KR102464099B1 - 다능성 간세포에 의한 허혈재관류 폐장애의 경감 및 치료 - Google Patents
다능성 간세포에 의한 허혈재관류 폐장애의 경감 및 치료 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 재생의료에 있어서, 다능성 간세포(Muse 세포)를 이용한 새로운 의료용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포으로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는, 허혈재관류폐장애를 경감 및 치료하기 위한 세포제제 및 의약조성물을 제공한다. 본 발명의 세포제제는, 상기 질환을 가지는 대상에 대하여, Muse 세포를 투여함으로써, 폐조직에 생착시켜서, 상기 질환을 경감 및 치료하는 구성에 근거하는 것이다.
Description
본 발명은, 재생의료에 있어서의 세포제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 다능성 간세포(幹細胞)를 함유하는 허혈재관류 폐장애의 치료에 유효한 세포제제 및 신규 치료방법에 관한 것이다.
대체로, 조직허혈은, 조직 내의 산소의 결핍, 및 염증유발성 사이토카인, 특히 TNF-α, 그리고 IL-1β, IL-6 및 IL-10의 유도에 기인하여, 세포기능장애 및 괴사를 초래할 가능성이 있는 몇 가지 화학적 사상(事象)을 불러온다. 혈류가 회복하면(재관류), 대부분이 프리라디칼(free radical) 형성에 의하여 발생되며, 재관류 부위에서 활성화되는 호중구에 의하여도 초래된다고 생각되는 추가적인 장애를 발생시키는 또 다른 일련의 사상이 일어난다. 대부분의 경우, 재관류 장애는, 특히 허혈이 단기간 일어나는 경우, 허혈장애보다 위독하다.
폐에 있어서의 허혈재관류 장애는, 혈류가 중단되고, 이어서 회복될 때에 언제든지 일어날 가능성이 있다. 허혈재관류 폐장애가 일어나는 시기로는, 예를 들어 장기이식 후, 심장수술시의 인공심폐 사용 후, 혈관형성 또는 혈류차단을 수반하는 폐암 등의 흉부외과수술 후, 폐혈전폐색증의 혈전용해 후 또는 혈전적출 후 등의 혈류재개시를 들 수 있다. 현재, 허혈재관류 장애의 치료에서는, 부신피질 스테로이드나 프로스타사이클린의 투여, 일산화질소(NO2)의 흡입, 폐보존액의 개량 등이 이루어지고 있지만, 허혈재관류 폐장애는 폐이식의 15~30% 정도로 발생하고 있어, 폐이식 후의 급성기의 거절반응 및 그에 따르는 사망에 관여하고 있다(비특허문헌 1 및 2).
최근, 재생의료분야에 있어서, 간세포를 이용한 세포요법이 다양한 질환에 대하여 연구되고, 임상으로의 응용도 행하여지고 있다. 예를 들어, 골수간엽계세포획분(MSC)은, 성체로부터 단리되어, 뼈, 연골, 지방세포, 신경세포, 골격근 등으로 분화하는 능력을 가지는 것이 알려져 있다(비특허문헌 3 및 4). 하지만, MSC는 다양한 세포를 포함하는 세포군으로, 그 분화능의 실체를 알 수 없으며, 치료효과에 편차가 크다. 또한, 성체 유래의 다능성 간세포로서 iPS 세포(특허문헌 1)가 보고되어 있는데, iPS 세포의 수립에는, 간엽계세포인 피부섬유아세포획분에 특정 유전자나 특정 화합물을 체세포에 도입한다는 매우 복잡한 조작을 필요로 하는 것과 더불어, iPS세포가 높은 종양형성능력을 가지는 것으로부터, 임상응용으로의 매우 높은 장애물이 존재하고 있다.
본 발명자들 중 한 사람인 데자와의 연구에 의하여, 간엽계세포획분에 존재하고, 유도조작 없이 얻어지는 SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3)을 표면항원으로서 발현하고 있는 다능성 간세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells; Muse 세포)가 간엽계세포획분이 가지는 다능성을 담당하고 있어, 조직재생을 목표로 한 질환치료에 응용할 수 있을 가능성이 있다는 것이 명확해졌다. 또한, Muse 세포는, 간엽계세포획분을 다양한 스트레스로 자극함으로써 농축할 수 있다는 것도 알 수 있었다(특허문헌 2; 비특허문헌 5). 하지만, 허혈재관류 폐장애의 경감 및/또는 치료에 Muse 세포를 사용하여, 기대되는 치료효과가 얻어지는 것을 명확하게 한 예는 없다.
비특허문헌 1: Fiser, S.M., et al., J.Heart Lung Transplant., 20, p.631-636(2001)
비특허문헌 2: Meyers, B.F., et al., J.Thorac.Cardiovasc.Surg., 120, p.20-26(2000)
비특허문헌 3: Dezawa, M., et al., J.Clin.Invest., Vol.113, p.1701-1710(2004)
비특허문헌 4: Dezawa, M., et al., Science, Vol.309, p.314-317(2005)
비특허문헌 5: Wakao, S, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.108, p.9875-9880(2011)
본 발명은, 재생의료에 있어서, 다능성 간세포(Muse 세포)를 이용한 새로운 의료용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, Muse 세포를 포함하는 허혈재관류 폐장애의 치료에 유효한 세포제제 및 의약조성물, 그리고 신규 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 허혈재관류 폐장애 모델 래트를 제작하고, 폐동맥주사에 의하여 Muse 세포를 투여함으로써, 허혈재관류 폐장애가 경감되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르었다.
즉, 본 발명은, 이하와 같다.
[1] 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는, 허혈재관류 폐장애를 경감 및/또는 치료하기 위한 세포제제.
[2] 상기 [1]에 있어서, 외부 스트레스 자극에 의하여 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분을 포함하는 세포제제.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD105 양성인 세포제제.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 세포제제.
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성 및 CD271 음성인 세포제제.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성 및 Dct 음성인 세포제제.
[7] 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 이하의 성질을 모두 가지는 다능성 간세포인 세포제제:
(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐.
[8] 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 있어서, 허혈재관류 폐장애가 폐이식 후, 심장수술시의 인공심폐 사용 후, 혈관형성 또는 혈류차단을 수반하는 폐암 등의 흉부외과수술 후, 및/또는 폐혈전폐색증의 혈전용해 후 또는 혈전적출 후의 혈류재개시에 발생하는 폐장애인 세포제제.
[9] 상기 [1]~[8] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 폐조직에 생착하는 능력을 가지는 세포제제.
본 발명은, 허혈재관류 폐장애를 앓고 있는 대상에 대하여, Muse 세포를 투여함으로써, 폐조직의 질환부위에 선택적으로 집적시켜서, 그 조직 내에서 Muse 세포가 사이토카인이나 조직보호인자 등을 지속적을 분비하여, 정상적인 폐조직을 구축시킬 수 있다.
도 1은, 허렬재관류 폐장애 래트 모델에 있어서의 Muse 세포를 이용한 폐의 기능적 평가(P/F비)의 결과를 나타낸다.
도 2는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델에 있어서의 Muse 세포를 이용한 폐의 기능적 평가(A-aDO2)의 결과를 나타낸다.
도 3은, 허혈재관류 폐장애 래트 모델에 있어서의 Muse 세포를 이용한 폐의 기능적 평가(좌폐 컴플라이언스)의 결과를 나타낸다.
도 4는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델에 있어서의 Muse 세포를 이용한 폐의 조직학적 평가(헤마톡실린·에오신 염색 후의 병리학적 평가)의 결과를 나타낸다.
도 5는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델에 있어서의 Muse 세포를 이용한 폐의 조직학적 평가(TUNEL 양성 세포수)의 결과를 나타낸다.
도 6은, 허혈재관류 폐장애 래트 모델의 폐조직편에 있어서의 golgi 양성 세포수의 측정결과를 나타낸다.
도 7a는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델의 폐조직 내의 각종 사이토카인의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 7b는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델의 폐조직 내의 각종 사이토카인의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 8은, 허혈재관류 폐장애 래트 모델의 폐조직의 동결절편을 이용하여 평가한 폐포상피 증식능의 측정결과를 나타낸다.
도 2는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델에 있어서의 Muse 세포를 이용한 폐의 기능적 평가(A-aDO2)의 결과를 나타낸다.
도 3은, 허혈재관류 폐장애 래트 모델에 있어서의 Muse 세포를 이용한 폐의 기능적 평가(좌폐 컴플라이언스)의 결과를 나타낸다.
도 4는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델에 있어서의 Muse 세포를 이용한 폐의 조직학적 평가(헤마톡실린·에오신 염색 후의 병리학적 평가)의 결과를 나타낸다.
도 5는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델에 있어서의 Muse 세포를 이용한 폐의 조직학적 평가(TUNEL 양성 세포수)의 결과를 나타낸다.
도 6은, 허혈재관류 폐장애 래트 모델의 폐조직편에 있어서의 golgi 양성 세포수의 측정결과를 나타낸다.
도 7a는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델의 폐조직 내의 각종 사이토카인의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 7b는, 허혈재관류 폐장애 래트 모델의 폐조직 내의 각종 사이토카인의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 8은, 허혈재관류 폐장애 래트 모델의 폐조직의 동결절편을 이용하여 평가한 폐포상피 증식능의 측정결과를 나타낸다.
본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는 허혈재관류 폐장애를 경감 및/또는 치료하기 위한 세포제제 및 의약조성물, 그리고 신규 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 이하에 상세하게 설명한다.
1. 적용질환과 그 진단
본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는 세포제제 또는 의약조성물을 이용하여, 허혈재관류 폐장애의 경감 및 치료를 목표로 한다. '허혈재관류 폐장애'란, 폐이식 후의 이식폐기능 부전의 주된 원인으로 되며, 폐이식 후 3개월 이후에 일어나는 만성거절반응에도 관여하고 있는, 허혈재관류 후에 폐에 있어서 발생하는 허혈재관류 장애이다.
대체로, '허혈재관류 장애'란, 허혈상태에 있는 장기나 조직에 허혈재관류가 일어났을 때, 그 장기나 조직 내의 미소순환에 있어서 다양한 독성물질의 생성이 야기되어 일어나는 장애를 말한다. McCord에 의하여 보고된 허혈·재관류 이론이 최초이다(N.Engl.J.Med., 312, 159-163(1985)). 허혈의 시간과 정도, 장기의 종류 등에 의하여 장애의 정도는 다르다. 불완전 허혈인 쪽이 장애가 강한 경우도 있다. 재관류에 의하여 혈관내피세포 상처, 미소순화장애를 초래하여, 장기장애로 진전된다고 생각되고 있다. 장애를 일으키는 기서로서, 슈퍼옥사이드(O2-)나 하이드록실라디칼(HO·) 등의 활성산소나 일산화질소(NO) 등의 프리라디칼 생성에 따른 장애, 각종 사이토카인, 엔도셀린, 아라키돈산 등의 각종 케미컬메디에이터 생성에 따른 장애, 활성화 호중구와 혈관내피세포의 상호작용에 근거하는 장애 등의 기서가 생각되고 있다. 국소뿐만 아니라 2차적으로 전신의 주요장기에 장애를 초래한다(원격장기장애). 특히, 뇌, 폐, 간, 신장 등이 표적장기가 되며, 다장기부전을 초래한다. 심근경색, 뇌경색, 장간막혈관폐색증 등에 대한 재관류요법 후나 장기이식 후에 보이는 경우가 많다.
본 발명의 세포제제 또는 의약조성물에 따른 적용질환은, 폐에 있어서의 허혈재관류 장애로서, 한정되지 않지만, 폐이식 후, 심장수술시의 인공심폐 사용 후, 혈관형성 또는 혈류차단을 수반하는 폐암 등의 흉부외과수술 후, 폐혈전폐색증의 혈전용해 후 또는 혈전적출 후 등의 혈류재개시에 발생하는 폐장애를 들 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 적용질환을 치료하기 위하여, 후술하는 세포제제 및 의약조성물을 대상으로 투여(이하, 총칭하여 '이식'으로 기술하는 경우가 있음)하고, 적용질환의 경감 및/또는 치료를 가능하게 한다. 여기에서, '경감'이란, 허혈재관류 폐장애에 수반하는 각종 증상의 완화 및 진행의 억제를 의미하고, 바람직하게는 일상생활에 지장이 없을 정도로까지 증상을 완화하는 것을 의미한다. 또한, '치료'란, 허혈재관류 폐장애에 수반되는 각종 증상을 억제하는 것 또는 완전히 소실시키는 것을 말한다.
2. 세포제제 및 의약조성물
(1) 다능성 간세포
본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 다능성 간세포는, 전형적으로는, 본 발명자들 중 한 사람인 데자와가 인간 생체 내에 그 존재를 발견하고, 'Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring)세포'라고 명명한 세포이다. Muse 세포는, 골수액, 지방조직(Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013(published on Jan 17, 2014))이나 진피결합조직 등의 피부조직으로부터 얻을 수 있고, 각 장기의 결합조직에도 산재한다. 또한, 이러한 세포는, 다능성 간세포와 간엽계 간세포의 양쪽의 성질을 가지는 세포이고, 예를 들어 각각의 세포표면마커인 'SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)'과 'CD105'의 더블양성으로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 이들의 항원마커를 지표로서 생체조직으로부터 분리할 수 있다. 또한, Muse 세포는 스트레스 내성으로, 간엽계조직 또는 배양간엽계 세포로부터 다양한 스트레스 자극에 의하여 농축할 수 있다. 본 발명의 세포제제에는, 스트레스 자극에 의하여 Muse 세포가 농축된 세포획분을 이용할 수도 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법, 및 특징 등의 상세는, 국제공개공보 WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또한, Wakao 등(2011, 상술)에 의하여 보고되어 있는 바와 같이, 골수, 피부 등으로부터 간엽계세포를 배양하고, 그것을 Muse 세포의 모집단으로서 이용하는 경우, SSEA-3 양성 세포의 모두가 CD105 양성세포인 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서의 세포제제 및 의약조성물에 있어서, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계간세포로부터 Muse 세포를 분리하는 경우는, 단순히 SSEA-3을 항원마커로서 Muse 세포를 정제하여, 사용할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서는, 허혈재관류 폐장애를 경감 및/또는 치료하기 위한 세포제제 및 의약조성물에 있어서 사용될 수 있는 SSEA-3을 항원마커로서, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 다능성 간세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 단순히 'SSEA-3 양성세포'로 기재하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, '비Muse 세포'란, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계 세포에 포함되는 세포로서, 'SSEA-3 양성세포' 이외의 세포를 가리킨다.
간단하게는, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 세포표면마커인 SSEA-3에 대한 항체를 단독으로 이용하고, 또는 SSEA-3 및 CD105에 대한 각각의 항체를 모두 이용하며, 생체조직(예를 들어, 간엽계조직)으로부터 분리할 수 있다. 여기에서, '생체'란, 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는, 수정란이나 포배기보다 발생단계가 앞인 배아는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생단계의 배아는 포함된다. 포유동물에는, 한정되지 않지만, 사람, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트 등의 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페렛 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는, 생체의 조직으로부터 직접 마커를 이용하여 분리되는 점에서, 배성간세포(ES 세포)나 iPS 세포로 명확하게 구별된다. 또한, '간엽계조직'이란, 뼈, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄, 치수, 제대, 제대혈 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예를 들어, Muse 세포는, 골수나 피부, 지방조직으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 생체의 간엽계조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 분리하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 분리수단을 이용하여, 섬유아세포나 골수간엽계 간세포 등의 배양간엽계 세포로부터 Muse 세포를 분리하여도 좋다. 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 있어서는, 사용되는 Muse 세포는, 리시피엔트에 대하여 자가여도 좋고, 또는 타가여도 좋다.
상기와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 SSEA-3 양성, 및 SSEA-3과 CD105의 이중양성을 지표로 하여 생체조직으로부터 분리할 수 있는데, 사람 성인 피부에는, 다양한 타입의 간세포 및 전구세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 하지만, Muse 세포는, 이들 세포와 같지 않다. 이와 같은 간세포 및 전구세포에는 피부유래 전구세포(SKP), 신경제간세포(NCSC), 멜라노블라스트(MB), 혈관주위세포(PC), 내피전구세포(EP), 지방유래간세포(ADSC)를 들 수 있다. 이러한 세포에 고유 마커의 '비발현'을 지표로 하여, Muse 세포를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는, CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c-kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF인자(폰빌레브란트 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커), 및 Dct(MB의 마커)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 11개의 마커 중 적어도 1개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 분리할 수 있으며, 더욱이 CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 더욱이 상기 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는, 이하:
(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐
으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성질을 가져도 좋다. 본 발명의 일 국면은, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는, 상기 성질을 모두 갖는다. 여기에서, 상기 (i)에 대하여, '텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음'이란, 예를 들어 TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore사)를 이용하여 텔로머레이스 활성을 검출한 경우에, 낮거나 또는 검출할 수 없는 것을 말한다. 텔로머레이스 활성이 '낮다'란, 예를 들어 체세포인 인간섬유아세포와 같은 정도의 텔로머레이스 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela세포에 비하여 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머레이스 활성을 가지고 있는 것을 말한다. 상기 (ii)에 대하여, Muse 세포는, in vitro 및 in vivo에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계, 및 외배엽계)으로 분화하는 능력을 가지고, 예를 들어 in vitro에서 유도배양함으로써, 간세포, 신경세포, 골격근세포, 평활근세포, 골세포, 지방세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, in vivo에서 정소로 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화하는 능력을 나타내는 경우가 있다. 더욱이, 정맥주사에 의하여 생체에 이식함으로써 손상을 받은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)에 유주(遊走) 및 생착하여, 조직에 따른 세포로 분화하는 능력을 가진다. 상기 (iii)에 대하여, Muse 세포는, 부유배양에서는 증식속도 약 1.3일로 증식하는데, 부유배양에서는 1세포로부터 증식하고, 배양체양세포 덩어리를 만들어 14일간 정도에서 증식이 멈춘다,라고 하는 성질을 가지는데, 이들 배양체양세포 덩어리를 접착배양으로 가지고 가면, 다시 세포증식이 개시되어, 세포 덩어리로부터 증식한 세포가 확산되어 간다. 더욱이, 정소로 이식한 경우, 적어도 반년 동안은 암화하지 않는다는 성질을 가진다. 또한, 상기 (iv)에 대하여, Muse 세포는, 셀프리뉴얼(자기복제)능을 가진다. 여기에서, '셀프리뉴얼'이란, 1개의 Muse 세포로부터 부유배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체양세포 덩어리에 포함되는 세포로부터 3배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있는 동시에, 배양체양세포 덩어리의 세포를 다시 1세포로 부유배양으로 가지고 감으로써, 다음 세대의 배양체양세포 덩어리를 형성시키고, 거기에서 다시 3배엽성의 분화와 부유배양에서의 배양체양세포 덩어리를 확인할 수 있는 것을 말한다. 셀프리뉴얼은 1회 또는 복수회의 사이클을 반복하면 좋다.
또한, 본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포를 포함하는 세포획분은, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계세포에 외적 스트레스 자극을 주고, 그 외적 스트레스에 내성인 세포를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의하여 얻어지는 이하의 성질의 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 가지는 SSEA-3 양성 및 CD105 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분이어도 좋다.
(i) SSEA-3 양성;
(ii) CD105 양성;
(iii) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(iv) 삼배엽으로 분화하는 능력을 가짐;
(v) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(vi) 셀프리뉴얼능을 가짐.
상기 외적 스트레스는, 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건 하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열쇼크로의 폭로 하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결처리, 유해물질 존재 하에서의 배양, 활성산소 존재 하에서의 배양, 기계적 자극 하에서의 배양, 진동처리 하에서의 배양, 압력처리 하에서의 배양 또는 물리적 충격 중 어느 것 또는 복수의 조합이어도 좋다. 예를 들어, 상기 프로테아제에 의한 처리시간은, 세포에 외적 스트레스를 주기 위하여 합계 0.5~36시간 행하는 것이 바람직하다. 또한, 프로테아제 농도는, 배양용기에 접착한 세포를 벗길 때, 세포 덩어리를 단일세포로 각각으로 할 때, 또는 조직으로부터 단일세포를 회수할 때에 이용되는 농도라면 좋다. 프로테아제는, 세린프로테아제, 아스파라긴산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 금속 프로테아제, 글루타민산 프로테아제 또는 N말단 트레오닌 프로테아제인 것이 바람직하다. 더욱이, 상기 프로테아제가 트리프신, 콜라게나아제 또는 디스파아제인 것이 바람직하다.
그리고, 본 발명의 세포제제에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는, 혈관내 투여 등에 의하여 생체에 투여 후, 허혈재관류 폐장애가 있는 폐조직에 생착하고, 그 후에 Muse 세포는, 항염증 작용이나 조직보호 작용을 발휘하는 동시에, 그 조직을 구성하는 세포로 분화하여, 허혈재관류 폐장애를 경감 및/또는 치료하는 것으로 생각된다.
(2) 세포제제 및 의약조성물의 조제 및 사용
본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 한정되지 않지만, 상기 (1)에서 얻어진 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 생리식염수나 적절한 완충액(예를 들어, 인산완충생리식염수)에 현탁시킴으로써 얻어진다. 이 경우, 자가 또는 타가의 조직으로부터 분리한 Muse 세포수가 적은 경우에는, 투여 전에 세포를 배양하고, 소정의 세포농도가 얻어질 때까지 증식시켜도 좋다. 한편, 이미 보고되어 있는 바와 같이(국제공개공보 WO2011/007900호 팸플릿), Muse 세포는, 종양화하지 않으므로, 생체조직으로부터 회수한 세포가 미분화인 상태로 포함되어 있어도 암화의 가능성이 낮아 안전하다. 또한, 회수한 Muse 세포의 배양은, 특별히 한정되지 않지만, 통상의 증식배지(예를 들어, 10% 송아지 혈청을 포함하는 α-최소필수배지(α-MEM))에 있어서 행할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 국제공개공보 WO2011/007900호를 참조하여, Muse 세포의 배양 및 증식에 있어서, 적절히 배지, 첨가물(예를 들어, 항생물질, 혈청) 등을 선택하고, 소정 농도의 Muse 세포를 포함하는 용액을 조제할 수 있다. 인간 대상으로 본 발명의 세포제제 또는 의약조성물을 투여하는 경우에는, 인간의 장골로부터 수 mL 정도의 골수액을 채취하고, 예를 들어 골수액으로부터의 접착세포로서 골수간엽계 간세포를 배양하여 유효한 치료량의 Muse 세포를 분리할 수 있는 세포량에 도달할 때까지 증가시킨 후, Muse 세포를 SSEA-3의 항원마커를 지표로서 분리하여서, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포제제로서 조제할 수 있다. 또는, 예를 들어 Muse 세포를 SSEA-3의 항원마커를 지표로서 분리한 후, 유효한 치료량에 도달할 때까지 세포를 배양하여 증가시킨 후, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포제제로서 조제할 수 있다.
또한, Muse 세포의 세포제제 및 의약조성물로의 사용에 있어서는, 그 세포를 보호하기 위하여 디메틸술폭시드(DMSO)나 혈청알부민 등을, 세균의 혼입 및 증식을 방지하기 위하여 항생물질 등을 세포제제 및 의약조성물에 함유시켜도 좋다. 더욱이, 제제 상 허용되는 다른 성분(예를 들어, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)이나 간엽계 간세포에 포함되는 Muse 세포 이외의 세포 또는 성분을 세포제제 및 의약조성물에 함유시켜도 좋다. 당업자는 이들 인자 및 약제를 적절한 농도로 세포제제 및 의약조성물에 첨가할 수 있다.
상기에서 조제되는 세포제제 및 의약조성물 내에 함유하는 Muse 세포수는, 허혈재관류 폐장애의 경감 및/또는 치료에 있어서 원하는 효과(예를 들어, P/F비, A-aDO2, 폐컴플라이언스, 호흡지수의 정상화)가 얻어지도록, 대상의 성별, 연령, 체중, 환부의 상태, 사용하는 세포의 상태 등을 고려하여, 적절히 조정할 수 있다. 후술하는 실시예 3~8에 있어서, 허혈재관류 폐장애 모델 래트를 이용하여, Muse 세포 이식에 따른 각종 효과를 검토하였는데, 체중 약 290~340g의 모델 래트에 대하여는, SSEA-3 양성 세포를 1×105세포/PBS 200μl(1개체당)로 투여하는 것에 의하여, 매우 뛰어난 효과가 얻어졌다. 이러한 결과로부터 포유동물(인간 포함)의 1개체당 약 1×105세포/kg~약 1×106세포/kg(예를 들어, 3×105세포/kg)을 체중환산한 세포량을 투여함으로써 뛰어난 효과가 얻어지는 것이 기대된다. 한편으로, 혈관으로의 세포투여에 따른 폐색을 방지하기 위하여, 1회 투여분량으로서, 예를 들어 SSEA-3 양성 세포를 1×108세포/개체 이하, 바람직하게는 5×107세포/개체 이하, 보다 바람직하게는 1.8×107세포/개체 이하로 세포제제에 함유시키면 좋다. 여기에서 개체는 래트, 인간을 포함하는데 이것으로 한정되지 않는다. 그리고, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 원하는 치료효과가 얻어질때까지 복수회(예를 들어, 2~10회), 적절히 간격(예를 들어, 1일 2회, 1일 1회, 1주 2회, 1주 1회, 2주 1회)을 두고 투여되어도 좋다. 따라서, 대상의 상태에도 따르지만, 치료상 유효량으로서는, 예를 들어 1개체당 약 1×104세포~약 1×108세포로 1~10회 투여량이 바람직하다. 1개체에 있어서의 투여총량으로서는, 한정되지 않지만, 1×104세포~1×109세포, 1×104세포~5×108세포, 1×104세포~1×108세포, 1×104세포~5×107세포, 1×104세포~1×107세포, 1×104세포~5×106세포, 1×104세포~1×106세포, 1×104세포~5×105세포, 1×104세포~1×105세포, 1×105세포~1×109세포, 1×105세포~5×108세포, 1×105세포~1×108세포, 1×105세포~5×107세포, 1×105세포~1×107세포, 1×105세포~5×106세포, 1×105세포~1×106세포, 1×106세포~1×109세포, 1×106세포~5×108세포, 1×106세포~1×108세포, 1×106세포~5×107세포, 1×106세포~1×107세포, 1×107세포~1×109세포, 1×107세포~5×108세포, 1×107세포~1×108세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 허혈재관류 폐장애, 예를 들어 장기이식 후, 심장수술시의 인공심폐 사용 후, 혈관형성 또는 혈류차단을 수반하는 폐암 등의 흉부외과수술 후, 폐혈전폐색증의 혈전용해 후 또는 혈전적출 후 등의 혈류재개시에 발생하는 폐장애를 경감 및 치료대상으로 하는데, 투여기간으로는, 허혈재관류 후에 호흡기내과적인 소견, 흉부초음파 화상진단이나 MRI 등에 의하여 허혈재관류 폐장애로 진단된 후로, 진단 직후에서 수개월 이내여도 좋다. 예를 들어, 그 세포제제 등은, 상처를 입은 직후에 투여되는 것이 바람직한데, 상처를 입은 후의 늦은 시기, 예를 들어 상처를 입고 나서 1시간 후, 1일 후, 1주일 후, 1개월 후, 3개월 후, 6개월 후여도 본 발명의 세포제제 등의 효과를 기대할 수 있다. 또한, 사용되는 Muse 세포는, 타가 유래의 경우라도 면역응답을 야기하지 않는 것이 본 발명자들의 실험으로 확인되어 있으므로, 허혈재관류 폐장애의 경감 및 치료에 있어서 원하는 효과가 얻어질 때까지 적절히 투여하면 된다.
3. 허혈재관류 폐장애 모델 래트의 제작
본 명세서에 있어서는, 본 발명의 세포제제에 의한 허혈재관류 폐장애의 경감 및 치료 효과를 검토하기 위하여 허혈재관류 폐장애 모델 래트를 제작하여 사용할 수 있다. 그 모델로서 사용되는 래트에는, 한정되지 않지만, 일반적으로 Spraugue Dawley(SD)계 래트, Wistar/ST계 래트를 들 수 있다. 허혈재관류 폐장애 모델 래트를 제작하는 방법은 공지이며, 예를 들어 Manning, E. 등(Hum. Gene Ther., 21, p.713-727(2010))의 방법에 따라서 허혈재관류 폐장애 모델 래트를 제작할 수 있다. 또한, 상기 방법에 의하여 제작된 모델 래트가, 허혈재관류 폐장애를 가지는지 아닌지를 후술하는 폐기능의 평가에 의하여 확인할 수 있다.
본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는, 질환부위에 집적하는 성질을 가진다. 따라서, 세포제제 또는 의약조성물의 투여에 있어서, 그들의 투여부위(예를 들어, 복강내, 근내, 질환부위), 투여되는 혈관의 종류(정맥 및 동맥) 등은 한정되지 않는다. 또한, 투여되는 Muse 세포가 질환부위에 도달하여, 생착한 것을 확인하는 방법으로는, 예를 들어 미리 형광단백질(예를 들어, 녹색형광단백질(GFP))을 발현하도록 유전자 도입된 Muse 세포를 제작하고, 생체에 투여 후, 형광을 검출할 수 있는 시스템에 의하여 관찰하고, Muse 세포의 동태를 확인할 수 있다. 한편, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는 인간 유래이므로, 래트와는 이종(異種)의 관계에 있다. 모델 동물에 있어서 이종의 세포 등이 투여되는 실험에서는, 이종세포의 생체 내에서 거절반응을 억제하기 위하여, 이종세포의 투여 전 또는 동시에 면역억제제(시클로스포린 등)가 투여되어도 좋다.
4. 허혈재관류 폐장애 모델 래트에 있어서의 Muse 세포에 의한 경감 및 치료효과
본 발명의 실시형태에서는, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 인간을 포함하는 포유동물에 있어서의 허혈재관류 폐장애 및 그에 따르는 각종 증상을 경감 및/또는 치료할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기에서 제작한 허혈재관류 폐장애 모델 래트를 이용하여, 실험적으로 Muse 세포에 의한 증상의 경감 등을 검토하고, 그 Muse 세포의 효과를 평가할 수 있다. 평가방법으로서는, 래트를 이용한 폐기능을 평가하는 일반적인 측정계를 이용하여 할 수 있다.
(1) 기능적 평가
본 발명에 따르면, 폐의 기능적 평가는, 당업자에 의하여 승인되는 일반적인 수법을 이용하여 행할 수 있으며, 예를 들어 P/F비, A-aDO2(폐포기·동맥혈산소분압교차), 폐컴플라이언스의 측정에 의하여 행할 수 있다.
(a) P/F비
P/F비는, 폐의 기능적 평가에 있어서 일반적으로 사용되는 산소화의 지수이며, 그 비는, PaO2(동맥혈산소분압)/FiO2(흡입산소분압)로 계산된다. 인간 정상인이라면, 정상값이 400~500이 된다. 이러한 수치 이하에서는, 저산소 상태로 간주된다. 상기 산소분압은, 한정되지 않지만, 혈액가스 분석장치(예를 들어, GASTAT-navi(Techno Medica, Yokohama, Japan))에 의하여 측정할 수 있다. 후술하는 실시예 3에 나타나는 바와 같이, 정상 래트에서는 P/F비가 500 전후, 허혈재관류 폐장애 래트에서는 100 미만이며, Muse 세포의 투여에 의하여 P/F비를 정상에 가깝게 할 수 있다.
(b) A-aDO2(폐포기·동맥혈산소분압교차)
A-aDO2는, 폐포기산소분압(PAO2)과 동맥혈산소분압(PaO2)의 차이를 의미하고, A-aDO2를 구함으로써 폐포에서의 가스교환이 정상으로 되고 있는지 아닌지를 판단할 수 있다. PaO2는, 동맥혈을 채취하고, 혈액가스 분석장치를 이용하여 측정할 수 있는데, PAO2는, 폐포에 포함되는 산소분압 때문에 직접 측정할 수 없다. 그 때문에, PAO2는, 계산식(PAO2=760-47)×0.21-PaCO2/0.8)에 의하여 이론값을 구한다. 인간 정상인이라면, 정상값이 5~15이 된다. 이 수치 이상에서는 가스 교환이 정상이 아니라고 간주된다. 후술하는 실시예 3에 나타나는 바와 같이, 정상 래트에서는 A-aDO2가 150mmHg 전후, 허혈재관류 폐장애 모델 래트에서는 500mmHg 이상이고, Muse 세포의 투여에 의하여 A-aDO2를 정상에 가깝게 할 수 있다.
(c) 폐컴플라이언스
폐의 유연성을 나타내는 지수로, 폐컴플라이언스는, 폐의 수축하려고 하는 성질(탄성)의 역수로 나타난다. 가로축에 폐를 신장시키는 압력(△P), 세로축에 폐의 용량변화(△V)를 플롯하면, 압-양 곡선이 얻어지고, 이 곡선의 경사(△V/△P)가 정적 폐컴플라이언스가 된다. 본 연구에서는 보다 간편하게 폐컴플라이언스를 측정, 산출하기 위하여 1회 환기량(ml)/환기압(cmH2O)에 의하여 구해지는 동적 폐컴플라이언스를 이용하였다. 또한, 본 연구에서 이용한 래트는 성장과정에 있으며, 폐 또한 성장하므로, 개체간에 따른 크기를 보정하기 위하여, 동적 폐컴플라이언스를 개체 체중(kg)으로 나눈 수치(ml/cmH2O/kg)로 비교하였다. 폐컴플라이언스가 높으면, 폐는 신장하기 쉬운 상태라고 할 수 있고, 한편 낮으면 폐는 경직된 상태라고 할 수 있다. 후술하는 실시예 4에 나타나는 바와 같이, 정상 래트에서는 폐컴플라이언스가 1 전후, 허혈재관류 폐장애 모델 래트에서는 0.6이며, Muse 세포의 투여에 의하여 폐컴플라언스를 정상에 가깝게 할 수 있다. 래트를 이용한 경우의 측정방법과는 다르지만, 인간에서는 200ml/cmH2O가 정상값이다.
(2) 조직학적 평가
본 발명에 따르면, 조직학적 평가는, 당업자에 의하여 승인되는 일반적인 수법을 이용하여 행할 수 있으며, 예를 들어 헤마톡실린·에오신(HE) 염색, TUNEL 염색에 의하여 행할 수 있다.
(a) 헤마톡실린·에오신 염색
조직염색법에서는, 헤마톡실린·에오신 염색이 곧잘 사용되고, 당업자에게 주지이다. 본 발명에 따르면, 폐의 조직학적 평가로서, 폐조직을 추출하고, 그 염색 후, 4가지 병리학적 항목(폐포강내의 부종, 폐포강내의 출혈, 폐포·폐포격벽의 울혈, 염증성 세포의 침윤)의 정도에 따라서 0~4+의 5단계로 급성폐장애의 정도를 그레이딩하고, 각 동물실험 그룹간에서 비교함으로써 평가할 수 있다. 보다 구체적으로는, 평가에서는 2명이 블라인드 매너가 되고, 상기 병리학적 항목의 각각에 대하여, 5단계 평가, 즉 스코어 0: 병변부 0%, 1: 병변부 1~25%, 2: 병변부 26~50%, 3: 병변부 51~75%, 및 4: 병변부 76~100%를 이용하여 스코어링한다. 후술하는 실시예 5에 나타나는 바와 같이, Muse 세포를 투여한 처치그룹에서는, PBS만을 투여한 대조그룹과 비교하여, 모든 병리학적 항목에 있어서의 평균스코어가 감소할 수 있다.
(b) TUNEL 염색
본 발명에 따르면, TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)법을 이용하여, 장애폐에 있어서의 아포토시스를 평가할 수 있다. 이것은, 아포토시스의 과정에서 발생하는, 조직 슬라이스 내의 단편화 DNA를 비오틴 표식 뉴클레오티드로 표식한 후, HRP 표식 스트렙트아비딘을 반응시켜서 염색하는 방법이다. 검출시약으로서는, FITC, DAB, Blue Label의 어느 것이어도 좋다. 염색 후, 현미경 하에서 TUNEL 양성 세포수를 산출함으로써, 각 실험그룹에서 비교할 수 있다. 예를 들어, 실시예 6에 나타나는 바와 같이, 현미경 하에서 10시야로 TUNEL 양성 세포수를 비교하면, PBS 투여의 대조와 비교하여, Muse 세포에 의한 처치그룹에서는 아포토시스에 기인한 TUNEL 양성 세포수를 현저하게 감소시킬 수 있다.
이하의 실시예에 의하여, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 한정되는 것이 전혀 아니다.
실시예
실시예
1: 각종 세포의 조제
(1) 간엽계 간세포의 조제
론자재팬 주식회사로부터 구입한 인간 간엽계 간세포(MSC)를 사용하였다. 기보에 따라, 저글루코오스, L-글루타민 함유의 DMEM(Life Technologies, Carlsbad, U.S.A.)에 10% 소태아 혈청(FBS)(Sigma-Aidrich, St. Louis, U.S.A.)와 카나마이신을 첨가한 배지를 이용하여, 10cm 디시에서 37℃, 5%의 CO2의 조건으로 배양하였다. 세포가 90% 컴플루엔트의 세포밀도에 달한 곳에서 0.25% 트립신-EDTA(Life Technologies, Carlsbad, U.S.A.)로 세포를 박리하고, 1:2로 계대하였다. 마찬가지로 배양, 계대를 반복하고, 7~8계대째의 세포를 실험에 이용하였다.
(2) Muse 세포의 조제
인간 MSC를 배양, 계대하고, 7~8계대째의 세포를 이용하였다. 우선, FluoroBrite DMEM(Life Technologies, Carlsbad, U.S.A.) 44ml에 5% 소혈청 알부민(Sigma-Aidrich, St. Louis, U.S.A.)를 5ml, 100mM EDTA를 1ml 첨가하고, 버퍼를 작성하였다. 래트 lgM 항Stage-Specific Embryonic Antigen-3(SSEA-3) 항체(1:1000, BioLegend, San Dieggo, U.S.A.)를 1차 항체로 하고, MSC와 작성한 버퍼 내에서 빙상에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 400g으로 5분간 원심하여, 상청을 제거하고 900μl의 버퍼를 첨가하고, 애호적으로 피펫팅(pipetting)하여 세정하였다. 이러한 세정 조작을 3회 반복하고, FITC 컨쥬게이트화 항래트 lgM항체(1:100, Jackson Immunoresearch, Baltimore, U.S.A.)를 2차 항체로 하여 빙상에서 1시간 반응시켰다. 2차 항체와 반응시킨 후, 상술한 세정을 3회 행하였다. 이어서, 항FITC 마이크로비즈(1:10, Miltenyibiotec, Germany)를 빙상에서 15분간 반응시키고, 2회 세정한 후, MACS(magnetic-activated cell sorting)를 이용하여 SSEA-3 양성 세포를 Muse 세포로서 분리하였다. 세포를 분리한 후, BD FACS Aria(BD Biosceiences, Franklin Lakes, U.S.A.)를 이용하여, MACS로 분리한 세포의 일부를 해석하여, 분리한 세포집단 내에 포함되는 SSEA-3 양성 세포수의 비율을 확인하였다. FACS에 의한 해석에 있어서 SSEA-3 양성률이 70% 이상인 것을 실험에 사용하였다. 이하에 서술하는 실험에 있어서 이용되는 'Muse 세포'는, SSEA-3 양성 세포를 70% 이상 포함하는 MACS에 의하여 분리된 세포이다.
실시예
2:
허혈재관류
폐장애
모델
래트의
제작과 각종 세포의 투여
본 연구에서는, 허혈재관류 폐장애 모델 래트에 PBS를 투여하는 PBS 그룹, 인간 MSC 그룹, Muse 세포를 투여하는 Muse 그룹, 수술조작을 하지 않은 정상그룹의 합계 4그룹을 마련하였다. 허혈재관류 폐장애 후의 폐기능의 평가는, 각 그룹 n=8로 평가하였다. PBS 그룹은 PBS 200μl, MSC 그룹은 MSC 1.5×105세포/200μl PBS, Muse 세포 1.5×105세포/200μl PBS를 각각 재관류 직후에 좌폐동맥을 30G 바늘로 천지하여, 1분간에 걸쳐 투여한다.
생후 9주, 체중 290~340g의 수컷 Sprague Dawley 래트를 이용하였다. 이소플루레인을 흡입시킴으로써 마취를 도입하였다. 충분히 진정이 얻어진 곳에서, 14G 혈관 카테터로 기관내 삽관하여, 래트용 인공호흡기에 접속하였다. 마취 중은 1회 환기량 1ml/100g, 호흡수 80회/분, 호기종말양압 2cmH2O, 흡입마취약 농도는 1%로 관리하였다. 래트를 우측으로 눕게 하고, 좌후측방 절개, 제5 늑간에서 개흉하였다. 폐인대를 절리하여, 좌폐를 수동(授動)시키고, 좌폐문을 충분히 박리한 후, 50단위의 헤파린을 좌측 기정맥으로부터 투여하였다. 헤파린 투여로부터 5분간 경과한 후, 흡기종말에서 좌폐동맥, 좌폐정맥 및 좌주기관지를 마이크로 수술용의 혈관클립으로 차단하였다. 차단 중, 폐에는 젖은 거즈를 덮고, 보온매트를 이용하여 흉강내 온도를 37℃로 유지하였다. 차단시간은, van der Kaaji NP 등의 보고(Eur J Cardiothorac Surg 2005; 27: 774-782)에 따라서 2시간으로 하였다. 차단을 해제한 직후에, 좌폐동맥으로부터 PBS, MSC, Muse 세포를 각각 투여하였다. 그 후, 3-0견사를 이용하여 늑간, 근층, 피부를 봉합하여 클로징하였다. 클로징 후, 이소플루레인의 흡입을 중지한 상태에서 환기를 계속하여, 자발호흡이 재개하는 것을 확인하고, 14G 카테터를 제거하였다.
실시예
3: 폐의
산소화능
및
환기능의
평가
재관류 3일, 5일에 래트를 이소플루레인에 의한 전신마취 하에 기관절개하고, 14G 혈관 카테터를 기관에 삽입하였다. 3-0견사로 결찰하고, 카테터와 기간을 고정하여, 카테터와 인공호흡기를 접속하였다. 흉골정중절개로 개흉하였다. 좌우의 횡격막을 절개하고, 거즈를 이용하여 복부장기의 흉강내로의 탈출을 막았다. 우폐문을 현미경 하에 박리한 후, 우폐동맥을 결찰하였다. 그 후, 흡입산소농도 100%, 1회 환기량 1ml/체중 100g, 호흡수 80/분, 호기종말양압 2cmH2O로 5분간 환기시킨 후, 상행대동맥으로부터 채혈하였다. 혈액가스분석을 행하고, 동맥혈산소분압/흡입산소농도비(P/F비), 또한 이하의 식으로부터 산출되는 A-aDO2(A-aDO2=713-동맥혈 이산화탄소분압/0.8-동맥혈산소분압)를 각 그룹간에서 비교하였다. 혈액가스분석은 GASTAT-navi(Techno Medica, Yokohama, Japan)를 이용하여 측정하였다. 각 그룹 n=8로 평가하였다.
재관류로부터 3일째(Day 3), 재관류로부터 5일째(Day 5)에 동맥혈 혈액가스분석을 행하고, P/F비, A-aDO2를 측정하여 비교하였다. P/F비는, Day 3에 있어서 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.001), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.01), 또한 Day 5에 있어서 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.001), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.001), MSC 그룹과 PBS 그룹(p<0.01)에서 통계학적 유의차를 확인하였다(도 1). A-aDO2는, Day 3에 있어서 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.01), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.05), 또한 Day 5에 있어서 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.001), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.001), MSC 그룹과 PBS 그룹(p<0.01)에서 통계학적 유의차를 확인하였다(도 2). 이들 결과로부터 Muse 세포의 투여에 의하여, 허혈재관류 폐장애 모델 래트에 있어서의 폐의 기능이 개선되고, 허혈재관류 폐장애에 있어서의 Muse 세포의 치료 유효성을 확인할 수 있었다.
실시예
4:
좌폐
컴플라이언스의
평가
혈액가스분석 후, 우폐문을 모스키토페안 겸자로 차단하고, 환기수를 80회/분으로 설정하여, 분시환기량을 40ml에서 단계적으로 200ml까지 높이고, 각 환기량에 있어서의 환기압을 계측하였다. 1회 환기량을 개체중량으로 나누어 조정하고, 환기량/환기압(ml/kg/cmH2O)을 구하여, 폐컴플라이언스로서 각 그룹간에서 비교하였다. 각 그룹 n=8로 평가하였다.
재관류로부터 3일째(Day 3), 재관류로부터 5일째(Day 5)에 좌폐컴플라이언스를 측정하여 비교하였다. Day 3에 있어서 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.001), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.05), MSC 그룹과 PBS 그룹(p<0.05), 또한 Day 5에 있어서 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.001), MSC 그룹과 PBS 그룹(p<0.05)에서 통계학적 유의차를 확인하였다(도 3). 실시예 3과 마찬가지로, 이 결과로부터 허혈재관류 폐장애에 있어서의 Muse 세포의 치료유효성을 확인할 수 있었다.
실시예
5: 조직학적 평가
좌폐컴플라이언스를 측정한 후, 심폐 블록을 적출하고, 기관으로부터 4% 파라포름알데히드를 10cmH2O의 압으로 주입하고, 좌폐를 4% 파라포름알데히드 중에 24시간 고정하였다. 고정 후, 폐조직을 분할하여, 절반을 파라핀에 포리하고, 다른 절반을 0.C.T.컴파운드에 포리하여, 각각 파라핀 절편, 동결절편을 제작하였다. 파라핀 절편은 3μm, 동결절편은 8μm로 박절절편을 각각 제작하였다.
(1) 허혈재관류 폐장애의 병리학적 검색
파라핀 절편을 이용하여 헤마톡실린·에오신 염색을 하고, Okada Y 등의 보고(Transplantating 1997; 64: 801-806)에 근거하여, 4가지 병리학적 항목(폐포강내의 부종, 폐포강 내의 출혈, 폐포·폐포격벽의 울혈, 염증성 세포의 침윤)의 정도에 따라 0~4+의 5단계로 급석폐장애의 정도를 그레이딩하고, 각 그룹간에서 비교하였다. 3일째, 5일재에서 각각 각 그룹 n=8로 평가하였다.
Day 3과 Day 5에 있어서 HE 염색을 하고, 상기 4가지 병리학적 항목에 대하여 0~4의 5단계로 평가하였다. Day 3에 있어서, 폐포내 부종은 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.01), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.01), 폐포내 출혈은 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.01), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.01), 모세혈관의 울혈은 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.01), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.05), 호중구 침윤은 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.01), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.01)에서 통계학적 유의차를 확인하였다(도 4). Day 5에서는, 호중구 침윤에 대하여 Muse 그룹과 PBS 그룹(p<0.01), Muse 그룹과 MSC 그룹(p<0.05)에서 통계학적 유의차를 확인하였다(데이터 미개시). 이와 같이, Muse 세포를 투여한 처치그룹에서는, PBS만을 투여한 대조그룹과 비교하여, 모든 병리학적 항목에 있어서의 평균 스코어가 감소하고 있는 것으로부터, Muse 세포는 허혈재관류 폐장애의 치료에 유효한 것을 확인할 수 있었다.
(2) 래트 장애폐에 있어서의 아포토시스의 평가
장애폐에 있어서의 아포토시스를 평가하기 위하여, TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)법을 행하였다. TUNEL법에는 DeadEnd(상표) Fluorometric TUNEL System(Promega, Wisconsin, U.S.A.)을 이용하여, 첨부하는 프로토콜에 따라서 염색을 하였다. 200배로 10시야 관찰하고, TUNEL 양성세포수를 산출하여, 10시야의 합계의 TUNEL 양성 세포수를 각 그룹간에서 비교하였다. Day 3, Day 5에서 각각 각 그룹 n=4로 평가하였다.
Day 3 및 Day 5에 있어서, PBS 그룹, MSC 그룹 및 Muse 그룹의 좌폐절편을 이용하여 TUNEL법을 행하고, 아포토시스 세포를 검출하여, 200배 시야로 10시야 관찰하고, TUNEL 양성 세포수를 비교하였다(도 5). Day 3에 있어서 Muse 그룹은 PBS 그룹(p<0.01), MSC 그룹(p<0.05)와 비교하여 유의하게 적으며, Day 5에 있어서 Muse 그룹은 PBS 그룹(p<0.001), MSC 그룹(p<0.01)과 비교하여 유의하게 적었다. 이 결과로부터, Muse 세포에 의한 처치그룹에서는, 허혈재관류 폐장애에 기인하여 아포토시스에 이른 세포수를 현저하게 감소시킬 수 있었다.
실시예
6:
래트
장애폐에
있어서의
인간
세포수의
평가
동결절편을 이용하여, 1차 항체로서 토끼 항인간 golgi 항체(1:50, Abcam, Cambridge, UK)를 4℃로 하룻밤 반응시켰다. 2차 항체로서 Cy3 컨쥬게이터화 당나귀항 토끼 lgG 항체(1:500, Jackson Immunoresearch, Baltimore, U.S.A.)를 2시간, 실온에서 반응시키고, 면역조직화학을 행하여, MSC 그룹, Muse 그룹에 있어서의 항인간 golgi 항체 양성세포수를 산출하였다. 2그룹모두 1개체당 3절편씩 작성하고, 절편의 면적을 측정하여, 절편마다 전체 양성세포수를 산출하고, 단위면적당 항인간 golgi 항체 양성세포수를 2그룹간에서 비교하였다. Day 3, Day 5에서 각각 각 그룹 n=4로 평가하였다.
Day 3 및 Day 5에 있어서, 좌폐조직에 대하여 항인가 golgi 항체에 의한 면역조직화학을 행하고, 각 절편 내의 인간 golgi 양성세포수를 각 개체 3절편씩 산출하였다. Day 3에 있어서, Muse 세포를 허혈재관류 폐장애 모델 래트에 투여한 그룹은 MSC를 정상 래트에 투여한 그룹(p<0.05), Muse 세포를 정상 래트에 투여한 그룹(p<0.05) 및 MSC를 허혈재관류 폐장애 모델 래트에 투여한 그룹(p<0.05)보다 유의하게 많은 인간세포가 남아 있었다. 또한, Day 5에 있어서, Muse 세포를 허혈재관류 폐장애 모델 래트에 투여한 그룹은 MSC를 허혈재관류 폐장애 모델 래트에 투여한 그룹(p<0.01)과 비교하여 유의하게 많은 인간세포가 남아 있었다(도 6). 즉, Muse 세포는 MSC보다 효율적이고 지속적으로 장애폐에 작용할 수 있다고 할 수 있다.
실시예
7:
래트
장애폐에
있어서의 발현 단백질의 평가
폐장애에 있어서의 발현 단백질을 비교하기 위하여, 장애폐로부터 단백질을 추출하고, 웨스턴 블로팅을 행하였다. PBS 그룹, MSC 그룹, Muse 그룹의 좌폐조직을 재관류 후 3일째에 적출하고, 바이오매셔에 의하여 호모지나이즈하여, 프로테아제 저해제 칵테일(Roche, Mannheim, Germany)을 첨가한 Lysis Buffer(20mM Tris-HCI, 150mM NaCl, 1% Triton X-100)에 의하여 15분간 빙상에서 반응시켰다. 추출한 단백질량은 Bradford법으로 정량하였다. 이어서, Lysis Buffer와 등량의 x2 Sample Buffer(30% 글리세롤, 4% 도데실황산나트륨, 125mM Tris-HCl(pH 6.8), 100mM 디티오스레이톨, 10mM EDTA, 10% β-메르캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 첨가하고, 100℃에서 10분간 인큐베이트한다. 각각의 샘플은 50μg씩 10%, 15% SuperSep Ace(Wako, Osaka Japan)에서 전기이동하고, Immobilon-P 전사 멤브레인(Merck Millipore, Billerica, U.S.A.)에 전사한다. 5% 스킴밀크(Nakarai Tesque, Kyoto, Japan)에서 4℃, 1시간으로 블로킹한 후, 1차 항체로서 5% 스킴밀크로 희석한 토끼 항IL-10 항체(1:2500, Abcam, Cambridge, UK), 토끼 항IL-1β 항체(1:5000, Merck Millipore Billerica, U.S.A.), 마우스 항IL-6 항체(1:2000, Abcam, Cambridge, UK), 염소 항KGF 항체(1:2000, R&D system, Minneapolis, U.S.A.), 토끼 항PGE2 항체(1:1000, Bioss, Boston, U.S.A.), 토끼 항SDF(Stem cell drived factor)-1 항체, 토끼 항상피성 나트륨 채널(ENaC) 항체(1:500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.A.), 토끼 항Akt 항체(1:2000, Cell Signaling Technology, Danvers, U.S.A.), 토끼 항Bcl-2 항체(1:500 Abcam, Cambridge, UK), 마우스 항β-악틴 항체(1:10000, Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여, 4℃에서 하룻밤 반응시킨다. 2차 항체에는 페록시다아제 컨쥬게이트화 염소 항마우스 IgG 항체(1:10000) 또는 페록시다아제 컨쥬게이트화 염소 항토끼 IgG 항체(1:15000), 페록시다아제 컨쥬게이트화 당나귀 항염소 IgG 항체(1:5000)를 사용하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 발색에는 Piece Western Blotting substrate Plus(Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.A.)를 이용하여, 5분간 발색시키고, LAS-4000 IR 멀티컬러(Fuji Film, Tokyo, Japan)로 촬상하여, β-악틴에 대한 각 단백질의 발현 레벨비를 산출하여서 각 그룹간에서 비교하였다.
Day 3에 있어서 PBS 그룹, MSC 그룹, Muse 그룹의 좌폐조직으로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블로팅을 행하고, 밴드의 농염을 각 그룹에서 비교한 결과를 도 7에 나타낸다. Muse 그룹과 MSC 그룹에서는 PGE2(p<0.01), SDF-1(p<0.05), IL-6(p<0.05), ENaC(p<0.05), Bcl-2(p<0.05), Akt(p<0.01)로, Muse 그룹과 PBS 그룹에서는 PGE2(p<0.01), SDF-1(p<0.01), IL-6(p<0.05), ENaC(p<0.05), BcI-2(p<0.05), Akt(p<0.01)로 통계학적으로 유의하게 Muse 그룹의 발현이 높아졌다. 통계학적 유의차는 인정되지 않았지만, KGF, II-10, MMP2, IGF-1의 발현은 Muse 그룹에서 높고, IL-1b의 발현은 Muse 그룹에서 낮았다.
허혈재관류 폐장애 모델 래트에 Muse 세포를 투여함으로써, MSC를 투여하는 것보다 우수한 기능개선효과가 얻어졌다. 장애폐의 웨스턴 블로팅에서는 Muse 그룹에 있어서, KGF, PGE2, IL-10, SDF-1, IL-6, MMP-2, IGF-1, ENaC, Bcl-2, Akt의 발현이 높고, IL-1β의 발현이 낮았다. ENaC는 I형 폐포상피세포 및 II형 폐포상피세포에 발현하고 있는 나트륨이온채널에서 나트륨이온의 흡수를 통하여 폐포강의 수분 클리어런스에 있어서 중요한 역할을 다하며, 허혈재관류 폐장애를 포함하는 급성폐장애에 있어서의 폐수종의 발생에도 관여하고 있다. KGF는 ENaC의 발현을 유도하여, 폐포수분 클리어런스를 항진시킨다. ENaC의 발현이 촉진됨으로써 폐포수분 클리어런스가 항진하고, 병리조직에 있어서의 폐포내 부종의 개선에 기여하여서, 폐기능 개선에 관여하였다고 생각된다.
IL-6, IGF-1, SDF-1은, 세포증식을 촉진시키고, 조직을 수복한다. 이들 사이토카인이 고발현하고 있던 Muse 그룹에서는, PCNA에 따른 I형 폐포상피세포, II형 폐포상피세포의 증식능 평가에 있어서, 모두 분열기에 있는 세포수가 유의하게 많았다. 또한, 허혈재관류 폐장애에 있어서 아포토시스는 폐기능 장애의 발생에 크게 관여하고 있는데, Bcl-2 및 Akt는, 아포토시스 경로에 있어서, 아포토시스를 억제하는 움직임을 가지는 단백질이다. Muse 그룹에서는 이들 단백질의 발현이 항진하고 있어, TUNEL법에 있어서의 양성세포수가 Muse 그룹에서 감소하고 있던 것으로부터 명확하듯이, Muse 그룹에서는, 아포토시스가 보다 강하게 억제되고 있었다. 즉, Muse 그룹에서는 허혈재관류 장애 후에 생존하는 I형 및 II형 폐포상피세포가 많았다고 할 수 있다. I형 및 II형 폐포상피세포가 많이 생존 또는 증식하는 것은, 각각 유효한 가스교환면적의 증가 및 폐서팩턴트 단백의 생성을 의미하고, 각각 직접적으로 산소화능 및 폐컴플라이언스의 개선에 기여하였다고 생각된다. 더욱이, 장애폐에 있어서의 I형 및 II형 폐포상피세포수의 증가는, 폐포상피세포에 발현하고 있는 ENaC가 증가하는 것을 의미하고, 이에 따라서도 폐포내 부종의 개선에 기여하였다고 생각된다.
PGE2는, T세포의 증식을 억제하여 면역억제효과, 혈관내피세포 보호라고 하는 직접적인 작용 이외에, IL-10을 통한 항염증작용을 가지고 있다. PGE2가 고발현하고 있던 Muse 그룹에서는 강력한 항염증작용, 면역억제작용을 가지는 IL-10도 고발현하고 있어, Muse 그룹에서는 염증성 사이토카인인 IL-1b의 저하, 병리조직에 있어서의 호중구 침윤의 경감에 관여하여, 폐기능의 개선에 기여하였다고 생각된다.
실시예
8:
래트
장애폐에
있어서의
폐포상피증식능의
평가
동결절편을 이용하여, Tris-EDTA(pH 9.0), 80℃, 20분간 마이크로웨이브로 항원부활화를 행한 후, 증식기의 세포마커로서 마우스 항PCNA(Proliferating cell nuclear antigen) 항체(1:500, Abcam, Cambridge, UK), 2형 폐포상피세포의 마커로서 토끼 항Pro Surfactant protein C 항체(1:1000, Merck Millipore, Billerica, U.S.A.), 1형 폐포상피세포의 마커로서 토끼 항Aquaporin 5 항체(1:250, Abcam, Cambridge, UK)를 1차 항체로서 사용하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 2차 항체는 각각 FITC 컨쥬게이트화 당나귀 항마우스IgG 항체(1:500, Jackson Immunoresearch, Baltimore, U.S.A.), Cy3 컨쥬게이트화 당나귀 항토끼 IgG 항체(1:500, Jackson Immunoresearch, Baltimore, U.S.A.)를 이용하여 2시간, 실온에서 반응시켰다. 200배 시야로 관찰하고, PCNA와 Pro Surfactant protein C, PCNA와 Aquaporin 5의 각각 공양성 세포를 10시야로 산출하였다. 각각을 증식기에 있는 2형 폐포상피 세포수, 1형 폐포상피 세포수로 하여서 PBS 그룹, MSC 그룹, Muse 그룹에서 비교하였다. 재관류 후 3일째, 5일째에서 각각 각 그룹 n=4로 평가하였다.
Day 3, Day 5에 있어서 항PCNA 항체를 이용하여, 분열기에 있는 세포수를 산출하였다. I형 폐포상피세포 마커인 아쿠아포린 5와 II형 폐포상피세포 마커인 pro SPC의 항체와 각각 공염색을 하고, 공양성 세포를 200배 시야로 10시야 관찰하여 산출하였다. 결과를 도 8에 나타낸다. PCNA와 아쿠아포린 5의 공양성세포수는 Day 3에 있어서 Muse 그룹은 MSC 그룹(p<0.01)과 PBS 그룹(p<0.01)보다 통계학적으로 유의하게 공양성 세포수가 많았다. Day 5에 있어서는, 통계학적 유의차는 인정되지 않았지만, Muse 그룹에서 공양성 세포수가 많았다. PCNA와 pro SPC의 공양성 세포수는 Day 3에 있어서 Muse 그룹은 MSC 그룹(p<0.05) 및 PBS 그룹(p<0.05)와 비교하여 유의하게 공양성 세포수가 많았다. Day 5에서는, Muse 그룹은 공양성 세포수가 다른 2 그룹과 비교하여 공양성 세포수가 많고, 특히 PBS 그룹과의 사이에서는 통계학적 유의차가 인정되었다(p<0.05).
본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 허혈재관류 폐장애의 경감 및 치료에 응용할 수 있다.
본 명세서에 인용하는 모든 간행물 및 특허문헌은, 참조에 의하여 전체적으로 본 명세서 내에 원용된다. 한편, 예시를 목적으로 하여, 본 발명의 특정 실시형태를 본 명세서에서 설명하였는데, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 변경 가능한 것은 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.
Claims (9)
- 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는, 허혈재관류 폐장애를 경감 또는 치료하기 위한 세포제제이고,
상기 다능성 간세포가,
(i) CD105 양성이고;
(ii) CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성 및 CD271 음성이고;
(iii) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(iv) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(v) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(vi) 셀프리뉴얼능을 가짐
의 성질을 모두 가지는, 상기 세포제제. - 제 1 항에 있어서,
외부 스트레스 자극에 의하여 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분을 포함하며, 여기서 외부 스트레스 자극은 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건 하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열쇼크로의 폭로 하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결처리, 유해물질 존재 하에서의 배양, 활성산소 존재 하에서의 배양, 기계적 자극 하에서의 배양, 진동처리 하에서의 배양, 압력처리 하에서의 배양 또는 물리적 충격 중 어느 하나 이상의 조합인 세포제제. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 세포제제. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성 및 Dct 음성인 세포제제. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
허혈재관류 폐장애가 폐이식 후, 심장수술시의 인공심폐 사용 후, 혈관형성 또는 혈류차단을 수반하는 흉부외과수술 후, 또는 폐혈전폐색증의 혈전용해 후 또는 혈전적출 후의 혈류재개시에 발생하는 폐장애인 세포제제. - 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 폐조직에 생착하는 능력을 가지는 세포제제.
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