JP6796143B2

JP6796143B2 - トロンビン処理幹細胞に由来するエキソソームを含む慢性肺疾患治療用組成物

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Publication number: JP6796143B2
Application number: JP2018551233A
Authority: JP
Inventors: ユンシルチャン、; ウォンソンパク、; ドンキュンソン、; ソユンアン、
Original assignee: サムソンライフパブリックウェルフェアファウンデーション
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2020-12-02
Anticipated expiration: 2037-03-30
Also published as: KR20170119019A; US10723997B2; WO2017179840A1; KR101843634B1; EP3443966A1; EP3443966A4; EP3443966B1; CN109069541A; US20190153383A1; JP2019511509A

Description

本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、慢性肺疾患（ＣｈｒｏｎｉｃＰｕｌｍｏｎａｒｙＤｉｓｅａｓｅ）の予防または治療用薬学的組成物、それを含有する薬学製剤、およびその製造方法に関する。

気管支肺異形成症（ＢＰＤ：ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｙｓｐｌａｓｉａ）は、主として未熟児で呼吸不全やこれによる人工呼吸器の治療によって発生する発達性慢性肺疾患であって、最近、肺の未熟程度が特にさらに深刻で、ＢＰＤの発病危険がより一層高い出生体重１，０００ｇｍ未満の超極小の未熟児の治療が活発に進行されるに伴い、この疾患の発病頻度が急激に増加している。ＢＰＤは、新生児、特に未熟児の死亡の主な原因疾患であるだけでなく、生存児の場合にも、入院期間が長期化し、肺動脈高血圧のような深刻な後遺症を誘発したり、退院以後にもウイルス性急性細気管支炎および肺炎などで再入院が必要な場合が５０％以上であり、また、長期的に気管支の過敏性が増加して、気管支喘息に転換される場合も多く、究極的に、脳性マヒのような深刻な神経学的後遺症と関連しているものと知られている。

従来、未熟児のＢＰＤを治療する方法としては、新生児および未熟児の人工換気の治療時に正圧換気による圧力、体積損傷、酸素濃度を低減して治療してみようとする物理的な努力が主として行われ、損傷した肺炎症を減らす治療であるステロイド療法が共に使用されたことがあるが、未熟児で使用する場合、神経学的に良くない予後、特に脳性マヒの増加と関連があるという報告があって、使用が制限されているのが現況である。したがって、新生児／未熟児のＢＰＤは、その難治性に起因して効果的で且つ明確な治療法の開発が非常に重要で且つ至急である。

間葉系幹細胞は、その多分化能と共に、組織の再生、治療および免疫反応に関与する細胞として知られていて、このような特性を利用して臍帯血、骨髄などから間葉系幹細胞を分離培養して、ＢＰＤのような慢性肺疾患に対する治療剤として開発しようとする努力があった。しかし、このような幹細胞自体を利用した治療法は、次のような限界と副作用の問題があった。

第一に、基本的に、細胞治療剤は、ＤＮＡトランスファーによる発癌（ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）可能性を排除することができない。
第二に、幹細胞自体の大きいサイズに起因して血管閉塞（ｖａｓｃｕｌａｒｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）や心筋梗塞を誘発することがある（ＣｉｒｃＨｅａｒｔＦａｉｌ．２０１０；３：ｅ５−ｅ６参照）。
第三に、臍帯血のような同種細胞を使用して移植（同種移植）する場合、細胞表面抗原（ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ）による拒絶反応の問題がある。
第四に、一般的に、細胞治療剤は、製造工程が複雑であり、保管運送に制約が多いため、生産費用が高いという限界がある。

このように、幹細胞が有している基本的限界に起因して、副作用を減らしながらも治療効果を増進させるための方案として、遺伝子操作を利用した効能改善方法が開発されたことがあるが、現在まで明確な代案はないのが実情である。

なお、エキソソームは、多様な細胞から分泌される膜構造の小さい小胞（約３０〜１００ｎｍの直径）であって、電子顕微鏡を用いた研究において原形質膜から直接脱離するものではなく、多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒｂｏｄｉｅｓ，ＭＶＢｓ）と呼ばれる細胞内の特定区画が起源であり、細胞外に放出、分泌されることが観察された。すなわち、多胞体と原形質膜の融合が起こると、小胞は、細胞外環境に放出されるが、これをエキソソームと言う。このようなエキソソームがどんな分子的機構により形成されるか確実に明らかにされていないが、赤血球細胞だけでなく、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球、樹枝状細胞、血小板、大食細胞などを含む多様な種類の免疫細胞、腫瘍細胞、幹細胞なども、生きている状態でエキソソームを生産して分泌すると知られている。

特に、幹細胞に由来するエキソソームは、受容体および蛋白質だけでなく、核成分を含有していて、細胞間コミュニケーションの役割をすると知られている。また、前記幹細胞に由来するエキソソームは、幹細胞に比べて動物血清を相対的に少なく含有していて、動物血清の感染による症状（ｚｏｏｎｏｓｉｓ）の危険性も排除することができる。このようなエキソソームの特性を考慮すると、エキソソームを利用した細胞治療法は、従来の幹細胞治療法の限界を克服できる新しいパラダイムになると期待される。

これより、本発明者らは、ＢＰＤを含む慢性肺疾患において、幹細胞治療剤が有する制約を克服しながらも、治療効能を改善させるために鋭意研究した結果、幹細胞由来のエキソソーム、特にトロンビンで処理した幹細胞に由来するエキソソームが、細胞死滅に対する保護効果および血管新生効果が顕著に増加するという事実を確認することにより、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、トロンビンで処理した幹細胞に由来するエキソソームを含む、慢性肺疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。

しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。

本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエキソソームを有効成分として含む、慢性肺疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の一実施形態において、前記幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多分化能幹細胞、および羊膜上皮細胞よりなる群から選択される幹細胞であることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、または胎盤に由来することを特徴とする。

本発明のさらに他の実施形態において、前記慢性肺疾患は、気管支肺異形成症（Ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｙｓｐｌａｓｉａ）、慢性気管支炎（ｃｈｒｏｎｉｃｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、肺気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ）、または末梢気道病変（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｓｍａｌｌａｉｒｗａｙｄｉｓｅａｓｅｓ）であることを特徴とする。

本発明のさらに他の実施形態において、前記慢性肺疾患は、気管支肺異形成症であることを特徴とする。

本発明のさらに他の実施形態において、前記薬学的組成物は、個体の気道または血管内に投与されることを特徴とする。

本発明のさらに他の実施形態において、前記薬学的組成物は、培養培地、サイトカイン、成長因子、および遺伝子よりなる群から選択される補助成分をさらに含むことを特徴とする。

本発明のさらに他の実施形態において、前記エキソソームは、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子、または再生因子の発現が増加していることを特徴とする。

本発明のさらに他の実施形態において、前記成長因子は、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、またはＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）であることを特徴とする。

また、本発明は、前記組成物を含有する、慢性肺疾患の予防または治療用薬学製剤を提供する。

本発明の一実施形態において、前記製剤は、注射剤形、注入剤形、または噴霧剤形であることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、前記製剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする。

また、本発明は、（ａ）幹細胞の培養後にトロンビンを処理する段階と、（ｂ）前記段階（ａ）の培養液からエキソソームを分離する段階と、（ｃ）前記段階（ｂ）で分離したエキソソームを有効成分として含有する組成物を製造する段階とを含む、前記薬学的組成物の製造方法を提供する。

本発明の一実施形態において、前記段階（ａ）のトロンビンは、培地内に１〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で含まれることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、前記段階（ｃ）のエキソソームは、遠心分離されることを特徴とする。

本発明のさらに他の実施形態において、前記遠心分離は、５，０００〜５００，０００ｇで１０分間〜５時間行われることを特徴とする。

また、本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエキソソームを個体に投与する段階を含む、慢性肺疾患治療方法を提供する。

また、本発明は、慢性肺疾患を予防または治療する製剤を製造するのに使用されるトロンビン処理された幹細胞に由来するエキソソームの用途を提供する。

本発明のエキソソームをベースとした治療剤によれば、無細胞の（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）製剤であるから、ＤＮＡが含まれていないので、発癌の危険性が少なく、細胞表面抗原がないため、移植拒絶反応の問題がない。

また、細胞よりサイズが非常に小さいため、全身投与時に微細血管に閉塞を起こすおそれがなく、非細胞分離物質であって、在庫があってすぐに入手可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）製品への薬剤開発が可能であるので、製造コストを減らすことができる。

また、非処理幹細胞に比べてトロンビンで処理した幹細胞に由来するエキソソームが少ない量でも慢性肺疾患の治療効果に優れているので、治療的用量のエキソソームを生成するための幹細胞の要求量を顕著に減少させて、治療剤生産費用を顕著に低減することができるという長所がある。

したがって、本発明によれば、幹細胞治療剤が有する従来の問題を解決しながらも、治療効能を顕著に改善することができるため、本発明の治療薬は気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を含む多様な慢性肺疾患の治療に有用に用いられる。

幹細胞にトロンビン処理時にエキソソームの分泌が活性化する過程をＴＥＭイメージ分析により確認した結果である。トロンビン処理された幹細胞由来のエキソソームにおいてエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９が正常に発現するかを確認したウェスタンブロットの結果である。トロンビン処理によりエキソソーム内成長因子（ＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ）、抗炎症サイトカイン（ＩＬ−６）等の発現が増加することを示す免疫分析の結果である。トロンビン処理幹細胞由来のエキソソームに対するｉｎｖｉｔｒｏ肺細胞死滅抑制効果を示すＭＴＴアッセイの結果である。エキソソームが濃度依存的に肺細胞死滅抑制効果を発揮することを示すＭＴＴアッセイの結果である。トロンビン処理幹細胞由来のエキソソームに対するｉｎｖｉｖｏ気管支肺異形成症（ＢＰＤ）動物モデルにおける肺胞損傷の治療効果を示すＨ＆Ｅ染色結果であって、組織染色顕微鏡写真である。トロンビン処理幹細胞由来のエキソソームに対するｉｎｖｉｖｏ気管支肺異形成症（ＢＰＤ）動物モデルにおける肺胞損傷の治療効果を示すＨ＆Ｅ染色結果であって、肺胞損傷程度を定量化したグラフである。トロンビン処理幹細胞由来のエキソソームに対するｉｎｖｉｖｏ気管支肺異形成症（ＢＰＤ）動物モデルにおける細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の保護効果を示すＴＵＮＥＬアッセイ結果であって、ＴＵＮＥＬ染色顕微鏡写真である。トロンビン処理幹細胞由来のエキソソームに対するｉｎｖｉｖｏ気管支肺異形成症（ＢＰＤ）動物モデルにおける細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の保護効果を示すＴＵＮＥＬアッセイ結果であって、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数を定量化したグラフである。トロンビン処理幹細胞由来のエキソソームに対するｉｎｖｉｖｏ気管支肺異形成症（ＢＰＤ）動物モデルにおける血管新生誘導効果を示すフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）分析結果であって、抗−ｖＷｆ免疫蛍光染色写真である。トロンビン処理幹細胞由来のエキソソームに対するｉｎｖｉｖｏ気管支肺異形成症（ＢＰＤ）動物モデルにおける血管新生誘導効果を示すフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）分析結果であって、これを定量化したグラフである。

本発明において「幹細胞」というのは、未分化の細胞であって、自己複製能力を有しながら、二つ以上の互いに異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。本発明の幹細胞は、自家幹細胞または同種由来幹細胞であってもよく、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む任意の種類の動物由来であってもよく、前記幹細胞が成体に由来するものであってもよく、胚芽に由来するものであってもよく、これらに限定されない。

本発明の幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞を含み、好ましくは、成体幹細胞である。前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多分化能幹細胞、または羊膜上皮細胞であってもよく、好ましくは、間葉系幹細胞であるが、これに限定されない。前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、および胎盤などに由来する間葉系幹細胞であってもよいが、これらに限定されない。

本発明において「臍帯血」は、胎盤と胎児を連結する臍帯静脈から採取された血液を意味する。臍帯血は、出産時に自然的に発生する副産物であって、数回の手術を必要とする骨髄などの一般間葉系組織より極めて採取が容易であり、骨髓移植に比べて臍帯血の保管産業が活性化し、すでにインフラが構築されているので、供与者を求めることも容易である。これと共に、臍帯血由来細胞は、組織や臓器移植で拒絶反応を起こす最も重要な原因である組織適合抗原ＨＬＡ−ＤＲ（ｃｌａｓｓＩＩ）が発現しない細胞であるから、従来の移植手術時に問題になった拒絶反応などの免疫反応を誘発しないか、最小化することができ、自家由来臍帯血はもちろん、他家由来臍帯血も使用することができる。

本発明において「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」というのは、多様な細胞から分泌される膜構造の小さい（略３０〜１００ｎｍの直径）小胞を意味し、多胞体と原形質膜の融合が起こり、細胞外環境に放出される小胞を意味する。前記エキソソームは、自然的に分泌されたものであるか、あるいは人工的に分泌されたものを含む。

本発明において「慢性肺疾患」というのは、肺に異常な炎症反応が起こり、そのため、次第に気流制限が進行されて肺機能が低下し、呼吸困難を誘発することになる呼吸器疾患を意味する。例えば、気管支肺異形成症（Ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｙｓｐｌａｓｉａ）、慢性気管支炎（ｃｈｒｏｎｉｃｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、肺気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ）、または末梢気道病変（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｓｍａｌｌａｉｒｗａｙｄｉｓｅａｓｅｓ）を含むことができるが、これに制限されず、好ましくは、気管支肺異形成症である。

本発明において「慢性肺疾患の予防または治療」とは、慢性肺疾患の軽減、緩和、および症状の改善を含み、慢性肺疾患を発症する可能性を低減することを含む意味である。

本発明において「トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）処理された幹細胞」は、非処理幹細胞に比べて細胞生存性（ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、酸化機能（ｏｘｉｄａｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ）など細胞安定性には変化なく、幹細胞の主な作用機序であるバラクリン特性（ｐａｒａｃｒｉｎｅｐｒｏｐｅｒｔｙ）の増加によって幹細胞機能／効能が強化し得る。ひいては、トロンビン処理により、幹細胞に由来するエキソソームの治療効能を強化させるだけでなく、エキソソームの分泌量を増加させることができる。

この際、パラクリンとしては、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子または再生因子が増加することができ、特に成長因子は、細胞分裂や生長、分化を促進する蛋白質性の生理活性物質を意味するものであって、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）等を含むことができる。

本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で特別な制限なく投与され得、例えば、経口または非経口方式で投与され得るが、気道または血管内に投与することが好ましい。

本発明の薬学的組成物は、幹細胞由来エキソソームと共に慢性肺疾患の治療効果を有する公知の補助成分を１種以上さらに含有することができる。例えば、慢性肺疾患の治療に効果的な遺伝子［例えば、抗−炎症性サイトカイン（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅ）遺伝子、炎症性サイトカイン（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅ）に対するｓｉＲＮＡまたはアンチ−センスプライマー（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ）］またはこれを含む発現ベクター、自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）または傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果を提供するサイトカイン［例えば、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−１０］、成長因子［例えば、ケラチン形成細胞成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）］、およびこれらの組合せよりなる群から選択された補助成分を一つ以上さらに含むことができる。

本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、個体の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なり、当業者により適切に選択され得る。前記組成物の投与は、一日に一回投与することもでき、数回分けて投与することもでき、これらに限定されない。

本発明の薬学的組成物は、慢性肺疾患の治療のために単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療、および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。

本発明の組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体をさらに含むことができる。例えば、注射剤の場合には、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、または安定化剤などを、局所投与用製剤の場合には、基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、潤滑剤、または保存剤などをさらに含むことができる。

本発明の組成物は、薬学的分野において通常の方法により個体の身体内投与に適合した単位投与型の製剤で剤形化させて投与することができる。このような目的に適合した剤形としては、非経口投与製剤として注射用アンプルのような注射剤、注入バックのような注入剤、およびエアロゾール製剤のような噴霧剤などが好ましい。前記注射用アンプルは、使用直前に注射液と混合調製することができ、注射液としては、生理食塩水、ブドウ糖、リンガー液などを使用することができる。また、注入バックは、塩化ポリビニルまたはポリエチレン材質のものを使用することができる。本発明において投与は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。

本発明においてトロンビン処理濃度は、幹細胞／エキソソームの効能を強化させるのに適合した濃度であれば十分であり、特別な制限はないが、培地に１〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で含まれることが好ましい。

本発明においてエキソソームを分離する方法には制限がなく、例えば培養液から、遠心分離、超高速遠心分離、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、毛細管電気泳動、ポリマーを利用した分離などの方法およびこれらの組合せを利用して分離することができ、好ましくは、遠心分離／超遠心分離である。この際、遠心分離／超遠心分離は、４℃、５，０００〜５００，０００ｇで１０分間〜５時間行うことが好ましい。

本発明において細胞培養に用いられる培地は、糖、アミノ酸、各種栄養物質、血清、成長因子、無機質などの細胞の成長および増殖などに必須の要素を含む生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で幹細胞などの細胞の成長および増殖のための混合物を意味する。本発明において用いられる培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０，ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１０）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１２）、α−ＭＥＭ（α−ＭｉｎｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、およびＫｎｏｃｋＯｕｔＤＭＥＭなどの商業的に製造された培地または人為的に合成された培地を含むが、これらに限定されない。

以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

実施例１：幹細胞にトロンビン処理によるエキソソーム分泌および効能増強誘導
１−１．トロンビンによるエキソソーム分泌誘導
ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（３×１０^５個）を６０ｍｍの培養皿（ｏｒａｎｇｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃４４５０２００）に分注した後、１週間培養した。培養皿に細胞が飽和増殖したことを確認した後、５０ｕｎｉｔ／ｍｌのトロンビン（ＲＥＹＯＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，ＬＴＤ）が希釈されている血清フリー培養培地（ＭＥＭａｌｐｈａｍｅｄｉａ）に交替し、さらに６時間培養した。

この際、トロンビン処理により間葉系幹細胞でエキソソームの分泌が活性化するかを確認するために、エキソソームの分泌過程をＴＥＭ（ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）イメージにより確認した。その結果、図１に示されたように、トロンビンによる刺激がエキソソームの分泌を誘導することが分かった。

その後、前記培養液を遠心分離チューブに分けて入れて、４℃、１００，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を新しいチューブに移して、細胞残余物（ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。さらに、前記上澄み液を４℃、１００，０００ｒｐｍで２時間超遠心分離した後、上澄み液をさらに除去して、エキソソームを収得した（最終濃度：１５μｇ／ｍｌ）。

この際、収得した産物がエキソソームであるか否かを確認するために、公知のエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）の発現をウェスタンブロットを用いて検証した。その結果、図２に示されたように、トロンビン処理された幹細胞から収得したエキソソームは、正常にＣＤ６３およびＣＤ９を発現しており、エキソソームであることが確認された。

１−２．トロンビンによるエキソソーム効能増強
前記実施例１−１で収得したエキソソームがトロンビン処理により成長因子やＩＬ−６のような抗炎症サイトカインなどの発現が増加したかを確認した。

具体的には、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を利用して前記エキソソーム膜を溶解した後、エキソソーム内の蛋白質を分離して、エキソソーム内ＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６の量をＰｒｏｃａｒｔａｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｋｉｔ（ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、米国）で測定した。

その結果、図３に示されたように、トロンビン処理によりエキソソーム内ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）の発現が、トロンビン非処理幹細胞から収得したエキソソーム（対照群、ｎｏｒｍａｌ）に比べて増加したことを確認した。

このような結果は、トロンビン処理により幹細胞由来エキソソームの細胞再生、血管再生、抗炎症効能が増強されることを意味する。

実施例２：トロンビン処理幹細胞由来のエキソソームに対するｉｎｖｉｔｒｏ肺細胞死滅抑制効果
２−１．肺細胞死滅抑制効果
ラット肺上皮細胞株（ｒａｔｐｕｌｍｏｎａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ、韓国細胞株バンク）Ｌ２ｃｅｌｌｌｉｎｅにＨ_２Ｏ_２を１時間処理して、酸化的損傷（ｏｘｉｄａｔｉｖｅｉｎｊｕｒｙ）を誘導することにより、高濃度酸素誘導肺疾患（ｈｙｐｅｒｏｘｉｃｌｕｎｇｄｉｓｅａｓｅ）のｉｎｖｉｔｒｏモデルを製作した。

その後、前記実施例１で収得したエキソソーム、すなわちトロンビン処理幹細胞から収得したエキソソーム（１０ｕｇ）を前記ｉｎｖｉｔｒｏモデルに処理した後、ＭＴＴアッセイを用いて肺細胞の生存率を測定した。

その結果、図４に示されたように、トロンビン処理幹細胞から収得したエキソソーム（Ｔｈｅｘｏ）は、トロンビン非処理幹細胞から収得したエキソソーム（ＮＣｅｘｏ）や線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）から収得したエキソソーム（ｆｉｂｒｏｅｘｏ）に比べて肺細胞の死滅が顕著に抑制されることを確認し、これを通じて、本発明のトロンビン処理エキソソームの肺細胞保護効果が最も優れていることを検証した。

２−２．エキソソーム濃度による効果
前記実施例２−１の高濃度酸素誘導肺疾患（ｈｙｐｅｒｏｘｉｃｌｕｎｇｄｉｓｅａｓｅ）のｉｎｖｉｔｒｏモデルを利用して、エキソソームの肺細胞死滅抑制効果が濃度依存的に発揮されるかを確認した。

具体的には、前記実施例１で収得したエキソソーム、すなわちトロンビン処理幹細胞から収得したエキソソームをそれぞれ２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、および２０μｇの濃度で前記ｉｎｖｉｔｒｏモデルに処理した後、ＭＴＴアッセイを用いて肺細胞の生存率を測定した。

その結果、図５に示されたように、エキソソームは、濃度依存的に肺細胞死滅抑制、すなわち肺細胞保護効果を発揮することを確認することができた。

実施例３：トロンビン処理幹細胞由来のエキソソームに対するｉｎｖｉｖｏ治療効果
３−１．気管支肺異形成症動物モデル製作
すべての動物実験は、三星生命科学研究所の実験動物委員会（ＲｅｓｅａｒｃｈＡｎｉｍａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＳａｍｓｕｎｇＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、韓国）により承認を受け、機関のガイドラインに従った。

まず、気管支肺異形成症動物モデルを製作するために、在胎期間を正確に把握することができる妊娠したＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（大韓バイオリンク、韓国）を購入した後、実験動物飼育施設で飼育した。この際、飼育は、６９．５×５０．０×３２．０ｃｍサイズのアクリルボックス（密閉されたＰｌｅｘｉｇｌａｓケージ）で１気圧下に十分な湿度（４０〜６０％）と温度（２３〜２６℃）を維持した。

その後、母ラットから自然分娩されて生まれた新生ラットに出生直後（出産後１０時間内）から高濃度酸素を１４日間８５〜９０％以上の酸素飽和度が維持されるようにケージ内に持続的に投与した。また、母ラットの酸素毒性による肺水腫を防ぐために、２４時間の周期で母ラットを室内空気または酸素条件に移動させながら１４日間続いて飼育した。

３−２．エキソソーム投与後の治療効果検証
前記実施例１の方法で収得したエキソソーム、すなわちトロンビン処理により効能増強されたエキソソーム２０ｕｇをＦＢＳフリー−ＭＥＭに懸濁させ、０．０５ｍｌの懸濁液を２６ゲージ針を利用して、前記実施例３−１で高濃度酸素に露出させた出生５日目のラットの気道内に投与した。

その後、実験１４日目に新生ラットにペントバルビタールを腹腔内注射して麻酔を行った後、四肢固定後、胸郭を切開して、心臓と肺組織を露出させた。このうち一部のラットは、氷冷ＰＢＳ溶液で心臓灌流を行った後、心臓と肺を共に摘出し、気管支に管を入れ、堅固に固定させ、４％ホルムアルデヒド固定液を入れて、２５ｃｍをＨ_２Ｏの圧力で一定に膨らませた後、一晩中、同一の固定液で固定した。その後、下記の実験をそれぞれ行った。

組織観察：Ｈ＆Ｅ染色
４％ホルムアルデヒドで２４時間固定させた前記肺組織の断片をパラフィンに包埋させた後、４μｍの厚さでカットして、ヘマトキシリン／エオシン組織染色して、光学顕微鏡で組織観察することにより、高濃度酸素で損傷誘導された肺組織に対して幹細胞と幹細胞由来エキソソームの治療的効果を比較評価した。

その結果、図６ａに示されたように、正常ラットの肺組織（ＮＣ）に比べて気管支肺異形成症が誘導されたラットの肺組織（ＨＣ）は、肺胞損傷が激しく、このような肺胞損傷に対して本発明のトロンビン誘導された幹細胞由来エキソソーム投与群（Ｈ＋ＭＳＣ−ＥＶ）は、幹細胞投与群（Ｈ＋ＭＳＣ）と同様に肺胞保護／治療効果を示した。他方で、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に由来するエキソソーム投与群（Ｈ＋Ｆｉｂｒｏ−ＥＶ）は、幹細胞由来エキソソームとは異なって、治療的効果が殆どないことを示していて、エキソソームが由来したソース（ｓｏｕｒｃｅ）細胞特異的に治療効果が決定されることが分かる。

また、肺胞損傷程度を平均線形指数（ｍｅａｎｌｉｎｅａｒｉｎｄｅｘ）で定量化した結果、図６ｂに示されたように、正常群（ＮＣ）に比べて気管支肺異形成症モデル群（ＨＣ）で肺胞の発達が損傷して、平均線形指数が有意に高く示されたが、気管支肺異形成症モデルに幹細胞を投与した群（ＨＭ）やトロンビン誘導幹細胞由来エキソソームを投与した群（ＨＭ−ｅｖ）においては、肺損傷が好転して、平均線形指数の数値が顕著に低くなったことが分かる。これに対し、線維芽細胞に由来するエキソソーム投与群（ＨＦ−ｅｖ）は、幹細胞由来エキソソームとは異なって、治療的効果が殆どないことが分かる。

細胞死滅分析：ＴＵＮＥＬアッセイ
ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋ−ｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇａｓｓａｙ）は、細胞死滅程度を測定する染色方法であると広く知られている。死滅する細胞のＤＮＡは、正常細胞とは異なって、３’−ＯＨＤＮＡ末端を露出させた切断されたＤＮＡ断片を有するので、ＴｄＴ（ＴｅｒｍｉｎａｌＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）という酵素を利用して３’−ＯＨＤＮＡ末端にフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）で標識させて、死滅する細胞を正常細胞と区別して測定することができるようにする方法であって、ＴＵＮＥＬ陽性染色細胞数が多いほど死滅した細胞が多いことを意味する。

具体的には、脱パラフィン化した５μｍの肺区域（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄ５μｍｌｕｎｇｓｅｃｔｉｏｎｓ）を製作した後、ｉｎｓｉｔｕｃｅｌｌｄｅａｔｈｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｓ７１１０ＡｐｏｐＴａｇ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して製造社のプロトコルによって分析を行った。

その結果、図７ａおよび図７ｂに示されたように、前記Ｈ＆Ｅ組織染色の結果と一致することが分かった。すなわち、正常ラットの肺組織（ＮＣ）に比べて気管支肺異形成症が誘導されたラットの肺組織（ＨＣ）は、細胞死滅が激しく、このような細胞死滅に対して本発明のトロンビン誘導された幹細胞由来エキソソーム投与群（Ｈ＋ＭＳＣ−ＥＶ）は、幹細胞投与群（Ｈ＋ＭＳＣ）と同様に、細胞死滅抑制効果を示した。他方で、線維芽細胞に由来するエキソソーム投与群（Ｈ＋Ｆｉｂｒｏ−ＥＶ）は、幹細胞由来エキソソームとは異なって、細胞死滅抑制効果が殆どないことを示していて、エキソソームが由来したソース細胞特異的に治療効果が決定されることがわかる。

血管新生分析：フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）
本発明のトロンビン誘導された幹細胞由来エキソソームが血管新生を誘導して気管支肺異形成症の治療効果を発揮するかを確認するために、間葉系細胞が血管内皮細胞に分化するとき、合成分泌するフォン・ヴィレブランド因子（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ；ｖＷｆ）の活性を観察することにより、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）程度を分析した。

具体的には、脱パラフィン化した５μｍの肺区域（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄ５μｍｌｕｎｇｓｅｃｔｉｏｎｓ）を製作した後、ｖＷｆを追跡するために、抗−ｖＷＦ１次抗体（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｍａｒｋｅｒｓ，ｒａｂｂｉｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌｓ，Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびビオチン化２次抗体を使用して免疫蛍光染色を行った。その後、肺区域（ｌｕｎｇｓｅｃｔｉｏｎ）に存在するｖＷＦの量は、ＩｍａｇｅＪ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を利用して免疫蛍光染色の蛍光強度を測定することにより評価した。

その結果、図８ａおよび図８ｂに示されたように、正常ラットの肺組織（ＮＣ）に比べて気管支肺異形成症が誘導されたラットの肺組織（ＨＣ）は、血管形成が減少し、このような血管形成減少に対して本発明のトロンビン誘導された幹細胞由来エキソソーム投与群（Ｈ＋ＭＳＣ−ＥＶ）は、幹細胞投与群（Ｈ＋ＭＳＣ）と同様に、血管新生効果を示した。他方で、線維芽細胞に由来するエキソソーム投与群（Ｈ＋Ｆｉｂｒｏ−ＥＶ）は、幹細胞由来エキソソームとは異なって、血管新生効果が殆どないことを示していて、エキソソームが由来したソース細胞特異的に治療効果が発揮されることがわかる。

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解されなければならない。

本発明のエキソソームに基づいた治療剤によれば、従来の幹細胞治療剤が有する問題である移植拒絶反応や製造コストなどの問題を解決しながらも、治療効能を顕著に改善できるため、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を含む多様な慢性肺疾患の治療に有用に用いられる。

Claims

幹細胞に由来するエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、慢性肺疾患（ＣｈｒｏｎｉｃＰｕｌｍｏｎａｒｙＤｉｓｅａｓｅ）の予防または治療用薬学的組成物であって、前記慢性肺疾患は気管支肺異形成症であり、前記幹細胞は間葉系幹細胞であり、前記幹細胞はトロンビンで処理されたものである、予防または治療用薬学的組成物。
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、または胎盤に由来する、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物は、個体の気道または血管内に投与される、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物は、培養培地、サイトカイン、成長因子、および遺伝子よりなる群から選択される補助成分をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記エキソソームは、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子、または再生因子の発現が、トロンビンで処理されていない幹細胞に由来するエキソソームと比ベて増加している、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記成長因子は、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、またはＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）である、請求項５に記載の薬学的組成物。
請求項１に記載の組成物を含有する、慢性肺疾患（ＣｈｒｏｎｉｃＰｕｌｍｏｎａｒｙＤｉｓｅａｓｅ）の予防または治療用薬学製剤であって、前記慢性肺疾患が気管支肺異形成症である、予防または治療用薬学製剤。
前記製剤は、注射剤形、注入剤形、または噴霧剤形である、請求項７に記載の薬学製剤。
前記製剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項７に記載の薬学製剤。
下記の段階を含む、請求項１に記載の薬学的組成物の製造方法：
（ａ）トロンビンを含む培養液中で幹細胞を培養する段階；
（ｂ）前記段階（ａ）の前記培養液からエキソソームを分離する段階；および
（ｃ）前記段階（ｂ）で分離したエキソソームを有効成分として含有する組成物を製造する段階。
前記段階（ａ）のトロンビンは、培地内に１〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１０に記載の製造方法。
前記段階（ｃ）のエキソソームは、遠心分離される、請求項１０に記載の製造方法。
前記遠心分離は、５，０００〜５００，０００ｇで１０分間〜５時間行われる、請求項１２に記載の製造方法。