KR20170119019A

KR20170119019A - 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 만성폐질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170119019A
Application number: KR1020160046197A
Authority: KR
Inventors: 장윤실; 박원순; 성동경; 안소윤
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2017-10-26
Also published as: CN109069541A; EP3443966B1; KR101843634B1; WO2017179840A1; US20190153383A1; JP6796143B2; US10723997B2; JP2019511509A; EP3443966A1; EP3443966A4

Abstract

본 발명은, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 만성 폐질환(Chronic Pulmonary Disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 이를 함유하는 약학 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 엑소좀 기반 치료제에 의하면, cell-free 제제이기 때문에 발암의 위험성이 적고 이식거부 반응의 문제가 없을 뿐만 아니라, 전신 투여시 미세혈관에 폐색을 일으킬 우려가 없으며, 세포가 아닌 분리물질로써 off the shelf 제품으로의 약제 개발이 가능하므로 제조단가를 줄일 수 있고, 트롬빈 처리 효과에 의해 낮은 농도의 엑소좀으로도 만성 폐질환 치료 효과가 우수하다는 장점이 있다.

Description

트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 만성폐질환 치료용 조성물{Compositions for Treating Chronic Lung Diseases Comprising Exosome Derived from Stem Cell Treated with Thrombin}

본 발명은, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 만성 폐질환(Chronic Pulmonary Disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 이를 함유하는 약학 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

기관지 폐 이형성증(BPD: bronchopulmonary dysplasia)은 주로 미숙아에서 호흡부전이나 이로 인한 인공호흡기 치료로 인하여 발생하는 발달성 만성 폐질환으로서, 최근 폐의 미숙 정도가 특히 더 심하여 BPD의 발병위험이 더욱 더 높은 출생체중 1,000gm 미만의 초극소 미숙아 치료가 활발하게 진행됨으로써 이 질환의 발병빈도는 급격히 증가하고 있다. BPD는 신생아 특히 미숙아 사망의 주요 원인질환일 뿐만 아니라 생존아의 경우에도 입원기간이 장기화되고, 폐동맥고혈압과 같은 심각한 후유증을 유발하거나 퇴원 이후에도 바이러스성 급성 모세기관지염과 폐렴 등으로 재입원이 필요한 경우가 50% 이상이며 또한 장기적으로 기관지의 과민성이 증가되어 기관지 천식으로 전환되는 경우도 많고, 궁극적으로 뇌성마비와 같은 심각한 신경학적 후유증과 연관되는 것으로 알려져 있다.

종래, 미숙아의 BPD를 치료하는 방법으로는, 신생아 및 미숙아의 인공환기 치료시 양압환기에 의한 압력, 부피 손상, 산소농도를 줄여 치료해 보려는 물리적인 노력이 주를 이루었고, 손상된 폐염증을 줄이는 치료인 스테로이드 요법이 함께 사용된 바 있으나, 미숙아에서 사용하는 경우 신경학적으로 좋지 않은 예후, 특히 뇌성마비의 증가와 연관이 있다는 보고가 있어 사용이 제한되고 있는 실정이다. 따라서, 신생아/미숙아의 BPD는 그 난치성으로 인하여 효과적이고 뚜렷한 치료법의 개발이 매우 중요하고도 시급하다.

중간엽 줄기세포는 그 다분화능과 함께, 조직의 재생, 치료 및 면역 반응에 관여하는 세포로 알려져 있어, 이와 같은 특성을 이용하여 제대혈, 골수 등로부터 중간엽 줄기세포를 분리배양하여 BPD와 같은 만성 폐질환에 대한 치료제로 개발하고자 하는 노력이 있어왔다. 그러나, 이러한 줄기세포 자체를 이용한 치료법은 다음과 같은 한계와 부작용의 문제가 있어 왔다.

첫째, 기본적으로 세포 치료제는 DNA transfer로 인한 발암(tumorogenicity) 가능성을 배제할 수 없고,

둘째, 줄기세포 자체의 큰 사이즈로 인하여 혈관 폐색(vascular obstruction)이나 심근경색을 유발할 수 있으며(Circ Heart Fail. 2010;3:e5-e6 참조)

세째, 제대혈과 같은 동종세포를 사용하여 이식시(동종이식) 세포 표면항원(surface antigen)으로 인한 거부반응의 문제가 있으며,

네째, 일반적으로 세포 치료제는 제조공정이 까다롭고 보관운송에 제약이 많아 생산비용이 높다는 한계가 있다.

이와 같이, 줄기세포가 갖고 있는 원천적 한계로 인하여, 부작용을 줄이면서도 치료효과를 증진시키기 위한 방안들로서 유전자 조작을 이용한 효능개선 방법이 개발된 바 있으나, 현재까지 뚜렷한 대안은 없는 실정이다.

한편, 엑소좀은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭(대략 30-100 nm의 직경)으로서, 전자현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것이 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 한다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려졌다.

특히, 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있어 세포 간 커뮤니케이션 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 줄기세포에 비해 동물 혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배재할 수 있다. 이러한 엑소좀의 특성을 고려할 때 엑소좀을 이용한 세포치료법은 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 패러다임이 될 것으로 기대된다.

이에, 본 발명자들은 BPD를 포함하는 만성 폐질환에 있어서, 줄기세포 치료제가 갖는 제약을 극복하면서도 치료 효능을 개선시키기 위해 예의 연구한 결과, 줄기세포 유래의 엑소좀, 특히 트롬빈으로 처리한 줄기세포에서 유래된 엑소좀이 세포 사멸에 대한 보호 효과 및 혈관신생 효과가 현저하게 증가한다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은, 트롬빈으로 처리한 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는, 만성 폐질환(Chronic Pulmonary Disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 만성 폐질환(Chronic Pulmonary Disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 만성 폐질환은, 기관지 폐 이형성증(Bronchopulmonary dysplasia), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 폐기종(emphysema), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 또는 말초 소기도 질환(Peripheral small airway diseases)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 만성 폐질환은 기관지 폐 이형성증(Bronchopulmonary dysplasia)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 개체의 기도 또는 혈관내로 투여되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 배양배지, 사이토카인, 성장인자 및 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 보조성분을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 엑소좀은 성장인자, 면역조절인자, 항산화인자 또는 재생인자의 발현이 증가되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 성장인자는 BDNF(brain-derived neurotropic factor), FGF(fibroblast growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), NGF(nerve growth factor), 또는 VEGF(vascular endothelial growth factor)인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 상기 조성물을 함유하는, 만성 폐질환(Chronic Pulmonary Disease)의 예방 또는 치료용 약학 제제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제제는 주사제형, 주입제형 또는 분무제형인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 제제는 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, (a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 분리한 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 상기 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (a)의 트롬빈은 배지내에 1-1000 unit/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)의 엑소좀은 원심분리를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 원심분리는 5,000-500,000 g에서 10분 내지 5시간 동안 행해지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 엑소좀 기반 치료제에 의하면, cell-free 제제이기 때문에 DNA가 포함되지 않아 발암의 위험성이 적고 세포 표면항원이 없어 이식거부 반응의 문제가 없다.

또한, 세포보다 size가 매우 작기 때문에 전신 투여시 미세혈관에 폐색을 일으킬 우려가 없으며, 세포가 아닌 분리물질로써 off the shelf 제품으로의 약제 개발이 가능하므로 제조단가를 줄일 수 있다.

또한, 비처리 줄기세포에 비하여 트롬빈으로 처리한 줄기세포에서 유래된 엑소좀이 적은 양으로도 만성 폐질환 치료 효과가 우수하므로, 치료적 용량의 엑소좀을 생성하기 위한 줄기세포의 요구량을 현저히 감소시켜 치료제 생산 비용을 현저하게 낮출 수 있는 장점이 있다.

따라서, 본 발명에 의하면 종래 줄기세포 치료제가 갖는 문제를 해결하면서도 치료 효능을 현저히 개선할 수 있는 바, 기관지 폐 이형성증(BPD)을 포함하는 다양한 만성 폐질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은, 줄기세포에 트롬빈 처리시 엑소좀의 분비가 활성화되는 과정을 TEM 이미지 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 2는, 트롬빈 처리된 줄기세포 유래의 엑소좀에서 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9가 정상적으로 발현되는지를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 3은, 트롬빈 처리에 의해 엑소좀내 성장인자(BDNF, FGF, HGF, NGF, VEGF), 항염증 사이토카인(IL-6) 등의 발현이 증가됨을 보여주는 면역분석 결과이다.
도 4는, 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀에 대한 in vitro 폐세포 사멸억제 효과를 보여주는 MTT assay 결과이다.
도 5는, 엑소좀이 농도 의존적으로 폐세포 사멸 억제효과를 발휘함을 보여주는 MTT assay 결과이다.
도 6은, 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀에 대한 in vivo 기관지 폐 이형성증(BPD) 동물모델에서의 폐포 손상 치료효과를 보여주는 H&E staining 결과로서, 도 6A는 조직염색 현미경 사진이고, 도 6B는 폐포 손상 정도를 정량화한 그래프이다.
도 7은, 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀에 대한 in vivo 기관지 폐 이형성증(BPD) 동물모델에서의 세포사멸(apoptosis) 보호효과를 보여주는 TUNEL assay 결과로서, 도 7A는 TUNEL 염색 현미경 사진이고, 도 7B는 TUNEL 양성 세포수를 정량화한 그래프이다.
도 8은, 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀에 대한 in vivo 기관지 폐 이형성증(BPD) 동물모델에서의 혈관신생 유도효과를 보여주는 van Willebrand factor(vWf) 분석 결과로서, 도 8A는 항-vWf 면역형광염색 사진이고, 도 8B는 이를 정량화한 그래프이다.

본 발명에서 '줄기세포'란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 '제대혈'은 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액을 의미한다. 제대혈은 출산 시 자연적으로 발생하는 부산물로서, 여러 차례의 수술을 필요로 하는 골수 등의 일반 간엽조직보다 훨씬 채취가 용이하고, 골수 이식에 비해 제대혈 보관산업이 활성화되어 이미 인프라가 구축되어 있으므로 공여자를 구하는 것도 용이하다. 이와 더불어, 제대혈 유래 세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 가장 중요한 원인인 조직적합항원 HLA-DR(class II)이 발현되지 않는 세포이므로, 기존의 이식수술시 문제가 되었던 거부반응 등의 면역반응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있어, 자가유래 제대혈은 물론 타가유래 제대혈 또한 사용할 수 있다.

본 발명에서 '엑소좀(exosome)'이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은(대략 30-100 nm의 직경) 소낭을 의미하며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 상기 엑소좀은 자연적으로 분비된 것이거나, 혹은 인공적으로 분비된 것을 포함한다.

본 발명에서, '만성 폐질환'이란 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환을 의미한다. 예를 들면, 기관지 폐 이형성증(Bronchopulmonary dysplasia), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 폐기종(emphysema), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 또는 말초 소기도 질환(Peripheral small airway diseases)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 기관지 폐 이형성증(Bronchopulmonary dysplasia)이다.

본 발명에서, '만성 폐질환의 예방 또는 치료'란, 만성 폐질환의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함하며, 만성 폐질환이 걸릴 가능성을 낮추는 것을 포함하는 의미이다.

본 발명에서, '트롬빈(thrombin) 처리된 줄기세포'는 비처리 줄기세포에 비하여 cell viability, oxidative function 등 세포 안정성에는 변화 없이 줄기세포의 주된 작용기전인 paracrine property의 증가로 인하여 줄기세포 기능/효능이 강화될 수 있다. 나아가 트롬빈 처리로 인하여, 줄기세포에서 유래된 엑소좀의 치료 효능을 강화시킬 뿐만 아니라, 엑소좀의 분비량을 증가시킬 수 있다.

이때, paracrine으로는 성장인자, 면역조절인자, 항산화인자 또는 재생인자가 증가될 수 있으며, 특히 성장인자는 세포 분열이나 생장, 분화를 촉진하는 단백질성의 생리활성물질을 의미하는 것으로, BDNF(brain-derived neurotropic factor), FGF(fibroblast growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), NGF(nerve growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), IL-6(Interleukin-6) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 특별한 제한없이 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구 또는 비경구 방식으로 투여될 수 있으나, 기도 또는 혈관 내로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀과 함께 만성 폐질환의 치료 효과를 갖는 공지의 보조성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 예를 들면, 만성 폐질환 치료에 효과적인 유전자[예컨대, 항-염증성 사이토카인(anti-inflammatory cytokine) 유전자, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)에 대한 siRNA 또는 안티-센스 프라이머(antisense primer)] 또는 이를 포함하는 발현벡터, 자가분비(autocrine) 또는 측분비(paracrine) 효과를 제공하는 사이토카인[예컨대, 인터루킨 (interleukin)-10], 성장인자[예컨대, 케라틴 형성 세포 성장인자(Keratinocyte growth factor)], 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 보조성분을 하나 이상 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 만성 폐질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 개체의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 투여는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 트롬빈 처리 농도는 줄기세포/엑소좀의 효능을 강화시키는 데 적합한 농도이면 족하고 특별한 제한은 없으나, 배지에 1-1000 unit/ml 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 엑소좀을 분리하는 방법에는 제한이 없으며, 예를 들면 배양액에서, 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동, 폴리머를 이용한 분리 등의 방법 및 이들의 조합을 이용하여 분리할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리/초원심분리이다. 이때, 원심분리/초원심분리는, 4℃, 5,000-500,000 g에서 10분 내지 5시간 동안 행하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 세포 배양에 이용되는 배지는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium) 및 KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 줄기세포에 트롬빈 처리에 의한 엑소좀 분비 및 효능증강 유도

1-1. 트롬빈에 의한 엑소좀 분비 유도

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(3×10⁵개)를 60 mm 배양접시(orange scientific cat# 4450200)에 분주 후 1주일간 배양하였다. 배양접시에 세포가 포화 증식된 것을 확인한 후, 50 unit/ml 트롬빈(REYON Pharmaceutical.Co.,LTD)이 희석되어 있는 혈청프리-배양배지(MEM alpha media)로 교체하고, 다시 6시간 동안 배양하였다.

이때, 트롬빈 처리에 의해 중간엽 줄기세포에서 엑소좀의 분비가 활성화되는지 확인하기 위하여 엑소좀의 분비 과정을 TEM(Transmission Electronic Microscopy) 이미지를 통해 확인하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 트롬빈에 의한 자극이 엑소좀의 분비를 유도함을 알 수 있었다.

이후, 상기 배양액을 원심분리 튜브에 나누어 담아 4℃, 100,000 rpm에서 30분간 원심분리하였으며, 상층액을 새 튜브에 옮겨 세포 잔여물(debris)을 제거하였다. 다시, 상기 상층액을 4℃, 100,000 rpm에서 2시간 동안 초원심분리한 후, 상층액을 더욱 제거하여 엑소좀을 수득하였다(최종 농도: 15 μg/ml).

이때, 수득한 산물이 엑소좀이 맞는지 확인하기 위하여, 공지의 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9(System Bioscience, Mountain View, CA, USA)의 발현을 웨스턴 블랏을 통하여 검증하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 수득한 엑소좀은 정상적으로 CD63 및 CD9를 발현하고 있었는 바, 엑소좀임을 컨펌하였다.

1-2. 트롬빈에 의한 엑소좀 효능 증강

상기 실시예 1-1에서 수득한 엑소좀이 트롬빈 처리에 의하여 성장인자나 IL-6와 같은 항염증 사이토카인 등의 발현이 증가되었는지 확인하였다.

구체적으로는, 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 상기 엑소좀 막을 용해한 후, 엑소좀 내의 단백질을 분리하여 엑소좀 내 BDNF, FGF, HGF, NGF, VEGF, IL-6의 양을 Procarta immunoassay kit(affymatrix, 미국)로 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 처리에 의해 엑소좀 내 BDNF(brain-derived neurotropic factor), FGF(fibroblast growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), NGF(nerve growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), IL-6(Interleukin-6)의 발현이, 트롬빈 비처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀(대조군, normal)에 비하여 증가되었음을 확인하였다.

이러한 결과는 트롬빈 처리에 의해 줄기세포 유래 엑소좀의 세포재생, 혈관재생, 항염증 효능이 증강됨을 의미하는 것이다.

실시예 2: 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀에 대한 in vitro 폐세포 사멸억제 효과

2-1. 폐세포 사멸 억제 효과

래트 폐 상피세포주(rat pulmonary epithelial cells, 한국세포주은행) L2 cell line에 H₂O₂를 1시간 처리하여 산화적 손상(oxidative injury)을 유도함으로써, 고농도 산소 유도 폐질환(hyperoxic lung disease)의 in vitro 모델을 제작하였다.

이후, 상기 실시예 1에서 수득한 엑소좀, 즉 트롬빈 처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀(10ug)을 상기 in vitro 모델에 처리한 후, MTT assay를 통하여 폐세포의 생존률을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀(Th exo)은, 트롬빈 비처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀(NC exo)이나 fibroblast에서 수득한 엑소좀(fibro exo)에 비하여 폐세포 사멸이 현저히 억제됨을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 트롬빈 처리 엑소좀의 폐세포 보호 효과가 가장 우수함을 검증하였다.

2-2. 엑소좀 농도에 따른 효과

상기 실시예 2-1의 고농도 산소 유도 폐질환(hyperoxic lung disease)의 in vitro 모델을 이용하여, 엑소좀의 폐세포 사멸 억제 효과가 농도 의존적으로 발휘되는지 확인하였다.

구체적으로는, 상기 실시예 1에서 수득한 엑소좀, 즉 트롬빈 처리 줄기세포에서 수득한 엑소좀을 각각 2.5, 5, 10 및 20 μg의 농도로 상기 in vitro 모델에 처리한 후, MTT assay를 통하여 폐세포의 생존률을 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 엑소좀은 농도 의존적으로 폐세포 사멸 억제, 즉 폐세포 보호 효과를 발휘함을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 트롬빈 처리 줄기세포 유래의 엑소좀에 대한 in vivo 치료 효과

3-1. 기관지 폐 이형성증( Bronchopulmonary dysplasia ) 동물모델 제작

모든 동물실험은 삼성생명과학연구소 실험동물위원회(Research Animal Laboratory Committee of Samsung Biomedical Research Institute, 대한민국)에 의해 승인을 받았고 기관의 가이드라인을 따랐다.

먼저, 기관지 폐 이형성증 동물모델을 제작하기 위하여, 재태기간을 정확히 알 수 있는 임신된 스프래그 돌리 백서(대한 바이오링크, 대한민국)를 구입한 후, 실험동물 사육시설에서 사육하였다. 이때, 사육은 69.5×50.0×32.0 ㎝ 크기의 아크릴 통(밀폐된 Plexiglas 케이지)에서 1기압 하에 충분한 습도(40-60%)와 온도(23-26℃)를 유지하였다.

이후, 어미 백서로부터 자연 분만되어 태어난 신생 백서에게 출생 직후(출산후 10시간 내)부터 고농도 산소를 14일간 85-90% 이상의 산소 포화도가 유지되도록 케이지 내에 지속적으로 투여하였다. 또한, 어미 백서의 산소 독성으로 인한 폐부종을 막기 위하여 24시간을 주기로 어미 쥐를 실내 공기 또는 산소 조건으로 이동시키면서 14일간 계속 사육하였다.

3-2. 엑소좀 투여후 치료효과 검증

상기 실시예 1의 방법으로 수득한 엑소좀, 즉 트롬빈 처리에 의해 효능 증강된 엑소좀 20 ug을 FBS free α-MEM에 현탁시키고 0.05 ml의 현탁액을 26 게이지 바늘을 이용하여, 상기 실시예 3-1에서 고농도 산소에 노출시킨 출생 5일째 백서의 기도 내로 투여하였다.

이후, 실험 14일째 신생 백서에게 펜토바르비탈을 복강 내 주사하여 마취를 시행한 후, 사지 고정 후 흉곽을 절개하여 심장과 폐 조직을 드러나게 하였다. 이 중 일부의 백서는 빙냉 PBS 용액으로 심장관류를 실시한 다음 심장과 폐를 함께 적출하고, 기관지로 관을 넣고 단단히 고정시키고 4% 포름알데하이드 고정액을 넣어 25 ㎝ H₂O의 압력으로 일정하게 부풀린 다음, 밤새 동일 고정액으로 고정하였다. 이후, 하기의 실험을 각각 수행하였다.

조직 관찰 : H &E staining

4% 포름알데하이드에 24시간 고정시킨 상기 폐조직의 절편을 파라핀에 포매시킨 후 4㎛의 두께로 잘라 헤마톡실린/에오신 조직염색하여 광학현미경으로 조직관찰함으로써, 고농도 산소로 손상 유도된 폐조직에 대하여 줄기세포와 줄기세포 유래 엑소좀의 치료적 효과를 비교평가하였다.

그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 정상 백서의 폐조직(NC)에 비하여 기관지 폐 이형성증이 유도된 백서의 폐조직(HC)은 폐포손상이 심하였으며, 이러한 폐포손상에 대하여 본 발명의 트롬빈 유도된 줄기세포 유래 엑소좀 투여군(H + MSC-EV)은, 줄기세포 투여군(H + MSC)과 유사하게 폐포 보호/치료 효과를 보였다. 반면, 섬유아세포(fibroblast)에서 유래된 엑소좀 투여군(H + Fibro-EV)은 줄기세포 유래 엑소좀과 달리 치료적 효과가 거의 없음을 보여주고 있어, 엑소좀이 유래된 source 세포 특이적으로 치료효과가 결정됨을 알 수 있다.

또한, 폐포손상 정도를 mean linear index로 정량화한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 정상군(NC)에 비하여 기관지 폐 이형성증 모델군(HC)에서 폐포의 발달이 손상되어 mean linear index가 유의하게 높게 나타났으나, 기관지 폐 이형성증 모델에 줄기세포를 투여한 군(HM)이나 트롬빈 유도 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 군(HM-ev)에서는 폐손상이 호전되어 mean lienar index 수치가 현저히 낮아졌음을 알 수 있다. 이에 반하여, 섬유아세포(fibroblast)에서 유래된 엑소좀 투여군(HF-ev)은 줄기세포 유래 엑소좀과 달리 치료적 효과가 거의 없음을 알 수 있다.

세포사멸 분석: TUNEL assay

TUNEL assay(Terminal deoxynucleotidyl-mediated dUTP nick-end labeling assay)는 세포 사멸정도를 측정하는 염색방법으로 널리 알려져 있다. 사멸하는 세포의 DNA는 정상 세포와 다르게 3'-OH DNA 말단을 노출시킨 조각난 DNA 절편을 가지므로, TdT(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)라는 효소를 이용하여 3'-OH DNA 말단에 fluorescein-12-dUTP(nucleotide)로 표지시켜, 사멸하는 세포를 정상 세포와 구별해 측정할 수 있게 하는 방법으로서, TUNEL 양성염색 세포수가 많을수록 사멸된 세포가 많음을 의미한다.

구체적으로는, deparaffinized 5 ㎛ lung sections을 제작한 후, in situ cell death detection kit(S7110 ApopTag, Chemicon, Temecula, CA, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 상기 H&E 조직염색의 결과와 일치함을 알 수 있었다. 즉, 정상 백서의 폐조직(NC)에 비하여 기관지 폐 이형성증이 유도된 백서의 폐조직(HC)은 세포사멸이 심하였으며, 이러한 세포사멸에 대하여 본 발명의 트롬빈 유도된 줄기세포 유래 엑소좀 투여군(H + MSC-EV)은, 줄기세포 투여군(H + MSC)과 유사하게 세포 사멸 억제 효과를 보였다. 반면, 섬유아세포(fibroblast)에서 유래된 엑소좀 투여군(H + Fibro-EV)은 줄기세포 유래 엑소좀과 달리 세포 사멸 억제 효과가 거의 없음을 보여주고 있어, 엑소좀이 유래된 source 세포 특이적으로 치료효과가 결정됨을 알 수 있다.

혈관신생 분석: von Willebrand factor ( vWF )

본 발명의 트롬빈 유도된 줄기세포 유래 엑소좀이 혈관신생을 유도하여 기관지 폐 이형성증의 치료효과를 발휘하는지 확인하기 위하여, 중간엽세포가 혈관내피세포로 분화될 때 합성분비하는 van Willebrand factor(vWf)의 활성을 관찰함으로써 혈관신생(angiogenesis) 정도를 분석하였다.

구체적으로는, deparaffinized 5 ㎛ lung sections을 제작한 후, vWf를 추적하기 위해 항-vWF 1차 항체(endothelial cell markers, rabbit polyclonals, Dako, Glostrup, Denmark) 및 biotinylated 2차 항체를 사용하여 면역형광 염색을 실시하였다. 이후, lung section에 존재하는 vWF의 양은, Image J (National Institutes of Health, USA)를 이용하여 면역형광 염색의 형광강도를 측정함으로써 평가하였다.

그 결과, 도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, 정상 백서의 폐조직(NC)에 비하여 기관지 폐 이형성증이 유도된 백서의 폐조직(HC)은 혈관형성이 감소하였으며, 이러한 혈관형성 감소에 대하여 본 발명의 트롬빈 유도된 줄기세포 유래 엑소좀 투여군(H + MSC-EV)은, 줄기세포 투여군(H + MSC)과 유사하게 혈관신생 효과를 보였다. 반면, 섬유아세포(fibroblast)에서 유래된 엑소좀 투여군(H + Fibro-EV)은 줄기세포 유래 엑소좀과 달리 혈관신생 효과가 거의 없음을 보여주고 있어, 엑소좀이 유래된 source 세포 특이적으로 치료효과가 발휘됨을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 만성 폐질환(Chronic Pulmonary Disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 만성 폐질환은, 기관지 폐 이형성증(Bronchopulmonary dysplasia), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 폐기종(emphysema), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 또는 말초 소기도 질환(Peripheral small airway diseases)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 만성 폐질환은 기관지 폐 이형성증(Bronchopulmonary dysplasia)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 개체의 기도 또는 혈관내로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 배양배지, 사이토카인, 성장인자 및 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 보조성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 엑소좀은 성장인자, 면역조절인자, 항산화인자 또는 재생인자의 발현이 증가되어 있는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 성장인자는 BDNF(brain-derived neurotropic factor), FGF(fibroblast growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), NGF(nerve growth factor), 또는 VEGF(vascular endothelial growth factor)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1 항의 조성물을 함유하는, 만성 폐질환(Chronic Pulmonary Disease)의 예방 또는 치료용 약학 제제.
제 10 항에 있어서, 상기 제제는 주사제형, 주입제형 또는 분무제형인 것을 특징으로 하는, 약학 제제.
제 10 항에 있어서, 상기 제제는 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 제제.
하기의 단계를 포함하는, 제 1 항의 약학적 조성물의 제조방법:
(a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 분리한 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제조하는 단계.
제 13 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 트롬빈은 배지내에 1-1000 unit/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 13 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 엑소좀은 원심분리를 이용하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 15 항에 있어서, 상기 원심분리는 5,000-500,000 g에서 10분 내지 5시간 동안 행해지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.