KR102278102B1 - 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 급성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

엑소좀을 유효성분으로 포함하는 급성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엑소좀을 이용한 급성 간질환의 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 급성 간질환을 예방, 증상을 개선 또는 치료하기 위한 의약품 및 식품 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

엑소좀을 유효성분으로 포함하는 급성 간질환의 예방 또는 치료용 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating acute liver diseases comprising an exosome as an active ingredient}
본 발명은 엑소좀(Exosome)을 유효성분으로 포함하는 급성 간질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
간질환의 병력이 없는 건강한 사람에게서 간기능 손상으로 인한 최초 증상 발생 후 26주 이내에 급격한 간성뇌증으로 진행과 혈액 응고 장애가 함께 나타나는 경우를 급성 간부전이라고 한다.
급성 간부전의 원인은 다양하지만, 흔히 바이러스 감염에 의한 경우와 약제 또는 독소에 의한 경우가 가장 흔하다. 가장 특징적인 임상 증상은 간성뇌증이라고 불리는 신경학적인 증후군으로 흔히 경련과 섬망과 같은 증상을 보이며, 급격히 혼수로까지 진행할 수 있을 정도로 위험하다. 간성뇌증과 함께 뇌부종이 나타날 수 있는데, 이는 급격한 뇌압의 상승으로 인한 뇌간의 헤르니아(hernia; 장기의 일부가 원래 있어야 할 장소에서 벗어난 상태)를 유발하여 환자의 상태를 위협하게 된다.
급성 간부전의 치료의 경우, 간이식 치료와 각종 합병증의 치료로 구분할 수 있는데 간이식이란 급성 간부전의 최종적인 치료법이며 생존율을 높일 수 있는 유일한 방법이다. 그럼에도 급성 간부전의 경우 간성뇌증을 포함하는 다양한 심각한 합병증이 동반되기 때문에 병의 경과 및 치료 결과가 매우 좋지 않은 문제가 있다.
반면에, 간섬유화는 간세포가 파괴되고 정상조직이 반흔조직으로 대치되면서 간의 기본구조 변화 및 간기능이 상실되는 만성적이며 진행적인 질환이라는 점에서 급성 간부전과는 상이한 질병이며, 본 발명은 세포사멸의 억제와 염증반응 완화 효과를 통해 환자의 생존률을 높이고 간수치를 개선하는 것이므로 기존의 간섬유화 방지를 위한 약학적 조성물 등과는 큰 차이가 있음이 분명하다.
한편, 성체줄기세포의 하나인 중간엽 줄기세포는 특정 배양 조건에서 뼈, 연골, 근육 및 간 등의 중간엽 조직들로 분화할 수 있는 다능성 세포로서, 쉽게 분리할 수 있으며 일반 배지 조건에서도 분화 없이 충분한 양을 확보할 수 있다는 장점이 있다. 이외에도 동종 간 세포치료에서 세포 정착을 도와 이식된 세포의 생존기간을 연장시켜줌으로써 그 이용가치가 매우 높다.
최근에 조직재생 분야에서 중간엽 줄기세포를 이용한 세포 대체 치료뿐 만 아니라 중간엽 줄기세포로부터 생성되는 물질의 근거리분비(paracrine)에 의한 치료 효과들이 보고되고 있다. 실제로 중간엽 줄기세포는 신경, 혈관생성 및 항염증반응 등을 유도하는 다양한 물질들(세크레톰; secretome)을 분비하는 것으로 확인되었다. 이러한 세크레톰을 이용해 암이나 심장 질환 같은 질병을 완화할 수 있다는 연구들이 보고되고 있다. 따라서 조직치료 및 재생 분야에서 세크레톰을 이용한 무세포치료(cell-free therapy)의 가능성이 제시되었으나, 치료 효과를 보이는 세크레톰에 구체적으로 어떠한 성분들이 포함되어 있는지에 대한 연구는 많이 부족하며, 또한 그들이 특정 질환에서 어떤 기전 및 조절 네트워크를 통해 손상 조직의 회복에 영향을 주는지에 대한 이해가 매우 미흡하여 이를 보완할 추가 연구가 반드시 필요하다.
세크레톰을 내포한 엑소좀은 한 세포로부터 다른 세포로 특정 성분을 운반하는 중요한 매개체로서, 이를 받아들이는 세포의 유전자 발현 변화를 야기할 수 있다고 알려져 있다. 엑소좀은 40-100 nm의 크기를 지닌 입자로, 세포외 운반체 (extracellular vesicles)로서 역할을 하며 줄기세포를 비롯한 다양한 세포로부터 분비되어 혈액, 체액(biological fluid), 뇨 및 세포배양액에 존재하는 것으로 확인되었다. 이러한 엑소좀은 세포내 엔도좀 트래피킹 과정을 통해 생성된 후기 엔도좀과 원형질막의 융합을 통해 생성된다.
엑소좀은 해당 세포에서 발현하고 있는 특정 단백질과 mRNA 전사체를 포함하고 있을 뿐만 아니라 중요하게도 RNA 자체로서 유전자의 발현을 조절하는 다양한 small non-coding RNA(microRNA, piRNA 등)들도 함유되어 있다. 따라서 엑소좀은 기원한 해당 세포의 유전적 특성을 반영하고 있다고 알려져 있다. 또한 엑소좀은 40-100 nm의 작은 크기로 인하여 전신 투여(systemic administration)시 혈액 순환에서 신속하게 제거되는 것으로 알려져 있다(Gangadaran et al., Current Perspectives on In Vivo Noninvasive Tracking of Extracellular Vesicles with Molecular Imaging, BioMed Research International Volume 2017, Article ID 9158319, 11 pages).
대한민국특허등록공보 10-1860266 대한민국특허등록공보 10-1843634
질병 예방 효과를 기대하기 위해서는 특정 질병을 발병시키는 원인이 발생하기 일정한 시간 전의 투여에 의한 약제 효과의 지속성이 요구된다. 40-100 nm의 작은 크기를 갖는 엑소좀의 생체 내 신속한 클리어런스로 인하여 기존에 엑소좀을 이용한 예방약은 개발된 적이 없었으며, 엑소좀의 지속적인 작용을 통한 질병의 예방 효과는 기대되지 않았다.
엑소좀을 이용하여 여러 질환을 치료하는 조성물은 이미 알려져 있으나 본 발명과 같이 엑소좀을 미리 투여하여 특정 질환을 예방하는 연구는 전무하여 이에 대한 보다 많은 연구가 요구되고 있다.
본 발명자들은 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀이 100 nm 내지 300 nm의 큰 직경을 가지며, 이를 미리 투여한 급성 간질환 유발 동물 모델에서 급성 간손상 예방효과를 거둘 수 있다는 놀라운 사실을 확인하였고, 이는 미리 투여한 엑소좀이 면역 부착 세포를 조절하여 추후 급성 간손상 발생시 면역반응을 억제하는 메카니즘에 의하여 엑소좀의 효과 지속성을 확보함을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 엑소좀(Exosome)을 유효성분으로 포함하는, 급성 간질환 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 엑소좀(Exosome)을 포함하는, 급성 간질환 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엑소좀(Exosome)을 유효성분으로 포함하는, 급성 간염, 급성 간손상(acute liver injury) 및 급성 간부전(acute liver failure)으로 이루어진 군으부터 선택되는 급성 간질환 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 엑소좀은 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 BAX(Bcl-2-associated X protein)의 발현을 억제, 또는 카스파제-3(Caspase-3)의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 PARP{(Poly (ADP-ribose) polymerase}의 불활성화를 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 염증반응을 완화시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염증반응은 면역세포 침윤에 의한 염증반응일 수 있다.
또한, 본 발명은 엑소좀(Exosome)을 포함하는, 급성 간염, 급성 간손상(acute liver injury) 및 급성 간부전(acute liver failure)으로 이루어진 군으부터 선택되는 간질환 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 엑소좀을 이용한 급성 간질환 예방, 개선 또는 치료효과를 제공한다. 본원 실시예의 급성 간부전 유발 동물 모델에서 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 동물 모델의 경우 투여하지 않은 동물 모델에 비해 생존률이 높았으며, AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransaminase)수치가 개선되었고 세포사멸 억제효과 및 항염증 효과가 우수한 것으로 밝혀진 바 본 발명의 조성물은 급성 간질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물, 식품 조성물 등으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 LPS(Lipopolysaccharide)/GalN(D-(+)-Galactosamine)만 투여한 마우스(mouse)와 LPS/GalN과 함께 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 함께 투여한 마우스의 생존율을 비교한 결과이다.
도 2는 LPS/GalN만 투여한 마우스와 LPS/GalN과 함께 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 함께 투여한 마우스 혈청에서 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransaminase)수치를 비교한 결과이다.
도 3은 LPS/GalN만 투여한 마우스와 LPS/GalN과 함께 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 투여한 마우스 간 조직에서 세포사멸(Apoptosis)와 관련된 단백질 인자들의 발현을 분석한 결과이다.
도 4는 LPS/GalN만 투여한 마우스와 LPS/GalN과 함께 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀을 함께 투여한 마우스에서 면역세포 침윤에 의한 염증반응의 차이를 헤마톡실린과 에오진(Hematoxylin & Eosin) 염색을 통해 관찰한 결과이다.
도 5는 엑소좀을 예방 목적으로 2회 투여한 뒤, LPS/GalN 투여 후 5시간에서 ALT(alanine aminotransferase)　대비 다양한 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 엑소좀을 예방 목적으로 2회 투여한 뒤, LPS/GalN 투여 후 5시간에서 ALT(alanine aminotransferase)　대비 다양한 유전자의 mRNA 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 엑소좀을 예방 목적으로 2회 투여한 뒤, LPS/GalN 투여 후 5시간에서 각 마우스 개체 별 ALT 양과 각 마우스 간조직에서 다양한 면역세포 부착 분자들의 mRNA 발현양과의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 8은 웨스턴 블랏으로 면역 세포 부착 분자인 Vcam-1 및 Icam-1의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 미리 투여한 급성 간질환 유발 동물 모델에서 급성 간손상 예방효과를 거둘 수 있다는 놀라운 사실을 확인하였고, 이는 미리 투여한 엑소좀이 면역 부착 세포를 조절하여 추후 급성 간손상 발생시 면역반응을 억제하는 메카니즘에 의하여 엑소좀의 효과 지속성을 확보함을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀은 100 nm 초과 내지 300 nm 이하의 큰 직경을 갖는 것일 수 있다. 이러한 큰 직경을 갖는 본 발명의 엑소좀은, 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 과정에서 분자량 컷오프(Molecular Weight Cut-Off)가 300 내지 500 kDa인 필터를 사용하여 추출된 것일 수 있다.
상기 본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 정맥을 통해 전신 투여(systemic administration)하는 경우에도, 기존의 엑소좀과는 달리 엑소좀의 효과 지속성을 확보하여 급성 간질환 예방효과를 나타낼 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 엑소좀은 면역 부착 분자(immune cell adhesion molecule)의 발현을 조절하는 것에 의하여 간질환 예방 효과를 나타낼 수 있으며, 상기 면역 부착 분자는 VCAM-1 (Vascular cell adhesion protein 1), ICAM-1　(Intercellular Adhesion Molecule 1), PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1), L-셀렉틴, E-셀렉틴, P-셀렉틴 및 인테그린 베타2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상일 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에서는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 마우스의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 마우스에 비해 생존율이 유의하게 증가함을 확인하였다(실시예3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 마우스의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 마우스에 비해 개선된 AST 및 ALT수치가 나타남을 확인하였다(실시예4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 마우스의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 마우스에 비해 세포사멸과 관련된 인자인 BAX (Bcl-2-associated X protein)의 발현이 억제되고 카스파제-3(caspase-3)의 활성이 억제되었으며 끊어진 PARP(Poly (ADP-ribose) polymerase) C-term이 적게 나타나는 것을 통하여 세포사멸이 억제됨을 확인하였다(실시예5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 헤마톡실린 & 에오진 염색을 통해 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀을 투여한 급성 간부전 유발 마우스의 경우 상기 엑소좀을 투여하지 않은 마우스에 비해 염증반응이 억제됨을 확인하였다(실시예6 참조).
상기와 같은 본 발명의 실시예 결과를 통해 본 발명에 따른 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 엑소좀은 급성 간부전이 유도된 마우스의 생존율을 증가시키고 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransaminase)수치의 개선, 세포사멸 억제 및 항염증 효과가 있음을 확인하였는 바, 상기 엑소좀은 급성 간부전의 예방, 개선 또는 치료용도로 이용될 수 있다.
이에, 본 발명은 엑소좀(Exosome)을 유효성분으로 포함하는, 급성 간질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 급성 간질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 급성 간질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하고 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 엑소좀은 유전적 인자를 내포하여 한 세포에서 다른 세포로 그 유전적 인자의 정보를 전달하는 역할을 하고, 그 직경은 바람직하게는 100 nm 초과 내지 300 nm 이하일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 급성 간질환이란 급성 간염, 급성 간손상(acute liver injury) 및 급성 간부전(acute liver failure)으로 이루어진 군으부터 선택되는 것일 수 있다. 여기서, "급성 간부전"이란 간질환의 병력이 없는 건강한 사람에게서 간기능 손상으로 인한 최초 증상 발생 후 26주 이내에 급격히 간성뇌증과 혈액 응고장애로 진행하는 경우를 말하며, 황달이 생긴 지 7일 이내 간성뇌증이 발생하는 경우를 초급성 간부전, 7일~3주 내에 발생하는 경우 급성 간부전, 3주~26주 내에 발생하는 경우는 급성 간부전으로 분류한다. 급성 간부전의 원인은 다양하지만, 흔히 바이러스 감염에 의한 경우와 약제 또는 독소에 의한 경우가 가장 흔하며 가장 특징적인 임상 증상은 간성뇌증이라고 불리는 신경학적인 증후군으로 흔히 경련과 섬망과 같은 증상을 보이며, 급격히 혼수로까지 진행할 수 있을 정도로 위험하다. 치료는 간이식 치료와 각종 합병증의 치료로 구분할 수 있으며 간이식이란 급성 간부전의 최종적인 치료법이며 생존율을 높일 수 있는 유일한 방법이다. 각종 합병증의 치료는 간이식이 가능한 병원의 중환자실에서 면밀한 진단 및 검사를 통해 시행되어야 한다. 급성 간부전의 경우 간성뇌증을 포함하는 다양한 심각한 합병증이 동반되기 때문에 병의 경과 및 치료 결과가 매우 좋지 않다.
본 발명에서 엑소좀은 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 용어 "줄기세포"란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)"는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포이다.
지방, 골수, 제대혈 등 다양한 출처로부터 유래한 MSC는 서로 상이한 치료적 잠재력을 갖는 것으로 알려져 있다(Jin et al., Comparative Analysis of Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue, and Umbilical Cord Blood as Sources of Cell Therapy, Int J Mol Sci. 2013 Sep; 14(9): 17986-18001).
본 발명의 유효성분으로 사용하는 엑소좀은 유전적 인자를 내포하여 한 세포에서 다른 세포로 그 유전적 인자의 정보를 전달하는 신호전달체로서, 엑소좀이 추출된 세포의 상태에 의존하여 상이한 특성을 나타낸다.
예컨대 지방유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Human adipose-derived stem cells; Stem-EXO), 피부각질세포로부터 추출한 엑소좀(Human epidermal keratinocytes; K-EXO) 및 피부섬유아세포로부터 추출한 엑소좀(Human foreskin fibroblasts; F-EXO)은 내부에 포함되어 있는 생체활성인자가 서로 상이함이 확인되었다(WO2016-072821 A1).
또한 지방 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포 등 줄기세포의 출처에 따라서도 엑소좀이 상이한 특성을 가짐이 확인되었다.
본 발명에 사용되는 엑소좀은 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells)로부터 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 증식하는 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 유래한 것일 수 있다. 증식하는 줄기세포로부터 유래한 엑소좀은 줄기세포를 배양하는 과정에서 추출할 수 있다.
지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 골수 또는 제대혈에서 유래된 중간엽 줄기세포와 세포형태와 면역 표현형에서 비슷하지만, 상이한 치료적 잠재력을 가지며, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포보다 세포 군집형성 빈도가 높으므로 수율이 높은 이점이 있다.
또한, 지방조직은 자가 지방에서 추출하므로 면역거부 반응 등의 위험이 없으며, 윤리적으로도 문제가 없고, 지방조직 추출 또는 흡입 시술은 중간엽 줄기세포를 추출할 때 개체에게 줄 수 있는 통증 및 부담감이 골수유래 중간엽 줄기세포를 얻기 위한 골수 천자와 비교할 때 상대적으로 적을 것으로 판단된다.
또한 환자로부터 얻을 수 있는 골수 및 혈액의 양은 크게 제한되어 있는 반면, 지방 유래 줄기세포는 풍부한 지방조직으로부터 얻어지므로, 엑소좀 추출을 위한 원재료로서 용이하게 이용할 수 있다.
상기 지방조직은 인간, 렛트(rat), 마우스(mouse), 개, 소 등의 지방조직으로부터 수득할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 인간의 지방조직으로부터, 더 바람직하게는 환자의 자가지방조직으로부터 수득할 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 BAX(Bcl-2-associated X protein)의 발현을 억제, 또는 카스파제-3(Caspase-3)의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "BAX (Bcl-2-associated X protein)"는 bcl-2-like protein 4라고도 호칭되는 Bcl-2 패밀리 단백질 중의 하나를 의미한다. 상기 Bax는 세포의 세포사멸(apoptosis)를 촉진시키는 역할을 수행하는데, 주로 미토콘드리아의 외막에 결합된 상태로 존재하며, 그의 C-말단의 4개 잔기는 미토콘드리아 내막과 외막 사이의 막간 공간에 돌출된 상태로 존재한다. 이 단백질은 미토콘드리아 전압 의존적 음이온체널(VDAC)과 상호작용하고, 막 전위의 손실 및 시토크롬 c의 방출을 초래하는 VDAC의 개방을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "세포사멸(apoptosis)"란 세포가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식의 한 형태로 세포의 괴사나 병적인 죽음인 네크로시스(Necrosis)와는 구별된다. 아포토시스는 발생 과정에서 몸의 형태 만들기를 담당하고, 성체에서는 정상적인 세포를 갱신하거나 이상이 생긴 세포를 제거하는 일을 담당하고 있다. 암 세포 내의 세포 소실, 바이러스 감염과 약물, 방사선 등에서 일어난다는 점은 유사한 과정인 프로그램 세포사(PCD:programmed cell death)와 다른 점이다.
본 발명에서 사용하는 용어 "카스파제(caspase)"란 세포사멸의 마지막 단계에서 핵단백질과 세포내 단백질을 분해하여 실제로 세포 사망을 일으키는 주된
단백분해 효소로서 효소의 활성 부위에 시스테인(cystene)이 있으며, 기질이 되는 단백질의 아미노산 서열 중 아스파트산(aspartic acid)을 특이적으로 인식하여 그 다음 아미노산 결합을 절단하는 효소이다. 카스파제-3는 32kDa의 시스테인 프로테아제로서 포유동물의 뇌에서 형태유전학적(morphogenetic) 세포 죽음 동안 중요한 역활을 하는 이펙터 카스파제로 불활성인 효소전구체(zymogen) 상태로 존재하다가 17kDa와 12kDa 서브 유닛으로 끊어지면서 활성화 된다.
본 발명에서 상기 조성물은 염증반응을 완화시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "염증반응"이란 상처가 난 곳이 열나고 붉게 되고 부어오르며 통증을 느끼게 되는 반응이다. 염증반응은 상처부위의 비만세포로부터 나온 히스타민을 포함하여 상처를 통해 들어온 박테리아를 포식하면서 활성화된 대식세포가 분비한 사이토카인 등에 의해 시작된다.
본 발명에서 사용하는 용어 "면역세포(Immune cell)"란 선천성 면역과 후천성 면역에 관여하는 세포를 말한다. 면역세포는 자기 자신으로부터 유래되지 않은 다양한 물질을 인식하여 병원체 및 바이러스, 기생물 등으로부터 우리 몸을 방어하는 역할을 하는 세포이다. 선천성 면역에는 피부장벽, 염증반응, 보체계, 세포장벽, 자연살해세포 등이 관여하는 면역이고, 후천성 면역에는 킬러 T 세포, 도움 T 세포, B 림프구 등이 관여하는 면역이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 엑소좀을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 엑소좀(Exosome)을 포함하는, 급성 간질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예1 . 지방 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 분리 및 특성 분석
인간지방 줄기세포유래 엑소좀은 인간지방줄기세포를 배양하는 과정에서 추출하였다.
구체적으로, 인간지방줄기세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose) 배양 배지에서 배양하였다. 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청, 무항생제, 무페놀레드인 배지로 교체하여 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 상층액을 회수한 이후에는 다시 일반 배양배지를 줄기세포에 첨가하여 배양하였고, 이러한 과정은 계대 7까지 반복하였다.
회수한 세포배양 상층액은 2,000 ×g, 4 ℃에서 10분간 원심분리하는 단계와 바틀탑 필터(Bottle top filter, 공극크기; 0.22 μm)를 이용한 필터링 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거해주었다. 1차 정제단계를 거친 다음, 엑소좀 농축 및 추가정제를 위해 접선유동여과 시스템(Tangential flow filtration; TFF)을 이용하였다. 이 때, 사용한 필터규격은 MWCO(Molecular Weight Cut-Off) 300 kDa 혹은 500 kDa을 사용하였다. 필터 단계에서 엑소좀은 인산완충용액(Phosphate buffered saline, PBS)로 1~3회 세척하였다.
추출된 엑소좀은 나노입자추적분석기(Nanoparticle tracking analysis, NTA)와 단백질 정량분석을 통해 엑소좀의 농도와 단백질량을 확인하였다. 엑소좀의 농도를 평가하기 위해서 엑소좀은 하나의 프레임 당 화면으로 확인되는 나노입자수가 20 개 이상 되도록 측정하였으며, 이때 추출한 엑소좀 농도는 평균적으로 1.78 × 1010 particle/mL이고, 평균 크기는 211.6 nm 내외임을 확인하였다. 또한 BCA 단백질 정량 방법을 통해 평균 185.8 μg/mL의 단백질 농도를 확인하였다.
실시예2 . 급성 간부전 유발 동물 모델 제작
전격성 간질환 동물 모델은 먼저 3주령 ICR male 쥐를 한 주 동안 habituation 시켰다. 4주령이 되었을 때 전 날 18시간 금식 후, LPS(Lipopolysacharride) 20 μg/kg, GalN(D-(+)-Galactosamine) 800 mg/kg를 복강 내 투여하였다. 엑소좀은 예방목적으로는 마우스에서는 11마리에게 LPS/GalN 투여 2일 전부터 매일 총 두 번 정맥 내 주사로 107, 108개 엑소좀을 투여하였으며(통상 예방군), 사후 긴급예방목적으로는 마우스에서는 11마리에게 LPS/GalN 투여 후 3시간 뒤에 107, 108개 엑소좀을 투여하였다(사후 긴급예방군). 대조군으로는 마우스에서는 11마리에게 LPS/GalN만 투여하였다(대조군).
실시예3 . 급성 간부전 유발 동물 모델에 엑소좀 투여에 따른 마우스 생존율 증가 확인
마우스 생존율 측정은 LPS/GalN 투여 후 24시간 동안 측정하였으며, LPS/GalN 투여 후부터 사망까지의 시간 및 사망한 마우스의 마리 수를 측정하였다. 생존율 그래프는 GraphPad Prism 프로그램을 이용하여 그래프를 그린 후, Kaplan-Meier curves와 log-rank test를 통해 통계적으로 처리하였다. 그 결과 LPS/GalN만 투여한 쥐 11마리 중 36.36%인 4마리가 죽었으며, 각각 LPS/GalN 투여 후 6시간 35분, 7시간 30분, 8시간 20분, 10시간 6분에서 사망하였으나(대조군), 통상적인 예방목적으로 LPS/GalN 투여 2일 전부터 미리 107 혹은 108개 엑소좀을 투여한 마우스에서는 11마리 모두 LPS/GalN 투여 후 24시간 동안 100% 생존하였다(통상 예방군). 사후 긴급예방목적으로 LPS/GalN 투여 3시간 후에 엑소좀을 투여한 마우스 11마리도 24시간 동안 100% 생존하였다(사후 긴급예방군). Kaplan-Meier curves와 log-rank test를 통해 통계적으로 생존율에 대한 차이를 분석하였을 때 LPS/GalN만 투여한 군에서 유의미하게 생존율이 감소하였지만, LPS/GalN과 107 혹은 108개 엑소좀을 함께 처리한 군에서는 다시 생존율이 유의미하게 증가하였다.
실시예4 . 급성 간부전 유발 동물 모델에 엑소좀 투여에 따른 간수치 개선 확인
간 수치를 측정하기 위해 LPS/GalN 단독 투여 및 LPS/GalN과 108개 엑소좀을 동시에 투여하고, 투여 후 5시간이 되었을 때 간문맥 혹은 좌심실에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 상온에서 10분간 incubation 후, 1500g, 10분, 4℃ 원심분리 하였고, 상층액만 따서 혈청을 모았다. 모은 혈청은 간수치 분석업체를 통해 AST, ALT 수치 결과를 분석 받았다. 그 결과 대조군 대비 LPS/GalN만 투여한 쥐에서 유의미하게 증가했던 AST, ALT 수치가 LPS/GalN에 108개 엑소좀을 함께 투여한 마우스에는 다시 유의미하게 감소하였다.
실시예5 . 급성 간부전 유발 동물 모델에 엑소좀 투여에 따른 세포사멸 억제 확인
지방 유래 중간엽 줄기세포 엑소좀이 엑소좀을 투여한 마우스의 간 조직에서 세포사멸 억제 정도를 확인하기 위해 LPS/GalN 단독 투여 및 LPS/GalN과 108개 엑소좀을 함께 투여 후 5시간이 되었을 때 간 조직을 적출하였다. PBS로 washing 후 담낭을 제거하였고, 간 조직 중 Caudate Lobe를 분리하여 Western blot용 샘플 조직으로 사용하였다. 분리한 Caudate Lobe를 프로테이즈 억제제, 포스파테이즈 억제제가 포함된 Lysis buffer에 넣고 호모게나이저로 갈았다. 얼음에서 30분 incubation 후 13,000rpm, 10분, 4℃ 원심분리 하였고, 상층액만 모았다. BCA정량으로 단백질 농도를 정량 하였다. 2-Mercaptoethanol이 들어가 있는 4x 샘플 버퍼와 샘플을 섞은 후 95℃, 10분 끓였다. Immunoblotting을 통해 Active caspase-3, PARP, BAX의 단백질양을 정량 및 정성 분석하였다. 그 결과 LPS/GalN만 처리한 마우스의 간 조직에서 세포사멸의 마커인 Active Caspase-3, BAX, Cleaved PARP 단백질이 증가하였고, LPS/GalN과 108개 엑소좀을 함께 투여한 마우스에서는 감소하였다.
실시예6 . 급성 간부전 유발 동물 모델에 엑소좀 투여에 따른 항염증 효과 확인
Liver sinusoid와 중심정맥에 염증세포의 침윤정도를 확인하기 위해 LPS/GalN 단독 투여 및 LPS/GalN과 108개 엑소좀을 함께 투여 후 5시간에서 마우스 간 조직을 적출하였다. PBS로 washing 후 담낭을 제거하였고, 간 조직 중 Left Lobe를 분리하여 헤마톡실린과 에오진 염색용 샘플 조직으로 사용하였다. 간조직은 파라핀 섹션으로 단면화 하였고, 두께는 5μm로 단면화 하여 헤마톡실린 에오진 염색을 하였다. 40x 배율 광학현미경을 통해 sinusoid와 중심정맥에 침윤 되어있는 면역세포를 확인하였다. 그 결과 LPS/GalN만 투여한 마우스의 sinusoid와 중심정맥에 호중구와 단핵구 등의 면역세포 침윤이 관찰되었으나, LPS/GalN과 108개 엑소좀을 함께 투여한 마우스에서는 면역세포의 침윤이 감소하였다.
실시예7 . 급성 간부전 예방 효과를 나타내는 기전 확인
지방 유래 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 투여한 마우스에서 급성 간질환 예방 효과를 나타내는 기전을 확인하기 위하여 LPS/GalN 투여 2일 전부터 매일 총 두 번 정맥 내 주사로 107, 108개 엑소좀을 투여하고, LPS/GalN 투여 후 5시간이 되었을 때 간 조직을 적출하였다. 이로부터 다양한 유전자의 발현량을 측정한 후 그 결과를 도 5 내지 도 8에 나타내었다.
도 5는 ALT(alanine aminotransferase)　대비 다양한 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 것이다. 이 중 특히 면역 세포 부착 분자인 L-selectin 및 PSGL-1의 발현이 LPS/GalN 투여에 의하여 현저하게 증가하였으나, 미리 엑소좀을 투여한 군의 경우 이들 분자의 발현이 억제되는 것으로 확인되었다.
도 6은 ALT(alanine aminotransferase)　대비 다양한 유전자의 mRNA 발현을 확인한 결과, 면역 세포 부착 분자인 E-selectin 및 integrin β의 mRNA 발현이 LPS/GalN 투여에 의하여 현저하게 증가한 반면에, 미리 엑소좀을 투여한 군의 경우 이들 분자의 발현이 억제되었음을 보여준다.
도 7은 다양한 면역 세포 부착 분자들의 mRNA 발현을 나타낸 것이며, 도 8은 웨스턴 블랏으로 면역 세포 부착 분자인 Vcam-1 및 Icam-1의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5 내지 도 8의 실험결과, 예방을 위해 LPS/GalN 투여 48시간 전 및 24시간 전에 엑소좀을 투여한 경우 다양한 면역 세포 부착 분자들의 발현이 억제되는 것으로 확인되었는바, 이는 미리 투여한 엑소좀이 면역 부착 세포를 조절하여 추후 급성 간손상 발생시 면역반응을 억제하는 메카니즘에 의하여 예방 효과를 나타냄을 제시한다.

Claims (9)

  1. 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀(exosomes)을 유효성분으로 포함하는, 급성 간염, 급성 간손상(acute liver injury) 및 급성 간부전(acute liver failure)으로 이루어진 군으부터 선택되는 간질환 예방용 약학적 조성물로서,
    상기 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀의 직경(diameter)은 100 nm 초과 내지 300 nm 이하인 것을 특징으로 하는 간질환 예방용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 간질환이 발생하기 48시간 이전부터 발병 직전까지의 시간에 투여되는 것을 특징으로 하는 간질환 예방용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 과정에서 분자량 컷오프(Molecular Weight Cut-Off)가 300 내지 500 kDa인 필터를 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 간질환 예방용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 투여용인 것을 특징으로 하는 간질환 예방용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 조성물을 투여 받을 환자의 자가 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 것을 특징으로 하는 간질환 예방용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 간질환의 치료 효과도 함께 갖는 것을 특징으로 하는 간질환 예방용 약학적 조성물.
  9. 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀(exosomes)을 유효성분으로 포함하는, 급성 간염, 급성 간손상(acute liver injury) 및 급성 간부전(acute liver failure)으로 이루어진 군으부터 선택되는 간질환 예방용 식품 조성물로서,
    상기 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀의 직경(diameter)은 100 nm 초과 내지 300 nm 이하인 것을 특징으로 하는 간질환 예방용 식품 조성물.
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