KR20200132550A - 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포, 이의 조정 배지 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 동맥경화성 혈관질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 동맥경화성 혈관질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 타 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지들과 상이한 단백질 프로파일을 가지고 이를 통해 혈중 콜레스테롤을 저하시키며, 혈관 염증 관련 인자들의 발현 억제, LDLR(Low-Density Lipoprotein Receptor) 발현 억제, VEGF 발현 증진 등에서 현저한 효과를 보여 동맥경화성 혈관질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낸다.
본 발명의 동맥경화성 혈관질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 타 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지들과 상이한 단백질 프로파일을 가지고 이를 통해 혈중 콜레스테롤을 저하시키며, 혈관 염증 관련 인자들의 발현 억제, LDLR(Low-Density Lipoprotein Receptor) 발현 억제, VEGF 발현 증진 등에서 현저한 효과를 보여 동맥경화성 혈관질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지를 유효성분으로 포함하는 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상이 나타난다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성 질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해 요인이 된다.
VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)는 혈관내피세포 표면에서 발현되는 세포부착분자로서 대표적인 염증반응 단백질이다. 정상적인 경우 매우 낮은 수준으로 발현되어 있으나 TNF-α, 인테페론-γ, 인터루킨-1 β 등 싸이토카인류 염증매개물질에 의하여 자극을 받으면 발현량이 급속히 증가되어 혈류 중 이동하는 단핵구나 임파구 등 염증세포를 부착하고 염증세포가 염증발생 조직으로 이동하는데 역할을 한다. 따라서, VCAM-1의 발현은 염증세포가 염증발생 부위로 이동 및 집속하는 초기에 작용하여 염증반응의 증폭작용에 중요한 작용을 한다.
동맥경화성 혈관질환은 지질대사와 관련된 유전적 요인과 식습관, 흡연, 운동부족 등 환경적 요인에 의하여 동맥이 경화되는 혈관 질환으로서, 이로 인하여 심장질환, 뇌혈관 질환 등의 순환계 질환의 원인이 된다. 동맥경화의 초기 발생에 관한 가설은 "손상에 대한 반응(responce-to-injury hypothesis)"으로서, 유전적 변이, 과산화물, 혈장 호모시스테인 농도 증가, 미생물 감염 등의 원인에 의하여 혈관 내피세포가 정상적인 항상성을 유지하지 못하는 기능부전 상태가 되는 것이다. 내피세포가 기능부전 상태로 되면 세포부착물질이 크게 발현되고 세포 투과성이 증가되어 혈중 면역세포, 혈소판, 지방질 등의 부착 및 조직으로의 투과성이 증가되며, 이들 면역세포들의 염증매개인자 및 성장인자 분비 등 염증반응 때문에 동맥경화성 병변이 발생 및 발달하게 된다는 것이다. 이때 혈중 저밀도 지단백질(low density lipoprotein, 이하 LDL)이 산화, 당결합, 집적화, 당단백 결합 등의 원인으로 변형-LDL(modified-LDL, 이하 MLDL)이 생성되고, 이들은 혈관 내피세포 및 평활근의 자극 및 손상을 유발한다. 이로 인하여, 내피세포의 혈관세포부착물질-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) 발현 및 염증세포의 염증매개인자 방출이 촉진되면 LDL은 내피 세포 아래에 유입 및 축적이 되고, 축적된 LDL 및 산화된 MLDL은 다시 대식세포, T 임파구 등 면역세포의 유입 및 활성화를 유발하는 과정을 되풀이하여 병변의 염증반응을 촉진하게 된다. 그 후 병변으로 유입된 대식세포나 임파구로부터 방출된 가수분해효소, 염증매개인자, 성장인자 등의 작용으로 병반은 괴사하게 되고, 괴사된 병소 부위로 단핵구의 유입, 평활근의 이동 및 분화, 섬유성 조직의 형성 등의 반복적인 과정을 통하여 병변 조직은 MLDL을 핵으로 한 괴사조직에 섬유질이 덮인 복잡한 구조의 섬유질 병변으로 발달하게되며, 발달된 병변 조직으로부터 혈전이 생성되고 동맥이 경화되어 혈류장애 등 순환기 질환이 나타나게 되는 것이다.
이러한 배경하에, 혈관건강을 유지하기 위한 방법은 혈관 내 이물질의 축적을 막는 것이다. 특히, 혈관 내 죽종 (atheroma) 생성과 유도에 영향을 미치는 다양한 세포부착분자(cell adhesion molecule, CAM) 중 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)의 발현을 억제하는 것은 혈관 건강유지를 위한 중요한 요소이다. 또한, 동맥경화는 동맥벽에 지질과 섬유질 요소가 축적되어 진행되는 염증성 질환인바, 혈장 저밀도 지질 단백질(low-density lipoprotein: LDL), 콜레스테롤 등의 감소를 통해서도 혈관 건강의 유지가 가능하다.
한편, 줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다.
치료 방법으로서 최근 줄기세포 및 조직공학을 이용한 이식치료법이 개발되고 있다. 하지만, 이러한 이식 치료 기법으로는 치료효과가 뛰어나고 인체의 면역반응을 일으키지 않는 안정한 세포 치료제를 개발하기 어렵다는 문제가 있다. 그 동안 여러 가지 줄기세포를 이용하여 세포 치료제로써 활용하기 위한 시도들이 진행되고 있지만, 면역 조절 능력에 대한 확인은 아직 부분적으로만 진행되고 있다. 또한, 최근에는 줄기세포를 직접 손상된 조직에 이식하는 방법 이외에 줄기세포의 배양액에 포함된 매개성 물질의 탁월한 측분비 효과가 생체내 또는 생체외 실험에서 입증되고 있다. 줄기세포는 인체 내에서 일생 동안 세포의 성장과 재생에 관련된 다양한 성장인자와 사이토카인 등을 분비하고, 줄기세포 배양액에는 이러한 단백질 성분들이 함유되어 있으며, 세포이식 시의 부작용인 면역거부반응을 회피할 수 있으므로, 줄기세포 배양액은 치료제로 개발하기에 유리한 장점을 가지기 때문에 관련 연구개발이 진행되고 있다.
상기와 같은 줄기세포 관련 연구를 진행하기 위해서는 줄기세포의 원활한 수급이 필요하다. 그러나, 중간엽 줄기세포 중에서도 몇몇 줄기세포는 그 이용에 있어서 세포를 얻는데 큰 제한이 있기 때문에 그 이용이 어렵다. 예를 들어, 제대혈, 지방조직으로부터 유래한 중간엽 줄기세포는 침습적인 방법을 이용해 얻어야만 한다. 가장 비침습적인 방법을 이용해 얻을 수 있는 세포는 골수채취를 통한 중간엽 줄기세포이지만, 골수채취는 마취가 필요하고 고통을 유발하여, 그 이용에 제한이 있다. 이에 대한 대안으로 환자 맞춤형 줄기세포를 분리하기 위해 말초혈액을 이용한 세포획득법 등이 요구되고 있으나 말초혈액만으로는 성인에서 분리할 수 있는 중간엽 줄기세포의 수가 너무 적고 분리방법이 경제적이지 못하며, 분리해낸다고 해도 세포치료에 사용가능한 양만큼 증식이 원활하지 않은 경우가 대부분이기에 좀 더 실용성을 높일 수 있는 대체 방안이 필요하다. 또한, 고령인 환자에서 얻는 성체 줄기세포는 낮은 연령에게서 얻는 세포들에 비해 세포능이 현저히 떨어지며 각종 인자들의 분비 및 줄기세포의 이동 능력 등이 떨어지기 때문에, 저연령의 환자로부터 자연스럽게 분리될 수 있거나 버려지는 조직으로부터 세포를 얻을 필요성이 있다. 또한, 이렇게 얻어진 세포는 실험에 용이한 양적 확보가 가능하고 세포의 계대 배양 시에 분화능이 잘 유지될 필요성이 있다.
또한, 줄기세포들은 그 유래에 따라 그 특성이 상이하다.
따라서 특정 질환에 대한 치료를 위해 질환에 따라 치료에 적합한 특성을 가지는 줄기세포를 선택하고 이의 특성을 이용하여 특정 질환에 대한 치료 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두를 유효 성분으로 포함하는 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 포함하는 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 동맥경화성 혈관질환을 예방 또는 치료할 수 있는 적합한 종류의 줄기세포를 확인하던 중, 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두가타 유래 중간엽 줄기세포들과 대비하여 다른 프로파일을 가지며, 이에 의해 동맥경화성 혈관질환의 예방 및 치료에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포란 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직인 편도에서 유래된 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, "편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지"는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액으로부터 편도 유래 중간엽 줄기세포가 제거된 배양액 또는 이의 상층액을 의미하며, "편도 유래 중간엽 줄기세포 배양 상층액", "편도 유래 중간엽 줄기세포 조건 배양액" 또는 "편도 유래 중간엽 줄기세포 배양 배지"와 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두의 투여로 동맥경화성 혈관질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두의 투여로 동맥경화성 혈관질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 동맥경화성 혈관질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 동맥경화성 혈관질환은 지질대사와 관련된 유전적 요인과 식습관, 흡연, 운동부족 등 환경적 요인에 의하여 동맥이 경화되는 혈관 질환이다. 구체적으로, 동맥경화, 허혈성 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 뇌졸중, 편두통, 부정맥, 중풍, 혈관종, 혈관섬유종, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 및 말초혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두를 유효 성분으로 포함하는 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두는타 유래 중간엽 줄기세포 및 이의 조정 배지와 대비하여 상이한 단백질 프로파일을 가진다. 예를 들어, 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 하기 표 1로 표시되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함한다:
[표 1]
편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지는 타 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지와 달리 위 표 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 더 포함하거나 발현하는 것일 수 있다. 지방 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 또는 이들의 조정배지 등에서는 위 언급된 단백질의 발현이 매우 낮거나 거의 없을 수 있다.
이에 따라 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포는 상기 표 1로 이루어지군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 발현하는 것일 수 있다. 또한 본원 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 상기 표 1로 이루어지군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 조정 배지의 성분으로 포함하는 것일 수 있다.
본원 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두는 위와 같이 타 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정 배지와 대비하여 상이한 프로테오믹스 프로파일을 가지며, 이에 의하여 타유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지들보다 우수하게 동맥경화성 혈관질환의 치료 효과를 가진다. 구체적으로, 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두는 혈중 콜레스테롤을 저하시키며, 혈관 염증 관련 인자들의 발현 억제, LDLR(Low-Density Lipoprotein Receptor) 발현 억제, VEGF 발현 증진 등에서 현저한 효과를 보여 동맥경화성 혈관질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포는 타 유래 줄기세포와 대비하여 기원 조직인 편도의 획득이 용이하며 수술 후 버려지는 편도 조직의 재활용이 가능하고 초기 수득율이 매우 높다는 점에서 주입해야 하는 세포, 조정 배지 및 이들 모두의 양을 자유롭게 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포, 조직, 이의 조정 배지 및 이들 모두를 포함하며, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로 사용되어 동맥경화성 혈관질환에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 동맥경화성 혈관질환은 상기 언급된 바와 같다.
본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포는 당업계에 알려진 방법에 따라 편도로부터 추출 가능하다. 예컨대, 대한민국등록특허 제10-1508413호 등에 기재된 방법에 따라 편도로부터 추출가능하다.
편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하고 세포를 제거한 후, 수득된 배양액, 배양 상층액 또는 이의 농축물이거나 이의 동결건조물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기 세포를 혈청 배지에서 계대 배양한 후, 무혈청 배지에서 배양하여 수득될 수 있다.
편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기 세포를 무혈청 배지에서 계대 배양하여 수득될 수 있다.
편도 유래 중간엽 줄기세포는 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상적으로 배양될 수 있다. 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 조직으로부터 수득된 편도 유래 중간엽 줄기세포를 혈청 배지에서 계대배양한 후, 무혈청 배지에서 계대 배양하여 수득되고, 이를 그대로 사용하거나 또는 원심분리나 필터를 이용한 여과에 의해 줄기세포 및 거대분자를 제거한 후에 수득된 상층액을 사용할 수 있다. 또한, 수득된 상층액은 그대로 사용하거나 또는 농축하여 수득된 농축물로 사용할 수 있다.
편도 유래 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
상기 혈청 배지는 편도 유래 중간엽 줄기세포와 동일한 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 배지로서, 혈청이 보충된 DMEM 배지일 수 있다. 혈청은 우태아혈청(FBS)일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 혈청 배지의 총 중량에 대해 1 내지 10 중량%일 수 있다. 필요에 따라, 항생제, 항진균제 및 마이코플라스마 억제제 등을 포함할 수 있으며, 이들은 배지의 총 중량에 대해 1 중량%일 수 있다. 항생제는 페니실린-스트렙토마이신 등 세포 배양에서 통상적으로 사용되는 항생제를 포함하고, 항진균제는 암포테리신-B(fungizone) 등을 포함하며, 마이코플라스마 억제제는 겐타마이신, 시프로플록사신, 타일로신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 무혈청 배지 중에서의 배양은 혈청 배지에서의 배양액을 제거하고, 세포를 인산염 완충용액으로 세척한 후에 수행될 수 있다.
바람직하게, 상기 혈청 배지는 5 내지 12% 우태아혈청 및 1%의 항생제가 보충된 DMEM 배지일 수 있다.
바람직하게, 상기 무혈청 배지는 DMEM 배지일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도로부터 단리된 편도 조직을 잘게 자른 후, 편도 조직을 배양 플레이트의 바닥에 부착시키고, 10% 우태혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지 중에서 37℃ 및 5% CO2 상태의 배양기에서 배양하는 단계, 세포의 밀도가 80% 이상의 포화상태 (confluence)에 도달했을 때, 세포를 분리하고 계대 배양시키는 단계, 세포를 추가 배양한 후, 인산염 완충용액으로 세척하는 단계, 세척된 세포를 혈청 및 항생제를 포함하지 않는 DMEM 배지에서, 37℃ 및 5% CO2 상태의 배양기에서 배양하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액을 원심분리나 여과시켜 세포를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에서 예방은 상기 조성물의 투여로 동맥경화성 혈관질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 치료는 상기 조성물의 투여로 동맥경화성 혈관질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 조성물은 1 ml 당 5.0×106개 내지 1.0×107개의 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로션, 연고, 동결건조제 등 다양한 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 약학적 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제, 주입제 등이 바람직하다. 또한, 상기 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 편도 유래 중간엽 줄기세포, 이의 조정 배지 및 이를 이식받을 수혜자에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제로는 이에 한정되지 않으나, 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있다. 이외에도, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife®) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.
또한, 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및/또는 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 경구 투여, 카테터를 이용한 비외과적 투여, 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 다양한 투여 방법이 이용될 수 있다. 투여량은 줄기세포의 경우 105 내지 109 세포/kg 체중, 바람직하게는 5X105 내지 108 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 조정 배지의 경우 농축 정도에 따라 그 투여량이 달라질 수 있으나 10 μl/kg 내지 1 ml/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 포함하는 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 동맥경화성 혈관질환은 동맥경화, 허혈성 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 뇌졸중, 편두통, 부정맥, 중풍, 혈관종, 혈관섬유종, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 및 말초혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지를 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 5 내지 90 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 동맥경화성 혈관질환의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 식품 조성물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 동맥경화성 혈관질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명에 "편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두", "동맥경화성 혈관질환", "투여" 등의 용어는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두를 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 대상체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다. 또한 이와 같은 대상체들에는 동맥경화성 혈관질환의 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 동맥경화성 혈관질환의 치료를 위한 약제의 제조에서 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 동맥경화성 혈관질환의 치료에 사용하기 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 동맥경화성 혈관질환의 치료를 위한 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지 또는 이들 모두의 용도를 제공한다.
본 발명의 동맥경화성 혈관질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 타 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지들과 상이한 단백질 프로파일을 가지고 이를 통해 혈중 콜레스테롤을 저하시키며, 혈관 염증 관련 인자들의 발현 억제, LDLR(Low-Density Lipoprotein Receptor) 발현 억제, VEGF 발현 증진 등에서 현저한 효과를 보여 동맥경화성 혈관질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낸다.
도 1은 고지방식를 통한 고지혈, 고콜레스테롤 상태를 유발한 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 치료 효능을 확인하기 위한 실험 스케쥴을 나타낸다.
도 2는 고지방식를 통한 고지혈, 고콜레스테롤 상태를 유발한 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 콜레스테롤 저하능을 확인한 결과를 나타낸다(chow: 일반식이, HFD: 고지방식이, HFD+TMSC: 고지방식이+편도 유래 중간엽 줄기 세포). (*p<0.05, ***p<0.001)
도 2는 고지방식를 통한 고지혈, 고콜레스테롤 상태를 유발한 마우스 모델에서 편도 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 콜레스테롤 저하능을 확인한 결과를 나타낸다(chow: 일반식이, HFD: 고지방식이, HFD+TMSC: 고지방식이+편도 유래 중간엽 줄기 세포). (*p<0.05, ***p<0.001)
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예, 제조예를 제시한다. 하기의 실시예, 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지의 제조
편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cell, T-MSC) 는 이대목동병원 이비인후-두경부외과에서 편도적출술을 시행하는 환자로부터 적출된 편도조직(4-20세의 저연령층 조직, 임상윤리위원회 심의 통과: ECT 11-53-02)으로부터 얻었다. 이는 대한민국 등록 특허 제10-1508413호와 같이 제조되었으며, 구체적인 제조방법은 아래와 같다.
편도 조직을 콜라게나제 타입 I 및 DNase를 사용하여 절단하고, 이로부터의 세포를 Ficoll-Paque 농도 구배 원심부리를 통해 모아서, 48시간동안 배양하였다. 배양된 세포 중 부착된 세포만을 취하였고, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 하에 배양하였다.
조정 배지를 제조하기 위해 편도 유래 중간엽 줄기세포는 85 % confluency까지 배양되었고, 이에 도달한 후에 PBS로 2회 wash 후 FBS가 들어가지 않은 신선한 배양 배지로 교환되었다. 세포는 48 시간 추가로 배양되었고 조정 배지가 회수되었다. 조정 배지는 원심분리에 의해 50배 농축되었다.
<실시예 2> 편도 유래 중간엽 줄기세포의 동맥경화성 혈관질환 치료 효과 확인
고지방식이 유도 고지혈, 고콜레스테롤 상태를 포함하는 질환모델을 이용하여, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 동맥경화성 혈관질환 치료 효과를 확인하였다. 고지방식이 유도 동맥경화성 혈관질환 모델을 이용한 실험 스케쥴을 도 1에 나타내었다.
실험 및 절차는 이화여자대학교 동물 윤리위원회의 승인 하에 수행되었고, 모든 실험은 관련 구제 및 가이드라인 하에 수행되었다.
BALB/c 마우스(수컷, 8주령)는 pathogen-free 조건 하에 12 시간 밤/낮 주기로 유지되었다. 고지혈, 고콜레스테롤 상태를 포함하는 질환모델은 고지방식이(Fat 60%)를 이용하여 유도하였다. 사용한 식이는 고지방식이 (D12492) (60% fat, 20% carbohydrate, 20% protein, 5.24 kcal/g)와 일반 식이(D12450K) (10% fat, 70% carbohydrate, 20% protein, 3.85 kcal/g)이며 Research Diets (New Brunswick, NJ)회사 제품을 이용하였다. 8주령의 Balb/c마우스를 무작위로 일반 식이군과 고지방식이군로 나누었고, 복강 주사를 이용하여 6주 차부터 편도 유래 중간엽 줄기세포을 주사하였다. 편도 유래 중간엽 줄기세포를 2주에 한번 2x106 세포의 양을 복강 주사하였다.
1. 콜레스테롤 감소 효과 확인
편도 유래 중간엽 줄기세포를 16주차까지 주입한 후, 콜레스테롤의 수준 변화를 측정하였다, 구체적으로, 혈청 내 콜레스테롤의 수준을 Reflotron Plus machine (Roche Diagnostics, Germany)을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혈중 콜레스테롤의 수준은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따라 크게 감소하였고, 이를 통해 본원 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지가 동맥경화성 혈관질환의 치료에 우수한 효과를 보임을 확인하였다.
<실시예 2> 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지의 성분 확인
프로테오믹스를 통하여 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정배지의 성분을 구체적으로 분석하였다. 나노 액체 크로마토그래피-질량 분석(MS)/MS 분석을 나노 고 성능 액체 크로마토그래피 (Agilent, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 수행하였다. 나노 칩 컬럼 (Agilent, 150 mm 0.075 mm)을 펩타이드 분리를 위해 사용하였다. 액체 크로마토그래피 분리를 위한 이동상 A는 탈이온수 내 0.1 % formic acid였고, 이동상 B는 아세토나이트릴 내 0.1 % formic acid를 사용하였다. 크로마토그래피 구배는 3% B로부터 45% B까지 70 분, 45% B 로부터 95% B 까지 1 분, 95% B로 9 min, and 3% B로 10 분으로 하였으며, 300 nL/min의 flow rate를 유지하였다. 생산 이온 스펙트라는 information-dependent acquisition mode로 수집되었고 나서 분석되었다. 전구체 m/z 값은 3Da의 selection quadrupole resolution를 사용하여 가장 강한 이온으로 시작하여 선택되었다. rolling collision energy feature가 사용되었고, 전구체 이온 m/z 값에 대한 dynamic exclusion time은 60초였다. mascot algorithm (Matrixscience, Boston, MA, USA)를 단백질 서열 데이터 베이스 내 존재하는 펩타이드 서열을 확인하기 위해 사용하였다.
위 결과 다양한 단백질들이 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지에서 확인되었다. 특히, 아래 표와 같은 성분들은 타 유래 중간엽 줄기세포에서 확인되지 않고 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지에서 특이적으로 확인되는 단백질 성분들에 해당함을 확인하였다.
위 확인되는 바와 같이, 편도 유래 중간엽 줄기세포 조정 배지에서 골수 유래 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지들에서 확인되지 않는 다양한 인자들이 확인되었으며, 이를 통해 편도 유래 중간엽 줄기세포 및 이의 조정배지가 타유래 중간엽 줄기세포와 일부 다른 특성을 지니는 것임을 확인하였다.
또한, 이러한 차이를 기초로 하여 혈중 콜레스테롤을 저하시키며, 혈관 염증 관련 인자들의 발현 억제, LDLR(Low-Density Lipoprotein Receptor) 발현 억제, VEGF 발현 증진 등에서 현저한 효과를 보여 동맥경화성 혈관질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낸다.
Claims (7)
- 편도 유래 중간엽 줄기세포, 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두를 유효 성분으로 포함하는 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유효 성분은 편도 유래 중간엽 줄기세포인 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유효 성분은 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정배지인 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지는 무혈청 배지에서 배양된 배양액, 배양상층액 또는 이의 농축물인 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지 또는 이들 모두는 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시키는 것인 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동맥경화성 혈관질환은 동맥경화, 허혈성 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 뇌졸중, 편두통, 부정맥, 중풍, 혈관종, 혈관섬유종, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 및 말초혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 동맥경화성 혈관질환은 동맥 경화, 고지혈증 또는 고콜레스테롤혈증인 동맥경화성 혈관질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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| KR (1) | KR20200132550A (ko) |
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|---|---|---|---|---|
| KR20230129130A (ko) | 2022-02-28 | 2023-09-06 | 주식회사 에이치피바이오 | Ldl에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 상기 dna 앱타머의 용도 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20140096649A (ko) | 2013-01-28 | 2014-08-06 | 강릉원주대학교산학협력단 | 인삼열매 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 제2형 당뇨병 치료용 조성물 |
| KR20170123699A (ko) | 2015-03-13 | 2017-11-08 | 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 | 제2형 진성 당뇨병 환자의 치료 |
-
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Patent Citations (2)
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