KR20210099014A - 말초 혈류 장애의 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체의 중간엽 조직 또는 배양 중간엽 세포에 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포(Muse 세포)를 포함하는, 말초 혈류 장애를 치료하기 위한 세포 제제에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 말초 혈류 장애는 바람직하게는 말초 동맥 질환이고, 보다 바람직하게는 사지의 만성 동맥폐색증이다.

Description

말초 혈류 장애의 치료제

본 발명은 재생 의료에 있어서의 세포 제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 말초 동맥 질환 등의 말초 혈류 장애의 혈관 재생 요법에 유효한 다능성 줄기세포를 함유하는 세포 제제에 관한 것이다.

65세 이상의 고령자 인구의 비율은 예측을 크게 웃도는 스피드로 증가하고 있다.

반면, 식생활의 서구화나 자동차 사회를 중심으로 한 생활 양식의 변화에 따라, 메타볼릭 신드롬 등의 새로운 생활습관병의 개념이 생겨나고, 사회의 질병 구조가 크게 변화되고 있다. 특히 동맥경화성 질환이 늘어나고, 허혈성 심질환의 증가와 함께 말초 동맥 질환(PAD:peripheral arterial disease)이 증가하고 있다.

PAD는 주로 사지의 만성 동맥폐색증을 의미하고, 폐색성 동맥경화증(ASO:arteriosclerosis obliterans), 폐색성 혈전혈관염(TAO:thromboangiitis obliterans, 이른바 버거씨병), 슬와 동맥 포착 증후군 등이 포함된다.

PAD는 허혈성 하지라는 발의 증상으로서 나타난다. 그러나, 단순한 발의 질병이 아니라, 가령화나 당뇨병을 배경으로 한 동맥 경화에 의해 말초 혈관의 폐색이 일어나고, 허혈성 하지로서 나타난 것이다. 이 때문에 PAD는 동일한 동맥경화성 질환인 허혈성 심질환이나 뇌질환을 수반하는 경우가 많다. 예후는 매우 나쁘고, 사망율은 악성 종양보다도 높다고 일컬어지고 있다. 조기 발견에 의해 적절한 치료를 수행하는 것이 중요하다.

현재 PAD 치료 방침은 하지의 순환 장애에 대한 대응, 전신의 주요 장기(뇌, 심장, 신장)에 대한 대응, 동맥 경화의 리스크 팩터(흡연, 당뇨병, 고지혈증, 고혈압, 비만, 운동부족, 스트레스 등)에 대한 대응 등이고, 치료 방법으로는 크게 내과적 치료와 외과적 치료로 분류된다.

PAD의 내과적 치료로는, 운동 요법, 온열 요법 등의 이학 요법이나, 실로스타졸, 베라프로스트 나트륨, 염산 사포그릴레이트, 염산 티클로피딘, 이코사펜트산 에틸, 알프로스타딜, 알프로스타딜 알파덱스, 아르가트로반, 바트룩소빈, 펜톡시필린 등의 항혈소판약, 항혈전약 및 혈관확장약 등을 비롯한 약물 요법이 행해지고 있다.

또, PAD의 외과적 치료로는, 벌룬 확장술, 스텐트 유치술, 아세렉토미 등의 혈관내 치료나, 혈전 내막 적제술, 바이패스술, 교감 신경 절제술 등의 외과적 수술이 행해지고 있다.

그러나, 하지의 괴사가 중증인 경우에는 상기 내과적 치료나 외과적 치료를 수행해도 효과가 얻어지지 못하는 경우도 많고, 이러한 경우에는 구명을 목적으로 하여 하지 절단이 되는 환자가 여전히 늘어나고 있다.

따라서, 폐색성 동맥경화증(ASO:arteriosclerosis obliterans), 폐색성 혈전혈관염(TAO:thromboangiitis obliterans, 이른바 버거씨병), 슬와 동맥 포착 증후군 등을 포함하는 PAD에 있어서, 혈관의 재생, 그것에 의거한 하지 허혈 개선 효과 등을 가능하게 하는 새로운 치료 방법이 기대되고 있다.

최근, 상기 PAD의 치료에 있어서도, 재생 의료에 의한 연구가 이루어지고 있다.

그 하나로서, 성인의 골수 및 말초혈 단핵구 중에 혈관 내피 세포로 분화될 수 있는 혈관 내피 전구 세포가 존재하는 것이 보고되었고, 골수 유래 단핵 세포 이식은 하지 허혈 동물 모델에 있어서, 혈관 신생이나 측부 혈행로의 발달에 따라 하지 혈류량 증가 작용을 발휘하는 것이 확인되었다.(비특허문헌 1)

그러나, 골수 단핵구 이식에 의한 치료는 다량의 골수액 채취를 필요로 하고 침습이 크며, 또한, 신선 분리 세포 때문에 골수 세포 중의 줄기 세포 및 전구 세포량에 개인차가 있고 임상 효과에 큰 차이가 난다는 것이 밝혀지고 있다.

또, 중간엽 줄기 세포를 이용한 당해 재생 의료 연구로서, 래트 하지 허혈 모델, 마우스 하지 허혈 모델, 토끼 하지 허혈 모델을 이용하여 중간엽 세포를 이식함으로써 혈관 재생 촉진 효과, 하지 허혈의 개선 효과가 보고되고 있다.(비특허문헌 2, 비특허문헌 3, 비특허문헌 4)

그러나, 이식 세포의 혈관에의 장기 생착이나 혈관 구성 세포로의 분화가 보이지 않는 등, 재생 의료의 효과로서 충분한 것이라고는 할 수 없다.

한편, 본 발명자들 중 한 사람인 이데자와의 연구에 의해, 중간엽 세포 획분에 존재하고, 유전자 도입이나 사이토카인 등에 의한 유도 조작 없이 얻어지는, SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3)을 표면 항원으로서 발현하고 있는 다능성 줄기 세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells;Muse 세포)가 중간엽 세포 획분이 갖는 다능성을 담당하고 있으며, 조직 재생을 지향한 질환 치료에 응용할 수 있는 가능성이 있다는 것을 알게 되었다(예를 들면, 특허문헌 1; 비특허문헌 5 내지 7). 그러나, 말초 동맥 질환의 치료에 Muse 세포를 사용하고, 기대되는 치료 효과가 얻어지는 것을 밝힌 예는 없다.

특허문헌 1: 일본 특허 제5185443호 명세서 특허문헌 2: 국제공개 제WO2011/007900호 팸플릿

비특허문헌 1: Hou X et al. Mol Biol Rep 37:1467-1475(2010) 비특허문헌 2: Liu J., Hao H., Xia L., et al. Hypoxia pretreatment of bone marrow mesenchymal stem cells facilitates angiogenesis by improving the function of endothelial cells in diabetic rats with lower ischemia. PLoS ONE. 2015; 10(5) 비특허문헌 3: Xie N., Li Z., Adesanya T. M., et al. Transplantation of placenta-derived mesenchymal stem cells enhances angiogenesis after ischemic limb injury in mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2016; 20(1): 29-37 비특허문헌 4:Cunping Yin, Yuan Liang, Jian Zhang, Guangping Ruan, Zian Li, Rongqing Pang, and Xinghua Pan, Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells Relieve Hindlimb Ischemia through Enhancing Angiogenesis in Tree Shrews. Stem Cells International, Volume 2016(2016), Article ID 9742034, 9 pages 비특허문헌 5: Kuroda Y et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2010: 107: 8639-8643. 비특허문헌 6: Wakao S et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2011: 108: 9875-9880. 비특허문헌 7: Kuroda Y et al. Nat Protc, 2013:8:1391-1415. 비특허문헌 8: Kondo K et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.2009; 29: 61-66.

본 발명은 말초 동맥 질환을 포함하는 말초 혈류 장애의 치료를 위한 세포 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 마우스 하지 허혈 모델에 있어서, 인간 Muse 세포를 혈관 등으로부터 투여, 또는 대상의 말초 동맥 부위 및 그 주변에 직접 투여함으로써, Muse 세포가 상해된 말초 동맥 부위에 집적·생착하여 장애를 발생시키는 말초 동맥 부위의 혈관을 재생하고, 말초 동맥 부위의 혈관 장애의 개선 또는 회복을 초래하는 것을 발견하였고, 그에 따라서, Muse 세포가 말초 동맥 질환을 포함하는 말초 혈류 장애의 치료에 바람직하게 사용할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은 이하와 같다.

[1]생체의 중간엽 조직 또는 배양 중간엽 세포에 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포를 포함하는, 말초 혈류 장애를 치료하기 위한 세포 제제.

[2]말초 혈류 장애는 말초 동맥 질환인, [1]에 기재된 세포 제제.

[3]말초 동맥 질환은 사지의 만성 동맥폐색증인, [2]에 기재된 세포 제제.

[4]말초 동맥 질환은 폐색성 동맥경화증인, [2] 또는 [3]에 기재된 세포 제제.

[5]말초 동맥 질환은 폐색성 혈전혈관염(버거씨병)인, [2] 또는 [3]에 기재된 세포 제제.

[6]말초 동맥 질환은 슬와 동맥 포착 증후군인, [2] 또는 [3]에 기재된 세포 제제.

[7]상기 다능성 줄기 세포는 이하의 성질 모두를 갖는 다능성 줄기 세포인, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 세포 제제

(i)텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없다;

(ii)삼배엽 중 어느 하나의 배엽의 세포로 분화되는 능력을 갖는다;

(iii)종양성 증식을 나타내지 않는다; 및

(iv)셀프 리뉴얼 능력을 갖는다.

[8]상기 다능성 줄기 세포는 이하의 성질 모두를 갖는 다능성 줄기 세포인, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 세포 제제:

(i)SSEA-3 양성;

(ii)CD105 양성;

(iii)텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없다;

(iv)삼배엽 중 어느 하나의 배엽으로 분화되는 능력을 갖는다;

(V)종양성 증식을 나타내지 않는다; 및

(vi)셀프 리뉴얼 능력을 갖는다.

[8]생체의 중간엽 조직 또는 배양 중간엽 세포에 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포의, 말초 혈류 장애를 치료하기 위한 세포 제제의 제조를 위한 사용.

[9]상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 세포 제제의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 말초 혈류 장애의 치료 방법.

[10]상기 세포 제제는 정맥 내에 투여되는, [9]의 말초 혈류 장애의 치료 방법.

[11]상기 세포 제제는 복수회 투여되는, [9] 또는 [10]의 말초 혈류 장애의 치료 방법.

본 발명에서는, 말초 동맥 질환 등의 말초 혈류 장애를 앓고 있는 대상에 대하여, Muse 세포를 혈관 등으로부터 투여 또는 대상의 말초 혈관 부위 및 그 주변에 직접 투여함으로써, Muse 세포가 장애를 받은 말초 혈관 부위에 집적·생착하여 장애를 발생시키는 말초 혈관 부위의 혈관을 재생하고, 말초 혈관 부위의 혈류 장애를 개선 또는 회복시킬 수 있다.

Muse 세포는 장애를 받은 말초 혈관 부위에 효율적으로 유주(遊走)하여 생착할 수 있고, 생착된 부위에서 혈관을 구성하고, 이식에 앞서 치료 대상 세포로의 분화 유도가 불필요하다. 또, 비종양 형성성이고 안전성도 우수하다. 게다가, Muse 세포는 면역 거절을 받지 않기 때문에, 도너로부터 제조된 타가 제제에 의한 치료도 가능하다. 따라서, 상기에 나타낸 우수한 성능을 갖는 Muse 세포에 의해, 말초 동맥 질환 등의 말초 혈류 장애를 앓는 환자의 치료에 용이하게 실행 가능한 수단을 제공할 수 있다.

중간엽 줄기 세포나 자가 골수 세포에서는, 정맥 투여로 세포가 장애 부위에 도달하는 것이 어렵거나, 또는 도달한다고 하더라도 그 효율이 매우 낮기 때문에, 근육 주사로 투여되는 것이 일반적이지만, 근육 주사는 연속 치료가 곤란하다는 문제가 있다. 이에 비하여, Muse 세포 등은 정맥 투여만으로 장애 부위에 선택적으로 도달·집적하는 것이 가능하고, 또 정맥 투여이기 때문에 복수회 투여도 가능하다. 이러한 것으로부터 복수회의 치료를 수행함으로써, 중간엽 줄기 세포나 자가 골수 세포보다도 우수한 치료 효과가 얻어질 가능성이 시사된다.

도 1은 하지 허혈 모델 마우스(누드 마우스)에 각 세포를 투여한 경우의 혈류 레이저 도플러 측정에 의한 결과를 나타낸 그래프이다. 세로축은 허혈성 하지/비허혈성 하지의 혈류비를 나타낸다. 도면에서, Ve: Vehicle, BM: bone marrow, nMuse: non Muse 세포, Muse: Muse 세포를 나타낸다.
도 2는 각 세포를 투여 후, 6일째의 혈관 신생 인자인 혈관 신생 관련 유전자의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 각 세포를 투여 후, 28일째의 허혈 골격근내 혈관 밀도를 측정한 결과를 나타낸 사진이다. 좌측이 Muse 세포 투여, 우측이 Vehicle을 나타낸다.
도 4는 Muse 세포, 비Muse 세포, BMMNC(골수 단핵 세포) 또는 PBS를 근육 또는 정맥에 주사한 BALBc 마우스 허혈 뒷다리에 있어서의 혈류의 레이저 도플러 분석의 결과를 나타낸 도이다. A는 허혈성 하지/비허혈성 하지의 혈류비의 경시 변화를 나타내고(**P < 0.01 PBS vs. Muse i.v., ##P < 0.01 non Muse i.v. vs. Muse i.v.), B는 수술 후 7일, C는 수술 후 14일의 혈류비를 나타낸다(**군간의 유의차(P 0.01)). 한편, 결과는 평균 ± SEM(n = 5)으로 나타내고, B, C에 있어서의 도트는 각 마우스에 대응한다.
도 5는 PBS 또는 Muse 세포 투여 14일 후의 허혈성 내전근의 조직 절편을 항CD31 항체 및 DAPI로 염색한 결과를 나타낸 도(현미경 사진)이다. 스케일 바 50 μm.

본 발명은 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포(Muse 세포)를 포함하는, 말초 혈류 장애를 치료하기 위한 세포 제제에 관한 것이다. 본 발명을 이하에 상세히 설명한다.

1. 적용 질환

본 발명의 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포(Muse 세포)를 포함하는 세포 제제는 말초 동맥 질환의 치료에 사용된다.

본 발명에 있어서, "말초 혈류 장애"란 말초 혈관의 장애나 교감 신경의 장애 등에 의해 말초의 혈류가 저하됨으로써 일어나는 장애를 의미한다.

말초 혈관의 장애로는, 말초 동맥 질환(PAD:peripheral arterial disease) 및 말초 정맥 질환을 들 수 있다.

"말초 동맥 질환"에는 기질적 말초 동맥 질환 및 기능적 말초 동맥 질환이 포함되고, 기질적 말초 동맥 질환으로는, 폐색성 동맥경화증(ASO:arteriosclerosis obliterans), 폐색성 혈전혈관염(TAO:thromboangiitis obliterans, 이른바 버거씨병), 급성 동맥폐색증(급성 동맥폐전증, 급성 동맥혈전증을 포함한다), 대동맥염 증후군, 베체트병, 슬와 동맥 포착 증후군, 슬와 동맥 외막 낭종, 잔류 좌골 동맥 등을 들 수 있고, 기능적 말초 동맥 질환으로는, 레이노병 등을 들 수 있다.

"말초 동맥 질환"으로는, 사지의 만성 동맥폐색증에 해당하는 질환이 바람직하고, 상기의 질환 중에서 폐색성 동맥경화증, 폐색성 혈전혈관염 및 슬와 동맥 포착 증후군이 바람직하다.

레이노병으로는, 1차성 레이노 증후군 및 2차성 레이노 증후군을 포함하고, 그 원인은 특별히 한정되지 않고, 교원병에 의한 것, 외상에 의한 것, 진동에 의한 것, 흉곽 출구 증후군에 의한 것, 만성 폐색성 동맥 질환에 의한 것, 혈액 질환에 의한 것, 신경 질환에 의한 것 등이 예시된다.

"말초 정맥 질환"으로는, 정맥 혈전증(심부 정맥 혈전증 등), 만성 정맥 부전, 하지정맥류, 정맥류성 습진, 정맥류성 궤양 등을 들 수 있다.

교감 신경의 장애로는, 교감 신경의 반사 이상을 들 수 있고, 반사성 교감 신경성 위축증, 카우살기아, 환지통, 중추성 동통 등의 말초 혈류 장애를 일으킬 수 있는 교감 신경의 장애가 포함된다.

2. 세포 제제

(1)다능성 줄기 세포(Muse 세포)

본 발명의 세포 제제에 사용되는 다능성 줄기 세포는 본 발명자들 중 한 사람인 이데자와가, 인간 생체 내에 그 존재를 찾아내고, "Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring) 세포"라고 명명한 세포이다. Muse 세포는 골수액, 지방 조직(Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013(Epub) (published on Jan 17, 2014))이나 피부의 진피 결합 조직 등으로부터 얻을 수 있을 뿐 아니라, 널리 조직이나 장기의 결합 조직에 존재하는 것이 알려져 있다. 또, 이 세포는 다능성 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포의 양쪽 성질을 갖는 세포이고, 예를 들면, 세포 표면 마커인 "SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)" 양성 세포, 바람직하게는 SSEA-3 양성 및 CD105 양성의 2중 양성 세포로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함한 세포 집단은 예를 들면, SSEA-3 단독 또는 SSEA-3 및 CD105의 발현을 지표로 하여 생체 조직으로부터 분리할 수 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법 및 특징 등의 상세는 특허 문헌 2(국제공개 제WO2011/007900호)에 개시되어 있다. 또, Muse 세포가 여러 가지 외적 스트레스에 대한 내성이 높다는 것을 이용하여, 단백질 분해 효소 처리나, 저산소 조건, 저인산 조건, 저혈청 농도, 저영양 조건, 열쇼크에 노출, 유해 물질 존재 하, 활성 산소 존재 하, 기계적 자극 하, 압력 처리 하 등 각종 외적 스트레스 조건 하에서의 배양에 의해 Muse 세포를 선택적으로 농축할 수 있다. 한편, 본 명세서에서는, 말초 동맥 질환을 치료하기 위한 세포 제제로서, SSEA-3을 지표로 하여 이용하고, 생체의 중간엽 조직 또는 배양 중간엽 조직으로부터 조제된 다능성 줄기 세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 간단히 "SSEA-3 양성 세포"라고 기재하는 경우가 있다. 또, 본 명세서에서는, "비Muse 세포"란 생체의 중간엽 조직 또는 배양 중간엽 세포에 포함되는 세포이고, "SSEA-3 양성 세포" 이외의 세포를 가리키는 경우가 있다.

Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 세포 표면 마커인 SSEA-3 또는 SSEA-3 및 CD105을 지표로 하여 생체 조직(예를 들면, 중간엽 조직)으로부터 조제할 수 있다. 여기서, "생체"란 포유 동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는 수정란이나 포배기보다 발생 단계가 앞인 배(胚)는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생 단계의 배(胚)는 포함된다. 포유 동물에는, 한정되지 않지만, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 모르모트 등의 설치류, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페렛 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는 생체의 조직으로부터 직접 마커를 가지고 분리되는 점에서, 배성 줄기 세포(ES 세포)나 iPS 세포와 명확히 구별된다. 또, "중간엽 조직"이란 골, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 건(腱), 치수(齒髓), 제대, 제대혈, 양막 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예를 들면, Muse 세포는 골수나 피부, 지방 조직, 혈액, 치수(齒髓), 제대, 제대혈, 양막 등으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 생체의 중간엽 조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 조제하고, 이용하는 것이 바람직하다. 또, 상기 조제 수단을 이용하여, 섬유아세포나 골수 중간엽 줄기 세포 등의 배양 중간엽 세포로부터 Muse 세포를 조제해도 무방하다.

또, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 생체의 중간엽 조직 또는 배양 중간엽 세포에 외적 스트레스 자극을 줌으로써, 상기 외적 스트레스에 내성 세포를 선택적으로 증식시켜서 그 존재 비율을 높인 세포를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해서도 조제할 수 있다.

상기 외적 스트레스는 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건 하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열쇼크에 노출 하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결 처리, 유해 물질 존재 하에서의 배양, 활성 산소 존재 하에서의 배양, 기계적 자극 하에서의 배양, 진탕 처리 하에서의 배양, 압력 처리 하에서의 배양 또는 물리적 충격 중 어느 하나 또는 복수의 조합이어도 무방하다.

상기 프로테아제에 의한 처리 시간은 세포에 외적 스트레스를 주기 위하여 합계 0.5 내지 36시간 수행하는 것이 바람직하다. 또, 프로테아제 농도는 배양 용기에 접착된 세포를 벗겨낼 때, 세포덩어리를 단일 세포로 분리할 때, 또는 조직으로부터 단일 세포를 회수할 때에 이용되는 농도라면 무방하다.

상기 프로테아제는 세린 프로테아제, 아스파라긴산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 금속 프로테아제, 글루타민산 프로테아제 또는 N 말단 트레오닌 프로테아제인 것이 바람직하다. 게다가, 상기 프로테아제는 트립신, 콜라게나제 또는 디스파제인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 세포 제제에 있어서는, 사용되는 Muse 세포는 세포 이식을 받는 레시피언트에 대하여 자가이어도 무방하고, 또는 타가이어도 무방하다.

상기한 바와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단은 예를 들면, SSEA-3 양성 또는 SSEA-3 및 CD105의 이중 양성을 지표로 하여 생체 조직으로부터 조제할 수 있는데, 인간 성인 피부에는 여러 가지 타입의 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 그러나, Muse 세포는 이들 세포와 동일하지 않다. 이와 같은 줄기 세포 및 전구 세포에는, 피부 유래 전구 세포(SKP), 신경제 줄기 세포(NCSC), 멜라노블라스트(MB), 혈관 주위 세포(PC), 내피 전구 세포(EP), 지방 유래 줄기 세포(ADSC)를 들 수 있다. 이들 세포에 고유한 마커의 "비발현"을 지표로 하여, Muse 세포를 조제할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는 CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c-kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF 인자(폰빌레브란드 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커) 및 Dct(MB의 마커)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 11개의 마커 중에서 적어도 1개, 예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 하여 조제할 수 있고, 게다가, CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 하여 조제할 수 있고, 게다가, 상기의 11개의 마커의 비발현을 지표로 하여 조제할 수 있다.

또, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 상기 특징을 갖는 Muse 세포는 이하:

(i)텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없다;

(ii)삼배엽 중 어느 하나의 배엽의 세포로 분화되는 능력을 갖는다;

(iii)종양성 증식을 나타내지 않는다; 및

(iv)셀프 리뉴얼 능력을 갖는다

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 성질을 가져도 무방하다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는 상기 성질을 모두 갖는다.

여기서, 상기 (i)에 대하여, "텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없다"란 예를 들면, TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore사)를 이용하여 텔로머레이스 활성을 검출한 경우에, 낮거나 또는 검출할 수 없다는 것을 말한다. 텔로머레이스 활성이 "낮다"란 예를 들면, 체세포인 인간 섬유아세포와 동일 정도의 텔로머레이스 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela 세포에 비하여 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머레이스 활성을 갖고 있는 것을 말한다.

상기 (ii)에 대하여, Muse 세포는 in vitro 및 in vivo에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계 및 외배엽계)으로 분화되는 능력을 가지며, 예를 들면, in vitro에서 유도 배양함으로써, 간세포(간아세포 또는 간세포 마커를 발현하는 세포를 포함함), 신경 세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 골세포, 지방 세포 등으로 분화될 수 있다. 또, in vivo에서 정소에 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화되는 능력을 나타내는 경우가 있다. 게다가, 정맥주사에 의해 생체에 이식함으로써 상해를 입은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)에 유주 및 생착하여 조직에 따른 세포로 분화되는 능력을 갖는다.

상기 (iii)에 대하여, Muse 세포는 증식 속도 약 1.3일로 증식하지만, 부유 배양에서는 하나의 세포로부터 증식하고, 배양체 유사 세포덩어리를 만들어 일정한 크기가 되면 14일간 정도에서 증식이 멈춘다는 성질을 갖는데, 이 배양체 유사 세포덩어리를 접착 배양으로 이행하면, 다시 세포 증식이 개시되고, 세포덩어리로부터 증식한 세포가 약 1.3일의 증식 속도로 펴져 간다. 다시 정소에 이식한 경우, 적어도 반년간은 암화되지 않는 성질을 갖는다.

또, 상기 (iv)에 대하여, Muse 세포는 셀프 리뉴얼(자기 복제) 능력을 갖는다. 여기서, "셀프 리뉴얼"이란 1개의 Muse 세포로부터 부유 배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체 유사 세포덩어리에 포함되는 세포로부터 삼배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있음과 동시에, 배양체 유사 세포덩어리의 세포를 다시 하나의 세포로 부유 배양에 가져 감으로써, 다음 세대의 배양체 유사 세포덩어리를 형성시키고, 그로부터 다시 삼배엽성의 분화와 부유 배양에서의 배양체 유사 세포덩어리를 확인할 수 있다는 것을 말한다. 셀프 리뉴얼은 1회 또는 복수회의 사이클을 반복해도 무방하다.

(2)세포 제제의 조제 및 사용

본 발명의 세포 제제는 한정되지 않지만, 상기 (1)에서 얻어진 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포 집단을 생리식염수나 적절한 완충액(예를 들면, 인산 완충 생리식염수)에 현탁시킴으로써 얻어진다. 이 경우, 자가 또는 타가의 조직으로부터 분리한 Muse 세포수가 적은 경우에는 세포 이식 전에 세포를 배양하여, 소정의 세포수가 얻어질 때까지 증식시켜도 무방하다. 한편, 이미 보고되고 있는 바와 같이(국제공개 제WO2011/007900호 팸플릿), Muse 세포는 종양화되지 않기 때문에, 생체 조직으로부터 회수한 세포가 미분화인 채로 포함되어 있더라도 암화의 염려가 낮아서 안전하다. 또, 회수한 Muse 세포의 배양은 특별히 한정되지 않지만, 통상의 증식 배지(예를 들면, 10% 송아지 혈청을 포함하는 α-최소 필수 배지(α-MEM) 등)에서 수행할 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 국제공개 제WO2011/007900호 팸플릿을 참조하여, Muse 세포의 배양 및 증식에 있어서, 적절히 배지, 첨가물(예를 들면, 항생 물질, 혈청) 등을 선택하고, 소정 농도의 Muse 세포를 포함하는 용액을 조제할 수 있다. 인간 대상에 본 발명의 세포 제제를 투여할 경우에는 인간의 장골로부터 골수액을 채취하고, 예를 들면, 골수액으로부터의 접착 세포로서 골수 중간엽 줄기 세포를 배양하여 유효한 치료량의 Muse 세포가 얻어지는 세포량에 이를 때까지 늘린 후, Muse 세포를 SSEA-3의 항원 마커를 지표로 하여 분리하고, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포 제제로서 조제할 수 있다. 또는 예를 들면, 골수액으로부터 얻어진 골수 중간엽 줄기 세포를 외적 스트레스 조건 하에서 배양하여 유효한 치료량에 이를 때까지 Muse 세포를 증식, 농축한 후, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포 제제로서 조제할 수 있다.

또, Muse 세포의 세포 제제에의 사용에 있어서는, 상기 세포를 보호하기 위하여 디메틸술폭시드(DMSO)나 혈청 알부민 등을, 세균의 혼입 및 증식을 막기 위하여 항생 물질 등을 세포 제제에 함유시켜도 무방하다. 게다가, 제제상 허용되는 다른 성분(예를 들면, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)을 세포 제제에 함유시켜도 무방하다. 당업자는 이들 인자 및 약제를 적절한 농도로 세포 제제에 첨가할 수 있다. 이와 같이, Muse 세포는 각종 첨가물을 포함하는 의약 조성물로서 사용하는 것도 가능하다.

상기에서 조제되는 세포 제제 중에 함유하는 Muse 세포수는 말초 혈류 장애의 치료에 있어서 원하는 효과가 얻어지도록, 대상의 성별, 연령, 체중, 환부 상태, 사용하는 세포 상태 등을 고려하여 적절히 조정할 수 있다. 한편, 대상으로 하는 개체는 인간 등의 포유 동물을 포함하지만 이것에 한정되지 않는다. 또, 본 발명의 세포 제제는 원하는 치료 효과가 얻어질 때까지, 복수회(예를 들면, 2 내지 10회), 적절히 간격(예를 들면, 1일에 2회, 1일에 1회, 1주일에 2회, 1주일에 1회, 2주일에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 6개월에 1회)을 두고 투여되어도 무방하다. 따라서, 대상의 상태에도 따르지만, 치료상 유효량으로는, 예를 들면, 하나의 개체 당 1회에 대하여 1 × 10³ 세포 내지 1 × 10¹⁰ 세포로 1 내지 10회의 투여량이 바람직하다. 하나의 개체에 있어서의 투여 총량으로는, 한정되지 않지만, 1 × 10³ 세포 내지 1 × 10¹¹ 세포, 바람직하게는 1 × 10⁴ 세포 내지 1 × 10¹⁰ 세포, 더욱 바람직하게는 1 × 10⁵ 세포 내지 1 × 10⁹ 세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포 제제에 사용되는 Muse 세포는 상해를 입은 말초 혈관 부위에 유주(遊走)하고, 생착하는 성질을 갖는다. 따라서, 세포 제제의 투여 부위나 투여 형태는 특별히 한정되지 않고, 말초 혈류 장애 부위 또는 그 근방에 주사 등의 방법에 의해 국소 투여되어도 무방하고, 혈관 내에 주사 등의 방법에 의해 투여해도 무방하다. 투여되는 혈관의 종류(정맥 및 동맥)는 특별히 한정되지 않고, 질환에 따라서 적절히 선택되는데, 정맥내 주사가 바람직하고, 정맥내 주사를 복수회 수행함으로써, 치료 효과를 장기간 지속 가능하기 때문에 보다 바람직하다.

본 발명의 세포 제제는 말초 혈류 장애를 앓는 환자의 장애가 발생한 말초 혈관 부위의 혈관을 재생할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

[실시예]

실시예 1: 하지 허혈 모델 마우스의 제작

본 실시예에 있어서의 마우스를 이용한 실험 프로토콜은 "교토 부립의대 동물 실험 등에 관한 규정"을 준수하고, 실험 동물은 교토 부립의대 동물 실험 센터의 감독 하에서 당해 규정에 따라서 제작되었다. 보다 구체적으로는, 이하의 순서에 따라 제작하였다.

8 내지 10주령의 암컷 BALB/C 누드 마우스를 이소플루란의 흡입에 의해 마취(유도 시: 4%, 유지 시: 2%)하였다. 하지를 절개하고, 실체 현미경(KONAN OPERATION MICROSCOPE KOM) 하에서, 좌총 대퇴동정맥 및 좌천 대퇴동정맥 말초를 5-0 견사로 결찰하였다. 이와 같이 하여 제작된 마우스를 하지 허혈 모델 마우스로 하여 이하의 실험에 사용하였다.

실시예 2: 인간 Muse 세포의 조제

인간 Muse 세포의 분리 및 동정에 관한 국제공개 제WO2011/007900호에 기재된 방법에 준하여, Muse 세포를 얻었다. Muse 세포의 소스로는, 시판의 중간엽 줄기 세포(MSC, Lonza사)를 이용하였다. 이식에 사용되는 Muse 세포는 장애를 받은 말초 동맥 부위에 생착한 것을 확인하기 위하여, 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하고, 세포가 이에 따라 표지(標識)되도록, 미리 렌치 바이러스-GFP 유전자를 Muse 세포에 도입하였다. GFP로 표지된 Muse 세포를 GFP 및 SSEA-3의 이중 양성 세포로서 FACS에 의해 분리하였다. 또, MSC로부터 Muse 세포를 분리한 나머지 세포를 비Muse 세포로서 사용하였다. 또, GFP 양성 MSC도 FACS에 의해 단리하고, MSC군으로서 사용하였다.

실시예 3: 하지 허혈 모델 마우스에 대한 각 세포의 투여

실시예 1에서 제작한 하지 허혈 모델 마우스를 4군으로 나누고, 모델 제작 후 1일째에, 각 군의 마우스에 Muse 세포(3 × 10⁴ 개, 100 μL)(Muse), 비Muse 세포(3 × 10⁴ 개, 100 μL)(nMuse), MSC(2 × 10⁵ 개, 100 μL)(BM) 또는 Vehicle(인산 완충액)(Ve)을 좌대퇴부 2부위에 나누어서 투여하였다. 1군의 동물수는 5 마리로 하였다.

실시예 4: 레이저 도플러에 의한 경시적 하지 혈류 평가

하지 허혈 모델 마우스 제작 후, 0, 3, 7, 10 및 14일에, 2차원 레이저 혈류 화상 장치[laser doppler perfusion image(LDPI) analyzer(OMEGAZONE OZ-1, OMEGAWAVE, Inc. Tokyo, Japan)를 이용하여 혈류를 측정하였다. 각 개체의 좌우 양쪽의 하지 혈류를 측정하고, 좌측(환부측)/우측(건측)의 비를 산출하고, 이것을 LDPI 인덱스로 하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, Muse 세포군에서는 14일 이후에도 혈류 개선이 계속되고, 허혈한 좌하지는 건강한 우하지와 동일 정도까지 혈류가 개선되었다. 한편, 비Muse 세포군(nMuse), MSC군(BM) 및 Vehicle군(Ve)에서는 10일까지는 일정한 혈류 개선을 나타내지만, 14일 이후는 개선이 보이지 않았다.

실시예 5: 혈관 신생 인자인 혈관 신생 관련 유전자의 발현량의 측정

세포 투여 후 6일째의 좌측(환부측)의 하지 골격근의 mRNA를 추출하여, 혈관 신생 관련 유전자로서 대표적인 VEGF 및 bFGF(특히 FGF-2)의 발현량을 real-time RT-PCR의 절대 정량법으로 측정하였다. 측정 방법은 비특허문헌 8에 의거하여 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. Muse 세포군은 Vehicle군과 비교하여 이들 혈관 신생 인자인 혈관 신생 관련 유전자(mRNA) 발현량이 유의하게 높았다.

실시예 6: 허혈 골격근내 혈관 밀도의 측정

세포 투여 후 28일의 좌측(환부측)의 하지 골격근의 조직을 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde: PFA)에 의해 고정하고, 파라핀 절편을 작성한 후, 항Isolectin GS-IB4 항체, Alexa Fluor 568 Conjugate(Thermo Fisher Scientific사, 300배 희석으로 사용)을 이용하여 허혈 하지 골격근에 있어서의 혈관 내피 세포의 면역 조직 화학 염색을 수행하고, 골격근 섬유 당 혈관 내피 세포의 비율을 혈관 밀도로서 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다. Muse 세포군(도 3 좌측)에서는, Vehicle군(도 3 우측)과 비교하여 이들 허혈 골격근 내의 혈관 밀도가 높은 것을 알 수 있다.

실시예 7: 야생형 마우스를 이용한 하지 허혈 모델에 있어서의 평가

야생형 BALBc 마우스(수컷 12주령)를 이용하여, 실시예 1과 마찬가지로 하여, 하지 허혈 모델 마우스를 제작하였다. 제작한 하지 허혈 모델 마우스를 군으로 나누고, 모델 제작 후 1일째에 각 군의 마우스에, Muse 세포(3 × 10⁴ 개, 200 μL)(Muse), 비Muse 세포(3 × 10⁴ 개, 200 μL)(non Muse), 또는 골수 단핵 세포(2 ×10⁵ 개, 200 μL)(BMMNC)를 꼬리정맥내(i.v.) 또는 근육내(i.m.)에 주사하였다. 대조로서, PBS를 꼬리정맥에 주사하였다. 1군의 동물수는 5 마리로 하였다.

수술 전, 수술 후, 수술 후 1일째, 3일째, 7일째, 14일째에, 각각의 군에 있어서, 혈류를 실시예 4와 마찬가지로 레이저 도플러 혈류 분석기에 의해 평가하고, 허혈 뒷다리와 비허혈 뒷다리에서 혈류량을 측정하고, 그 비를 산출하였다. 결과를 도 4의 A에 나타낸다. 또, 7일째 및 14일째의 결과를 도 4의 B 및 C에 나타낸다.

그 결과, 야생형 마우스에 있어서도, 인간 Muse 세포는 근육주사, 정맥주사 그 어느 것에 있어서나 하지의 허혈을 개선시키는 것을 알 수 있었다. 인간 Muse 세포 정맥주사는 Muse 세포 근육주사 및 마우스 자가 골수 단핵구 근육주사와 실질적으로 동등한 효과가 있다는 것은 Muse 세포는 정맥부터 환부에 도달하여 생착되고, 허혈 개선 효과를 발휘한다는 것을 나타내고 있다.

다음으로, 대조군 또는 Muse 세포 정맥주사군의 마우스의 허혈성 내전근을 수술 후 14일째에 채취하고, 조직 해석을 수행하였다. 채취된 허혈성 내전근을 4% PFA 중에서 1시간 고정하고, 30% 자당 용액 속에서 밤새 인큐베이트하였다. 이어서, 조직을 최적 절단 온도(OCT) 화합물(Sakura Finetek)에 포매하고, 액체 질소 중에서 급속 동결하고, 클리오스탓 상에서 절단하였다. 조직 절편을 1:5,000의 희석으로 토끼 항CD31(ab182981; Abcam)과 밤새 인큐베이트하였다. 염소 항토끼 Alexa594(Abcam)를 2차 항체로서 이용하였다. DAPI(써모피셔 사이언티픽)를 갖는 Prolong GOLD Antifade에서 마운트한 후, BZ X800 광학 현미경(Keyence)을 이용하여 화상화를 수행하였다. 결과를 도 5에 나타낸다. Muse 투여군에서는 내피 세포 마커인 CD31의 발현이 유의하게 항진되고 있으며, Muse 세포는 허혈 뒷다리의 혈관 신생을 촉진하여 허혈 상태를 개선하는 것이 시사되었다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명의 세포 제제는 말초 동맥 질환 등의 말초 혈류 장애를 앓는 환자에게 투여함으로써, 장애를 받은 말초 혈관 부위에 집적·생착하여, 장애를 발생시키는 말초 혈관 부위의 혈관을 재생하고, 말초 혈관 부위의 혈류 장애를 개선 또는 회복시킬 수 있다.

Claims (8)

1. 생체의 중간엽 조직 또는 배양 중간엽 세포에 유래하는 SSEA-3 양성의 다능성 줄기 세포를 포함하는, 말초 혈류 장애를 치료하기 위한 세포 제제.
2. 제1항에 있어서,
   말초 혈류 장애는 말초 동맥 질환인, 세포 제제.
3. 제2항에 있어서,
   말초 동맥 질환은 사지의 만성 동맥폐색증인, 세포 제제.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
   말초 동맥 질환은 폐색성 동맥경화증인, 세포 제제.
5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
   말초 동맥 질환은 폐색성 혈전혈관염(버거씨병)인, 세포 제제.
6. 제2항 또는 제3항에 있어서,
   말초 동맥 질환은 슬와 동맥 포착 증후군인, 세포 제제.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 다능성 줄기 세포는 이하의 성질 모두를 갖는 다능성 줄기 세포인, 세포 제제:
   (i)텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없다;
   (ii)삼배엽 중 어느 하나의 배엽의 세포로 분화되는 능력을 갖는다;
   (iii)종양성 증식을 나타내지 않는다; 및
   (iv)셀프 리뉴얼 능력을 갖는다.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 다능성 줄기 세포는 이하의 성질 모두를 갖는 다능성 줄기 세포인, 세포 제제:
   (i)SSEA-3 양성;
   (ii)CD105 양성;
   (iii)텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없다;
   (iv)삼배엽 중 어느 하나의 배엽으로 분화되는 능력을 갖는다;
   (V)종양성 증식을 나타내지 않는다; 및
   (vi)셀프 리뉴얼 능력을 갖는다.

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