ES2882702T3 - Células "Muse" como agente profiláctico o terapéutico para el aneurisma - Google Patents

Abstract

Un producto celular para su uso en la prevención y/o tratamiento de un aneurisma, que comprende una célula madre pluripotente positiva para SSEA-3 derivada de un tejido mesenquimatoso en un cuerpo vivo o una célula madre pluripotente positiva para SSEA-3 derivada de una célula mesenquimatosa cultivada.

Description

DESCRIPCIÓN

Células "Muse" como agente profiláctico o terapéutico para el aneurisma

Campo técnico

La presente invención se refiere a un producto celular en el tratamiento regenerativo. Más en particular, la presente invención se refiere a un producto celular que comprende una célula madre pluripotente eficaz para reparar y regenerar vasos sanguíneos dañados.

Técnica anterior

El aneurisma es una patología en la que se hincha una porción debilitada de la pared de una arteria, e incluye un aneurisma verdadero en el que una arteria se expande mientras que se mantiene la estructura de tres capas que comprende la túnica íntima, la túnica media y la túnica adventicia, y el aneurisma disecante en el que una arteria se expande después de que se produce un desgarro en la túnica media en la pared arterial y provoca una disección de la arteria. Estos trastornos pueden ser una causa directa de muerte. En particular, durante muchos años se ha considerado que el aneurisma aórtico se provoca por trastornos de la pared de los vasos debido a arteriesclerosis e hipertensión. Sin embargo, a partir de estudios recientes, ahora se considera que también se provoca por inflamación, agresión oxidativa y similares que se producen en una pared vascular, especialmente en una túnica media y una túnica adventicia (por ejemplo, documentos distintos de patente 1 a 3).

Debido a las causas anteriores, las células inflamatorias, principalmente linfocitos y monocitos/macrófagos, se infiltran en la pared arterial, activando diversas proteasas tales como las metaloproteinasas de la matriz (MPM), lo que da como resultado la descomposición y ruptura de la matriz extracelular compuesta por fibras de elastina y fibras de colágeno en la túnica media y túnica adventicia. Simultáneamente, también se produce un adelgazamiento y debilitamiento de la pared aórtica, tal como, debido a la reducción y disfunción de las células endoteliales vasculares o la apoptosis de las células musculares lisas. Se considera que estos dan lugar a un agrandamiento irreversible de la arteria y a la formación de aneurismas (por ejemplo, documentos distintos de patente 4 a 7).

Con respecto a la aparición de una disección aórtica, la degradación de la pared arterial debido a la arteriesclerosis y la hipertensión provoca el desgarro de la túnica íntima en la pared arterial, lo que da como resultado una afluencia de sangre hacia el desgarro, provocando la disociación en dos luces, una luz verdadera y una luz falsa, a nivel de la túnica media. En la fase crónica, la fragilidad de la pared aórtica y diversos factores de riesgo de la arteriesclerosis como los antecedentes de la misma dan lugar a la formación de aneurismas en muchos casos.

El aneurisma aórtico no muestra ningún síntoma hasta que se produce la rotura o disección arterial, pero a menudo se encuentra en exploraciones clínicas o reconocimientos médicos periódicos y formación de imágenes de diagnóstico realizadas con otros propósitos. En general, cuando el diámetro del aneurisma aórtico es de aproximadamente 5 cm o más, se realiza un tratamiento tal como el reemplazo quirúrgico con un vaso artificial o una endoprótesis cubierta aórtica (un procedimiento de inserción de un injerto plegable desde una pequeña incisión en la ingle hasta la aorta). para reparar el aneurisma.

Sin embargo, es difícil detectar aneurismas verdaderos y aneurismas disecantes en una fase precoz. Además, los aneurismas aórticos rara vez se rompen cuando el diámetro es inferior a aproximadamente 5 centímetros. Por tanto, en una fase tan precoz, solo se ha realizado un tratamiento preventivo para reducir el riesgo de progresión o ruptura del aneurisma, tal como disminuir la frecuencia cardíaca y la tensión arterial usando un agente antihipertensivo y dejar de fumar.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un tratamiento fundamental para el aneurisma verdadero y el aneurisma disecante, así como los trastornos vasculares que dan lugar a los mismos en fases más tempranas, tales como la revascularización.

Recientemente, con el propósito de la curación completa de los aneurismas aórticos por revascularización, se ha empleado el tratamiento de los aneurismas con diversas células. Por ejemplo, el tratamiento intravascular con células musculares lisas vasculares en un modelo de xenoinjerto de rata divulgado en el documento distinto de patente 8 mostró un efecto de encogimiento del aneurisma en 8 semanas después del tratamiento por medio de catéter. El tratamiento con un vector de adenovirus que contiene un gen de tropoelastina recombinante en un modelo de elastasa de rata divulgado en el documento distinto de patente 9 también mostró una reducción en el tamaño del aneurisma concomitante con un incremento de fibra de elastina. Además, el tratamiento con células endoteliales en un modelo de xenoinjerto de rata divulgado en el documento distinto de patente 10 mostró un efecto de encogimiento del aneurisma en 8 semanas después del tratamiento por medio de catéter.

Sin embargo, todos los tratamientos se basan en trasplante de células vasculares o tratamiento génico y, además, los efectos son insuficientes.

Recientemente, se ha descubierto que las células madre mesenquimatosas (CMM) que tienen capacidades de autoproliferación y multipotenciales no solo se diferencian en células endoteliales vasculares sino que también secretan factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV) (por ejemplo, documentos distintos de patente 11 a 13). Por tanto, también se ha intentado el tratamiento de aneurismas por tratamiento regenerativo usando CMM (por ejemplo, documentos distintos de patente 14 a 17). Sin embargo, el efecto terapéutico del tratamiento regenerativo usando CMM para aneurismas aún no es suficiente. Sigue existiendo la necesidad particular de un procedimiento de prevención y tratamiento fundamentalmente de aneurismas a través de la revascularización, que comprenda administrar una pequeña dosis de CMM y permitir que las CMM invadan, por ejemplo, el medio vascular en un sitio lesionado, se adhieran al mismo y se diferencien en células vasculares en el sitio lesionado, es en particular necesario.

Los estudios de Dezawa, uno de los autores de la presente invención, han revelado que las células madre pluripotentes que están presentes en las fracciones de células mesenquimatosas (células multilinaje diferenciadoras de resistencia a la agresión; célula Muse) se pueden obtener sin la introducción de genes o la inducción por citocinas o similares, y expresan SSEA-3 (antígeno embrionario específico de fase 3) como un antígeno de superficie, pueden ser responsables de la pluripotencia que poseen las fracciones de células mesenquimatosas, y aplicarse al tratamiento de enfermedades dirigido a la regeneración de tejidos (por ejemplo, documento de patente 1; y documentos distintos de patente 18 a 20). Sin embargo, no se ha demostrado si el uso de células Muse en la prevención y/o tratamiento de trastornos vasculares podría proporcionar los efectos terapéuticos esperados.

Referencias de la técnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: la patente japonesa n.° 5185443 B2 se refiere a células madre pluripotentes derivadas de tejido vivo.

Documento de patente 2: la solicitud de patente europea 2886123 A1 se refiere a una preparación celular para su uso en medicina regenerativa que usa células madre pluripotentes.

Documento de patente 3: la solicitud de patente de EE. UU. 2004/161419 A1 se refiere a células madre placentarias y usos de las mismas.

Documento de patente 4: la solicitud de patente de EE. UU. 2011/070647 A1 se refiere a procedimientos para obtener directamente células madre pluripotentes a partir de tejido corporal.

Documento de patente 5: la solicitud de patente internacional WO 2016/035419 A1 se refiere a células madre pluripotentes para el tratamiento de úlceras cutáneas diabéticas.

Documento de patente 6: la solicitud de patente internacional WO 2016/044021 A1 se refiere a la selección de la enfermedad de aneurisma modulando las vías de fagocitosis.

Documento de patente 7: la solicitud de patente japonesa 2015/159895 A se refiere a un procedimiento para producir un cultivo celular para promover la angiogénesis o la excrecencia de axones.

Documento de patente 8: la solicitud de patente de EE. UU. 2016/082048 A1 se refiere a células madre pluripotentes para el tratamiento del infarto cerebral.

Documentos distintos de patentes

Documento distinto de patente 1: Petersen E., et al. J Vasc Endovasc Surg 2000: 457-461.

Documento distinto de patente 2: Crowther M., et al. J Vasc Surg 2000: 575-583.

Documento distinto de patente 3: Freestone T., et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995: 1145-1151.

Documento distinto de patente 4: Traub O., et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998: 677-685.

Documento distinto de patente 5: Visse R., et al. Circ Res 2003: 827-39.

Documento distinto de patente 6: Kazi M., et al. J Vasc Surg 2003: 1283-1292.

Documento distinto de patente 7: Fontain V., et al. Am J Pathol 2004: 2077-2087.

Documento distinto de patente 8: Allaire E., et al. Annals of Surgery 2004: 239(3): 417-427.

Documento distinto de patente 9: Xiong J., et al. J Vasc Surg 2008: 48(4): 965-973

Documento distinto de patente 10: Franck G., et al. Circulation 2013: 127: 1877-1887

Documento distinto de patente 11: Nagaya, N., et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004: 287(6), 2670­ 2676.

Documento distinto de patente 12: Nagaya N., et al. Circulation, 2005: 112, 1128-1135.

Documento distinto de patente 13: Kagiwada H., et al. J Tissue Eng Regen Med, 2008: 2(4), 184-189.

Documento distinto de patente 14: Schneider F., et al. Eur J Vasc Endovasc Surg, 2013: 45(6): 666-672 Documento distinto de patente 15: Hashizume R., et al. J Vasc Surg, 2011: 54(6): 1743-1752

Documento distinto de patente 16: Fu X M., et al. J Transl Med, 2013: 11: 175.

Documento distinto de patente 17: Yamawaki A., et al. Eur J Cardiothorac Surg, 2014: 45(5): e156-165. Documento distinto de patente 18: Kuroda Y., et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2010: 107: 8639-8643. Documento distinto de patente 19: Wakao S., et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2011: 108: 9875-9880. Documento distinto de patente 20: Kuroda Y., et al. Nat Protc, 2013: 8: 1391-1415.

Sumario de la invención

Problemas que se van a resolver por la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un producto celular para la prevención y/o tratamiento de aneurismas.

Medios para resolver los problemas

Los autores de la presente invención han descubierto que: en un modelo de trastorno vascular que usa un ratón inmunodeficiente que no rechaza células humanas, las células Muse humanas que se administran por medio de un vaso sanguíneo o similares, o se administran directamente al sitio vascular lesionado del sujeto y sus alrededores, se acumulan e injertan en, y a continuación restauran y reparan el vaso sanguíneo lesionado, dando como resultado una mejora o recuperación del trastorno vascular; y por tanto que las células Muse se pueden usar de forma adecuada en el tratamiento y prevención de trastornos vasculares, incluyendo el aneurisma aórtico, de este modo se completa la presente invención.

En consecuencia, la presente invención proporciona los siguientes [1] a [11].

[1] Un producto celular para la prevención y/o tratamiento de un aneurisma, que comprende una célula madre pluripotente positiva para SSEA-3 derivada de un tejido mesenquimatoso en un cuerpo vivo o una célula madre pluripotente positiva para SSEA-3 derivada de una célula mesenquimatosa cultivada.

[2] El producto celular del punto [1], en el que la célula madre pluripotente muestra expresión negativa para CD117, CD146, NG2, CD34, vWF y CD271.

[3] El producto celular del punto [1] o [2], en el que el aneurisma es un aneurisma aórtico.

[4] El producto celular del punto [3], en el que el aneurisma aórtico es un aneurisma aórtico abdominal o un aneurisma aórtico torácico.

[5] El producto celular del punto [1] o [2], en el que el aneurisma es un aneurisma visceral, un aneurisma de arteria periférica, un aneurisma cerebral o un aneurisma de arteria coronaria.

[6] El producto celular del punto [1] o [2], en el que el aneurisma es un aneurisma fusiforme o un aneurisma sacular.

[7] El producto celular del punto [1] o [2], en el que el aneurisma es un aneurisma verdadero, un aneurisma disecante o un aneurisma falso.

[8] El producto celular del punto [1] o [2], en el que el aneurisma es un aneurisma arterioesclerótico, un aneurisma inflamatorio o un aneurisma infectado.

[9] El producto celular de uno cualquiera de los puntos [1] a [8], en el que dicha célula madre pluripotente es una que tiene todas las características siguientes:

(i) que tiene actividad telomerasa baja o nula;

(ii) que puede diferenciarse en cualquiera de las células tridérmicas;

(iii) que no muestra proliferación neoplásica; y

(iv) que tiene capacidades de autorrenovación.

Efectos de la invención

En la presente invención, cuando se administran células Muse a un sujeto con un aneurisma por medio de un vaso sanguíneo o similares, o directamente a su sitio vascular lesionado y sus alrededores, las células pueden restaurar y reparar el vaso sanguíneo lesionado, dando como resultado una mejora o recuperación de funciones durante el trastorno vascular. El producto celular de la presente invención puede ejercer su efecto no solo durante la fase aguda del trastorno vascular, sino también durante la fase crónica, manteniendo de este modo el efecto terapéutico durante un largo período de tiempo.

Puesto que las células Muse pueden migrar e injertarse eficazmente en los vasos sanguíneos lesionados y, a continuación, diferenciarse espontáneamente en células constituyentes, tales como las células vasculares en el sitio de incorporación del injerto, no requieren la inducción de diferenciación en células diana terapéuticas antes del trasplante. Además, las células Muse no son oncógenas y tienen una seguridad superior. Además, puesto que las células Muse no están expuestas al rechazo inmunitario, también es posible el tratamiento con preparaciones alogénicas producidas a partir de donantes. Por lo tanto, las células Muse que tienen las capacidades superiores como se describe anteriormente pueden proporcionar un medio fácil y factible para el tratamiento de pacientes con trastornos vasculares.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra fotografías de aneurismas aórticos extraídos de ratones de los grupos indicados después de 8 semanas. La barra de escala representa 3 mm.

La FIG. 2 muestra gráficos de los diámetros de aneurismas aórticos de los grupos indicados después de 3 semanas y 8 semanas, como se mide por microscopía. * representa P < 0,05 y ** representa P < 0,01. La FIG. 3 muestra un gráfico de los diámetros de aneurismas aórticos de los ratones de los grupos indicados, como se mide por determinación ultrasónica. El eje vertical muestra el diámetro de aneurisma aórtico (mm).

La FIG. 4 muestra microfotografías de tinción de Masson de tejido elástico de tejidos de aneurisma aórtico de los ratones de los grupos indicados después de 3 semanas. Las barras de escala representan 200 |jm. La FIG. 5 muestra gráficos de los resultados de cuantificación del área de fibra elástica (elastina), representada como la proporción del área de fibra elástica con respecto al área de la sección transversal de la pared vascular total de los grupos indicados después de 3 semanas y después de 8 semanas. * representa P < 0,05 y ** representa P < 0,01.

La FIG. 6 muestra microfotografías de inmunotinción para alfa-actina de músculo liso (aSMA)/PFV 3 semanas después de la administración de células Muse (las barras de escala representan 50 jm ) (parte superior). La FIG. 6 también muestra un gráfico que muestra el número de células doble positivas para aSMA/PFV por unidad de área de los grupos indicados después de 3 semanas y 8 semanas (parte inferior).

La FIG. 7 muestra microfotografías de inmunotinción para CD31/PFV 3 semanas después de la administración de células Muse (las barras de escala representan 50 jm ) (parte superior). La FIG. 7 también muestra un gráfico que muestra el número de células doble positivas para CD31/PFV por unidad de área de los grupos indicados después de 3 semanas y 8 semanas (parte inferior).

La FIG. 8 muestra microfotografías de inmunotinción para F4/803 semanas después de la administración de células Muse (parte superior). La FIG. 8 también muestra un gráfico que muestra el número de células doble positivas para F4/80 por unidad de área de los grupos indicados después de 3 semanas y 8 semanas (parte inferior).

La FIG. 9 muestra microfotografías de inmunotinción para Ki67/PFV 3 semanas después de la administración de células Muse (las barras de escala representan 50 |jm) (parte superior). La FIG. 9 también muestra un gráfico que muestra los porcentajes de células positivas para Ki67 de los grupos tratados con células Muse después de 3 semanas y 8 semanas (parte inferior).

La FIG. 10 es un gráfico que muestra los resultados de detección de secuencia Alu en los órganos indicados del grupo tratado con células Muse y del grupo tratado con células distintas de Muse después de 8 semanas. Las concentraciones de secuencia Alu detectadas en los otros órganos y el grupo tratado con células Muse se expresan como proporciones con respecto a las derivadas de la aorta en el grupo tratado con células distintas de Muse, que se considera como el 1.

La FIG. 11 muestra la expresión de marcadores de células endoteliales tempranas (de A a C), marcadores de células musculares lisas desdiferenciadas (de D a F) y marcadores relacionados con la tolerancia a la agresión (de G a I) en células Muse humanas, células precursoras endoteliales (CPE) y células progenitoras CD34+, analizada por PCR cuantitativa. Cada nivel de expresión se indica como nivel de expresión relativo normalizado por el nivel de expresión de p-actina.

La FIG. 12A muestra microfotografías de láser multifotónico (fotografía) representativas de aneurisma de ratón cocultivado con células Muse. La columna de la izquierda representa imágenes de reconstrucción 3D de muestras de arterias que muestran las posiciones de las imágenes en la dirección axial indicada (líneas discontinuas 1 a 4) captadas cada 20 jm del lado luminal al lado exterior. La barra de escala representa 100 jm .

La FIG. 12B muestra secciones sagitales (fotografías) representativas de secciones congeladas teñidas con CD31 o CD34. Las puntas de flecha indican células que también son positivas para PFV. Las barras de escala representan 50 jm .

La FIG. 13A muestra microfotografías de láser multifotónico (fotografía) representativas de aneurismas obtenidos los días 3 y 5 en un modelo de aneurisma in vivo tratado con células Muse. La columna de la izquierda representa imágenes de reconstrucción 3D de muestras de arterias que muestran las posiciones de las imágenes en la dirección axial indicada (líneas discontinuas 1 a 4) captadas cada 20 jm del lado luminal al lado exterior. La barra de escala representa 100 jm .

La FIG. 13B muestra un esquema de tratamiento de aneurisma con una célula Muse.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un producto celular para la prevención y/o tratamiento de un aneurisma, comprendiendo el producto celular una célula madre pluripotente positiva para SSEA-3 (célula Muse). La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas y se describirá en detalle a continuación.

1. Indicaciones

El producto celular de la presente invención que comprende una célula madre pluripotente positiva para SSEA-3 (célula Muse) se usa para la prevención y/o tratamiento de un aneurisma. Un aneurisma es típicamente cuando una parte debilitada de las paredes arteriales sobresale debido a trastornos vasculares.

Como se usa en el presente documento, el término "trastorno vascular", que significa debilitamiento de la pared arterial debido a las causas mencionadas anteriormente que dan como resultado un aneurisma, también incluye trastornos de los vasos sanguíneos en la fase inicial antes de alcanzar el aneurisma. En la presente invención, los aneurismas incluyen: aneurisma de aorta torácica, aneurisma de aorta abdominal, aneurisma visceral, aneurisma de arteria periférica, aneurisma cerebral y aneurisma de arteria coronaria de acuerdo con la clasificación basada en el sitio de aparición; aneurisma fusiforme y aneurisma sacular de acuerdo con la clasificación basada en la forma; aneurisma verdadero, aneurisma disecante y aneurisma falso de acuerdo con la clasificación basada en el estado de la pared vascular; y aneurisma arterioesclerótico, aneurisma inflamatorio y aneurisma infectado de acuerdo con la clasificación basada en la causa.

2. Producto celular

(1) Célula madre pluripotente (célula Muse)

La célula madre pluripotente usada en el producto celular de la presente invención es una célula que se encontró en el cuerpo humano vivo y se denominó "célula Muse (multilinaje diferenciadora resistente a la agresión)" descubierta por Dezawa, uno de los autores de la presente invención. Es conocido que las células Muse se pueden obtener, por ejemplo, a partir de aspirado de médula ósea, tejido adiposo (Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., 20 de noviembre de 2013 (publicación electrónica) (publicada el 17 de enero de 2014)) y tejido conjuntivo dérmico de la piel, y están ampliamente presentes en tejidos y tejidos conjuntivos en órganos. Esta célula también tiene características tanto de célula madre pluripotente como de célula madre mesenquimatosa y se identifica, por ejemplo, como una célula positiva para "SSEA-3 (antígeno embrionario específico de fase 3)", un marcador de superficie celular, preferentemente como una célula doble positiva que es positiva para SSEA-3 y CD-105. Por lo tanto, las células Muse o una fracción celular que contiene células Muse se pueden aislar a partir de tejidos vivos usando, por ejemplo, solo la expresión de SSEA-3 o una combinación de SSEA-3 y CD-105 como marcador de superficie celular. Los procedimientos para la separación e identificación de, y las características de la célula Muse se han divulgado específicamente en el documento WO2011/007900. Las células Muse también se pueden enriquecer selectivamente utilizando la alta resistencia de las células Muse a diversas agresiones externas y cultivándolas en diversas condiciones de agresión externa, tal como en tratamiento con proteasa, en condición hipóxica, en condición de bajo contenido de fosfato, en una concentración sérica baja, en condición de baja nutrición, bajo exposición a choque térmico, en presencia de sustancia tóxica, en presencia de especies de oxígeno reactivas, bajo estimulación mecánica y bajo tratamiento a presión. Como se usa en el presente documento, las células madre pluripotentes (células Muse) o una fracción celular que contiene células Muse preparadas, como un producto celular para el tratamiento de trastornos vasculares, a partir de tejidos mesenquimatosos o tejidos mesenquimatosos cultivados usando SSEA-3 como marcador de superficie celular se pueden denominar simplemente como "células positivas para SSEA-3". Como se usa en el presente documento, el término "células distintas de Muse" se puede referir a células contenidas en tejidos mesenquimatosos o células mesenquimatosas cultivadas y excluyendo "células positivas para SSEA-3".

Las células Muse o una fracción celular que contiene células Muse se pueden preparar a partir de tejidos vivos (por ejemplo, tejidos mesenquimatosos) usando marcadores de superficie celular, SSEA-3 o SSEA-3 y CD-105, como marcador de superficie celular. Como se usa en el presente documento, el término "vivo" significa un cuerpo vivo de mamífero. En la presente invención, el cuerpo vivo no incluye óvulos fertilizados ni embriones en fases de desarrollo antes de la fase de blastocisto, pero incluye embriones en fases de desarrollo de fase de blastocisto o posteriores, incluyendo feto y blástula. Los ejemplos del mamífero incluyen, pero no se limitan a, primates tales como seres humanos y monos; roedores tales como ratones, ratas, conejos y cobayas; y gatos, perros, ovejas, cerdos, ganado, caballos, burros, cabras y hurones. La célula Muse usada en el producto celular de la presente invención se distingue definitivamente de las células madre embrionarias (células ME) y las células iPS en que la célula Muse se aísla directamente con marcadores a partir de tejidos vivos. El término "tejido mesenquimatoso" se refiere a tejidos presentes en tejidos u órganos diversos tales como hueso, membrana sinovial, grasa, sangre, médula ósea, músculo esquelético, dermis, ligamento, tendón, pulpa dental, cordón umbilical, sangre del cordón umbilical y amnios. Las células Muse se pueden obtener, por ejemplo, de médula ósea, piel, tejido adiposo, sangre, pulpa dental, cordón umbilical, sangre del cordón umbilical y amnios. Preferentemente, se recoge un tejido mesenquimatoso del cuerpo vivo, y a continuación se preparan las células Muse a partir del tejido y se usan. De forma alternativa, usando el procedimiento de preparación descrito anteriormente, se pueden preparar las células Muse a partir de células mesenquimatosas cultivadas tales como células madre mesenquimatosas de médula ósea y fibroblasto.

La fracción celular que contiene células Muse usadas en el producto celular de la presente invención también se puede preparar por un procedimiento que comprende la exposición de tejidos mesenquimatosos del cuerpo vivo o células mesenquimatosas cultivadas a una agresión externa para permitir selectivamente la proliferación de células tolerantes a la agresión y la recolección de las células con la proporción de abundancia incrementada de células tolerantes a la agresión.

La agresión externa mencionada anteriormente puede ser cualquiera de los siguientes: tratamiento con proteasa, cultivo en hipoxia, cultivo en condición de bajo contenido de fosfato, cultivo en baja concentración sérica, cultivo en condición de desnutrición, cultivo bajo exposición a choque térmico, cultivo a bajas temperaturas, tratamiento por congelación, cultivo en presencia de sustancias tóxicas, cultivo en presencia de especies de oxígeno reactivas, cultivo bajo agresión mecánica, cultivo bajo agitación, cultivo bajo tratamiento a presión o choques físicos o una combinación de los mismos.

El tratamiento con proteasa mencionado anteriormente se lleva a cabo preferentemente durante 0,5 a 36 horas en total para ejercer la agresión externa. La concentración de la proteasa puede ser una concentración usada cuando se recolectan células adheridas a un recipiente de cultivo, cuando los agregados celulares se separan en células individuales o cuando se recogen células individuales de un tejido.

Preferentemente, la proteasa mencionada anteriormente es serina proteasa, proteasa aspártica, cisteína proteasa, metaloproteasa, proteasa glutámica o treonina proteasa N terminal. Más preferentemente, la proteasa mencionada anteriormente es tripsina, colagenasa o Dispase.

La célula Muse usada en el producto celular de la presente invención puede ser autóloga o alogénica para un receptor de trasplante celular.

Como se describe anteriormente, las células Muse o una fracción celular que contiene células Muse se pueden preparar a partir de tejidos del cuerpo vivo, por ejemplo, usando positividad para SSEA-3 o doble positividad para SSEA-3 y CD-105 como marcador de superficie celular. Es conocido que la piel humana adulta comprende diversos tipos de células madre y células precursoras. Sin embargo, la célula Muse es diferente de estas células. Estas células madre y células precursoras incluyen células precursoras derivadas de la piel (SKP), células madre de la cresta neural (NCSC), melanoblastos (MB), pericitos (PC), células precursoras endoteliales (PE) y células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC). Las células Muse se pueden preparar usando la "no expresión" de marcadores exclusivos de estas células como marcador de superficie celular. Más específicamente, las células Muse se pueden aislar usando como índice de expresión negativa para al menos uno, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11, de 11 marcadores de superficie celular seleccionados del grupo que consiste en CD34 (un marcador para PE y ADSC), CD117 (c-kit) (un marcador para MB), CD146 (un marcador para PC y ADSC), CD271 (Ng FR) (un marcador para NCSC), NG2 (un marcador para PC), factor vWF (factor von Willebrand) (un marcador para PE), Sox10 (un marcador para NCSC), Snail (un marcador para SKP), Slug (un marcador para SKP), Tyrp1 (un marcador para MB) y Dct (un marcador para MB). Las células Muse se pueden preparar usando como índice de expresión negativa para, por ejemplo, pero sin limitarse a, CD117 y CD146; CD117, CD146, NG2, CD34, vWF y CD271; o los 11 marcadores descritos anteriormente.

La célula Muse que tiene las características descritas anteriormente y que se usa en el producto celular de la presente invención también tiene al menos una seleccionada del grupo que consiste en las siguientes características:

(i) que tiene actividad telomerasa baja o nula;

(ii) que puede diferenciarse en cualquiera de las células tridérmicas;

(iii) que no muestra proliferación neoplásica; y

(iv) que tiene capacidades de autorrenovación.

Preferentemente, la célula Muse usada en el producto celular de la presente invención tiene todas las características descritas anteriormente. Con respecto a (i) anterior, la frase "que tiene actividad telomerasa baja o nula" significa que la actividad telomerasa es baja o indetectable cuando se detecta usando, por ejemplo, el kit de detección de telomerasa TRAPEZE XL (Millipore). Que tiene actividad telomerasa "baja" significa, por ejemplo, que tiene actividad telomerasa comparable a la del fibroblasto humano somático, o que tiene actividad telomerasa de 1/5 o menos, preferentemente una décima parte o menos de actividad telomerasa, en comparación con la de la célula HeLa. Con respecto a (ii) anterior, la célula Muse se puede diferenciar en células triploblásticas (células endodérmicas, mesodérmicas y ectodérmicas) in vitro e in vivo. Por ejemplo, la célula Muse se puede diferenciar en hepatocito (incluyendo células que expresan marcadores de hepatoblastos o marcadores de hepatocitos), neurona, célula muscular estriada, célula muscular lisa, osteocito o adipocito por cultivo in vitro para su inducción. La célula Muse también se puede diferenciar en células triploblásticas cuando se trasplanta en el testículo in vivo. Además, la célula Muse puede migrar e injertarse en órganos lesionados (tales como corazón, piel, médula espinal, hígado y músculo) y diferenciarse en células adecuadas para los tejidos cuando se trasplanta a un cuerpo vivo por medio de inyección intravenosa. Con respecto a (iii) anterior, las células Muse pueden proliferar a partir de una única célula a una tasa de crecimiento de aproximadamente 1,3 días en cultivo en suspensión y formar grupos de células similares al cuerpo embrioide en un determinado tamaño y a continuación detener su proliferación después de aproximadamente 14 días. Cuando estos grupos de células similares al cuerpo embrioide se transfieren a un cultivo adherente, las células reinician la proliferación y las células que proliferan a partir de los grupos de células se extienden a una tasa de crecimiento de aproximadamente 1,3 días. Además, las células se caracterizan por que, cuando se trasplantan al testículo, no se vuelven cancerosas durante al menos medio año. Con respecto a (iv) anterior, la célula Muse tiene capacidades de autorrenovación (autorreplicación). El término "autorrenovación" significa que se puede observar la diferenciación en células de tres capas germinales a partir de células contenidas en los primeros grupos de células similares al cuerpo embrioide derivadas de una única célula Muse en un cultivo en suspensión; que se puede observar la formación de la segunda generación de grupos similares al cuerpo embrioide cultivando nuevamente una única célula de la primera generación de grupos similares al cuerpo embrioide en un cultivo en suspensión; y que se puede observar la diferenciación en células de tres capas germinales y la formación de la tercera generación de grupos similares al cuerpo embrioide obtenidas por cultivo en suspensión unicelular derivado de la segunda generación de grupos similares al cuerpo embrioide. Autorrenovación significa poder repetir durante uno o más ciclos experimentales mencionados anteriormente.

(2) Preparación y uso del producto celular

El procedimiento para obtener el producto celular de la presente invención incluye, pero sin limitarse a, suspender células Muse o una fracción celular que contiene células Muse obtenidas en (1) anteriormente en una solución salina fisiológica o una solución tampón adecuada (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). En este caso, si solo se obtienen pequeñas cantidades de células Muse de un tejido autólogo o alogénico, estas células se pueden cultivar antes del trasplante celular hasta que se obtenga la cantidad fija de células. Como se informa previamente (documento WO2011/007900), puesto que las células Muse no se vuelven oncogénicas, si quedan células recogidas de un tejido vivo y algunas células indiferenciadas, tienen una baja posibilidad de convertirse en células malignas y, por tanto, son seguras. Las células Muse recogidas se pueden cultivar en cualquier medio de cultivo común (por ejemplo, medio esencial mínimo a (a-MEM) complementado con suero de ternera al 10 %). Más específicamente, con referencia al documento WO2011/007900 descrito anteriormente, por ejemplo, se seleccionan apropiadamente un medio de cultivo y los aditivos (por ejemplo, antibióticos y suero) para el cultivo y la proliferación de células Muse, de modo que se puede preparar una solución que contiene la concentración fija de células Muse. Cuando el producto celular de la presente invención se administra a un sujeto humano, se recogen aspirados de médula ósea de un hueso ilíaco humano, y a continuación, por ejemplo, se cultivan células madre mesenquimatosas de médula ósea para obtener células adherentes del aspirado de médula ósea y se hacen proliferar hasta alcanzar la cantidad de células donde se puede obtener una cantidad terapéuticamente eficaz de células Muse. Después de esto, las células Muse se clasifican usando un marcador antigénico SSEA-3 como marcador de superficie celular. Estas células Muse autólogas o alogénicas se pueden usar para preparar el producto celular. De forma alternativa, por ejemplo, las células madre mesenquimatosas de médula ósea obtenidas de los aspirados de médula ósea se cultivan en condiciones de agresión externa para hacer proliferar y enriquecer las células Muse hasta que alcanzan una cantidad terapéuticamente eficaz. A continuación, estas células Muse autólogas o alogénicas se pueden usar para preparar el producto celular.

Cuando las células Muse se usan en el producto celular, el producto celular puede contener dimetilsulfóxido (DMSO), seroalbúmina o similares para la protección de las células y antibióticos o similares para prevenir la contaminación y proliferación de bacterias. El producto celular puede contener además otros componentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, vehículo, excipiente, disgregante, agente tampón, emulsionante, agente de suspensión, agente calmante, estabilizador, conservante, antiséptico, solución salina fisiológica). Se pueden añadir estos agentes y fármacos al producto celular en una concentración apropiada por el experto en la técnica. Por tanto, las células Muse también se pueden usar como una composición farmacéutica que contiene diversos aditivos.

La cantidad de células Muse contenidas en el producto celular preparado anteriormente se puede ajustar apropiadamente para obtener los efectos deseados en el tratamiento de trastornos vasculares, teniendo en cuenta, por ejemplo, el sexo, la edad y el peso de los sujetos, el estado de la parte enferma y el estado de las células que se van a usar. Los individuos que han de ser el sujeto incluyen, pero no se limitan a, mamíferos tales como seres humanos. El producto celular de la presente invención se puede administrar múltiples veces (por ejemplo, de 2 a 10 veces) a intervalos apropiados (por ejemplo, dos veces al día, una vez al día, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses o una vez cada seis meses) hasta obtener el efecto terapéutico deseado. Por tanto, dependiendo del estado del sujeto, la cantidad terapéuticamente eficaz es preferentemente una dosificación de, por ejemplo, de 1*103 a 1*1010 células/individuo/dosis en de 1 a 10 dosis. Los ejemplos de dosificación total para un individuo incluyen, pero no se limitan a, de 1*103 a 1X1011 células, preferentemente de 1*104 a 1*1010 células, más preferentemente de 1*105 a 1*109 células.

La célula Muse usada en el producto celular de la presente invención se caracteriza por la migración y la incorporación del injerto en los órganos lesionados. Por tanto, con respecto a la administración del producto celular, la vía de administración del producto celular y el tipo de vaso sanguíneo en el que se administra el producto celular (vena o arteria) no están limitados.

El producto celular de la presente invención puede proporcionar reparación y regeneración de vasos sanguíneos lesionados en pacientes con un aneurisma.

La presente invención se describirá en detalle con referencia a los ejemplos a con referencia, pero no se limita a los ejemplos de ninguna manera.

Ejemplos

Ejemplo 1: producción de modelo de aneurisma de ratón

Los protocolos experimentales que usan ratones en este ejemplo cumplieron con el "Reglamento para experimentos con animales y actividades relacionadas en la Universidad de Tohoku", y los animales experimentales se prepararon de acuerdo con el reglamento bajo la supervisión del Centro de Investigación con Animales de Laboratorio de la Universidad de Tohoku. Más específicamente, con referencia a un documento distinto de patente: Bi Y., et al., PLoS ONE 2013. "Rabbit AAA Model via Periaortic CaCl² and Elastase Incubation", los ratones modelo se prepararon por los siguientes procedimientos.

Se anestesiaron ratones IDCG macho de ocho semanas de edad (CLEA Japón) con inhalación de isoflurano (inducción: 4 %, mantenimiento: 1-1,5 %). Después de abrir el abdomen, se desprendió circunferencialmente una región desde justo debajo de la vena renal izquierda hasta la bifurcación aórtica al microscopio estereoscópico (Leica MZ6). Cuando se observaron una o dos ramas de la arteria lumbar, se ligaron con hilo de nailon 10-0 y se cortaron. La periferia de la arteria desprendida se cubrió con una gasa (4 * 8 mm) sumergida en una solución de inmersión (50 |jl de solución salina fisiológica que contenía 0,5 unidades/jl de elastasa y 0,5 mol/l de CaCh). Después de 20 minutos se retiró la gasa y se lavó la región dos veces con solución salina fisiológica. El grupo de control (grupo de referencia) se trató con una gasa que contenía solución salina fisiológica. El ratón así preparado se usó como modelo de aneurisma de ratón para los siguientes experimentos.

Ejemplo 2: preparación de la célula Muse humana

Las células Muse se ob tuv ie ron de acuerdo con el p roced im ien to descrito en el docum ento W O 2011/007900 sobre aislam iento e identificación de células Muse humanas. Se usó una célula madre mesenquimatosa disponible comercialmente (CMM, Lonza) como fuente de células Muse. Las células Muse usadas para el trasplante expresaron proteína fluorescente verde (PFV) para confirmar la incorporación del injerto en los tejidos aórticos. Para el marcaje de células con PFV, el gen lentivirus-PFV se introdujo en las células Muse con antelación. Las células Muse marcadas con PFV se aislaron como una célula doble positiva para PFV y SSEA-3 por FACS. Las células restantes después de separar las células Muse de las CMM se usaron como células distintas de Muse. Las CMM positivas para PFV también se aislaron por FACS y se usaron como grupo de CMM.

Ejemplo 3: administración de células a ratón modelo de aneurisma

Los ratones modelo de aneurisma preparados en el ejemplo 1 se dividieron en 4 grupos, y las células Muse (2*104, 200 j l) (M), las células distintas de Muse (2*104, 200 j l) (N), las CMM (2*104, 200 j l) (CMM) o el vehículo (tampón fosfato) (V) se administraron a los ratones en cada grupo por vía intravenosa por medio de la vena de la cola 3 veces, el día 3, 10, y 17 después de la preparación del modelo. También se proporcionaron grupos de dosis única que recibieron células Muse (2x104, 200 j l) o células distintas de Muse (2 *Í04, 200 jl), sólo el día 3 después de la preparación del modelo (M' y N', respectivamente). Además, un grupo en el que no se estableció el aneurisma se usó como grupo de referencia (S) para la comparación. El número de animales por grupo fue de 8 (pero 11 para los modelos de administración de 3 veces en los grupos de Muse y de distintas de Muse, y 4 en el grupo de referencia).

Ejemplo 4: macroscopia de la aneurisma

En la semana 8 después de la preparación del modelo de aneurisma, los animales se sacrificaron por sedación excesiva con isoflurano y se observaron macroscópicamente sus aortas. Como se muestra en la FIG. 1, el grupo de vehículo tenía una arteria notablemente expandida en comparación con el grupo de referencia, lo que indica que se formó un aneurisma aórtico en el grupo de vehículo. En el grupo de células Muse, la arteria mostró poca o ninguna expansión en comparación con el grupo de vehículo, y fue similar en aspecto a la del grupo de referencia. Se observaron expansiones arteriales en el grupo de células distintas de Muse y en el grupo de CMM, aunque los grados fueron menores que en el grupo de vehículo.

Ejemplo 5: medición del diámetro de aneurisma aórtico al microscopio

El diámetro de aneurisma aórtico se midió al microscopio estereoscópico (Leica MZ6) equipado con una cámara digital para microscopio (Leica MC120 HD). El diámetro de aneurisma se evaluó en base a la siguiente proporción:

(diámetro de aneurisma en la disección - diámetro de aneurisma antes de la preparación del modelo) / diámetro de aneurisma antes de la preparación del modelo.

Como se muestra en la FIG. 2, a las 3 semanas después de la preparación del modelo (fase temprana), tanto el grupo de 3 dosis como el grupo de dosis única del grupo de células Muse mostraron un diámetro de aneurisma significativamente más pequeño estadísticamente en comparación con el grupo de vehículo. Por otra parte, no hubo diferencias significativas entre el grupo de vehículo y los grupos de células distintas de Muse y CMM. De forma similar, incluso a las 8 semanas después de la preparación del modelo (fase remota), tanto el grupo de 3 dosis como el grupo de dosis única del grupo de células Muse mostraron un diámetro de aneurisma significativamente más pequeño estadísticamente en comparación con el grupo de vehículo, y no hubo diferencias significativas entre el grupo de vehículo y los grupos de células distintas de Muse y CMM. Estos resultados mostraron que la administración de tres o una única administración de células Muse disminuyó el diámetro de aneurisma.

Ejemplo 6: determinación ecográfica del diámetro de aneurisma en el transcurso del tiempo

Los días 3, 10, 17, 24, 31, 38, 45, 52 y 59 después de la administración de las células, se midió el diámetro de aneurisma en el transcurso del tiempo usando un dispositivo de formación de imágenes ecográfico para animales pequeños (SonoScape S6V). Como se muestra en la FIG. 3, desde el día 10, los grupos de tres dosis y de dosis única del grupo de células Muse tendieron a mostrar diámetros de aneurisma más pequeños, y los días 24 y 52 se observaron diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo de vehículo. Por otra parte, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de vehículo y los grupos de células distintas de Muse y CMM. Estos resultados mostraron que la administración de tres o una única administración de células Muse disminuyó el diámetro de aneurisma.

Ejemplo 7: evaluación histopatológica de la elasticidad aórtica

A las 3 u 8 semanas después de la preparación del modelo, las aortas se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4 %. Después de que se prepararon las secciones congeladas de las aortas, se sometieron a tinción de Masson de tejido elástico y a continuación se observaron. Como se muestra en la FIG. 4, a las 3 semanas después de la administración de las células, la estructura elástica ondulada del grupo de células Muse tendió a mantenerse en comparación con el grupo de distintas de Muse, el grupo de CMM y el grupo de vehículo. En la FIG. 5, para la cuantificación del área de la fibra elástica (elastina), se determinó la proporción del área de fibra elástica y el área total de sección transversal de la pared del vaso. A las 3 semanas después de la administración de las células, el área de fibra elástica disminuyó significativamente en el grupo de vehículo en comparación con el grupo de referencia. Tanto en el grupo de 3 dosis como en el grupo de dosis única del grupo de células Muse, las áreas de fibra elástica mantenidas fueron significativamente más grandes que las del grupo de vehículo. Por otra parte, no se observó dicho efecto en el grupo de células distintas de Muse y el grupo de CMM. Incluso a las 8 semanas después de la administración de las células, tanto en el grupo de 3 dosis como en el grupo de dosis única del grupo de células Muse, las áreas de fibra elástica mantenidas fueron significativamente más grandes que las del grupo de vehículo. Por otra parte, no se observó dicho efecto en el grupo de células distintas de Muse y el grupo de CMM. Estos resultados mostraron que la administración de las células Muse dio como resultado la retención de fibras elásticas en la aorta.

Ejemplo 8: diferenciación de células Muse en músculo liso vascular

Se evaluó la diferenciación de células Muse en músculo liso vascular usando preparaciones aórticas a las 3 u 8 semanas después de la administración de las células. Las aortas fijadas con PFA al 4 % se tiñeron inmunohistoquímicamente con anticuerpo anti-aSMA de ratón (Thermo, diluido en 1:200) y anticuerpo anti-PFV de conejo (Abcam, diluido en 1:500) como anticuerpos primarios; y a continuación, anticuerpo de burro anti-IgG de ratón (Life Technology, diluido en 1:500) y anticuerpo de burro anti-IgG de conejo (Life Technology, diluido en 1:500) como anticuerpos secundarios. Como se muestra en las imágenes en la FIG. 6 (parte superior), 3 semanas después de la administración de las células Muse, el citoplasma de las células musculares lisas vasculares que expresan aSMA se tiñó de rojo, mientras que el citoplasma de las células Muse que expresan PFV se tiñó de verde. Como se muestra en la imagen combinada, se observaron células teñidas tanto para aSMA como para PFV, lo que confirmó que las células Muse administradas se diferenciaron en músculo liso vascular. El gráfico de la FIG. 6 (parte inferior) muestra la cantidad de células doble positivas para aSMA/PFV por unidad de área en cada grupo. En el grupo de células Muse, se observaron células doble positivas con mayor frecuencia a las 3 y 8 semanas después de la administración de las células en el grupo de 3 dosis, y también se observaron en el grupo de dosis única. Por otro lado, solo se observaron unas pocas células doble positivas en el grupo de células distintas de Muse y en el grupo de CMM.

Ejemplo 9: diferenciación de células Muse en células endoteliales vasculares

La diferenciación de células Muse en células endoteliales vasculares se evaluó usando preparaciones aórticas a las 3 u 8 semanas después de la administración de las células. Las aortas fijadas con PFA al 4 % se tiñeron con anticuerpo de cabra anti-CD31 (Santa Cruz, diluido en 1:50) o anticuerpo de conejo anti-PFV (Abcam, diluido en 1:200) como anticuerpos primarios; y a continuación, anticuerpo de burro anti-IgG de cabra (Life Technology, diluido en 1:500) o anticuerpo de burro anti-IgG de conejo (Life Technology, diluido en 1:500) como anticuerpos secundarios. Como se muestra en las imágenes en la FIG. 7 (parte superior), 3 semanas después de la administración de las células Muse, el citoplasma de las células endoteliales vasculares que expresan CD31 se tiñó de rojo, mientras que el citoplasma de las células Muse que expresan PFV se tiñó de verde. Como se muestra en la imagen combinada, se observaron células teñidas tanto para CD31 como para PFV, lo que confirmó que las células Muse administradas se diferenciaron en células endoteliales vasculares. El gráfico de la FIG. 7 (parte inferior) muestra la cantidad de células doble positivas para CD31/PFV por unidad de área. En el grupo de células Muse, se observaron células doble positivas con mayor frecuencia a las 3 y 8 semanas después de la administración de las células en el grupo de 3 dosis, y también se observaron en el grupo de dosis única. Por otro lado, solo se observaron unas pocas células doble positivas en el grupo de células distintas de Muse y en el grupo de CMM.

Ejemplo 10: migración de macrófagos a la aorta

La detección de macrófagos se llevó a cabo usando preparaciones aórticas a las 3 u 8 semanas después de la administración de las células. Se usaron anticuerpo de rata anti-F4/80 (AbD, diluido en 1:100) como anticuerpo primario y anticuerpo de cabra anti-IgG de rata (Life Technology, diluido en 1:500) como anticuerpo secundario. Como se muestra en la FIG. 8, las células con citoplasma teñido de rojo se identificaron como macrófagos. Se detectaron más macrófagos en el grupo de vehículo tanto a las 3 como a las 8 semanas después de la administración de las células en comparación con el grupo de referencia. Se detectaron menos macrófagos en el grupo de 3 dosis para las células Muse a las 3 y 8 semanas después de la administración de las células, lo que sugiere que se suprimió la infiltración de células inflamatorias asociadas con la lesión vascular. Aunque no tanto como la disminución observada en el grupo de 3 dosis con células Muse, se observaron disminuciones en la cantidad de macrófagos en otros grupos de administración de las células.

Ejemplo 11: determinación de la división celular en células Muse

Se determinó si las células Muse injertadas en la aorta se estaban dividiendo usando preparaciones aórticas a las 3 u 8 semanas después de la administración de las células. Se usaron anticuerpo de conejo anti-Ki67 (Thermo, diluido en 1:100) y anticuerpo de cabra anti-PFV (Abcam, diluido en 1:1000) como anticuerpos primarios; anticuerpo de burro anti-IgG de conejo (Life Technology, diluido en 1:500) y anticuerpo de burro anti-IgG de cabra (Life Technology, diluido en 1:500) como anticuerpos secundarios. Como se muestra en la FIG.

9, puesto que los núcleos de las células en división se tiñeron de rojo, los núcleos de las células Muse en división se tiñeron de rojo y los citoplasmas de las mismas se tiñeron de verde. Aproximadamente un 8,5 % de las células Muse se dividieron a las 3 semanas después de la administración de las células, lo que indica que una parte de las células Muse injertadas en tejidos proliferaron por división celular. Sin embargo, a las 8 semanas después de la administración de las células, las células Muse que mostraron división celular disminuyeron hasta aproximadamente un 2,1 %, lo que indica que las células Muse injertadas cambian gradualmente a la diferenciación. Esto sugirió que las células Muse ejercieron sus efectos terapéuticos a través de la migración, la proliferación y la diferenciación en la fase temprana, y a continuación, finalizaron gradualmente la proliferación, actuando de este modo en el sitio lesionado sin volverse malignas.

Ejemplo 12: distribución de células Muse y células distintas de Muse

Se investigó la distribución de células Muse o células distintas de Muse a las 8 semanas después de la administración de las células por PCR ultrarrápida dirigida a la secuencia Alu específica para el ADN humano. Los resultados se muestran en la FIG. 10. También se encontraron células Muse en el pulmón, pero la mayoría de las células Muse se distribuyeron en el sitio del aneurisma aórtico (Abd Ao).

Ejemplo 13: análisis del potencial de diferenciación de las células Muse en diversas células vasculares y la tolerancia a la agresión de las células Muse

Se investigó el potencial de diferenciación de las células Muse humanas en diversas células vasculares y la tolerancia a la agresión de las células Muse por análisis de expresión de marcadores usando PCR cuantitativa. Como controles, se usaron células precursoras endoteliales (CPE) que se sabe que se diferencian en células endoteliales y células progenitoras CD34+ (incluyendo células madre hematopoyéticas y células progenitoras vasculares) que se sabe que se diferencian en células endoteliales y células musculares lisas vasculares. Las células Muse se cultivaron en presencia de suero derivado de un ratón inmunodeficiente combinado grave (IDCG) en el que se indujo un aneurisma (el día 3 posoperatorio).

Los resultados se muestran en la FIG. 11.

Entre los marcadores epiteliales, FOXC1 se expresó lo más altamente en las células Muse (cada p < 0,001 para células CPE y CD34+). Por otra parte, KLF2 se expresó lo más altamente en células CD34+ (p < 0,01 para CPE, p = 0,34 para Muse), y MEF2C también se expresó lo más altamente en células CD34+ (p < 0,01 para CPE, p < 0,001 para Muse). Las expresiones de KLF2 y MEF2C en las células Muse fueron moderadas.

Las expresiones de ELK1, MYH10 y CAMK25, marcadores para células musculares lisas vasculares desdiferenciadas, fueron las más altas en células Muse (cada p < 0,001 para células CPE y CD34+).

Las expresiones de HSPA8, PDIA3 y MDH1, factores implicados en la tolerancia a la agresión, fueron notablemente altas en las células Muse (cada p < 0,001 para las células CPE y CD34+).

Estos resultados mostraron que las células Muse tenían la capacidad de diferenciarse en células endoteliales y células musculares lisas vasculares y eran altamente tolerantes a la agresión.

Ejemplo 14: análisis cinético de células Muse en un modelo de aneurisma in vitro

Para determinar si las células Muse poseen potencial de diferenciación en un microentorno aneurismático, se cultivaron conjuntamente células Muse humanas y tejidos de aneurisma. Específicamente, en base al procedimiento descrito en J Vasc Surg. 2015;62:1054-1063, la aorta abdominal de un ratón inmunodeficiente (IDCG) se envolvió con una gasa sumergida en una solución de 0,5 mol/l de CaCb que contenía elastasa pancreática porcina (0,5 unidades/^l) y se incubó durante aproximadamente 20 minutos para preparar un modelo de aneurisma abdominal. Se extirpó el tejido de aneurisma, se cortó longitudinalmente y se extendió, se colocó en una placa de cultivo con el lado luminal de la arteria orientado hacia arriba, y a continuación se añadieron 10.000 células Muse PFV+. Como se muestra en la FIG. 12A, el día 7, las células Muse se localizaron solo en la túnica íntima que es la capa superficial de la pared del aneurisma, pero en las semanas 2 y 3 las células Muse invadieron el tejido arterial y también se encontraron en la túnica media y la capa interna de la túnica adventicia. En la inmunotinción del día 7, como se muestra en la FIG. 12B, se observaron células Muse (marcadas con PFV) presentes en la túnica íntima como células positivas para CD31 y CD34, marcadores de células endoteliales vasculares.

Ejemplo 15: análisis cinético de células Muse en un modelo in vivo

Para determinar si las células Muse migran y se unen a los tejidos de aneurisma, se administraron por vía intravenosa a ratones modelo de aneurisma 20.000 células Muse PFV+ y se disecaron los días 3 y 5 después de la administración. A continuación, se analizó la cinética de migración de las células Muse con un microscopio láser multifotónico.

A diferencia del experimento de cultivo conjunto in vitro del ejemplo 14 en el que las células Muse se adhirieron en primer lugar al lado luminal del aneurisma y gradualmente invadieron más profundamente las capas de túnica media y túnica adventicia, como se muestra en la FIG. 13A, el día 3, se detectaron células Muse PFV+ solo en la túnica adventicia del sistema vascular, de las que algunas se acumularon alrededor de los vasos vasculares en la túnica adventicia (flecha). El día 5, las células Muse PFV+ permanecieron en la túnica adventicia, proliferando hacia la túnica media y la túnica íntima. Estos resultados sugirieron que, a diferencia del modelo in vitro, las células Muse que se administraron por vía intravenosa invadieron los tejidos de aneurisma, no desde el lado luminal del vaso, sino por medio de los vasos vasculares en la túnica adventicia, y a continuación migraron hacia la túnica media y la túnica íntima (FIG. 13B).

Disponibilidad industrial

El producto celular de la presente invención puede reconstruir y reparar tejidos en sitios lesionados, así como recuperar sus funciones cuando se administra a pacientes con trastornos vasculares y, por tanto, se puede aplicar para la prevención y tratamiento de aneurismas.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un producto celular para su uso en la prevención y/o tratamiento de un aneurisma, que comprende una célula madre pluripotente positiva para SSEA-3 derivada de un tejido mesenquimatoso en un cuerpo vivo o una célula madre pluripotente positiva para SSEA-3 derivada de una célula mesenquimatosa cultivada.

2. El producto celular para su uso de la reivindicación 1, en el que la célula madre pluripotente muestra expresión negativa para CD117, CD146, NG2, CD34, vWF y CD271.

3. El producto celular para su uso de la reivindicación 1 o 2, en el que el aneurisma es un aneurisma aórtico.

4. El producto celular para su uso de la reivindicación 3, en el que el aneurisma aórtico es un aneurisma aórtico abdominal o un aneurisma aórtico torácico.

5. El producto celular para su uso de la reivindicación 1 o 2, en el que el aneurisma es un aneurisma visceral, un aneurisma de arteria periférica, un aneurisma cerebral o un aneurisma de arteria coronaria.

6. El producto celular para su uso de la reivindicación 1 o 2, en el que el aneurisma es un aneurisma fusiforme o un aneurisma sacular.

7. El producto celular para su uso de la reivindicación 1 o 2, en el que el aneurisma es un aneurisma verdadero, un aneurisma disecante o un aneurisma falso.

8. El producto celular para su uso de la reivindicación 1 o 2, en el que el aneurisma es un aneurisma arterioesclerótico, un aneurisma inflamatorio o un aneurisma infectado.

9. El producto celular para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha célula madre pluripotente tiene todas las características siguientes:

(i) que tiene actividad telomerasa baja o nula;

(ii) que puede diferenciarse en cualquiera de las células tridérmicas;

(iii) que no muestra proliferación neoplásica; y

(iv) que tiene capacidades de autorrenovación.