어서는, 혈관 재생에 의한 근치를 목적으로 하여 각종 세포에 의한 동맥류 치료가 이루어지고 있다. 예를 들어, 비특허문헌 8에서는, 랫트 이종 이식 모델에 있어서의 혈관 평활근 세포를 이용한 혈관 내 치료가 개시되어 있어, 경카테터(transcatheter)적 투여 8주간에 동맥류의 축소 효과를 보인 것이 나타나 있다. 또한, 비특허문헌 9에서는, 랫트 엘라스타아제 모델에 있어서의 재조합 트로포엘라스틴 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 사용한 치료가 개시되어 있어, 엘라스틴 섬유 증생을 수반하는 동맥류 직경의 축소를 보인 것이 나타나 있다. 게다가 비특허문헌 10에서는, 랫트 이종 이식 모델에 있어서의 내피세포를 이용한 치료가 개시되어 있어, 경카테터적 투여 8주간에 동맥류의 축소 효과를 보인 것이 나타나 있다. 그러나 이들은 모두 혈관 세포의 이식이나 유전자 치료에 관한 것이며, 그 효과 또한 충분한 것이 아니다.

또한, 최근 자기 증식능과 다분화능을 갖는 간엽계 줄기세포(MSC: mesenchymal stem cells)가 혈관 내피세포로 분화될 뿐만 아니라, 혈관 내피세포 성장인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)를 분비하는 것이 발견되었고(예를 들어, 비특허문헌 11 ~ 13), 간엽계 줄기세포(MSC)를 이용한 재생 의료에 의한 동맥류의 치료도 시도되고 있다(예를 들어, 비특허문헌 14 ~ 17). 그러나, MSC에 따른 동맥류의 재생 의료에 의한 치료 효과는 현재, 아직 충분한 것이 아니며, 특히 적은 투여량으로 장해 부위의 혈관 중막 등에 당해 MSC가 침입하여 정착하고, 나아가 당해 장해 부위에서 혈관 세포로 분화하여 동맥류의 혈관 재생에 의한 근본적인 예방·치료를 실시할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

한편, 본 발명자들 중 한 사람인 데자와의 연구에 의해, 간엽계 세포 획분에 존재하며 유전자 도입이나 사이토카인 등에 의한 유도조작 없이 얻어지는, 발생단계-특이적 배아성 항원-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3, SSEA-3)을 표면 항원으로서 발현하고 있는 다능성 줄기세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells; Muse 세포)가 간엽계 세포 획분이 갖는 다능성을 담당하고 있어, 조직 재생을 목표로 한 질환 치료에 응용할 수 있는 가능성이 있음을 알게 되었다(예를 들어, 특허문헌 1; 비특허문헌 18~20). 그러나, 혈관장해의 예방 및/또는 치료에 Muse 세포를 사용하여 기대되는 치료 효과가 얻을 수 있음을 밝힌 예는 없다.

: 특허 제5185443호 명세서

: Petersen E, et al. J Vasc Endovasc Surg 2000: 457-461. : Crowther M, et al. J Vasc Surg 2000: 575-583. : Freestone T, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995: 1145-1151. : Traub O, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998: 677-685. : Visse R, et al. Circ Res 2003: 827-39. : Kazi M, et al. J Vasc Surg 2003: 1283-1292. : Fontain V, et al. Am J Pathol 2004: 2077-2087. : Allaire E, et al. Annals of Surgery 2004: 239(3): 417-427. : Xiong J, et al. J Vasc Surg 2008 : 48(4): 965-973 : Franck G, et al. Circulation 2013: 127: 1877-1887 : Nagaya, N, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004: 287(6), 2670-2676. : Nagaya N, et. al. Circulation, 2005: 112, 1128-1135. : Kagiwada H, et. al. J Tissue Eng Regen Med, 2008: 2(4), 184-189. : Schneider F, et al. Eur J Vasc Endovasc Surg, 2013: 45(6): 666-672. : Hashizume R, et al. J Vasc Surg, 2011: 54(6): 1743-1752. : Fu X M, et al. J Transl Med, 2013: 11: 175. : Yamawaki A, et al. Eur J Cardiothorac Surg, 2014: 45(5): e156-165. : Kuroda Y et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2010: 107: 8639-8643. : Wakao S et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2011: 108: 9875-9880. : Kuroda Y et al. Nat Protc, 2013: 8: 1391-1415.

본 발명은 혈관장해의 예방 및/또는 치료를 위한 세포 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 인간 세포를 거부하지 않는 면역 부전 마우스의 혈관장해 모델에 있어서, 인간 Muse 세포를 혈관 등으로 투여, 혹은 대상의 혈관장해 부위 및 그 주변에 직접 투여함으로써, Muse 세포가 상해를 입은 혈관에 집적·생착하여 장해 혈관을 재건 및 수복하고, 혈관장해의 개선 또는 회복을 가져오는 것을 발견하였고, 그것에 의해 Muse 세포가 대동맥류를 비롯한 혈관장해의 치료나 예방에 바람직하게 사용될 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 생체의 간엽계 또는 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포를 포함하는, 혈관장해를 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제.

[2] 혈관장해는 동맥류인, [1]에 기재된 세포 제제.

[3] 동맥류는 대동맥류인, [2]에 기재된 세포 제제.

[4] 대동맥류는 복부 대동맥류 또는 흉부 대동맥류인, [3]에 기재된 세포 제제.

[5] 동맥류는 내장기 동맥류, 말초 동맥류, 뇌동맥류 또는 관동맥류인, [2]에 기재된 세포 제제.

[6] 동맥류는 방추형 동맥류 또는 낭상 동맥류인, [2]에 기재된 세포 제제.

[7] 동맥류는 진성 동맥류, 해리성 동맥류 또는 가성 동맥류인, [2]에 기재된 세포 제제.

[8] 동맥류는 동맥경화성 동맥류, 염증성 동맥류 또는 감염성 동맥류인, [2]에 기재된 세포 제제.

[9] 상기 다능성 줄기세포는 이하의 성질 전부를 갖는 다능성 줄기세포인, 상기 [1] ~ [8] 중 어느 하나에 기재된 세포 제제:

(ⅰ) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다;

(ⅱ) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 갖는다;

(ⅲ) 종양성 증식을 나타내지 않는다; 및

(ⅳ) 셀프 리뉴얼능을 갖는다.

[10] 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포의 유효량을, 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 혈관장해를 예방 및/또는 치료하는 방법.

[11] 혈관장해를 예방 및/또는 치료하기 위해서 사용되는, 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포를 포함하는 세포 제제.

본 발명에서는 혈관장해를 앓고 있는 대상에 대해 Muse 세포를 혈관 등으로 투여 혹은 대상의 혈관장해 부위 및 그 주변에 직접 투여함으로써 장해를 갖는 혈관을 재건 및 수복하고, 혈관장해의 기능을 개선 또는 회복시킬 수 있다. 본 발명의 세포 제제는 혈관장해의 급성기뿐만 아니라, 만성기에 있어서도 효과를 발휘할 수 있기 때문에, 장기간에 걸쳐 치료 효과를 지속시킬 수 있다.

Muse 세포는 장해를 받은 혈관에 효율적으로 유주(遊走)하여 생착할 수 있고, 생착한 부위에서 혈관 세포 등의 구성 세포로 자발적으로 분화하므로, 이식에 앞서 치료 대상 세포로의 분화 유도가 불필요하다. 또한, 비종양 형성성이며 안전성도 뛰어나다. 게다가 Muse 세포는 면역거부를 받지 않는다는 점에서, 기증자로부터 제조된 타가(他家) 제제에 의한 치료도 가능하다. 따라서, 상기에 나타내는 우수한 성능을 갖는 Muse 세포에 의해, 혈관장해를 갖는 환자의 치료에 대한 용이하게 실행 가능한 수단을 제공할 수 있다.

도 1은 8주 후의 각 군의 마우스로부터 적출된 대동맥류의 사진이다. 스케일 바는 3 mm를 나타낸다.
도 2는 현미경 측정에 의해 3주 후 및 8주 후의 각 군의 대동맥류 직경을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타낸다.
도 3은 각 군의 마우스의 대동맥류 직경을 초음파 측정법에 의해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 대동맥류 직경(mm)을 나타낸다.
도 4는 3주 후의 각 군의 마우스의 대동맥류 조직의 Elastica-Masson 염색의 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 스케일 바는 200 ㎛를 나타낸다.
도 5는 3주 후 및 8주 후의 각 군에 있어서, 탄성 섬유(Elastin) 면적을 탄성 섬유 면적과 총 혈관벽 단면적의 비로 정량화한 결과를 나타내는 그래프이다. *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타낸다.
도 6의 왼쪽 도면은 Muse 세포 투여 3주 후에 있어서의 알파-평활근 액틴(alpha-smooth muscle actin, αSMA)/GFP의 면역 염색 결과를 나타내는 현미경 사진(스케일 바는 50 ㎛를 나타냄)이며, 도 6의 오른쪽 도면은 3주 후 및 8주 후의 각 군의 αSMA/GFP 양쪽 양성 세포의 단위 면적당의 수를 나타내는 그래프이다.
도 7의 왼쪽 도면은 Muse 세포 투여 3주 후에 있어서의 CD31/GFP의 면역 염색 결과를 나타내는 현미경 사진(스케일바 는 50 ㎛를 나타냄)이며, 도 7의 오른쪽 도면은 3주 후 및 8주 후의 각 군의 CD31/GFP 양쪽 양성 세포의 단위 면적당의 수를 나타내는 그래프이다.
도 8의 왼쪽 도면은 Muse 세포 투여 3주 후에 있어서의 F4/80의 면역 염색 결과를 나타내는 현미경 사진이며, 도 8의 오른쪽 도면은 3주 후 및 8주 후의 각 군의 F4/80 양성 세포의 단위 면적당의 수를 나타내는 그래프이다.
도 9의 왼쪽 도면은 Muse 세포 투여 3주 후에 있어서의 Ki67/GFP의 면역 염색 결과를 나타내는 현미경 사진(스케일 바는 50 ㎛를 나타냄)이며, 도 9의 오른쪽 도면은 3주 후 및 8주 후의 Muse 세포 투여군의 Ki67 양성 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 10은 8주 후의 Muse 세포 투여군 및 비-Muse 세포 투여군의 각 장기에 있어서의 Alu 서열의 검출 결과를 나타내는 그래프이다. 비-Muse 세포 투여군의 대동맥 유래의 Alu 서열 검출 농도를 1로 하여 그 밖의 장기 및 Muse 세포 투여군 각각의 값과의 비를 나타내고 있다.
도 11은 인간 Muse 세포, 내피 전구세포(EPC), CD34⁺ 전구세포에 있어서의, 초기 내피세포 마커(A ~ C), 탈분화 평활근 세포 마커(D ~ F) 및 스트레스 내성 관련 마커(G ~ I)의 정량 PCR에 의한 발현 해석의 결과를 나타내는 도면이다. 각각 β액틴의 발현량으로 표준화시킨 상대적 발현량을 나타낸다.
도 12A는 Muse 세포와 공배양된 마우스 동맥류의 대표적인 다광자 레이저 현미경 상을 나타낸다(사진). 왼쪽의 칼럼은 강측으로부터 외측으로 20 ㎛마다 캡처된 각 축방향의 상(파선 1 ~ 4)의 위치를 나타내는 동맥 샘플의 3차원 재구성 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 100 ㎛를 나타낸다.
도 12B는 CD31 또는 CD34로 염색된 동결 절편의 대표적인 화살모양 단면을 나타낸다(사진). 화살표 표시는 GFP와 양쪽의 양성 세포를 나타낸다. 스케일 바는 50 ㎛를 나타낸다.
도 13A는 Muse 세포를 투여한 생체 내(in vivo) 동맥류 모델에 있어서, 3일째 및 5일째에 얻어진 동맥류의 대표적인 다광자 레이저 현미경 상을 나타낸다(사진). 왼쪽 칼럼은 강측으로부터 외측으로 20 ㎛마다 캡처된 각 축방향의 상(파선 1 ~ 4)의 위치를 나타내는 동맥 샘플의 3차원 재구성 이미지를 나타낸다. 스케일 바는 100 ㎛를 나타낸다.
도 13B는 Muse 세포에 의한 동맥류 치료의 모식도를 나타낸다.

본 발명은 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포(Muse 세포)를 포함하는, 혈관장해를 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제에 관한 것이다. 본 발명을 이하에 상세하게 설명한다.

1. 적용 질환

본 발명의 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포(Muse 세포)를 포함하는 세포 제제는 혈관장해의 예방 및/또는 치료에 사용된다.

본 발명에 있어서, "혈관장해"란 동맥경화나 고혈압에 의해, 또는 혈관벽, 특히 중막, 외막에 생긴 염증, 산화 스트레스 등에 의해 생기고, 또한 드물게 상해, 동맥벽에 대한 세균이나 진균의 감염증 등에 의해 생기는 혈관의 장해를 들 수 있으며, 구체적으로는, 예를 들어 혈관장해에 의해 동맥벽의 약해진 부분이 부풀어 오르는 동맥류를 들 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, "혈관장해"는 상기 원인에 의해 동맥벽이 약해져 결과적으로 동맥류에 이르는 것이지만, 동맥류에 이르기 전의 초기 단계의 혈관장해도 포함된다.

본 발명에 있어서, 동맥류란 그 발생 부위에 의한 분류에 의해 흉부 대동맥류, 복부 대동맥류, 내장기 동맥류, 말초 동맥류, 뇌동맥류, 관동맥류 등을 들 수 있고, 그 형태에 의한 분류에 의해 방추형 동맥류, 낭상 동맥류 등을 들 수 있으며, 그 혈관벽 상태에 의한 분류에 의해 진성 동맥류, 해리성 동맥류, 가성 동맥류 등을 들 수 있고, 원인에 의한 분류에 의해 동맥경화성 동맥류, 염증성 동맥류, 감염성 동맥류 등을 들 수 있다.

2. 세포 제제

(1) 다능성 줄기세포(Muse 세포)

본 발명의 세포 제제에 사용되는 다능성 줄기세포는 본 발명자들 중 한 사람인 데자와가 인간 생체 내에 그 존재를 발견하여 "Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring) 세포"라고 명명한 세포이다. Muse 세포는 골수액, 지방조직(Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013(Epub)(published on Jan 17, 2014))나 피부의 진피 결합 조직 등으로부터 얻을 수 있는 것 외에, 널리 조직이나 장기의 결합 조직에도 존재하는 것이 알려져 있다. 또한, 이 세포는 다능성 줄기세포와 간엽계 줄기세포의 양쪽 모두의 성질을 갖는 세포이며, 예를 들어 세포 표면 마커인 "SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)" 양성 세포, 바람직하게는 SSEA-3 양성이며 CD-105 양성의 이중 양성 세포로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 예를 들어, SSEA-3 단독 또는 SSEA-3과 CD-105의 발현을 지표로 하여 생체 조직으로부터 분리할 수 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법 및 특징 등의 자세한 사항은 국제공개 제WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또한, Muse 세포가 여러 가지 외적 스트레스에 대한 내성이 높다는 점을 이용하여 단백질 분해효소 처리나 저산소 조건, 저인산 조건, 저혈청 농도, 저영양 조건, 열 충격(heat shock)에 대한 노출, 유해 물질 존재 하, 활성 산소 존재 하, 기계적 자극 하, 압력 처리 하 등 각종 외적 스트레스 조건 하에서의 배양에 의해 Muse 세포를 선택적으로 농축할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 혈관장해를 치료하기 위한 세포 제제로서 SSEA-3을 지표로서 사용하여 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 조직으로부터 조제된 다능성 줄기세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 단순히 "SSEA-3 양성 세포"로 기재하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, "비-Muse 세포"란 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에 포함되는 세포로서, "SSEA-3 양성 세포" 이외의 세포를 가리키는 경우가 있다.

Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 세포 표면 마커인 SSEA-3또는 SSEA-3과 CD-105를 지표로 하여 생체 조직(예를 들어, 간엽계 조직)으로부터 조제할 수 있다. 여기서, "생체"란 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는 수정란이나 포배기보다 발생 단계가 앞인 배는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생 단계의 배는 포함된다. 포유동물에는, 이에 한정되지 않지만, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 랫트, 토끼, 모르모트 등 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페럿 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는 생체의 조직으로부터 직접 마커를 가지고 분리되는 점에서, 배성 줄기세포(ES세포)나 iPS 세포와 명확하게 구별된다. 또한, "간엽계 조직"이란, 뼈, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄(腱), 치수(齒髓), 제대, 제대혈, 양막 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예를 들어, Muse 세포는 골수나 피부, 지방조직, 혈액, 치수, 제대, 제대혈, 양막 등에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 생체의 간엽계 조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 조제하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 조제 수단을 이용하여 섬유아세포나 골수 간엽계 줄기세포 등의 배양 간엽계 세포로부터 Muse 세포를 조제하여도 된다.

또한, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에 외적 스트레스 자극을 줌으로써, 그 외적 스트레스에 내성의 세포를 선택적으로 증식시켜 그 존재 비율을 높인 세포를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해서도 조제할 수 있다.

상기 외적 스트레스는 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열 충격에 대한 노출하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결 처리, 유해 물질 존재하에서의 배양, 활성 산소 존재하에서의 배양, 기계적 자극하에서의 배양, 진탕 처리하에서의 배양, 압력 처리하에서의 배양 또는 물리적 충격 중 어느 하나 또는 복수의 조합이어도 된다.

상기 프로테아제에 의한 처리 시간은 세포에 외적 스트레스를 주기 위해 합계 0.5 ~ 36시간 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 프로테아제 농도는 배양 용기에 접착된 세포를 떼어낼 때, 세포덩어리를 단일 세포로 뿔뿔이 흩어지게 할 때, 또는 조직으로부터 단일 세포를 회수할 때에 사용되는 농도면 된다.

상기 프로테아제는 세린 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 금속 프로테아제, 글루탐산 프로테아제 또는 N말단 트레오닌 프로테아제인 것이 바람직하다. 상기 프로테아제는 트립신, 콜라게나아제 또는 디스파아제인 것이 더 바람직하다.

또한, 본 발명의 세포 제제에 있어서는, 사용되는 Muse 세포는 세포 이식을 받는 수용자에 대해 자가여도 되고, 또는 타가여도 된다.

상기와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 예를 들어, SSEA-3 양성 또는 SSEA-3과 CD-105의 이중 양성을 지표로 하여 생체 조직으로부터 조제할 수 있으나, 인간 성인 피부는 여러 가지의 타입의 줄기세포 및 전구세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 그러나 Muse 세포는 이들 세포와 동일하지 않다. 이와 같은 줄기세포 및 전구세포에는 피부 유래 전구세포(SKP), 신경관 줄기세포(NCSC), 멜라닌모세포(Melanoblast, MB), 혈관 주위 세포(PC), 내피 전구세포(EP), 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 들 수 있다. 이들 세포에 고유의 마커의 "비발현"을 지표로 하여 Muse 세포를 조제할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는 CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c-kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF인자(폰빌레브란트병 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커) 및 Dct(MB의 마커)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 11개의 마커 중 적어도 1개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 조제할 수 있고, 또한 CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 조제할 수 있으며, 나아가 상기 11개의 마커의 비발현을 지표로 조제할 수 있다.

또한, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 상기 특징을 갖는 Muse 세포는, 이하:

(ⅰ) 텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다;

(ⅱ) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 갖는다;

(ⅲ) 종양성 증식을 나타내지 않는다; 및

(ⅳ) 셀프 리뉴얼능을 갖는다

는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 성질을 가져도 된다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는 상기 성질을 전부 갖는다.

여기서, 상기 (ⅰ)에 대해, "텔로머라아제 활성이 낮거나 또는 없다"란 예를 들어, TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore사)를 사용하여 텔로머라아제 활성을 검출한 경우, 낮거나 또는 검출할 수 없음을 말한다. 텔로머라아제 활성이 "낮다"란 예를 들어, 체세포인 인간 섬유아세포와 동일한 정도의 텔로머라아제 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela 세포에 비해 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머라아제 활성을 가지고 있음을 말한다.

상기 (ⅱ)에 대해, Muse 세포는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계 및 외배엽계)으로 분화하는 능력을 가지며, 예를 들어 시험관 내에서 유도 배양함으로써 간세포(간아세포 또는 간세포 마커를 발현하는 세포를 포함함), 신경세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 골세포, 지방세포 등으로 분화될 수 있다. 또한, 생체 내에서 정소에 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화되는 능력을 나타내는 경우가 있다. 게다가, 정맥 주사에 의해 생체에 이식함으로써 상해를 입은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)에 유주 및 생착되어, 조직에 따른 세포로 분화되는 능력을 갖는다.

상기 (ⅲ)에 대해, Muse 세포는 증식 속도 약 1.3일로 증식하지만, 부유 배양에서는 1 세포로부터 증식되고, 배양체형(胚樣體)형 세포덩어리를 만들어 일정한 크기가 되면 14일간 정도에서 증식이 멈춘다는 성질을 갖는데, 이들의 배양체형형 세포덩어리를 접착 배양으로 가져가면, 다시 세포 증식이 개시되어 세포덩어리로부터 증식된 세포가 약 1.3일의 증식 속도로 퍼져간다. 또 정소에 이식한 경우, 적어도 반년 간은 암화되지 않는다는 성질을 갖는다.

또한, 상기 (ⅳ)에 대해, Muse 세포는 셀프 리뉴얼(자기 복제) 능을 갖는다. 여기서, "셀프 리뉴얼"이란 1개의 Muse 세포로부터 부유 배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체형형 세포덩어리에 포함되는 세포로부터 삼배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있음과 동시에, 배양체형 세포덩어리의 세포를 다시 1 세포에서 부유 배양으로 가져감으로써, 다음 세대의 배양체형 세포덩어리를 형성시키고, 거기에서 다시 삼배엽성의 분화와 부유 배양에서의 배양체형 세포덩어리를 확인할 수 있음을 말한다. 셀프 리뉴얼은 1회 또는 복수회의 사이클을 반복하면 된다.

(2) 세포 제제의 조제 및 사용

본 발명의 세포 제제는, 한정되지 않지만, 상기 (1)에서 얻어진 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 생리 식염수나 적절한 완충액(예를 들어, 인산 완충 생리 식염수)에 현탁시킴으로써 얻어진다. 이 경우, 자가 또는 타가의 조직으로부터 분리된 Muse 세포수가 적은 경우에는, 세포 이식 전에 세포를 배양하여 소정의 세포수가 얻어질 때까지 증식시켜도 된다. 아울러, 이미 보고되어 있는 바와 같이(국제공개 제WO2011/007900호 팜플렛), Muse 세포는 종양화되지 않기 때문에, 생체 조직으로부터 회수한 세포가 미분화인 채 포함되어 있어도 암화의 가능성이 낮아 안전하다. 또한, 회수한 Muse 세포의 배양은, 특별히 한정되지 않지만, 통상적인 증식 배지(예를 들어, 10% 송아지 혈청을 포함하는 α- 최소 필수 배지(α- MEM) 등)에서 실시할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 국제공개 제WO2011/007900호 팜플렛을 참조하여, Muse 세포의 배양 및 증식에 있어서, 적절히 배지, 첨가물(예를 들어, 항생 물질, 혈청) 등을 선택하여 소정 농도의 Muse 세포를 포함하는 용액을 조제할 수 있다. 인간 대상에 본 발명의 세포 제제를 투여하는 경우에는, 인간의 장골로부터 골수액을 채취하고, 예를 들어 골수액으로부터의 접착 세포로서 골수 간엽계 줄기세포를 배양하여 유효한 치료량의 Muse 세포를 얻을 수 있는 세포량에 이를 때까지 증식시킨 후, Muse 세포를 SSEA-3의 항원 마커를 지표로 하여 분리하고, 자가 또는 타가 Muse 세포를 세포 제제로서 조제할 수 있다. 혹은, 예를 들어 골수액으로부터 얻어진 골수 간엽계 줄기세포를 외적 스트레스 조건하에서 배양하여 유효한 치료량에 이를 때까지 Muse 세포를 증식, 농축한 후, 자가 또는 타가 Muse 세포를 세포 제제로서 조제할 수 있다.

또한, Muse 세포의 세포 제제로의 사용에 있어서는, 그 세포를 보호하기 위해 디메틸설폭시드(DMSO)나 혈청 알부민 등을 세균의 혼입 및 증식을 방지하기 위해 항생 물질 등을 세포 제제에 함유시켜도 된다. 또한, 제제상 허용되는 다른 성분(예를 들어, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리 식염수 등)을 세포 제제에 함유시켜도 된다. 당업자는 이들 인자 및 약제를 적절한 농도로 세포 제제에 첨가할 수 있다. 이와 같이, Muse 세포는 각종 첨가물을 포함하는 의약 조성물로서 사용할 수도 있다.

상기에서 조제되는 세포 제제 중에 함유되는 Muse 세포수는 혈관장해의 치료에 있어서 원하는 효과가 얻어지도록, 대상의 성별, 연령, 체중, 환부 상태, 사용할 세포의 상태 등을 고려하여 적절히 조정할 수 있다. 또한, 대상으로 하는 개체는 인간 등의 포유동물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 세포 제제는 원하는 치료 효과가 얻어질 때까지 복수 회(예를 들어, 2 ~ 10회), 적절히 간격(예를 들어, 1일에 2회, 1일에 1회, 1주일에 2회, 1주일에 1회, 2주일에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 6개월에 1회)을 두고 투여되어도 된다. 따라서, 대상의 상태에 따라 다르기도 하지만, 치료상 유효량으로는 예를 들어, 한 개체당 1회에 대해 1×10³ 세포 ~ 1×10¹⁰ 세포로 1 ~ 10회의 투여량이 바람직하다. 한 개체에 있어서의 투여 총량으로는 이에 한정되지 않지만, 1×10³ 세포 ~ 1×10¹¹ 세포, 바람직하게는 1×10⁴ 세포 ~ 1×10¹⁰ 세포, 더욱 바람직하게는 1×10⁵ 세포 ~ 1×10⁹ 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는 상해를 입은 장기로 유주하여 생착하는 성질을 갖는다. 따라서, 세포 제제의 투여에 있어서, 세포 제제의 투여 부위, 투여되는 혈관의 종류(정맥 및 동맥)는 한정되지 않는다.

본 발명의 세포 제제는 혈관장해를 갖는 환자의 장해가 생긴 혈관을 수복 및 재생시킬 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것이 아니다.

실시예

실시예 1： 마우스 동맥류 모델의 제작

본 실시예에 있어서의 마우스를 사용한 실험 프로토콜은 「국립대학 법인 토호쿠 대학 동물실험 등에 관한 규정」을 준수하였고, 실험동물은 토호쿠 대학 동물실험 센터의 감독하에서 그 규정에 따라 제작되었다. 보다 구체적으로는, 비특허문헌: - Bi Y, et al. PLoS ONE 2013. "Rabbit AAA Model via Periaortic CaCl₂ and Elastase Incubation"을 참조하여 이하의 순서에 의해 제작하였다.

8주령의 수컷 SCID 마우스(일본 쿠레아)를 이소퓨란의 흡입으로 마취(유도시: 4%, 유지시: 1 - 1.5%)하였다. 복부를 절개하여 실체 현미경(Leica MZ6) 하에서 좌신정맥 바로 아래부터 대동맥 분기부까지를 전주성(全周性)으로 박리하였다.1 ~ 2개의 허리 동맥 분기를 발견한 경우에는 10-0 나일론 실로 결찰하여 절리(切離)하였다. 박리한 동맥의 주위를 침지 용액(엘라스타아제: 0.5 유닛/μL, CaCl₂: 0.5 mol/L를 포함하는 생리 식염수 50 μL)에 적신 거즈 조각(4 × 8 mm)으로 덮었다. 20분 후에 거즈를 치우고, 그 부분을 생리 식염수로 2회 세정하였다. 대조군(Sham군)에는 생리 식염수를 적신 거즈 조각으로 처치하였다. 이와 같이 하여 제작된 마우스를 마우스 동맥류 모델로 하여 이하의 실험에 사용하였다.

실시예 2: 인간 Muse 세포의 조제

인간 Muse 세포의 분리 및 동정에 관한 국제공개 제WO2011/007900호에 기재된 방법에 준하여 Muse 세포를 얻었다. Muse 세포의 공급원으로는 시판되는 간엽계 줄기세포(MSC, Lonza사)를 사용하였다. 이식에 사용되는 Muse 세포는 대동맥 조직에 생착된 것을 확인하기 위하여, 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하여 세포가 이에 의해 표지되도록 미리 렌티바이러스-GFP 유전자를 Muse 세포에 도입하였다. GFP로 표지된 Muse 세포를 GFP와 SSEA-3의 이중 양성 세포로 하여 FACS에서 분리하였다. 또한, MSC로부터 Muse 세포를 분리한 나머지의 세포를 비-Muse 세포로서 사용하였다. 또한, GFP 양성 MSC도 FACS에서 단리하여 MSC군으로 사용하였다.

실시예 3: 마우스 동맥류 모델에 대한 각 세포 투여

실시예 1에서 제작한 마우스 동맥류 모델을 4군으로 나누어 모델 제작 후, 3일째, 10일째, 17일째의 3회에 걸쳐, 각 군의 마우스에 Muse 세포(2 × 10⁴개, 200 μL)(M), 비-Muse 세포(2 × 10⁴개, 200 μL)(N), MSC(2 × 10⁴개, 200 μL)(MSC) 혹은 비히클(인산 완충액)(V)을 꼬리 정맥 안으로 투여하였다. 또한, 모델 제작 후, 3일째에만 Muse 세포(2 × 10⁴개, 200 μL) 혹은 비-Muse 세포(2 × 10⁴개, 200 μL)를 단회 투여하는 군(각각, M', N')을 만들었다. 게다가 동맥류 비제작군을 샴(Sham, S)군으로 이용하여 비교하였다. 한 군의 동물 수는 8마리로 하였다(Muse군 및 비-Muse군의 3회 세포 투여 모델에서는 11마리, Sham군은 4마리).

실시예 4： 동맥류의 육안적 관찰

동맥류 제작 후 8주의 시점에서 동물을 이소퓨란 과진정의 방법에 의해 안락사시켜, 대동맥을 육안적으로 관찰하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 비히클군에서는 샴군에 비해 현저하게 동맥이 확대되어 있고 대동맥류가 형성되어 있음이 확인되었다. Muse 세포군에서는 비히클군에 비해 동맥은 거의 확대되지 않았고, 외관은 샴군과 유사하였다. 비-Muse 세포군이나 MSC군에서는 비히클군보다도 정도가 가볍기는 하지만 동맥의 확대가 관찰되었다.

실시예 5: 현미경 하에서의 대동맥류 직경의 측정

실체 현미경(Leica MZ6) 하에서 현미경용 디지털 카메라(Leica MC120HD)를 사용하여 대동맥류 직경을 측정하였다. 동맥류 직경은(해부시의 혹(瘤)의 직경 - 모델 제작 전의 혹의 직경)/모델 제작 전의 혹의 직경)의 비에 의해 평가하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 모델 제작 후 3주째(급성기)에는 Muse 세포군은 3회 투여군 및 단회 투여군 모두 비히클군에 비해 통계학적으로 유의하게 혹의 직경이 작았다. 한편, 비-Muse 세포군이나 MSC군에서는 비히클군과의 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 모델 제작 후 8주째(만성기)에 있어서도 동일하게 Muse 세포군은 3회 투여군, 단회 투여군도 비히클군에 비해 통계학적으로 유의하게 혹의 직경이 작았지만, 비-Muse 세포군이나 MSC군에서는 비히클군과의 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 이상과 같이, Muse 세포의 3회 혹은 단회 투여에 의해, 동맥류 직경이 축소되는 것으로 나타났다.

실시예 6: 초음파에 의한 동맥류 직경의 경시적 측정

세포 투여 후 3, 10, 17, 24, 31, 38, 45, 52 및 59일에, 작은 동물용 초음파 화상 진단 장치(SonoScape S6V)를 사용하여 동맥류의 직경을 경시적으로 측정하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Muse 세포 투여군의 3회 투여군, 단회 투여군은 10일 이후에 동맥류 직경이 작은 경향을 나타내었고, 24일째 및 52일째에는 비히클군에 비해 통계학적 유의차가 관찰되었다. 한편, 비-Muse 세포군이나 MSC군에서는 비히클군과의 사이에 통계학적인 유의차는 관찰되지 않았다. 이상과 같이, Muse 세포의 3회 혹은 단회 투여에 의해, 동맥류 직경이 축소되는 것으로 나타났다.

실시예 7: 대동맥 탄성 섬유의 병리 조직학적 평가

모델 제작 후 3주 혹은 8주의 대동맥을 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde : PFA)로 고정하여 동결 절편을 제작한 후, Elastica-Masson 염색 후에 관찰하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포 투여 후 3주에 있어서 Muse 세포군에서는 비-Muse군이나 MSC군, 비히클군과 비교하여 물결 모양의 탄성 섬유 구조가 유지되는 경향에 있었다. 탄성 섬유(Elastin) 면적을, 탄성 섬유 면적과 총 혈관벽 단면적의 비로 정량화시킨 것을 도 5에 나타낸다. 세포 투여 후 3주째에는 비히클군에서는 샴군과 비교하여 유의하게 탄성 섬유 면적의 감소가 관찰되었다. Muse 세포군에서는 3회 투여군 및 단회 투여군 모두 비히클군에 비해 유의하게 탄성 섬유 면적이 크게 유지되고 있었다. 한편, 비-Muse 세포군이나 MSC군에서는 이와 같은 효과는 관찰되지 않았다. 세포 투여 후 8주째에 있어서도, Muse 세포군에서는 3회 투여군 및 단회 투여군 모두 비히클군에 비해 유의하게 탄성 섬유 면적이 크게 유지되고 있었다. 한편, 비-Muse 세포군이나 MSC군에서는 이와 같은 효과는 관찰되지 않았다. 이상으로부터, Muse 세포 투여에 의해 대동맥의 탄성 섬유가 유지되는 것으로 나타났다.

실시예 8: Muse 세포의 혈관 평활근으로의 분화

세포 투여 후 3주 혹은 8주의 대동맥 표본을 사용하여 Muse 세포의 혈관 평활근으로의 분화를 평가하였다. 4% PFA로 고정시킨 대동맥을 1차 항체로서 마우스 항αSMA항체(Thermo사제, 200배 희석해서 사용) 및 토끼 항GFP항체(abcam사제, 500배 희석해서 사용), 2차 항체로서 당나귀 항마우스IgG항체(라이프 테크놀로지사제, 500배 희석해서 사용) 혹은 당나귀 항토끼IgG항체(라이프 테크놀로지사제, 500배 희석해서 사용)를 사용하여 면역 조직화학의 방법으로 염색하였다. 도 6의 왼쪽 사진에 나타낸 바와 같이, Muse 세포 투여 후 3주에 있어서, αSMA를 발현하는 혈관 평활근은 세포질이 적색으로, GFP를 발현하는 Muse 세포는 세포질이 녹색으로 염색되었다. 병합(Merge)에서 보여지는 바와 같이, αSMA와 GFP가 모두 염색되는 세포가 관찰되었고, 투여한 Muse 세포가 혈관 평활근으로 분화된 것이 확인되었다. 도 6의 오른쪽 그래프에는 각 군에 있어서의 단위 면적당의 αSMA/GFP에 모두 양성인 세포수를 나타낸다. Muse 세포의 3회 투여군에서는 세포 투여 후 3주 및 8주에 공양성(共陽性) 세포가 가장 많이 관찰되었고, 단회 투여군에 있어서도 공양성 세포가 관찰되었다. 한편, 비-Muse 세포 투여군이나 MSC 투여군에서는 공양성 세포는 적었다.

실시예 9: Muse 세포의 혈관 내피세포로의 분화

세포 투여 후 3주 혹은 8주의 대동맥 표본을 사용하여 Muse 세포의 혈관 내 피 세포로의 분화를 평가하였다. 4% PFA로 고정시킨 대동맥을 1차 항체로서 염소 항CD31항체(Santa Cruz사제, 50배 희석해서 사용) 혹은 토끼 항GFP항체(abcam사제, 200배 희석해서 사용), 2차 항체로서 당나귀 항염소IgG항체(라이프 테크놀로지사제, 500배 희석해서 사용) 혹은 당나귀 항토끼IgG항체(라이프 테크놀로지사제, 500배 희석해서 사용)를 사용하였다. 도 7의 왼쪽 사진에 나타낸 바와 같이, Muse 세포 투여 후 3주에 있어서, CD31을 발현하는 혈관 내피세포는 세포질이 적색으로, GFP를 발현하는 Muse 세포는 세포질이 녹색으로 염색되었다. 병합에서 보여지는 바와 같이, CD31와 GFP가 모두 염색되는 세포가 관찰되었고, 투여한 Muse 세포가 혈관 내피세포로 분화된 것이 확인되었다. 도 7의 오른쪽 그래프에는 단위 면적당의 CD31/GFP에 모두 양성인 세포수를 나타낸다. Muse 세포의 3회 투여군에서는 세포 투여 후 3주 및 8주에 공양성 세포가 가장 많이 관찰되었고, 단회 투여군에 있어서도 공양성 세포가 관찰되었다. 한편, 비-Muse 세포 투여군이나 MSC 투여군에서는 공양성 세포는 적었다.

실시예 10: 대동맥으로의 대식세포의 유주

세포 투여 후 3주 혹은 8주의 대동맥 표본을 사용하여 대식세포의 검출을 시도하였다. 1차 항체로서 랫트 항F4/80항체(AbD사제, 100배 희석해서 사용), 2차 항체로서는 염소 항랫트항체(라이프 테크놀로지사제, 500배 희석해서 사용)를 사용하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 세포질이 붉게 염색되는 세포를 대식세포로 동정하였다. 비히클군에서는 3주 및 8주 모두 샴군에 비해 많은 대식세포가 검출되었다. Muse 세포의 3회 투여군에서는 3주 및 8주 모두 대식세포의 수가 적었고, 혈관 상해에 수반되는 염증성 세포 침윤이 억제되고 있음이 시사되었다. 그 밖의 세포 투여군에 있어서도, Muse 세포의 3회 투여군만큼은 아니지만 대식세포 수의 감소가 관찰되었다.

실시예 11: Muse 세포의 세포 분열의 확인

세포 투여 후 3주 혹은 8주의 대동맥 표본을 사용하여 대동맥에 생착된 Muse 세포가 분열하고 있는지의 여부를 평가하였다. 1차 항체로서 토끼 항Ki67항체(Thermo사제, 100배 희석해서 사용) 및 염소 항GFP항체(abcam사제, 1000배 희석해서 사용), 2차 항체로서는 당나귀 항토끼항체(라이프 테크놀로지사제, 500배 희석해서 사용) 및 당나귀 항염소항체(라이프 테크놀로지사제, 500배 희석해서 사용)를 사용하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 세포 분열하고 있는 세포는 핵이 적색으로 염색되어, 분열하고 있는 Muse 세포는 핵이 적색으로, 세포질은 녹색으로 염색되었다. 세포 투여 후 3주에는 약 8.5%의 Muse 세포가 분열하고 있고, 조직에 생착된 Muse 세포의 일부가 세포 분열에 의해 증식하고 있음을 나타내었다. 한편, 투여 후 8주에는 분열을 나타내는 Muse 세포는 약 2.1%로 감소하고 있고, 생착된 Muse 세포는 점차 분화로 이동하는 것이 나타났다. 이러한 것은, 급성기에는 Muse 세포가 유주·증식·분화하여 치료 효과를 발휘하고, 그 후 서서히 증식이 종료되어 장해 부위에서 암화되지 않도록 작용하고 있는 것이 시사되었다.

실시예 12: Muse 세포 및 비-Muse 세포의 분포

세포 투여 후 8주에 있어서의 Muse 세포 또는 비-Muse 세포의 분포를 인간 DNA에 특이적인 Alu 서열을 표적으로 한 실시간 PCR에 의해 조사하였다. 결과를 도 10에 나타낸다. Muse 세포는 폐에서도 볼 수 있었지만, 대부분은 대동맥류 부위(Abd Ao)에 분포하고 있었다.

실시예 13: Muse 세포의 각종 혈관 세포로의 분화능 및 스트레스 내성의 해석

인간 Muse 세포의 각종 혈관 세포로의 분화능과 스트레스 내성에 대하여, 정량 PCR에 의한 마커 발현 해석으로 조사하였다. 대조로서 내피세포로 분화하는 것이 알려져 있는 내피 전구세포(EPC), 그리고 내피세포 및 혈관 평활근 세포로 분화하는 것이 알려져 있는 CD34⁺ 전구세포(조혈 줄기세포와 혈관 전구세포를 포함함)를 사용하였다. 또한, Muse 세포는 동맥류를 유발시킨 중증 복합 면역부전(SCID) 마우스 유래의 혈청(수술 후 3일째)의 존재하에 배양하였다.

결과를 도 11에 나타낸다.

상피 마커로는 FOXC1의 발현이 Muse 세포에서 가장 높았다(EPC 및 CD34⁺ 세포에 대해 각각 p<0.001). 한편, KLF2의 발현은 CD34⁺ 세포에서 가장 높았고(EPC에 대해 p<0.01, Muse에 대해 p=0.34), MEF2C의 발현도 CD34⁺ 세포에서 가장 높았다(EPC에 대해 p<0.01, Muse에 대해 p<0.001). Muse 세포에 있어서의 KLF2와 MEF2C의 발현은 중간 정도였다.

탈분화 혈관 평활근 세포의 마커인 ELK1, MYH10 및 CAMK2δ의 발현은 Muse 세포에 있어서 가장 높았다(EPC 및 CD34⁺ 세포에 대해 각각 p<0.001).

스트레스 내성에 관련되는 인자인 HSPA8, PDIA3 및 MDH1의 발현은 Muse 세포에 있어서 현저하게 높았다(EPC 및 CD34⁺ 세포에 대해 각각 p<0.001).

이들 결과로부터, Muse 세포는 내피세포 및 혈관 평활근 세포로 분화하는 능력을 가지며 고 스트레스 내성인 것으로 나타났다.

실시예 14: 시험관 내 동맥류 모델에서의 Muse 세포의 동태 해석

Muse 세포가 동맥류의 미소 환경하에서 분화능을 갖는지의 여부를 조사하기 위해, 인간 Muse 세포와 동맥류 조직을 공배양하였다. 구체적으로는, J Vasc Surg. 2015; 62:1054-1063에 기재된 방법에 의거하여, 돼지 췌장 엘라스타아제(0.5 unit/㎕)를 포함하는 0.5 mol/L의 CaCl₂ 용액을 적신 거즈로 면역 부전 마우스(SCID)의 복부 대동맥을 약 20분간 감싸서 배양함으로써 복부 동맥류의 모델을 제작하였다. 동맥류 조직을 잘라 세로 방향으로 절개·전개하여 동맥의 내강 측을 위로 향하여 배양접시에 두고, 10000개의 GFP⁺ Muse 세포를 첨가하였다. 그 결과, 도 12A에 나타낸 바와 같이, 7일째에는 Muse 세포는 동맥류 벽의 표층의 내막에만 국재하지 않았지만, 2주째 및 3주째에는 Muse 세포는 동맥 조직 내에 침입하고, 중막과 외막층 내층에도 확인되었다. 7일째의 면역 염색에서는, 도 12B에 나타낸 바와 같이, 내막에서의 Muse 세포(GFP 표지되어 있음)는 혈관 내피세포의 마커인 CD31 및 CD34 양성 세포로서 관찰되었다.

실시예 15: 생체 내 모델에서의 Muse 세포의 동태 해석

Muse 세포가 동맥류 조직에 유주하여 결합하는지의 여부를 조사하기 위하여, 동맥류 모델 마우스에 20000개의 GFP⁺ Muse 세포를 정맥으로 투여하고, 투여로부터 3일째와 5일째에 마우스를 해부하여 다광자 레이저 현미경으로 Muse 세포 유주의 동태를 해석하였다.

그 결과, Muse 세포가 먼저 동맥류의 내강 측에 생착하고, 서서히 중막·외막층까지 깊게 침투해 나가는 결과가 된 실시예 14의 시험관 내 공배양 실험과는 달리, 도 13A에 나타낸 바와 같이 3일째에서는 GFP⁺ Muse 세포는 혈관계의 외막에서밖에 검출되지 않았으며, 그 일부는 외막에 있는 "혈관의 영양 혈관(vasa vasorum)"의 주위에 집적하였다(화살표). 5일째에는, GFP⁺ Muse 세포는 아직 외막에 머무르고 있었지만, 중막 및 내막을 향해 증식하였다. 이들 결과로부터, 시험관 내 모델과는 달리 정맥으로 투여된 Muse 세포는 혈관의 내강 측으로부터가 아니고, 외막의 "혈관의 영양 혈관"을 통해 동맥류 조직에 침입하고, 중막 및 내막측을 향해 유주하는 것이 시사되었다(도 13B).

[산업상 이용가능성]

본 발명의 세포 제제는 혈관장해를 갖는 환자에게 투여함으로써, 상해 부위에 있어서 조직을 재건 및 수복하고 기능을 회복시킬 수 있어 혈관장해의 예방이나 치료에 응용할 수 있다.

Claims (11)

1. 생체의 간엽계 조직 또는 배양 간엽계 세포에서 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기세포를 포함하는, 동맥류를 예방 및/또는 치료하기 위한 세포 제제.
2. 제1항에 있어서,
   동맥류는 대동맥류인 것인 세포 제제.
3. 제2항에 있어서,
   대동맥류는 복부 대동맥류 또는 흉부 대동맥류인 것인 세포 제제.
4. 제1항에 있어서,
   동맥류는 내장기 동맥류, 말초 동맥류, 뇌동맥류 또는 관동맥류인 것인 세포 제제.
5. 제1항에 있어서,
   동맥류는 방추형 동맥류 또는 낭상 동맥류인 것인 세포 제제.
6. 제1항에 있어서,
   동맥류는 진성 동맥류, 해리성 동맥류 또는 가성 동맥류인 것인 세포 제제.
7. 제1항에 있어서,
   동맥류는 동맥경화성 동맥류, 염증성 동맥류 또는 감염성 동맥류인 것인 세포 제제.
8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 다능성 줄기세포가 이하의 성질 전부를 갖는 다능성 줄기세포인 것인 세포 제제:
   (ⅰ) 헬라(Hela) 세포에 비해 1/5 이하의 텔로머라아제 활성을 갖고 있거나또는 텔로머라아제 활성이 없다;
   (ⅱ) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 갖는다;
   (ⅲ) 종양성 증식을 나타내지 않는다; 및
   (ⅳ) 셀프 리뉴얼능을 갖는다.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제

Images