KR20230129130A - Ldl에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 상기 dna 앱타머의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 LDL에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 상기 DNA 앱타머의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 LDL에 특이적으로 높은 친화도로 결합하고, 혈관질환의 발생과 관련된 LDL을 억제함으로써, LDL의 검출이나, 혈관질환의 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 LDL에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 상기 DNA 앱타머의 용도에 관한 것이다.
혈관질환은 혈관이 좁아져 발생하는 질환을 의미하는 것으로, 혈전 등의 혈액응고 덩어리 또는 지방의 축적으로 혈류가 방해를 받아 조직으로의 가스 및 영양 공급이 원활하게 이루어지지 못해 발생하는 질환들을 포함한다. 이외에도 혈관이 좁아지는 원인으로는 동맥의 염증 및 괴사와 갑작스럽게 조밀해지는 혈관연축 등이 있다.
이와 같은 혈관질환 중, 심뇌혈관 질환은 뇌와 심장에 혈액을 공급하는 혈관에 이상이 생긴 질환을 포함하며, 협심증, 심근경색 및 뇌경색 등이 이에 해당한다. 전세계적으로 심뇌혈관계 질환은 유병률이 높고 오랜 기간을 통해 발병해 계속 재발하는 만성질환이 많아 초기부터 적절한 치료 및 관리가 중요하다.
심뇌혈관 질환과 관련된 위험인자는 연령, 성별, 흡연, 운동부족 및 비만 등이 있으나, 최근 서구화된 식생활 및 급격한 생활양식의 변화를 고려할 때, 특히 지단백(lipoprotein)에 의한 콜레스테롤 축적인 대표적인 원인으로 꼽힌다. 따라서, 심뇌혈관 대사 질환의 주요 원인을 해결하기 위해, 혈중 지질농도를 저하시키는 것이 중요하다고 여겨지며, 이를 위해 고지방 식이를 억제하는 식이요법, 운동요법 및 약물요법 등이 권장되고 있다.
관련하여, LDL(low density lipoprotein)은 산화, 당결합, 집적화, 당단백 결합 등으로 변형되고, 변형된 LDL은 혈관 내피세포의 손상을 유발하여 염증반응을 일으킨다. 염증반응에 의해 LDL이 내피세포에 축적되고, 축적된 LDL은 다시 염증반응으르 촉진하는 작용으로 혈관 내 혈전을 생성하거나 동맥을 경화시키는 등 혈관질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 혈관질환의 치료나 혈관의 건강유지를 위해 LDL이나 콜레스테롤 등을 감소시키는 물질의 개발이 요구된다.
대한민국 공개특허 제10-2020-0132550호는 편도 유래 중간엽 줄기세포 및 이의 조정배지를 포함하는 조성물이 타 유래 중간엽 줄기세포 또는 이의 조정배지와 상이한 단백질 프로파일을 갖고, 혈중 콜레스테롤을 저하시키며, 혈관 염증관련 인자들이나 LDLR(low density lipoprotein receptor)의 발현을 억제하고, VEGF의 발현을 증진시킴으로써, 혈관질환의 치료에 사용될 수 있음을 개시한다.
본 발명의 목적은 특정 염기서열로 구성된 LDL에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 DNA 앱타머를 포함하는 LDL 검출용 조성물 및 키트, 및 상기 DNA 앱타머를 이용하여 LDL을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 DNA 앱타머의 혈관질환 치료 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 17로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 LDL(low density lipoprotein) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 LDL 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 LDL 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 DNA 앱타머는 LDL에 특이적으로 높은 친화도로 결합하고, 혈관질환의 발생과 관련된 LDL을 억제함으로써, LDL의 검출이나, 혈관질환의 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 SELEX 횟수에 따른 LDL에 대한 결합력을 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 58종류 DNA 앱타머의 LDL에 대한 친화도를 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 선별된 27종류 DNA 앱타머의 LDL에 대한 친화도를 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 9종류 DNA 앱타머의 세포투과도를 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 LDL_9-21, LDL_45, LDL_50 및 LDL_61 앱타머의 LDL 수준 저감 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 선별된 LDL_9-11, LDL_20, LDL_64 및 LDL_62 앱타머의 LDL 수준 저감 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 58종류 DNA 앱타머의 LDL에 대한 친화도를 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 선별된 27종류 DNA 앱타머의 LDL에 대한 친화도를 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 9종류 DNA 앱타머의 세포투과도를 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 선별된 LDL_9-21, LDL_45, LDL_50 및 LDL_61 앱타머의 LDL 수준 저감 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 선별된 LDL_9-11, LDL_20, LDL_64 및 LDL_62 앱타머의 LDL 수준 저감 효과를 확인한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 17로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 LDL(low density lipoprotein)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "LDL(low density lipoprotein)"은 간이나 장의 콜레스테롤을 조직으로 운반하는 지단백질 중의 하나로서, 조직세포에서 세포막, 호르몬 등을 합성 또는 저장한다. LDL은 세포막에 있는 수용체와 결합하여 세포내로 운반되며, 리소좀에서 가수분해되는데, 수용체에 이상이 생기면 선천성 고콜레스테롤 혈증을 유발하기도 한다. 또한, LDL은 콜레스테롤을 많이 함유하고 있어 혈액 내에 수준이 증가하면 관상동맥질환과 같은 혈관질환을 유발할 수 있다.
상기 LDL은 통상의 기술분야에 LDL이라고 알려진 모든 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 핵산분자를 의미한다. 상기 앱타머는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 17로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 DNA 앱타머는 LDL에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하는 한, 상기 서열번호 1 내지 17로 각각 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 서열번호 1, 4, 5, 9, 10, 12, 13, 14, 16 및 17로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 서열번호 1, 5, 9, 10, 12, 13, 14, 16 및 17로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성 및 안정성을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기, 구체적으로 리보오스 또는 디옥시리보스가 수식될 수 있다. 상기 수식은 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 예로는 플루오로화, O-알킬화, O-알릴화, S-알킬화, S-알릴화, 아미노화 등이 포함될 수 있다. 상기와 같은 당 잔기의 변형은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성을 높이기 위해, 핵산염기가 변형될 수 있다. 상기 핵산염기의 변형은 5위치의 피리미딘 변형, 6위치의 푸린 변형, 8위치의 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모로의 치환 또는 5-요오드-우리실로의 치환 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 뉴클레아제 및 가수분해효소 등에 대해 내성을 갖도록 인산기가 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 인산기는 티오에이트, 디티오에이트, 아미데이트, 포름아세탈, 3'-아민 등으로 치환될 수 있다. 나아가, 상기 DNA 앱타머는 3' 말단 또는 5' 말단의 변형을 포함할 수 있고, 상기 변형은 캡핑이나, 바이오티닐, 폴리에틸글리콜, 아미노산, 펩티드, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(myristoyl), 리소콜릭-올레일(lithocolic-oleyl), 도코사닐(docosanyl), 라우로일(lauroyl), 스테아로일(stearoyl), 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등이 부가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 LDL 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 LDL 검출용 조성물 및 키트에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 17로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 LDL 검출용 조성물에 포함되는 DNA 앱타머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 조성물을 포함하는 키트는 이에 포함되는 DNA 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 LDL 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 LDL 검출용 조성물 및 키트에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 17로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 시료는 LDL을 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 LDL 검출용 조성물 및 키트에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 17로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "혈관질환(vascular disease)"은 혈전 등의 혈액응고 덩어리 또는 지방의 축적으로 혈관이 좁아져 발생하는 질환을 의미한다. 상기 혈관질환은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 혈관질환을 포함할 수 있다. 또한, 상기 혈관질환은 혈관이 좁아져 발생하는 질환뿐 아니라, 혈관이 터져서 발생하는 질환도 포함할 수 있다. 일례로, 상기 혈관질환은 동맥경화, 죽상경화증, 죽상동맥경화증, 뇌경색, 협심증, 말초혈관 폐색성 질환, 심근경색, 당뇨성 망막증 또는 고혈압성 망막증을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구제제 또는 비경구제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여될수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식중 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.001 ~ 10,000 mg/㎏, 구체적으로는 0.1 g ~ 5 g/kg 일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회일 수 있고, 수회로 나뉠 수도 있다.
나아가, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 LDL 검출용 조성물 및 키트에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 17로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 DNA 앱타머는 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. DNA 앱타머의 제작
LDL(low density lipoprotein)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위해, 먼저 하기 기재된 바와 같이 DNA 라이브러리를 제작하였다.
1-1. 랜덤 DNA의 증폭
먼저, 40개의 랜덤 염기서열을 포함하는 76 bp 크기의 주형 DNA(서열번호 18: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3')와 이에 대한 정방향 프라이머(서열번호 19: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 20: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3')를 코스모진텍 사(한국)에 주문제작하였다. 이후, 1 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕의 10x PCR 완충용액, 4 ㎕의 dNTP 혼합물, 2 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머, 0.3 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕), 및 35.7 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
초기 변성 단계 | 94℃, 5분 | 1회 |
변성 단계 | 94℃, 30초 | 5회 |
어닐링(annealing) 단계 | 52℃, 30초 | |
연신(elongation) 단계 | 72℃, 30초 | |
후기 연신 단계 | 72℃, 5분 | 1회 |
수득된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 상기 PCR 산물을 PCR 정제키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 50 ㎕의 증류수를 사용하여 수득하였다. 수득된 산물은 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.
1-2. ssDNA 증폭
실시예 1-1에서 수득된 PCR 산물을 주형으로 비대칭(assymetric) PCR을 수행하여 dsDNA를 ssDNA로 증폭시켰다.
구체적으로, 1 ㎕의 PCR 산물, 10 ㎕의 10x 완충용액, 8 ㎕의 dNTP 혼합물, 2 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머(서열번호 19), 2 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머(서열번호 20), 0.5 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕), 및 76.5 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 이때, 역방향 프라이머는 비오틴이 결합된 프라이머를 사용하였다. 준비된 반응물을 변성, 어닐링 및 연신 단계를 5회 반복하는 대신 15회 반복하는 것을 제외하고는 상기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였다. 이후, PCR 산물에 이에 3배 부피의 100% 에탄올과, 1/1000배 부피의 tRNA를 첨가하여 -70℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 4℃에서 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 ssDNA만을 수득하였다.
1-3. ssDNA의 선별 및 회수
상기 확보된 ssDNA 산물 중 비오틴(Biotin)이 결합되어 있는 ssDNA를 제거하기 위하여, 상기 실시예에서 획득한 100 ㎕의 PCR 산물을 85℃에서 5분 동안 가열하였다. 이를 5분 동안 얼음에 넣어 식히고, 50 ㎕의 스트렙트아비딘 아가로즈 레진(streptavidin agarose resin, Thermo scientific, USA)을 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 조건 하에서 10분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 상기 서술한 바와 같이 100% 에탄올 및 tRNA를 이용하여 ssDNA만을 수득하였다.
1-4. 3차원 구조의 DNA 앱타머 제작
50 ㎕의 ssDNA 앱타머에 50 ㎕의 2× TBS 완충액을 첨가하고, 85℃에서 5분동안 끓여 변성시킨 후, 상온에서 1시간 이상 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.
실시예 2. LDL에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별
LDL에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 이용하여 SELEX를 수행함으로써 선별하였다.
구체적으로, 20 ㎕의 LDL(Sigma-Aldrich)과 상기에서 3차원 구조가 형성된 DNA 앱타머풀(pool)(571 μmol)을 혼합하고, 1× PBS 완충액을 사용하여 전체 부피를 100 ㎕로 조절하였다. 이를 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거함으로써 LDL과 결합하지 않은 DNA 앱타머를 제거하였다. 수득된 펠렛을 500 ㎕의 증류수로 3회 세척하고, 200 ㎕의 1× TE 완충액을 첨가한 후, 이를 85℃에서 끓였다. 이후, 이를 4℃, 13,000 rpm의 조건으로 10분 동안 원심분리하고, 상층액만을 회수하여 상기 서술한 바와 같이 100% 에탄올 및 tRNA를 이용하여 ssDNA만을 수득하였다. 수득된 펠렛은 건조시킨 후, 50 ㎕의 핵산분해효소(nuclease)가 포함되지 않은 증류수에 희석하였다. 수득된 ssDNA를 주형으로 사용하여 SELEX를 6회 반복수행하였다. 이후, LDL 대신 LDL이 결핍된 인간 혈장(Sigma-Aldrich)을 사용하여 네가티브 SELEX를 수행한 후, 다시 SELEX를 4회 수행하였다. SELEX를 반복수행하는 과정에서 수득된 각 풀(pool)에 포함된 DNA 앱타머의 LDL에 대한 친화성을 통상적인 나노드롭(nano drop) 방법으로 분광광도계를 사용하여 확인하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, SELEX를 9회 반복하여 수득된 풀이 LDL에 가장 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 3. LDL에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 서열 확인
상기에서 나노드랍 방법으로 LDL에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 풀로부터 DNA 앱타머 후보군의 서열을 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, 선별된 DNA 앱타머 풀을 주형으로 상기 서술한 바와 같이 프라이머(서열번호 19 및 20)를 사용하여 PCR을 수행하고, 수득된 PCR 산물은 솔젠트사의 T-블런트 PCR 클로닝 키트를 이용하여 T-벡터 클로닝에 사용되었다. T-벡터 클로닝은 1㎕의 T-블런트 벡터(10 ng/㎕), 4 ㎕의 PCR 산물 및 1 ㎕의 6× T-블런트 버퍼를 혼합하여 25℃에서 5분 동안 반응시켜 수행하였다. 상기 반응액을 100 ㎕의 DH5α 수용성 균주(competent cell)와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열 충격(heat shock)을 가한 후 얼음에서 2분 동안 방치하였다. 반응액에 900 ㎕의 SOC 배지(2% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM 글루코즈)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린(ampicillin, 50 ㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin, 50 ㎍/㎖), X-gal(50 ㎍/㎖) 및 IPTG(5 ㎍/㎖)가 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 도말하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 96개의 흰색 콜로니만을 선별하여 58개의 각각 다른 DNA 앱타머 염기서열을 확인하였다(Solgent, Korea).
실시예 4. LDL에 친화력이 더 높은 DNA 앱타머의 선별
상기에서 서열이 확인된 58종류의 DNA 앱타머를 이용하여 SELEX를 실시예 2에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 수행하여 LDL과 친화력이 더 높은 DNA 앱타머를 선별하였다. 선별된 DNA 앱타머와 LDL의 친화력은 통상적인 나노드롭 방법으로 확인하고, 그 결과, 회수된 앱타머의 농도를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 58종류의 앱타머 중, 회수농도가 120 ng 이상인 앱타머인 31종류를 선별하였다.
실시예 5. 실시간 PCR을 사용한 LDL 앱타머의 추가 선별
상기에서 높은 회수농도를 나타내어 LDL과 높은 결합력을 갖는 것으로 확인된 31종류의 앱타머를 이용하여 실시간 PCR을 수행함으로써, LDL과 더 높은 결합력을 갖는 앱타머를 추가 선별하였다.
구체적으로, 상기 선별된 31종류의 앱타머를 10, 10-1 및 10-2로 희석하여 PCR을 위한 주형으로 준비하였다. 실시간 PCR은 iQ SYBR 그린 수퍼믹스(iQ SYBR Green Supermix, Bio-rad, 미국)를 사용하여 통상적인 방법으로 수행하였고, PCR은 하기 표 2와 같은 조건으로 수행되었다. 이후, 수득된 값을 이용하여 Ct값으르 분석한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
초기 변성 단계 | 95℃, 5분 | 1회 |
변성 단계 | 95℃, 20초 | 40회 |
어닐링(annealing) 단계 | 55℃, 20초 | |
연신(elongation) 단계 | 72℃, 20초 | |
후기 연신 단계 | 72℃, 5분 | 1회 |
이름 | Ct 값 | 이름 | Ct 값 |
LDL_9-8 | 4.54 | LDL_58 | 7.84 |
LDL_25 | 4.7 | LDL_9-21 | 7.96 |
LDL_8 | 5.88 | LDL_50 | 8.04 |
LDL_64 | 6.15 | LDL_1 | 8.45 |
LDL_15 | 6.21 | LDL_38 | 8.61 |
LDL_62 | 6.21 | LDL_45 | 8.86 |
LDL_9-11 | 6.57 | LDL_27 | 9.13 |
LDL_61 | 6.71 | LDL_37 | 9.48 |
LDL_49 | 6.89 | LDL_2 | 10.66 |
LDL_20 | 7.14 | LDL_11 | 11.05 |
LDL_10-22 | 7.32 | LDL_48 | 11.8 |
LDL_44 | 7.44 | LDL_9 | 13.82 |
LDL_54 | 7.51 | LDL_4 | 15.93 |
LDL_14 | 7.71 | LDL_5 | 18.54 |
LDL_7 | 7.78 | LDL_9-1 | 20.33 |
LDL_40 | 7.82 | 대조군 | 18.69 |
표 3에 나타난 바와 같이, 대부분의 DNA 앱타머가 대조군보다 높은 결합력으로 LDL에 결합하였다. 다만, 대조군보다 Ct값이 낮거나, 실시간 PCR 결과 이중 피크(peak)를 형성하는 4종류의 DNA 앱타머(9-1, 4, 5 및 37)를 제외한 27종류의 앱타머를 선별하였다.
실시예 6. LDL에 대한 결합력의 정량분석
상기에서 선별된 27종류의 앱타머의 LDL에 대한 친화력을 통상적인 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 방법으로 확인하였다.
먼저, 27종류의 DNA 앱타머를 HBS-EP 완충액(GE Healthcare, BR-1001-88)에 0, 100, 200, 300, 500 또는 1,000 nM의 농도가 되도록 희석하여 준비하였다. 준비된 DNA 앱타머와 BIAcore 3000을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였으며, LDL이 코팅된 센서칩 CM5에 대한 DNA 앱타머의 결합력과 아무것도 코팅되지 않은 센서칩 CM5에 대한 DNA 앱타머의 결합력 차이를 확인하였다. 이때, 속도변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)을 이용하여 수득 및 정량하였고, 각 실험 후, 센서칩은 0.5% SDS를 이용하여 재생시켰다. 그 결과, DNA 앱타머의 LDL에 대한 친화력을 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, LDL과의 결합력이 더 우수한, 해리상수(KD) 값이 낮은 17종류의 앱타머를 선별하고, 그 서열 및 해리상수 값을 표 4에 나타내었다.
이름 | 서열 | KD값(nM) | 서열번호 |
LDL_1 | ATACCAGCTTATTCAATTCCAAGTGGTTTAAGGGGTTTCCCGTGAGTTTTTCGGCAGAGATAGTAAGTGCAATCT | 1.97 | 서열번호 1 |
LDL_5 | ATACCAGCTTATTCAATTAGTCAAGCCCAGTTTTGGCTGATGTAGGGAGTCGAAGGGTAGATAGTAAGTGCAATCT | 7.83 | 서열번호 2 |
LDL_9 | ATACCAGCTTATTCAATTCTTTGAAAGTATCGCAATTGATTCTGTACTTTTTTGTTCTAGATAGTAAGTGCAATCT | 4.88 | 서열번호 3 |
LDL_15 | ATACCAGCTTATTCAATTCGAGGCGGTGACGGAGAAAAGGTACCACAAACTTGCCTCTAGATAGTAAGTGCAATCT | 2.02 | 서열번호 4 |
LDL_20 | ATACCAGCTTATTCAATTGGTCCATAGAGTCAACGCGAGGTGGAACGGTCACTTGGTGAGATAGTAAGTGCAATCT | 0.64 | 서열번호 5 |
LDL_25 | ATACCAGCTTATTCAATTCGCAAGAGAAGTGGAACCAAGCGACCAGAC ATGAATGCAGAGATAGTAAGTGCAATCT | 6.57 | 서열번호 6 |
LDL_37 | ATACCAGCTTATTCAATTTTTTTTTGGTAAGGTCAACCTCGATCACAC TGAAGAGGCGAGATAGTAAGTGCAATCT | 17.6 | 서열번호 7 |
LDL_38 | ATACCAGCTTATTCAATTGGTACGCTTAATGGATGTTGCTCCAACTTTTGTTTGGTGAGATAGTAAGTGCAATCT | 3.35 | 서열번호 8 |
LDL_45 | ATACCAGCTTATTCAATTAAACGCCCCTGTGTTCACGGTTGATTTCGGTGGACGCGCAAGATAGTAAGTGCAATCT | 1.33 | 서열번호 9 |
LDL_50 | ATACCAGCTTATTCAATTCTAATGGGGCATGTGTCATCGTTCGTCGGTACTGACGGACAGATAGTAAGTGCAATCT | 0.84 | 서열번호 10 |
LDL_54 | ATACCAGCTTATTCAATTGCCAAAGCATAACACCTGATGCTTACGAGA GGGATTCCGTAGATAGTAAGTGCAATCT | 25.6 | 서열번호 11 |
LDL_61 | ATACCAGCTTATTCAATTGTCCAAAGGCGAAGAGCGTAGGGATAGAGACAGTTCTGAAGATAGTAAGTGCAATCT | 1.49 | 서열번호 12 |
LDL_62 | ATACCAGCTTATTCAATTGCAGCAAGTTAACGTAAATAGATCTATATTCCTTCGCTAGAGATAGTAAGTGCAATCT | 1.25 | 서열번호 13 |
LDL_64 | ATACCAGCTTATTCAATTGTCGGCAGGTGGACAGCATGTCAATTGGTTTGTTTATACAAGATAGTAAGTGCAATCT | 43.9 | 서열번호 14 |
LDL_9-8 | ATACCAGCTTATTCAATTGCATGATTTTGGGAACTGGTGCAGAGGGCTAGACGGTGTAAGATAGTAAGTGCAATCT | 2.27 | 서열번호 15 |
LDL_9-11 | ATACCAGCTTATTCAATTGCTCAGGTGTATTCACGTCTCGGGTAGGTAGTATCTTTCGAGATAGTAAGTGCAATCT | 0.0112 | 서열번호 16 |
LDL_9-21 | ATACCAGCTTATTCAATTCCCATTGGTGATCATATTTACTGTTTTGGGTGTGTGGGTGAGATAGTAAGTGCAATCT | 0.00345 | 서열번호 17 |
표 4에 나타난 바와 같이, 선별된 17종류의 DNA 앱타머는 모두 LDL에 높은 친화력으로 결합하였다. 특히, LDL_9-21 및 LDL_9-11 앱타머가 가장 높은 친화력을 나타내었다.
실시예 7. DNA 앱타머의 세포독성 확인
상기에서 선별된 17종류의 DNA 앱타머의 세포독성을 LDH 분석방법으로 확인하였다.
먼저, 인간유래 단핵구 세포인 THP-1(KCLB 40202, 한국) 세포주를 10% FBS(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배양배지를 사용하여 배양하였다. 배양된 세포를 96웰 플레이트에 웰당 4×104개가 되도록 분주하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양된 세포에 DNA 앱타머를 0.32, 1.6, 8, 40, 200, 1,000 또는 5,000 nM의 농도가 되도록 10 ㎕ 처리하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포 배양액을 사용하여 CyQUANT™ LDH 세포독성 분석 키트(Invitrogen, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 이때, 음성 대조군은 PBS 완충액을 사용하였다. 그 결과, 가장 고농도의 앱타머를 처리하였을 때, 수득된 값으로부터 세포독성(%)을 계산하여 표 5에 나타내었다.
이름 | 세포독성(%) | 이름 | 세포독성(%) |
LDL_1 | -0.005076269 | LDL_50 | -0.018198711 |
LDL_5 | 8.016845905 | LDL_54 | -0.017670993 |
LDL_9 | -0.025423162 | LDL_61 | -0.079980565 |
LDL_15 | -0.029680521 | LDL_62 | -0.020807051 |
LDL_20 | 0.029822038 | LDL_64 | 0.011077782 |
LDL_25 | 0.011790562 | LDL_9-8 | 9.513424081 |
LDL_37 | -0.011671765 | LDL_9-11 | -0.010169265 |
LDL_38 | -0.007509632 | LDL_9-21 | -0.035255208 |
LDL_45 | 0.000029699 |
표 5에 나타난 바와 같이, 17종류의 DNA 앱타머 대부분은 세포독성을 나타내지 않았다. 다만, LDL_5 및 LDL_9-8은 5 μM의 고농도에서만 약 8~9%의 세포독성을 나타내었다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 DNA 앱타머가 세포독성을 보이지 않음을 알 수 있었다.
실시예 8. DNA 앱타머의 세포투과도 확인
상기 선별된 17종류 DNA 앱타머 중, LDL과 친화력이 우수하고 세포독성이 낮은 9종류의 DNA 앱타머를 선별하여 체내에서 세포를 투과하여 표적에 도달하는지를 세포투과도 분석 방법으로 확인하였다. 세포투과도는 컬쳐코트 24-웰 인비트로 혈관투과성 분석 키트(CultureCoat 24-well in vitro vascular permeability assay kit, R&D systems, 미국)를 사용하여 확인하였다.
먼저, HUVEC(CRL-1730, ATCC, 미국) 세포주를 EGM™-2 내피세포 싱글쿼터™ 키트(EGM™-2 endothelial SingleQuots™ kit, Lonza, 스위스)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 배양하였다. 구체적으로, 세포를 2×105 cell/well로 분주하고, 여기에 1.17 nmol의 DNA 앱타머를 첨가하였다. 하기 수학식 1을 이용하여 흡광도 값으로부터 혈관투과성을 계산하고, 최소 투과도 샘플(C2: DNA 앱타머 미처리군, minimum permeability sample)을 1로 계산하여 도출된 상대값을 도 4에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 DNA 앱타머 라이브러리(C3)와 초기 선별된 앱타머 중 3종류의 앱타머(10-22, 37 및 64)를 사용하였다.
[수학식 1]
도 4에 나타난 바와 같이, 선별된 9종류의 앱타머 중, LDL_15 및 LDL_62를 제외한 7종류의 앱타머가 대조군인 LDL_10-22, LDL_37 및 DNA 앱타머 라이브러리(C3)에 비해 유의적으로 높은 세포투과도를 보였다. 특히 LDL_9-11, LDL_45, LDL_50 및 LDL_64 앱타머는 대조군과 비교하여 투과도가 2배 이상 높았다. 다만, 대조군으로서 사용된 LDL_64 앱타머는 다른 앱타머와 비교하여 LDL과의 결합력이 상대적으로 낮았으나, 세포투과도가 우수하여 표적 특이성에 의한 약효가 기대되어 이후 실험에 포함하였다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 LDL에 대한 DNA 앱타머가 세포투과성이 우수함을 알 수 있었다.
실시예 9. DNA 앱타머에 의한 LDL 저감 효과 확인
상기에서 선별된 8종류의 DNA 앱타머를 이용하여 LDL의 수준 저감 효과를 콜레스테롤 분석 키트(abcam, 영국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
구체적으로, 100 ㎕의 LDL에 DNA 앱타머를 각각 1.14, 3.08 또는 5.03 ㎍의 양으로 처리한 뒤, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 반응물을 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 수득된 펠렛을 100 ㎕의 PBS 완충액에 현탁하고, 동량의 2× 침전 완충액을 첨가하여 상온에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 이를 2회 반복하여 상층액을 전부 새 튜브에 옮겼다. 한편, 펠렛(pellet)은 200 ㎕의 PBS 완충액에 현탁시켰다. 이때, 상층액에는 HDL이 펠렛이 현탁된 현탁액에는 LDL 및 VLDL이 포함되어 있다. 이후, 45.6 ㎕의 콜레스테롤 분석 완충액, 0.4 ㎕의 콜레스테롤 프로브, 2 ㎕의 효소 믹스(enzyme mix) 및 2 ㎕의 콜레스테롤 에스테라제를 혼합한 혼합액에 상기 상층액 또는 펠렛 현탁액을 50 ㎕를 첨가하여 각각의 웰에 넣었다. 이를 37℃의 암조건에서 1시간 동안 반응시킨 후, 353/587 ㎚의 파장에서 형광값을 측정하고, 측정된 값으로부터 콜레스테롤의 농도를 계산하여 도 5 및 6에 나타내었다.
도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 앱타머가 LDL의 수준을 유의적으로 감소시켰다. 특히 LDL_9-11, LDL_64, LDL_20 및 LDL_45가 더 높은 LDL 수준 억제 효과를 나타내었다.
<110> HPBIO Inc.
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<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_1 aptamer
<400> 1
ataccagctt attcaattcc aagtggttta aggggtttcc cgtgagtttt tcggcagaga 60
tagtaagtgc aatct 75
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_5 aptamer
<400> 2
ataccagctt attcaattag tcaagcccag ttttggctga tgtagggagt cgaagggtag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_9 aptamer
<400> 3
ataccagctt attcaattct ttgaaagtat cgcaattgat tctgtacttt tttgttctag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 4
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_15 aptamer
<400> 4
ataccagctt attcaattcg aggcggtgac ggagaaaagg taccacaaac ttgcctctag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> LDL_20 aptamer
<400> 5
ataccagctt attcaattgg tccatagagt caacgcgagg tggaacggtc acttggtgag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> LDL_25 aptamer
<400> 6
ataccagctt attcaattcg caagagaagt ggaaccaagc gaccagacat gaatgcagag 60
atagtaagtg caatct 76
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> LDL_37 aptamer
<400> 7
ataccagctt attcaatttt tttttggtaa ggtcaacctc gatcacactg aagaggcgag 60
atagtaagtg caatct 76
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<212> DNA
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<220>
<223> LDL_38 aptamer
<400> 8
ataccagctt attcaattgg tacgcttaat ggatgttgct ccaacttttg tttggtgaga 60
tagtaagtgc aatct 75
<210> 9
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_45 aptamer
<400> 9
ataccagctt attcaattaa acgcccctgt gttcacggtt gatttcggtg gacgcgcaag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 10
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_50 aptamer
<400> 10
ataccagctt attcaattct aatggggcat gtgtcatcgt tcgtcggtac tgacggacag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 11
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_54 aptamer
<400> 11
ataccagctt attcaattgc caaagcataa cacctgatgc ttacgagagg gattccgtag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 12
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_61 aptamer
<400> 12
ataccagctt attcaattgt ccaaaggcga agagcgtagg gatagagaca gttctgaaga 60
tagtaagtgc aatct 75
<210> 13
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_62 aptamer
<400> 13
ataccagctt attcaattgc agcaagttaa cgtaaataga tctatattcc ttcgctagag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 14
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_64 aptamer
<400> 14
ataccagctt attcaattgt cggcaggtgg acagcatgtc aattggtttg tttatacaag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 15
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_9-8 aptamer
<400> 15
ataccagctt attcaattgc atgattttgg gaactggtgc agagggctag acggtgtaag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 16
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_9-11 aptamer
<400> 16
ataccagctt attcaattgc tcaggtgtat tcacgtctcg ggtaggtagt atctttcgag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 17
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LDL_9-21 aptamer
<400> 17
ataccagctt attcaattcc cattggtgat catatttact gttttgggtg tgtgggtgag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 18
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> template DNA
<400> 18
ataccagctt attcaattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnag 60
atagtaagtg caatct 76
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 19
ataccagctt attcaatt 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 20
agattgcact tactatct 18
Claims (7)
- 서열번호 1 내지 17로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 LDL(low density lipoprotein) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
- 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 LDL 검출용 조성물.
- 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 LDL 검출용 키트.
- 제1항의 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 LDL 검출방법.
- 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 혈관질환은 동맥경화, 죽상경화증, 죽상동맥경화증, 뇌경색, 협심증, 말초혈관 폐색성 질환, 심근경색, 당뇨성 망막증 또는 고혈압성 망막증인, 혈관질환 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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KR101528154B1 (ko) * | 2010-07-13 | 2015-06-11 | 삼성전자 주식회사 | 콜레스테롤 측정장치 및 이를 이용한 측정방법 |
WO2019010341A1 (en) * | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Innamed, Inc. | APTAMERS FOR MEASURING LIPOPROTEIN RATES |
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Patent Citations (1)
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