KR20060018851A - 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제 - Google Patents

조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제 Download PDF

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요지 야마다
히로시 안도
히데타카 사토
히로미 요코야마
마사히코 이시하라
이치로 미키
아키코 요시마츠
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교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제, 및 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 중으로부터 다기능성 줄기세포를 말초혈로 동원하는 약제에 관한 것이다.

Description

조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제{PREVENTIVE AND/OR REMEDY FOR DISEASES ACCOMPANIED BY TISSUE DESTRUCTION}
본 발명은, 과립구 콜로니 자극 인자 (Granulocyte Colony-Stimulating Factor, 이하 G-CSF 라 기술) 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제, 및 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제에 관한 것이다.
G-CSF 는 호중성(好中性) 과립구 전구세포를 증식 또는 분화시키고, 또한 성숙 호중구(球)를 활성화하는 폴리펩티드이다. G-CSF 는 주로, 골수이식, 암의 화학요법에 의한 호중구 감소증, 골수이형성 증후군, 재생불량성 빈혈, 선천성·특발성 호중구 감소증, 인간면역부전 바이러스 (HIV) 감염증 등에 있어서의 호중구 증가촉진에 사용되고 있는 [이케다 야스오 편, 「증례에서 배우는 G-CSF 의 임상」,의약저널사, 오사카, 1999년 2월, p.64-92]. 최근, G-CSF 가 말초혈 중의 줄기세포를 증가시키는 것이 보고되어 있다 [이케다 야스오 편, 「증례에서 배우는 G-CSF 의 임상」, 의약저널사, 오사카, 1999년 2월, p.139-168]. 줄기세포로서는, 조혈(造血) 줄기세포, 체성(體性) 줄기세포 (조직성 줄기세포) 등이 알려져 있 다.
G-CSF 에 의해 말초혈에 이입되는 조혈계의 줄기세포에는 각종 서브타입이 포함되는 것이 표시되어 있다 [Blood, 84, 2795-2801 (1994)]. 줄기세포의 골수로부터 말초혈로의 이입에는, G-CSF 를 포함하는 조혈인자, 세포접착분자, 케모카인, 메타로프로테아제 등이 서로 관여하고 있다 [Experimental Hematology, 30, 973-981(2002)]. G-CSF 에 의한 줄기세포의 골수로부터 말초혈로의 이입에는, 케모카인 수용체 CXCR4 와 그 리간드인 CXCL12 (별명 기질 세포 유도 인자 (stromal cell-derived factor) 1, SDF-1) 가 관여하고 있는 것으로 생각되고 있고, G-CSF 이외에도 시클로포스파미드도 동등한 생리활성을 갖고 있다 [The Journal of Clinical Investigation, 111, 187-196 (2003)].
또한 케모카인 CXCR4 저해제의 AMD-3100 (미국특허 제5612478호) 도, 골수로부터 말초혈로 조혈 줄기세포를 이입시키는 작용을 갖는 것으로 알려져 있다 [아메리칸·소사이어티·오브·헤마톨로지 (American Society of Hematology), 필라델피아, 미국, 2002년 6월 6일-10일].
조혈 줄기세포를 말초혈 중에 동원하는 방법의 하나로서 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 를 투여하는 방법이 알려져 있다 [Blood, 90, 903-908 (1997)].
또한, G-CSF 에 의해 인간 말초혈 중에 동원되는 세포로부터 분리된 CD34양성 세포를 심근경색 모델에 이식하면 혈관신생이 일어나, 심기능이 개선되는 것이 보고되어 있다 [Nature Medicine, 7, 430-436 (2001), WO2001/94420].
또한, 심근경색을 일으키기 전에 마우스에게 G-CSF 와 줄기 세포 인자 (stem cell factor) (SCF) 를 투여하면, 경색부위에서 심근과 혈관의 재생이 일어나는 점에서, G-CSF 에 의해 조혈 줄기세포가 말초혈 중에 흘러 나와 경색심근을 재생하는 것으로 생각되고 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10344-10349,(2001)].
코르티 (Corti) 등은 마우스에게 G-CSF 와 SCF 를 투여함으로써 골수 유래의 뉴런이 뇌내에서 증가하는 것을 보고하고 있다 [Experimental Neurology, 177(2), 443-452 (2002)].
또한 인간에서도 G-CSF 투여에 의해 말초혈 중에 동원시킨 세포를 이식함으로써 레시피언트의 간장, 소화관 상피, 피부 [New England Journal of Medicine, 346, 738-746 (2002)] 및 구강 상피 [Lancet, 361, 1084-1088 (2003)] 에 도너 유래의 세포가 검출되고 있다.
그러나, 조혈계 이외의 조직에 관해서는, G-CSF 투여에 의해 동원되는 어떠한 줄기세포에 의해 조직의 분화가 일어나는지는 밝혀져 있지 않다. 또한 혈구계나 순환기계 이외에서는 G-CSF 투여나 G-CSF 에서 동원된 줄기세포의 이식에 의해 질환을 치료할 수 있는지 여부에 관해서도 밝혀져 있지 않다.
폐기종, 만성기관지염, 만성폐색성 폐 질환 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 이하 COPD 라 기재), 낭포성선유증, 특발성 간질성 폐렴 (폐선유증), 비만성 폐선유증, 결핵, 천식 등은 모두 폐의 조직 파괴를 수반하는 중독 질환이다. 특히 폐기종 및 COPD 에서는 폐포의 파괴가 현저하다 (구도 쇼지, 호흡기질환의 치료와 간호, 난코도, 2002년 3월 출판 및 이케다야스오 편, 증례에서 배우는 G-CSF 의 임상, 의약저널사, 오사카, 1999년 2월, p.64-92). 폐기종, 만성기관지염 및 COPD 는 기관지, 세기관지 또는 폐포에 염증성의 병변이 생기는 병으로, 폐포의 파괴가 진행되면 호흡곤란을 일으킨다. 현재는 폐의 조직 파괴에 대한 충분한 치료방법은 없고, 유효성이 높은 예방약, 치료약및 치료방법의 개발이 요망되고 있다.
레티노인산은, 태아기의 폐의 성숙에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 엘라스타아제로 폐포를 파괴한 래트에 레티노인산을 투여한 바, 폐포가 수복되는 것이 보고되어 있다 [Nature Medicine, 3, 675-677 (1997)]. 레티노인산 유도체의 RO444753 [Journal of Medicinal Chemistry, 31, 2182-2192 (1988)] 에 관해서도, 동일하게 폐기종의 치료효과가 보고되어 있다 [American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 165(8), A825 (2002)]. 그러나, 폐포의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 레티노인산을 사용한 예는, 여러 가지 보고되어 있지만, 모두 높은 효과는 얻어져 있지 않다.
최근, 줄기세포의 이식 실험의 결과, 폐포는 빈번히 줄기세포로부터 새롭게 만들어지고 있는 것이 밝혀졌다 [Cell, 105, 369-377 (2001)].
간경변을 중심으로 하는 만성간질환은 30세부터 64세까지의 연령층의 사인 순위의 4위를 차지하고 있다. 또한, 사인 순위의 제 1 위인 악성 신생물 (암) 중에 간경변 등의 간질환을 원인으로 하는 간암에 의한 사망자는 남성이 2만 2천 900명 (폐암, 위암에 이어서 3위), 여성이 9천 400명 (위암, 폐암, 결장암에 이어서 4위) 도 포함되어 있다. 간염의 주요 원인인 간염 바이러스의 감염자는 B형 간염의 경우 150만명, C형 간염의 경우는 250만명 존재한다. 이들 바이러스성 간염에 대해서는 항바이러스약으로서 인터페론이 투여되고 있지만, 간경변으로의 이행을 완전히 멈출 수는 없다. 또한, 후생성의 조사에서는, 현재 약 220만명 정도의 사람들이 매일 청주의 경우 5합 이상이나 계속 마시고 있는 것으로 알려져 있다. 이들 문제의 음주자 중에서 지방간, 알코올성 간염, 간경변 등의 간장병 환자가 다수 발병하고 있다. 바이러스성 알코올성을 합하면 연간 약 30만명의 사람이 새롭게 간경변을 발병하고 있다. 그러나 현재, 간경변을 치료하는 방법은 전혀 없다. 최근, 알코올성 간염의 모델이 될 수 있는 사염화탄소 간 장해 모델에 대하여 골수세포를 이식함으로써, 간의 선유의 소실과 간 실질세포의 재생에 의해 간기능이 개선되는 것이 보고되었다 (제 2 회 재생의료학회, 고베, 2003년 3월 11일∼12일).
투석 환자수는 현재 17만명에 가까워지고, 신부전을 근치(根治)하기 위한 신장 재생약은 매우 큰 의료 니즈로 되고 있지만 현재, 신장 이식 이외에 유효한 치료법은 전혀 존재하지 않는다. 최근, 골수세포로부터 신사구체나 신뇨세관 상피가 신생되는 것이 보고되어, 골수의 줄기세포로부터 신장의 조직이 새롭게 신생되는 것이 밝혀져 왔다 [Kidney International, 62, 1285-1290 (2002)].
발명의 개시
본 발명의 목적은, G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제, 또는 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 중에서 다분화능 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제를 제공하는 것에 있다.
본 발명은, 이하의 (1)∼(35) 에 관한 것이다.
(1) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제.
(2) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 상기 (1) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(3) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 상기 (1) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(4) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 상기 (1) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(5) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 화학 수식된 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 상기 (1)∼(4) 의 어느 한 항에 기재된 예방 및/또는 치료제.
(6) 화학 수식이 폴리알킬렌글리콜 수식인 상기 (5) 항에 기재된 예방 및/또는 치료제.
(7) (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) 레티노인산 또는 레티노인산 유도체로 이루어지고, 동시에, 시간을 두고 따로따로, 또는 (a) 와 (b) 의 양쪽을 함유하는 하나의 약제로서 투여하기 위한 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제.
(8) (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) CXCR4 저해제로 이루어지고, 동시에, 시간을 두고 따로따로, 또는 (a) 와 (b) 의 양쪽을 함유하는 하나의 약제로서 투여하기 위한 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제.
(9) CXCR4 저해제가 AMD-3100 또는 그 유도체인 상기 (8) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(10) 조직 파괴를 수반하는 질환이 신경질환, 순환기계 질환, 간장 질환, 췌장 질환, 소화관계 질환, 신장 질환, 피부 질환 및 폐 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환인 상기 (1)∼(9) 의 어느 하나 1항에 기재된 예방 및/또는 치료제.
(11) 신경질환이 뇌경색, 뇌혈관장해, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병, 척수손상, 우울병, 조울병의 어느 하나인 상기 (10) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(12) 순환기계 질환이 폐색성혈관병, 심근경색, 심부전, 관동맥 질환의 어느 하나인 상기 (10) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(13) 간장 질환이 B형 간염, C형 간염, 알코올성 간염, 간경변, 간부전의 어느 하나인 상기 (10) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(14) 췌장 질환이 당뇨병, 췌염의 어느 하나인 상기 (10) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(15) 소화관계 질환이 클론병, 궤양성 대장염의 어느 하나인 상기 (10) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(16) 신장 질환이 IgA신증, 신장염, 신부전의 어느 하나인 상기 (10) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(17) 피부 질환이 욕창, 열상, 봉합창, 열상, 절개창, 교상, 피부염, 비후성반흔, 케로이드, 당뇨병성궤양, 동맥성궤양, 정맥성궤양의 어느 하나인 상기 (10) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(18) 폐 질환이 폐기종, 만성기관지염, 만성폐색성폐 질환, 낭포성선유증, 특발성 간질성 폐렴 (폐선유증), 비만성 폐선유증, 결핵 또는 천식인 상기 (10) 기재의 예방 및/또는 치료제.
(19) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는, 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제.
(20) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 상기 (19) 기재의 약제.
(21) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 상기 (19) 기재의 약제.
(22) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 상기 (19) 기재의 약제.
(23) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가, 화학 수식된 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인, 상기 (19)∼(22) 의 어느 한 항의 약제.
(24) 화학 수식이 폴리알킬렌글리콜 수식인 상기 (23) 기재의 약제.
(25) (a)과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) 레티노인산 또는 레티노인산 유도체로 이루어지고, 동시에, 시간을 두고 따로따로, 또는 (a) 와 (b) 의 양쪽을 함유하는 하나의 약제로서 투여하기 위한 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제.
(26) (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) CXCR4 저해제로 이루어지고, 동시에, 시간을 두고 따로따로, 또는 (a) 와 (b) 의 양쪽을 함유하는 하나의 약제로서 투여하기 위한, 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제.
(27) CXCR4 저해제가 AMD-3100 인 상기 (26) 기재의 약제.
(28) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료방법.
(29) (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) 레티노인산 또는 레티노인산 유도체를, 동시에, 또는 시간을 두고 따로따로 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료방법.
(30) (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) CXCR4 저해제를, 동시에, 또는 시간을 두고 따로따로 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료방법.
(31) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 방법.
(32) (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) 레티노인산 또는 레티노인산 유도체를, 동시에, 또는 시간을 두고 따로따로 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 방법.
(33) (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) CXCR4 저해제를, 동시에, 또는 시간을 두고 따로따로 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 방법.
(34) 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제의 제조를 위한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드의 사용.
(35) 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제의 제조를 위한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드의 사용.
1. 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제
본 발명에 있어서, 조직 파괴를 수반하는 질환으로는, 신경질환, 순환기계 질환, 간장 질환, 췌장 질환, 소화관계 질환, 신장 질환, 피부 질환, 폐 질환 등을 들 수 있다.
신경질환으로는, 뇌경색, 뇌혈관장해, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴무도병, 척수손상, 우울병, 조울병 등을 들 수 있다.
순환기계 질환으로는, 폐색성혈관병, 심근경색, 심부전, 관동맥질환 등을 들 수 있다.
간장 질환으로는 B형 간염, C형 간염, 알코올성 간염, 간경변, 간부전 등을 들 수 있다.
췌장 질환으로는 당뇨병, 췌염 등을 들 수 있다.
소화관계 질환으로는, 클론병, 궤양성 대장염 등을 들 수 있다.
신장 질환으로는, IgA신증, 신장염, 신부전 등을 들 수 있다.
피부 질환으로는, 욕창, 열상 (熱傷), 봉합창, 열상 (裂傷), 절개창, 교상, 피부염, 비후성반흔, 케로이드, 당뇨병성궤양, 동맥성궤양, 정맥성궤양 등을 들 수 있다.
폐 질환으로는, 폐기종, 만성기관지염, 만성폐색성폐 질환, 낭포성선유증, 특발성 간질성 폐렴 (폐선유증), 비만성 폐선유증, 결핵, 천식 등을 들 수 있다.
G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드로는, 서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 1 기재의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 나루토그라스팀 (상품명 노이압, 교와발효공업 제조), 필그라스팀 (상품명 그란, 산쿄 제조 ; 상품명 Granulokine, 호프만·라·로슈 제조 ; 상품명 Neupogen, 암젠 제조), 레노그라스팀 (상품명 노이트로진, 츄가이제약 제조 ; 상품명 Granocyte, 아벤티스 제조), 페그필그라스팀 (상품명 Neulasta, 암젠 제조), 살그라모스팀 (상품명 Leukine, 쉐링 제조) 등을 들 수 있다.
또, G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드로서는, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 에 의해, 서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖는 G-CSF 와의 아미노산 서열의 상동성을 검색하였을 때에, 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열번호 1 기재의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산 잔기가 치환되고, 또한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드의 구체예를 표 1 에 나타낸다.
N말단아미노산으로부터의 위치 (서열번호1 기재의 G-CSF) 각종 단백질에서의 치환 아미노산
a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l)
1번째(Thr) 3번째(Leu) 4번째(Gly) 5번째(Pro) 17번째(Cys) * Gfu Lys Ser Ser Val Ile Arg Ser Ser Cys Ile Arg Ser Ser Tyr Ile Arg Ser Ser Arg Thr Arg Ser Ser * Thr Arg Ser Ser Asn Glu Arg Ser Ser Ile Thr Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Ser * * Arg * Ser Ala Thr Tyr Arg Ser * * * * Ser
* 비치환 아미노산
또한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드는, 화학 수식되어 있어도 된다.
화학 수식의 방법으로는, 예를 들어 WO00/51626 에 기재된 방법 등을 들 수 있고, 예를 들어 폴리알킬렌글리콜로 수식, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 로 수식한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.
본 발명의 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 의약은, 치료제로서 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1개 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술분야에서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여경로는, 치료에 있어서 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들어 경구투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 근육내, 피하, 피내 또는 정맥내 등의 비경구투여 등을 들 수 있고, 바람직하게는 근육내, 피하, 피내, 정맥내 또는 기도내 투여 등을 들 수 있다.
투여형태로는, 예를 들어 정제, 캡슐제, 과립제, 주사제, 연고, 테이프제, 드라이파우더, 에어졸 등의 흡입제 등을 들 수 있다.
정제 등의 고형 제제의 제조에는, 예를 들어 유당 등의 부형제, 전분 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 등의 활택제, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 사용할 수 있다.
근육내, 피하, 피내, 정맥내 또는 기도내 투여에 적당한 제제로는, 주사제, 분무제 등을 들 수 있다.
주사제의 제조에 있어서는 예를 들어 물, 생리식염수, 대두유 등의 식물유, 용제, 가용화제, 등장화제, 보존제, 항산화제 등을 사용할 수 있다.
또한, 흡입제는 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 그 자체, 또는 수용자의 구강 및 기도점막을 자극하지 않고, 또한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 미세한 입자로서 분산시켜, 흡수를 용이하게 시키는 담체 등을 사용하여 조제된다. 담체로서 구체적으로는 유당, 글리세린 등을 들 수 있다. G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 및 사용하는 담체의 성질에 의해, 에어졸, 드라이파우더 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
투여량 또는 투여회수는, 목적으로 하는 치료효과, 투여방법, 치료기간, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1일당 0.01㎍/㎏∼10㎎/㎏ 을 투여하는 것이 바람직하다.
2. 과립구 콜로니 자극 인자와 다른 약제와의 병용
본 발명에 사용되는 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드는, 레티노인산 또는 레티노인산 유도체, 또는 CXCR4 저해제와 병용함으로써 그 작용을 증강시킬 수 있다.
레티노인산 유도체로는, 레티노인산 수용체에 결합하는 화합물이면 어떠한 것이어도 되지만, 구체적으로는 팔미트산레티놀, 레티놀, 레티날, 3-디히드로레티노인산, 3-디히드로레티놀, 3-디히드로레티날 등의 레티노인산 유도체, α-카로텐, β-카로텐, γ-카로텐, β-크립토크산틴, 에키네논 등의 프로비타민 A 등을 들 수 있다. 또한, 모트레티나이드 (상품명 Tasmaderm, 호프만·라·로슈 제조, US4105681 참조), WO02/04439 에 기재된 화합물, 타자로텐 (상품명 Tazorac, Allergan사, EP284288 참조), AGN-194310 및 AGN-195183 (Allergan제조, WO97/09297 참조), 레티노인산 토피케어 (retinoic acid TopiCare) (상품명 Avita, Mylan Laboratories 제조), UAB-30 (CAS Number 205252-59-1, UAB Research Foundation 제조) 등을 들 수 있다.
CXCR4 저해제로서는 AMD-3100 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드와, 레티노인산 또는 레티노인산 유도체, 또는 CXCR4 저해제는, 이들 각각의 유효성분을 함유하도록 제제화한 것이면, 단제 (합제) 로나 복수 제제의 조합으로나 사용 또는 투여할 수 있다. 복수 제제의 조합으로 사용할 때에는, 동시에 또는 시간을 두고 따로따로 사용 또는 투여할 수 있다. 또, 이들 제제는, 예를 들어 정제, 캡슐제, 과립제, 주사제, 연고, 테이프제, 또는 드라이파우더, 에어졸 등의 흡입제 등의 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드와, 레티노인산 또는 레티노인산 유도체, 또는 CXCR4 저해제의 바람직한 용량비 (중량/중량) 는, 사용하는 레티노인산 또는 레티노인산 유도체, 또는 CXCR4 저해제와의 조합, 레티노인산 또는 레티노인산 유도체, 또는 CXCR4 저해제의 효력 등에 따라 적절히 조정하면 되지만, 구체적으로는 예를 들어 1/50000 (과립구 콜로니 자극 인자/레티노인산 또는 레티노인산 유도체, 또는 CXCR4 저해제)∼100/1, 바람직하게는 1/10000∼20/1, 더욱 바람직하게는 1/1000∼10/1 사이의 비로 사용된다.
복수 제제의 조합으로 투여할 때에는, 예를 들어 (a) G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 함유하는 제 1 성분과, (b) 레티노인산 또는 레티노인산 유도체, 또는 CXCR4 저해제를 함유하는 제 2 성분을, 각각 상기 서술한 바와 같이 별도제제화하여, 키트로서 제작해 두고, 이 키트를 사용하여 각각의 성분을 동시에 또는 시간을 두고, 동일 대상에 대하여 동일 경로 또는 다른 경로로 투여할 수도 있다.
그 키트로는, 예를 들어 보존할 때에 외부의 온도나 빛에 의한 내용물인 성분의 변성, 용기로부터의 화학성분의 용출 등이 관찰되지 않는 용기이면 재질, 형상 등은 특별히 한정되지 않는 2개 이상의 용기 (예를 들어 바이알, 백 등) 와 내용물로 이루어지고, 내용물인 상기 제 1 성분과 제 2 성분이 따로따로의 경로 (예를 들어 튜브 등) 또는 동일 경로를 통해 투여 가능한 형태를 갖는 것이 사용된다. 구체적으로는, 정제, 주사제, 흡입제 등의 키트를 들 수 있다.
상기 제제는, 각각의 유효성분 외에 제제학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 붕괴제, 활택제, 결합제, 계면활성제, 물, 생리식염수, 식물유 가용화제, 등장화제, 보존제, 항산화제 등을 사용하여 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.
정제의 제조에 있어서는, 예를 들어 유당 등의 부형제, 전분 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 등의 활택제, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 사용할 수 있다.
주사제의 제조에 있어서는, 예를 들어 물, 생리식염수, 대두유 등의 식물유, 용제, 가용화제, 등장화제, 보존제, 항산화제 등을 사용할 수 있다.
또한, 흡입제는 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 그 자체, 또는 수용자의 구강 및 기도점막을 자극하지 않고, 또한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 미세한 입자로서 분산시켜, 흡수를 용이하게 시키는 담체 등을 사용하여 조제된다. 담체로는, 예를 들어 유당, 글리세린 등을 들 수 있다. 또한, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
투여량 또는 투여회수는, 목적으로 하는 치료효과, 투여방법, 치료기간, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드로서는 통상 성인 1일당 0.01㎍/㎏∼10㎎/㎏, 레티노인산 또는 레티노인산 유도체, 또는 CXCR4 저해제로서는 통상 성인 1일당 0.1㎎/㎏∼100㎎/㎏ 을 투여하는 것이 바람직하다.
3. 다분화능 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제
상기 1 또는 2 에 기재한 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제는, 말초혈 중에 다분화능 줄기세포를 동원하여, 동원된 다분화능 줄기세포에 의해 장해 조직을 재생할 수 있다.
4. 본 발명의 약제를 사용하여 질환을 치료하는 방법
본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 치료제를 사용하여 질환을 치료하는 방법으로는, 상기 1 에 있는 바와 같이 본 발명의 치료제를 환자에게 직접 투여함으로써, 장해 부위를 수복시키는 방법, 상기 3 의 약제에서 말초혈 중에 동원된 다분화능 줄기세포를 회수한 후, 회수한 다분화능 줄기세포를 그대로, 또는 생체 외에서 목적하는 세포 또는 조직으로 분화시킨 후, 장해 부위에 이식하는 방법 등, 어느 방법을 사용할 수도 있다.
다분화능 줄기세포, 또는 분화시킨 세포를 치료에 사용하는 경우, 다분화능 줄기세포 또는 분화시킨 세포를 헤모네틱스사의 헤모라이트2플러스 등을 사용하여 생리식염수에 의해 세정하고, 사용하는 기기는 완전 폐쇄계에서 배양세포의 농축, 세정, 회수처리가 가능한 것을 들 수 있고, 배양, 분화에 사용한 사이토카인 등의 물질을 제한없이 100% 제거할 수 있는 것이 바람직하다. 이에 의해 회수된 다분화능 줄기세포 또는 분화시킨 세포는, 통상의 점적법으로 정맥중에 주입하거나, 환부에 직접 주입함으로써 치료에 사용할 수 있다.
5. 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제의 평가방법
(1) 뇌·신경계 조직
본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제가, 뇌·신경계 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 이용할 수 있는 것은, 예를 들어 이하의 방법에 의해 확인할 수 있다.
상기 서술한 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를, 마우스, 래트 또는 원숭이 등의 실험동물에 투여하여, 파괴에 수반되는 증상의 경감, 신생된 뇌·신경계의 세포를 동정함으로써 뇌·신경계 조직의 파괴를 수반하는 질환에 유효한 것을 확인한다. 실험동물은, 허혈, 6-히드록시도파민 (6-hydroxydopamine) (6-OHDA) 투여 또는 카이닌산 투여 등의 방법에 의해, 뇌에 상해를 입힌 동물이 바람직하다. 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제의 투여경로로서는, 피하투여를 들 수 있다.
예를 들어, 뇌 내에서 신생된 신경계의 세포는 이하의 방법에 의해 검출할 수 있다.
미리 치사량의 방사선을 조사한 후에 녹색 형광 단백질 (Green Fluorescent Protein) (GFP) 을 구성적으로 발현하는 동일 계통의 트랜스제닉·마우스 유래의 골수를 이식한 골수 키메라·마우스를 준비하여, 그 골수 키메라·마우스에게 전술한 방법에 의해 뇌에 상해를 입힌 후에, 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를 투여한다. 신생된 신경계의 세포는 GFP 의 형광강도를 측정함으로써 동정할 수 있다.
(2) 간장 조직
본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제가 간장 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 이용할 수 있는 것은, 예를 들어 이하의 방법에 의해 확인할 수 있다.
상기 서술한 본 발명의 조직의 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를, 간세포 파괴 모델 동물에게 투여하여, 파괴에 수반되는 증상의 경감이나, 간장에서의 세포의 신생촉진에 의해 간장 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 유효한 것을 확인한다. 간세포 파괴를 수반하는 질환을 나타내는 모델 동물로서, 주로 사염화탄소엘라스타아제를 복강주사하는 모델 (American Journal of Pathology, 2002년, 161권, p.2003-2010) 이나, 간부분 절제 모델 (Arch.Pathol. 1931년, 12권, p.186-202) 등을 사용할 수 있다. 또한 간장의 파괴 병태를 갖는 유전자 개변동물로서, 푸마릴아세테이트 히드롤라아제 (Fumarylacetate hydrolase) (FAH) 결손 마우스 (Nature Medicine, 2000년, 6권, p.1229-1234) 등을 사용할 수 있다.
간세포 파괴의 평가에는, 혈장·혈청 중의 GPT (glutamic pyruvic transaminase), GOT (glutamic oxalacetic transaminase), 비릴빈, γ-GTP 의 농도측정 등으로 실행할 수 있다.
간장에서 신생된 간세포는 이하의 방법에 의해 검출할 수 있다.
미리 치사량의 방사선을 조사한 후에 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 구성적으로 발현하는 동일 계통의 트랜스제닉·마우스 유래의 골수를 이식한 골수 키메라·마우스를 준비하여, 그 골수 키메라·마우스에게 전술한 방법에 의해 간장에 상해를 입힌 후에, 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를 투여한다. 신생된 간장의 세포는 GFP 의 형광에 의해 동정할 수 있다.
(3) 췌장 조직
본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제가 췌장 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 이용할 수 있는 것은, 이하의 방법에 의해 확인한다.
상기 서술한 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를, 췌세포 파괴 모델 동물에게 투여하여, 파괴에 수반되는 증상의 경감이나, 췌장에서의 세포의 신생 촉진에 의해 췌장 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 유효한 것을 확인할 수 있다.
췌β세포 파괴를 수반하는 질환을 나타내는 모델 동물로서, 주로 스트렙토조토신을 복강주사하는 모델 (The Journal of Clinical Investigation, 1969년, 48권, p.2129-2139), 부분 췌절제 모델 (The Journal of Clinical Investigation, 1983년, 71권, p.1544-1553) 등이 알려져 있다. 췌β세포 파괴 병태를 갖는 자연 발증 동물로서, 비비만형 당뇨병 (non-obese diabetic) (NOD) 마우스 (Exp.Anima1, 1980년, 29권, p.1-13) 나, 바이오브리딩 (BioBreeding) (BB) 래트 (Diabetes, 1982년, 31권 (Suppl. 1), p.7-13) 등이 알려져 있다.
췌β 세포 파괴에 대한 증상의 개선은, 혈장·혈청 중의 인슐린이나 당 등의 농도 측정, 당부하 시험시의 내당능 등에서 실행할 수 있다. 또한, 체중변화, 식사량, 요당 농도 측정 등에 의해, 질환과 관련된 변화를 포착하는 것으로도 판정이 가능하다.
췌장에서 신생된 췌세포는 이하의 방법에 의해 검출할 수 있다.
미리 치사량의 방사선을 조사한 후에 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 구성적으로 발현하는 동일 계통의 트랜스제닉·마우스 유래의 골수를 이식한 골수 키메라·마우스를 준비하여, 그 골수 키메라·마우스에게 전술한 방법에 의해 췌장에 상해를 입힌 후에, 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를 투여한다. 신생된 췌장의 세포는 GFP 의 형광에 의해 동정할 수 있다.
(4) 신장 조직
본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제가 신장 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 이용할 수 있는 것은, 예를 들어 이하의 방법에 의해 확인할 수 있다.
상기 서술한 본 발명의 조직의 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를, 신세포 파괴 모델 동물에게 투여하여, 파괴에 수반되는 증상의 경감이나, 신장에서의 세포의 신생촉진에 의해 신장 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 유효한 것을 확인한다. 신장 파괴 모델로서는 각종 신염 모델이 바람직하다. 신염에 유사한 병태를 나타내는 모델 동물로서, 항Thy-1 항체를 정맥 주사함으로써 야기되는 항Thy-1 신염 모델 (신과 투석 1991년 임시증간호신질환모델, 도교의학사) 또는, 사구체 기저막에 대한 항체로 야기되는 신독성 신염 모델 (신과 투석 1991년 임시증간호 신질환 모델, 동경, 의학사) 등, 신부전에 유사한 병태를 나타내는 모델 동물로서 bovine serum albumin (BSA) 을 복강주사하는 모델 (Kidney Internationa1, 1999년, 55권, p.890-898) 등이 알려져 있다.
신세포파괴에 대한 증상의 개선은, 요단백 배설량 측정 등으로 평가할 수 있다.
신장에서 신생된 신세포는 이하의 방법에 의해 검출할 수 있다.
미리 치사량의 방사선을 조사한 후에 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 구성적으로 발현하는 동일 계통의 트랜스제닉·마우스 유래의 골수를 이식한 골수 키메라·마우스를 준비하여, 그 골수 키메라·마우스에게 전술한 방법에 의해 신장에 상해를 입힌 후에 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를 투여한다. 신생된 신장의 세포는 GFP 의 형광에 의해 동정할 수 있다.
(5) 폐 조직
본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제가 폐 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 이용할 수 있는 것은, 예를 들어 이하의 방법에 의해 확인할 수 있다.
상기 서술한 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를, 폐세포 파괴 모델 동물에게 투여하여, 파괴에 수반되는 증상의 경감이나, 폐에서의 세포의 신생촉진에 의해 폐조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 유효한 것을 확인한다. 폐 파괴 모델로서는 폐기종 유사 모델이 바람직하다. 폐기종과 유사한 병태를 나타내는 모델 동물로서, 주로 엘라스타아제를 함유하는 단백질 분해효소를 폐에 주입한 모델 [인바이론메탈·리서치(Environmental Research), 1984년, 제 33 권, p.454-472] 이나, 담배의 흡연 모델 [체스트 (Chest), 2002년, 제 121 권, 부록, p.188S-191S] 등이 알려져 있다. 폐의 조직 파괴 병태를 갖는 유전자 개변 동물로서는, 인터류킨13의 트랜스제닉 마우스 [더·저널·어브·클리니컬·인베스티게이션 (The Journal of Clinical Investigation), 2000년, 제 106 권, p.1081-1093], 종양괴사인자-α 의 트랜스제닉 마우스 [아메리칸·저널·어브·피지올로지 : 랭·셀룰라·몰레큘러·피지올로지 (American Journal of Physiology : Lung Cellular Molecular Physiology), 2001 년, 제 280 권, p.L39-L49) 등이 알려져 있다.
폐 세포 파괴에 대한 증상의 개선은, 폐의 절편의 조직상의 해석, 폐의 습윤량이나 용적의 측정 등으로 평가한다. 폐의 절편의 조직상의 해석은, 예를 들어 평균 2점간 거리나 폐포 면적의 측정 등을 사용하여 실행할 수 있다. 평균 2점간 거리 (mean linear intercept length) 는, 폐의 절편 표본의 현미경상에 일정한 길이의 격자를 긋고, 직선과 교차되는 폐포벽과 그 인접하여 직선과 교차되는 폐포벽 사이의 거리를 계측하여, 그 평균치로부터 구할 수 있다. 또한, 비침습적인 측정법으로서, 폐의 뢴트겐선 사진, X선 컴퓨터 단층촬영법 (X선 CT), 자기공명단층진단 (MRI) 등을 들 수 있다. 직접적이지는 않지만, 체중이나 호흡기능의 측정, 운동량이나 일정시간 내의 이동거리의 측정, 운동부하시험, 혈액산소분압측정, 폐포의 엘라스틴 분해산물인 데스모신의 요중 및 혈중농도측정 등에 의해, 질환과 관련된 변화를 포착하는 것에 의해서도 폐의 조직 파괴를 평가할 수 있다.
폐에서 신생된 세포는 이하의 방법에 의해 검출할 수 있다.
미리 치사량의 방사선을 조사한 후에 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 구성적으로 발현하는 동일 계통의 트랜스제닉·마우스 유래의 골수를 이식한 골수 키메라·마우스를 준비하고, 그 골수 키메라·마우스에게 전술한 방법에 의해 폐에 상해를 입힌 후에, 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를 투여한다. 신생된 폐세포는 GFP의 형광에 의해 동정할 수 있다.
(6) 골격근 조직
본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제가 골격근 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 이용할 수 있는 것은, 이하의 방법에 의해 확인할 수 있다.
상기 서술한 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를, 골격근 파괴 모델 동물에게 투여하여, 파괴에 수반되는 증상의 경감이나, 골격근의 세포의 신생촉진에 의해 골격근 조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 유효한 것을 평가한다. 골격근의 조직 파괴에 유사한 병태를 나타내는 모델 동물로서, 주로 카르디오톡신 등의 근독성이 있는 뱀독이나 염산부피바카인 등의 국소마취제를 골격근에 주입하는 모델 [의학의 흐름, 1996년, 179권, p.276-280] 등이 알려져 있다. 골격근의 파괴 병태를 갖는 유전자 개변 동물로서 디스트로핀 결손 mdx 마우스 [신경진보, 2001년, 45권, p.54-62] 등이 알려져 있다.
골격근 조직의 파괴에 대한 증상의 개선은, 골격근 섬유의 직경 및 수, 근선유화 및 지방화를 지표로 형태 관찰함으로써 평가가 가능하다. 또한, 비침윤적인 측정법으로서 근육 컴퓨터 단층촬영법 (근육 CT), 자기공명단층진단 (MRI) 등을 들 수 있다. 직접적이지는 않지만, 혈청 크레아틴 키나아제 (CK) 값 측정 등에 의해, 질환과 관련된 변화를 포착하는 것으로도 판정이 가능하다.
골격근에서 신생된 세포는 이하의 방법에 의해 검출할 수 있다.
미리 치사량의 방사선을 조사한 후에 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 구성적으로 발현하는 동일 계통의 트랜스제닉·마우스 유래의 골수를 이식한 골수 키메라·마우스를 준비하고, 그 골수 키메라·마우스에게 전술한 방법에 의해 골격근에 상해를 입힌 후에, 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를 투여한다. 새로 재생·신생된 골격근의 세포는 GFP 의 형광에 의해 동정할 수 있다.
(7) 피부 조직
본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제가 피부조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 이용할 수 있는 것은, 이하의 방법에 의해 확인할 수 있다.
전술한 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를, 피부 파괴 모델 동물에게 투여하여, 파괴에 수반되는 증상의 경감, 피부의 세포의 신생촉진에 의해 피부조직의 파괴를 수반하는 질환의 치료에 유효한 것을 평가한다. 피부조직의 파괴에 유사한 병태를 나타내는 모델 동물로서, 주로 유전적 당뇨병 마우스 (db/db) 또는 유전적 비만 마우스(ob/ob), 스테로이드 처치 마우스, 간 장해 래트 등의 난치성 모델 동물에 대한 피부 전층 결손창이나 열상창, 허혈성궤양 (욕창) 또는 감염창을 인공적으로 제작하는 피부 창상 모델 [단백 핵산 효소, 2000년, 45권, p.1145-1151] 등이 알려져 있다.
피부조직의 상해에 대한 증상의 개선은, 창상 면적의 측정, 피부 개열 장력의 측정, 삼출액량의 측정, 침윤 백혈구 수의 측정, 혈관 신생량의 측정, 육아 중의 세포 수나 콜라겐 생성량의 측정 등으로 실행할 수 있다.
피부에서 신생된 세포는 이하의 방법에 의해 검출할 수 있다.
미리 치사량의 방사선을 조사한 후에 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 구성적으로 발현하는 동일 계통의 트랜스제닉·마우스 유래의 골수를 이식한 골수 키메라·마우스를 준비하여, 그 골수 키메라·마우스에게 전술한 방법에 의해 피부에 상해를 입힌 후에, 본 발명의 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제를 투여한다. 신생된 피부의 세포는 GFP 의 형광에 의해 동정할 수 있다.
6. 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제의 평가방법
본 발명의 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제의 평가는 아래와 같이 하여 실행할 수 있다.
약제에 의해 유도된 세포를 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 구성적으로 발현하는 동일 계통의 트랜스제닉·마우스에서 채취하거나, 약제에 의해 동원된 세포를 채취하고, 그 세포에 레트로 바이러스 벡터를 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP) 등의 세포 표지 가능한 유전자를 도입한 후, 정맥내 또는 뇌실내에 투여한다. 신생된 세포는 GFP 의 형광에 의해 동정할 수 있다.
이하, 참고예 및 시험예에 의해, 본 발명의 예방 및/또는 치료제의 효과를 보다 구체적으로 설명한다.
참고예 1. G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 투여에 의한 말초혈 중의 단핵구 의 증가
수컷 SD (Sprague-Dawley) 래트 9주령 (일본찰스·리버) 3마리에, 나루토그라스팀 (교와발효공업 제조, 제품명; 노이압) 을 100㎍/㎏ 으로, 5일간 연속으로 피하 투여하고, 투여 개시 후 6일째에 복대동맥에서 말초혈을 취득하여, NycoPrep 1.077 Animal (AXIS-SHIELD사 제조) 에 의한 밀도구배원심법에 의해 단핵구획분을 농축하여, 세포 수를 측정하였다. 그 결과, (2.32±0.16)× 106 세포/mL (평균치±표준오차) 에서 (4.29±0.93)×106 세포/mL (평균치±표준오차) 로 단핵구가 증가되었다. 이 중에는 줄기세포가 함유되어 있었다.
참고예 2. G-CSF 투여에 의해 말초혈 중에 동원된 세포의 성질
(1) G-CSF 투여에 의해 동원된 말초혈 중에 동원되는 세포의 X선 조사 마우스로의 이식
G-CSF 를 투여함으로써 말초혈 중에 동원되는 세포를, 마우스 개체에 이식함으로써, 그 성질을 밝혔다.
전신 세포에 GFP 유전자가 삽입되어 GFP 단백질이 발현되어 있는 마우스 (C57BL/6×129 계통의 F4) 의 10 주령의 개체를 F군 3마리, G군 1마리로 나눠, 각각 따로따로 이하의 약제를 투여하였다. F군에 대하여는 5일간 연속으로 매일 1마리당, 나루토그라스팀 (교와발효공업사 제조 : 제품명 노이압) 을 10㎍ 피하 주사하였다.
G군에 대하여는, 5일간 연속으로 매일 1마리당, PBS (Phosphate Buffered Saline)(pH7.4) (LIFE TECHNOLOGIES사 제조) 를 200㎕ 피하 주사하였다.
마지막으로 약제를 투여한 다음날, F군, G군 각각 따로따로 마우스를 디에틸에테르를 사용하여 마취하여, 안정맥에서 말초혈을 채취하여, 미리 헤파린나트륨 (다케다약품공업사 제조) 을 분주한 튜브에 회수하여, 100μm 셀·스트레이나 (BECTON DICKINSON사 제조) 를 통과시켜 놓았다. 또한, G군에 관해서는 대퇴골을 적출하여, 대퇴골에 부착되어 있는 근육을 가위로 절제하여 대퇴골 전체를 노출시킨 후, 양단을 가위로 절단하여, 테루모 제조의 27G 의 바늘을 장착하여 PBS 를 함유한 주사바늘의 선단을 대퇴골의 무릎관절측으로 절단단에 꽂아, 시험관 속에 PBS 를 분출함으로써 골수세포를 채취하고, 그 후 100㎛ 셀·스트레이나 (BECTON DICKINSON사 제조) 를 통과시켜 놓았다.
이와 같이 채취한 말초혈 또는 골수세포를 아래와 같이 하여, C57BL/6 마우스에게 꼬리정맥으로부터 주입하여 이식하였다.
우선 이식을 받는 C57BL/6 마우스 (일본쿠레아사) 는 8주령인 것을 준비하고, 꼬리정맥주사를 받기 전 날에, 미리 X선 조사장치 (히타치메디코사 제조) 를 사용하여 12Gy 의 선량의 X선을 조사하여 놓았다. 이들 마우스를 H군, I군, J군, K군으로 나눠, H군에는 F군 유래의 마우스 말초혈을 1마리당 300㎕ 꼬리정맥에서 이식하고, I군에는 G군 유래의 마우스 말초혈을 1마리당 300㎕ 꼬리정맥에서 이식하고, J군에는 G 군 유래의 골수세포를 1마리당 3.0×106 을 꼬리정맥에서 이식하고, K군은 이식의 처치를 실행하지 않았다.
그 결과, I군 및 K군에서는 이식 후 7일 내지 10일 이내에 전부 사망하였다. 한편, H군 및 J군에서는 이식 후 8주령 경과해도 생존하고 있었다. 그러나, 골수이식한 J군의 마우스 중에는, 털이 빠져 피부가 진무르거나, 머리를 기울여 보행하여 걸음이 어색하다는 외견상 및 행동상의 이상이 보였다. G-CSF 를 투여한 마우스 말초혈을 이식한 H군에서는, 외견상 및 행동상의 이상은 보이지 않았다.
본 결과는, G-CSF 투여에 의해 마우스 말초혈 중에는 피부 등의 조직으로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포가 동원되는 것을 나타내고 있다.
(2) 세포이식을 받은 마우스의 해부
(1) 에서 얻어진 H군의 마우스를 해부하여, 관류 고정하여 각 장기를 적출하였다. 구체적으로는, 우선 넨부탈 (다이닛폰제약사 제조) 의 복강내주사에 의해 마취하여, 70% 에탄올로 전신을 적셔, 넓적다리의 피부를 집어 올려 무릎부터 대퇴부의 근원까지 가위로 절개하여 대퇴동맥 및 정맥을 노출시켜, 견제봉합사 (나쓰메제작소사 제조) 로 결찰한 후, 결찰 부위의 말단측부터 넓적다리를 절단하였다. 그곳으로부터 경골(脛骨)을 적출하고, 경골에 부착되어 있는 근육을 가위로 절제하여 경골 전체를 노출시킨 후, 양단을 가위로 절단하여, 테루모 제조의 23G 의 바늘을 장착하여 PBS 를 함유한 주사바늘의 선단을 경골의 무릎관절측으로 절단단에 꽂아, 시험관 속에 PBS 를 분사함으로써 골수세포를 채취하였다.
또한, 마우스 쪽은 개복 개흉하여 심장을 노출시켜, 25G 의 테루모제 날개 부착 정맥주사바늘을 좌심실에 삽입한 후, 우심이(耳)를 잘라 PBS 를 20㎖ 흘려넣어, 전신을 관류시켰다. 이 때, 심장으로부터 넘치는 혈액을 취득하여, 미리 헤파린나트륨 (다케다약품공업사 제조) 100 유니트(unit) 를 분주한 튜브에 넣어 말초혈로서 회수하였다.
PBS 를 전량 흘려넣은 후, 동일한 조작에 의해 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 을 20㎖ 흘려넣어 고정시켰다.
그 후, 우선 기관을 붙인 채로 폐를 적출하여, PBS 로 2배 희석한 OCT (optimum cutting temperature) 화합물 (MILES사 제조) 를 함유한 테루모 제조 서플로우 고정 바늘 (20G) 부속의 카테터를 장착한 20㎖ 시린지를 기관으로부터 삽입하여, 카테터의 끝과 기관을 견제봉합사 (나쓰메제작소사 제조) 로 결합하여, PBS 로 2배 희석한 OCT 용액 10㎖ 를 기관을 통해 폐에 주입하였다. 주입 후, 가로 세로가 수 mm 인 블록으로 절단하여, OCT 화합물로 포매(包埋)하여, 드라이아이스로 냉각한 이소펜탄으로 동결하였다.
또한, 나머지 장기에 관해서도 개체로부터 적출하여, 4℃ 에서 2시간 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 중에 담근 후, PBS 로 린스하여, 고(高)자당 용액 [20% Sucrose, PBS] 중에 담가 4℃ 에서 하룻밤 두고, 다음 날, 가로 세로 수 mm 인 블록으로 절단하여, OCT 화합물로 포매하여, 드라이아이스로 냉각한 이소펜탄으로 동결하였다.
이렇게 하여 동결시킨 조직을, 크라이오스텟을 사용하여 두께 1O㎛ 로 잘라 APS 코트 부착 슬라이드 글래스 (MATSUNAMI사 제조) 에 접착하여, 충분히 건조시켜 동결 절편을 제작하였다.
상기 조작과정에서 취득한 말초혈세포는, 등량의 0.9% NaCl 을 첨가하여 희 석하고, NycoPrep 1.077 Animal (다이이찌화학약품사 제조) 1.4㎖ 의 위에 중층하고, 실온에서 600×g, 30분간 원심분리하였다. 계면의 단핵구 부유액의 층을 회수하여, 1㎖ 의 PBS 를 첨가하여 혼화하고, 실온에서 400×g, 15분간 원심분리하고, 상등액을 제외하여, 침전되어 있는 단핵구를 PBS 0.5㎖ 로 현탁하여, FACS Calibur (BECTON DICKINSON사 제조) 를 사용하여 GFP 양성 세포수의 비율을 측정하였다. 그 결과, 말초혈 단핵구 중에서의 GFP 양성 세포의 비율은, 90.3% 이었다.
골수세포에 관해서도, 마찬가지로 FACS Calibur 를 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 측정한 바, 87.3% 가 GFP 양성 세포가 차지하였다.
또, 각 장기로부터 적출하여 제작한 동결 절편을 Zeiss사 제조 형광현미경 Axiophot2 로 관찰한 결과, 폐, 심장, 간장, 뇌, 위, 피부, 소장, 대장, 골격근, 췌장, 비장, 신장, 기관 등, 거의 모든 전신의 장기에서, GFP 양성 세포가 많이 존재하는 것을 확인하였다. 특히, 뇌에서는, 후구, 맥락총 등의 부분에서 GFP 양성 세포가 많이 관찰되었다. 본 결과는, G-CSF 투여에 의한 마우스 말초혈 중에 동원된 줄기세포가 전신의 여러가지 조직의 수복에 작용하는 것을 나타내고 있다.
(3) 면역 염색에 의한 GFP 양성 세포의 성질의 동정
(2) 에서 제작한 동결 절편에 관해서는, 아래와 같이 하여 여러 가지의 항체로 염색하여, GFP 양성 세포의 성질을 조사하였다.
우선, 여러 가지의 장기의 조직편에 대하여, 항사이토케라틴 항체에 의한 면 역염색을 하였다. 사이토케라틴은 상피계 세포의 마커이다.
피부를 적출하여 제작한 동결 절편을 얹은 슬라이드 글래스를 PBS 에 5분간 담그는 것을 3회 반복하고, 슬라이드 유리를 세정하였다. 그 후, 종농도가 10㎎/㎖ 가 되도록 PBS 로 희석한 프로테이나아제 (Proteinase) K (GibcoBRL사 제조) 에 15분간 담갔다. PBS 로 1회 세정한 후, 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 과 실온에서 15분간 반응시켰다. 다시 PBS 로 2회 세정한 후, 블로킹액 [10% 돼지 혈청 (DAKO사 제조), PBS] 에 실온에서 1시간 담그고, 다음에 일차 항체 [Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, Clones AE1/AE3] (DAKO사 제조) 를, 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 50배 희석한 용액과 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS 로 4회 세정한 후, 이차 항체 [Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H＋L)] (세이카가꾸공업사 제조) 를 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 800배 희석한 용액과, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS 로 4회 세정한 후, VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (VECTOR LABORATORIES사 제조) 를 절편에 적하하고, 커버 유리를 씌워 봉입하여, Zeiss 제조 형광현미경 Axiophot2 로 관찰하였다. GFP 양성 세포이면서 사이토케라틴 양성 세포가 관찰된 점에서, 이식에 사용한 G-CSF 에 의해 동원된 말초혈 중의 세포에는, 피부에 생착되어 상피계 세포로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포가 포함되는 것을 나타내고 있다.
항사이토케라틴 항체를 사용하여, 대장의 동결 절편에 대하여 동일한 염색을 하여, 형광현미경 하에서 관찰한 바, GFP 양성 세포이면서 사이토케라틴 양성 세포 가 관찰되었다. 이와 같은 점에서, 이식에 사용한 G-CSF 에 의해 동원된 말초혈 중의 세포에는, 대장에 생착되어 상피계 세포로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포가 포함되는 것을 나타내고 있다.
항사이토케라틴 항체와 혈구계 세포의 마커인 CD45 에 대한 항체를 사용하여, 소장의 동결 절편에 대하여도 동일한 염색을 하였다. 형광현미경 하에서 관찰한 바, GFP 양성 세포이면서 CD45 음성세포가 관찰되었다. 이와 같은 점에서, 이식에 사용한 G-CSF 에 의해 동원된 말초혈 중의 세포에는, 소장에도 생착되어 혈구계 이외의 세포로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포가 포함되는 것을 나타내고 있다.
다음에 여러 가지의 장기에 대하여, 항CD45 항체에 의한 면역염색을 하였다.
폐를 적출하여 제작한 동결 절편을 얹은 슬라이드 글래스를 PBS 로 5분간 담그는 것을 3회 행함으로써 세정한 후, DAKO 바이오틴 블로킹 시스템 (Biotin Blocking System) (1)액 (DAKO사 제조) 에 실온에서 10분간 담가, PBS 로 2회 세정한 후, DAKO 바이오틴 블로킹 시스템 (2) 액 (DAKO사 제조) 에 실온에서 10분간 담가, 다시 PBS 로 2회 세정하였다.
그 후, 블로킹액 [10% 돼지 혈청 (DAKO사 제조), PBS] 에 실온에서 1시간담그고, 다음에 일차 항체 [Biotin anti-mouse CD45 (LCA, Ly5)] (BD Pharmingen사 제조) 를, 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 100배 희석한 용액과 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS 로 4회 세정한 후, 2차 항체 (streptavidin, AlexaFluor594 conjugate) (Molecular Probe사 제조) 를 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 종농 도 5㎍/㎖ 가 되도록 희석한 용액과, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS 로 4회 세정한 후, VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (VECTOR LABORATORIES사 제조) 를 절편에 적하하고, 커버 유리를 씌워 봉입하여, 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, GFP 양성 세포이면서 CD45 음성세포가 관찰되었다. 이와 같은 점에서, 이식에 사용한 G-CSF에 의해 동원된 말초혈 중의 세포에는, 폐에 생착되어 혈구계 이외의 세포로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포가 포함되는 것을 나타내고 있다.
항 CD45 항체를 사용하여, 간장의 동결 절편에 대하여 동일한 염색을 하여, 형광현미경 하에서 관찰한 바, GFP 양성 세포이면서 CD45 음성세포가 관찰되었다. 이와 같은 점에서, 이식에 사용한 G-CSF 에 의해 동원된 말초혈 중의 세포에는, 간장에도 생착되어 혈구계 이외의 세포로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포가 포함되는 것을 나타내고 있다.
항CD45 항체를 사용하여, 심장, 뇌, 위, 피부, 소장, 대장, 골격근, 췌장의 동결 절편에 대해서도 동일한 염색을 하였다. 형광현미경 하에서 관찰한 바, 각각의 조직에 있어서 GFP 양성 세포이면서 CD45 음성세포가 관찰되었다. 이와 같은 점에서 이식에 사용한 G-CSF 에 의해 동원된 말초혈 중의 세포에는, 심장, 뇌, 위, 피부, 소장, 대장, 골격근, 췌장에도 생착되어 혈구계 이외의 세포로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포가 포함되는 것을 나타내고 있다.
시험예 1 X선 조사 마우스에 대한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드의 장관 상피에 대한 치유 효과
X선이 조사된 마우스는, 장관 상피나 골수 등에서의 세포 신생이 일어나지 않는다 (nature review cancer, 2003년, 3권, p.117-129). 그래서, 장관 상피 파괴 모델로서 X선 조사 마우스를 제작하여, 나루토그라스팀에 의해 말초혈에 동원된 세포가 수복에 기여하는지 여부를 확인하였다.
(1) 나루토그라스팀 투여에 의해 말초혈 중에 동원된 세포의 X선 조사 마우스로의 이식
전신 세포에 GFP 유전자가 삽입된, GFP 단백질 발현 마우스 (C57BL/6×129 계통) 의 8주령의 개체에 대하여, 5일간 연속으로 매일 1마리당, 나루토그라스팀 10㎍ 피하 주사하였다. 나루토그라스팀으로는, 노이압100 (교와발효공업 제조) 을 농도 100㎍/mL 가 되도록, PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH7.4) (LIFE TECHNOLOGIES사 제조) 에 용해하여 사용하였다.
마지막으로 나루토그라스팀을 투여한 다음날, 디에틸에테르를 사용하여 마우스를 마취하여, 안정맥에서 말초혈을 채취하여, 미리 헤파린나트륨 (다케다약품공업사 제조) 를 분주한 튜브에 회수하여, 100㎛ 셀·스트레이나 (BECTON DICKINSON사 제조) 를 통과시켜 놓았다.
이렇게 해서 채취한 말초혈을, 아래와 같이 하여 꼬리정맥으로부터 주입하여 이식하였다.
우선, 이식을 받는 C57BL/6 마우스 (일본쿠레아사) 는 8주령의 것을 준비하여, 이식 전날에, X선 조사장치 (히타치메디코사 제조) 를 사용하여 12Gy 의 선량의 X선을 조사하였다. 다음날, 이 마우스에 대하여, 채취한 말초혈을 1마리당 300㎕ 꼬리정맥으로부터 이식하였다. 그 후, 최저 4주간 경과하여 생존했는지 확인하여, 키메라 마우스 (이하, 말초혈 키메라 마우스라고 부른다) 를 제작하였다.
(2) 말초혈 키메라 마우스에 있어서의 장관 상피 세포에서의 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 동원 말초혈 유래 세포의 신생
(1) 에서 제작한 말초혈 키메라 마우스를 해부하고, 관류고정시켜 소장 및 대장을 적출하였다. 구체적으로는, 우선 말초혈 키메라 마우스에게 넨부탈 (다이닛폰제약사 제조) 을 복강내 주사하여 마취하여, 개복 개흉하여 심장을 노출시키고, 25G 의 테루모 제조의 날개 부착 정맥 주사 바늘을 좌심실에 삽입한 후, 우심이를 잘라 PBS 를 20mL 흘려넣어, 전신을 관류시켰다. PBS 를 전량 흘려넣은 후, 동일한 조작에 의해 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 을 20mL 흘려넣어 고정시켰다.
그 후, 고정한 마우스로부터 소장, 대장을 적출하고, 4℃ 에서 2시간 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 중에 담근 후, PBS 로 린스하여, 고자당용액 [20% Sucrose, PBS] 중에 담가 4℃ 에서 하룻밤 두고, 다음날, 가로 세로 수 mm 인 블록으로 절단하여, OCT (optimum cutting temperature) 화합물 (MILES사 제조) 로 포매하여, 드라이아이스로 냉각시킨 이소펜탄으로 동결하였다.
이렇게 하여 동결시킨 조직을, 크라이오스텟을 사용하여 두께 10㎛ 로 잘라, APS 코트 부착 슬라이드 글래스 (MATSUNAMI사 제조) 에 부착하여, 충분히 건조시켜 동결 절편을 제작하였다.
이렇게 해서 제작한 소장 및 대장의 동결 절편에 대하여, 이하와 같이 하여 항사이토케라틴 항체에 의한 면역염색을 하였다. 사이토케라틴은 상피계 세포의 마커이다.
동결 절편을 얹은 슬라이드 글래스를 PBS 에 5분간 담그는 것을 3회 반복하여, 슬라이드 글래스를 세정하였다. 그 후, 종농도가 10㎎/mL 로 되도록 PBS 로 희석한 프로테이나아제 K (GibcoBRL사 제조) 에 15분간 담갔다. PBS 로 1회 세정한 후, 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 과 실온에서 15분간 반응시켰다. 또한 PBS 로 2회 세정한 후, 블로킹액 [10% 돼지 혈청 (DAKO사 제조), PBS] 에 실온에서 1시간 담그고, 다음에 일차 항체 [Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, Clones AE1/AE3] (DAKO사 제조) 를, 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 50배 희석한 용액과 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS 로 4회 세정한 후, 2차 항체 [Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H＋L)] (세이카가꾸공업사 제조) 를 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 800배 희석한 용액과, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS 로 4회 세정한 후, VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (VECTOR LABORATORIES사 제조) 를 절편에 적하하고, 커버 유리를 씌워 봉입하여, Zeiss 제조의 형광현미경 Axiophot2 로 관찰하였다. 그 결과, GFP 양성이면서 사이토케라틴 양성인 세포가 관찰되었다. 따라서, 이식에 사용한 나루토그라스팀에 의해 말초혈 중으로 동원된 세포로부터, X선 조사에 의해 파괴된 소장 및 대장에 있어서, 각각의 조직의 상피계 세포에 신생된 것을 확인하였다.
시험예 2 사염화탄소 투여 모델 마우스에 대한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티 드의 간장에 대한 치유 효과
사염화탄소 투여에 의해 간장을 파괴한 모델 마우스를 사용하여, 나루토그라스팀에 의해 말초혈에 동원된 세포가 간세포로 신생되는지 여부를 아래와 같이 하여 조사하였다.
우선 시험예 1(1) 과 동일하게 나루토그라스팀 동원 말초혈을 X선 조사한 마우스에게 꼬리정맥 주입한 마우스 (말초혈 키메라 마우스) 를 만들었다. 이 말초혈 키메라 마우스에 대하여, 사염화탄소 (Wako사 제조) 를 2mL/㎏ 이 되도록 복강내 투여하였다. 또, 사염화탄소는 미네랄 오일 (Mineral 0il) (Sigma사 제조) 을 용매로 하여, 사염화탄소와 미네랄 오일의 용량비가 2 : 3 이 되도록 조제하였다.
복강내 투여하여 2주간 경과한 후, 이 마우스에 대하여 시험예 1(2) 에서 나타낸 방법과 동일한 방법으로 관류고정시켜, 간장을 적출하였다. 그 후, 고정한 마우스로부터 간장을 적출하여, 4℃ 에서 2시간 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 중에 담근 후, PBS 로 린스하여, 고자당용액 [20% Sucrose, PBS] 중에 담가 4℃ 에서 하룻밤 두고, 다음 날, 가로 세로 수 mm 인 블록으로 절단하고, OCT 화합물로 포매하여, 드라이아이스로 냉각시킨 이소펜탄으로 동결하였다.
이렇게 하여 동결시킨 조직을, 크라이오스텟을 사용하여 두께 10㎛ 으로 자르고, APS 코트 부착 슬라이드 글래스 (MATSUNAMI사 제조) 에 접착하여, 충분히 건조시켜 동결 절편을 제작하였다.
이렇게 해서 제작한 간장의 동결 절편에 대하여, 이하와 같이 하여 항알부민 항체에 의한 면역염색을 하였다. 알부민은 간 실질세포의 마커이다.
간장을 적출하여 제작한 동결 절편을 얹은 슬라이드 글래스를 PBS 에 5분간 담그는 것을 3회 행하여 세정한 후, 블로킹액 [10% 돼지 혈청(DAKO사 제조), PBS] 에 실온에서 1시간 담그고, 다음에 일차 항체 [Anti-mouse albumin rabbit polyclonal] (Biogenesis사 제조) 를, 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 200배 희석한 용액과 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS 로 4회 세정한 후, 이차 항체 (AlexaFluor594-anti rabbit IgG) (Molecular Probe사 제조) 를 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 800배 희석한 용액과, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS 로 4회 세정한 후, VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (VECTOR LABORATORIES사 제조) 를 절편에 적하하여, 커버 유리를 씌워 봉입하여, 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, GFP 양성이면서 알부민 양성이고, 형태적으로도 간 실질세포와 동일한 세포가 관찰되었다. 즉, 나루토그라스팀에 의해 말초혈 중으로 동원된 세포는, 사염화탄소에 의해 파괴된 간장에 있어서, 간 실질세포로 신생된 것이 확인되었다.
시험예 3 카르디오톡신 투여 모델 마우스에 대한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드의 골격근에 대한 치유 효과
카르디오톡신 투여에 의해 골격근을 파괴한 모델 마우스를 사용하여, 나루토그라스팀에 의해 말초혈에 동원된 세포가 골격근 섬유로 신생되는지 여부를 아래와 같이 하여 조사하였다.
우선, 시험예 1(1) 과 동일하게, 나루토그라스팀 동원 말초혈을 X선 조사한 마우스에게 꼬리정맥 주입한 마우스 (말초혈 키메라 마우스) 를 만들었다. 이 말초혈 키메라 마우스의 전경골근에 카르디오톡신을 25-50μL 근육내 투여하였다. 또 카르디오톡신 (Latoxan사 제조) 은 농도 1㎛ 가 되도록 PBS 에 용해하여 사용하였다.
다음에, 근육내 투여하여 4주간 경과한 후, 마우스로부터 전경골근을 적출하여, 4℃ 에서 2시간 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 중에 담근 후, PBS 로 린스하여, 고자당용액 [20% Sucrose, PBS] 중에 담가 4℃ 에서 하룻밤 두고, 다음날, 가로 세로 수 mm 인 블록으로 절단하고, OCT 화합물로 포매하여, 드라이아이스로 냉각시킨 이소펜탄으로 동결하였다.
이렇게 하여 동결시킨 조직을, 크라이오스텟을 사용하여 두께 10㎛ 으로 자르고, APS 코트 부착 슬라이드 글래스 (MATSUNAMI사 제조) 에 접착하여, 충분히 건조시켜 동결 절편을 제작하였다.
이렇게 해서 제작한 전경골근의 동결 절편에 대하여, 이하와 같이 하여 항데스민(Desmin) 항체에 의한 면역염색을 하였다. 데스민은 골격근 섬유의 마커이다.
전경골근을 적출하여 제작한 동결 절편을 얹은 슬라이드 글래스를 PBS 에 5분간 담그는 것을 3회 반복하여, 슬라이드 글래스를 세정하였다. 그 후, 종농도가 10㎎/mL 로 되도록 PBS 로 희석한 프로테이나아제 K (GibcoBRL사 제조) 에 15분간 담갔다. PBS 로 1회 세정한 후, 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 과 실온에서 15분간 반응시켰다. 또한 PBS 로 2회 세정한 후, 블로킹액 [10% 돼지 혈청 (DAKO사 제조), PBS] 에 실온에서 1시간 담그고, 다음에 일차 항체 [Anti-Desmin Delipidized, Whole Antiserum D8281] (Sigma사 제조) 를, 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 40배 희석한 용액과 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS 로 4회 세정한 후, 2차 항체 (AlexaFluor594-anti rabbit IgG) (Molecular Probe사 제조) 를 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 800배 희석한 용액과, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBS 로 4회 세정한 후, VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (VECTOR LABORATORIES사 제조) 를 절편에 적하하고, 커버유리를 씌워 봉입하여, 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, GFP 양성이면서 데스민 양성이고, 형태적으로도 골격근으로 판정할 수 있는 골격근 섬유가 관찰되었다. 즉, 나루토그라스팀에 의해 말초혈 중으로 동원된 세포는, 카르디오토옥신에 의해서 파괴된 골격근 조직 중에서, 골격근 섬유에 신생된 것이 확인되었다.
시험예 4 피부 창상 모델 마우스에 대한 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드의 치유 효과
통상적인 방법 [바이올로지컬 앤드 파마슈티컬 블루틴 Biological & Pharmaceutical Bulletin (Biol. Pharm. Bu11.) 1996년, 19권, p.530-535] 에 따라, 암컷 C57BL/KsJ-db/db Jcl 6주령 (일본쿠레아) 2마리를 넨부탈 (다이닛폰제약 제조) 복강내 투여에 의해 마취하여, 배측체모를 제모 후, 직경 4mm 의 생검 트레판 (카이 인더스트리즈) 을 사용하여 피부 전층 절제창을 제작하였다.
2마리 중의 1마리는 절제창 제작일 (이하 0일이라 기재한다) 로부터 나루토 그라스팀 10㎍/체(body) 를 1일 1회, 5일간 피내에 반복 투여하고, 다른 1마리에는 나루토그라스팀 대신에 PBS 를 투여하였다. 나루토그라스팀 (교와발효공업 제조) 은 농도 100㎍/mL 가 되도록 PBS 에 용해하여 사용하였다. 절제창을 만든 후, 시간이 경과함에 따라 창상 면적을 측정하여 창상 치유 정도를 구하였다. 창상 면적의 측정은, 배부(背部) 중앙에 만든 2개소의 절제창을 디지털 카메라 (Nikon COOLPIX990) 로 촬영 후, 화상해석소프트 (NIH 이미지) 를 사용하여 계측하였다. 표 2 에 창상 면적 (㎟) 과, 0일의 창상 면적을 100% 로 한 경우의 창상 면적의 비율을 창상 면적률 (%) 로 나타낸다.
절제창 제작 후의 일수
0일 3일 7일 10일
나루토그라스팀 투여 22.4㎟ (100%) 17.3㎟ (100%) 17.0㎟ (75.9%) 9.6㎟ (53.5%) 3.3㎟ (14.7%) 3.0㎟ (17.3%) 0.7㎟ (3.1%) 2.8㎟ (16.2%)
PBS 투여 13.2㎟ (100%) 10.5㎟ (100%) 10.7㎟ (81.1%) 7.8㎟ (74.3%) 6.4㎟ (48.5%) 7.8㎟ (74.3%) 5.2㎟ (39.4%) 5.1㎟ (48.6%)
창상 면적(㎟) (창상 면적률(%))
표 2 에 나타내는 바와 같이 나루토그라스팀 투여 마우스에서는 PBS 투여마우스와 비교하여 창상 면적 및 창상 면적률의 저하 촉진, 즉 피부 재생 촉진 효과가 관찰되었다.
시험예 5 래트 폐포 파괴 모델에서의 평가 (1)
수컷 SD 래트 9주령 (일본찰스·리버) 에, 돼지 췌엘라스타아제 (이하 엘라스타아제라 기재하는, 비활성 135 유니트/㎎ 단백질 (protein), Elastin Products 제조) 를 생리식염수 (오오쓰카제약 제조) 로 70유니트/mL 에 희석하여, 500μL 을 기관내 투여하였다. 엘라스타아제의 1유니트는 1㎎ 의 엘라스틴을 pH8.8, 37℃의 조건 하에서, 20분간에 분해되는 활성이다. 2주 후, 각 군의 평균체중이 거의 같아지도록, 1군 10마리로 군을 나누었다. 필그라스팀은 그란 주사액 M300 (기린비루 제조) 을, 농도가 20㎍/mL 이 되도록 생리식염수에 용해하여 사용하였다. 필그라스팀 투여군에는, 엘라스타아제 투여 후 3주째부터, 필그라스팀을 100㎍/㎏ 을 1일 1회, 5일간 피내에 반복투여하였다. 엘라스타아제 투여군에는, 엘라스타아제 투여 후에는, 아무것도 투여하지 않았다. 생리식염수 투여군에는, 엘라스타아제 대신에 생리식염수를 투여하고, 그 후에는 아무것도 투여하지 않았다. 엘라스타아제 투여 5주일 후에 폐를 적출하여, 기도 내에 25cm H20 로 가압한 포르말린을 주입하여 고정한 후에, 절편에서 폐포의 파괴 정도를 측정하였다. 평균 2점간 거리 (mean linear intercept length) 는, 폐 절편의 현미경 사진 상에, 1.325㎛ 의 격자선을 종횡으로 각각 5개 그어, 선 상에 교차하는 폐포벽을 측정한 후에, 격자선의 전장을 교차한 폐포벽 수를 나누어 구하였다 [인바이론메탈·리서치 (Environmental Research), 1987년, 42권, p.340-352].
도 1 에 평균 2점간 거리를 평균치±표준오차 (SE) 에 의해서 나타내었다. 도 1 이 나타내는 바와 같이 엘라스타아제 투여에 의해, 평균 2점간 거리의 연장, 즉 폐포벽 파괴가 관찰되었다. 필그라스팀 투여군에 있어서, 평균 2점간 거리의 단축, 즉 폐포벽 파괴의 16% 의 회복을 관찰할 수 있었다.
시험예 6 래트 폐포 파괴 모델에서의 평가 (2)
시험예 5 와 동일하게 엘라스타아제 처치에 의해 폐포 파괴한 래트에, 나루토그라스팀을 투여하여, 폐포의 파괴변화를 측정하였다.
나루토그라스팀은 노이압 250 (교와발효공업 제조) 을, 농도가 40㎍/mL 로 되도록 생리식염수에 용해하여 사용하였다. 나루토그라스팀 투여군에는, 엘라스타아제 투여 후 3주째부터, 나루토그라스팀 200㎍/㎏ 을 1일 1회, 5일간 피하에 반복투여하고, 그 후, 1주일에 3회의 투여를 5주간 실시하였다. 엘라스타아제 투여군에는, 엘라스타아제 투여 후에는 아무것도 투여하지 않았다. 생리식염수 투여군에는, 엘라스타아제 대신에 생리식염수를 투여하고, 그 후에는 아무것도 투여하지 않았다. 엘라스타아제 투여 8주일 후에 폐를 적출하여, 시험예 5 의 방법에 따라 해석하였다.
도 2 는 평균 2점간 거리를 평균치＋표준오차 (SE) 에 의해 나타낸 것이다. 도 2 가 나타내는 바와 같이 엘라스타아제 투여에 의해, 평균 2점간 거리의 연장, 즉 폐포벽 파괴가 관찰되었다. 나루토그라스팀 투여군에 있어서, 평균 2점간 거리의 단축, 즉 폐포벽 파괴의 35% 의 회복을 관찰할 수 있었다.
시험예 7 래트 폐포 파괴 모델에서의 평가 (3)
시험예 5 와 동일하게 엘라스타아제 처치에 의해 폐포 파괴한 래트에, 전체 trans-레티노인산 (이하, 레티노인산이라 기재), 또는 나루토그라스팀과 레티노인산을 투여하여, 폐포의 파괴변화를 측정하였다. 레티노인산 (시그마알드리치 제조) 은, 3㎎/mL 이 되도록 콘오일 (와코쥰야쿠공업 제조) 에 현탁하여 사용하였다. 나루토그라스팀은 노이압100 (교와발효공업 제조) 을, 농도가 20㎍/mL 이 되도록, 생리식염수에 용해하여 사용하였다. 엘라스타아제 투여 후 3주째부터 나루토그라스팀을 5일간, 100㎍/㎏ 을 1일 1회 피내에 반복 투여하였다. 레티노인산은, 엘라스타아제 투여 후 3주째부터 3주간, 1일 1회, 3㎎/㎏ 으로 반복 경구 투여하였다. 레티노인산만을 투여한 군 (레티노인산 투여군) 및 레티노인산과 나루토그라스팀을 양쪽 투여한 군 (레티노인산/나루토그라스팀 투여군) 을 형성하였다. 엘라스타아제 투여군에는, 엘라스타아제를 투여한 후에는, 아무것도 투여하지 않았다. 생리식염수 투여군에는, 엘라스타아제 대신에 생리식염수를 투여하고, 그 후에는 아무것도 투여하지 않았다. 엘라스타아제 투여 5주 후에 폐를 적출하고, 시험예 5 의 방법에 따라 해석하였다. 도 3 은 평균 2점간 거리를 평균치±표준오차 (SE) 에 의해 나타낸 것이다.
도 3 이 나타낸 바와 같이 레티노인산군에 있어서, 14% 의 평균 2점간 거리의 단축, 즉 파괴된 폐포벽의 회복이 관찰되었다. 레티노인산/나루토그라스팀군에서는, 파괴된 폐포벽의 강한 회복이 관찰되었다.
시험예 8 db/db 마우스에 대한 나루토그라스팀의 치유 효과
db/db 마우스는, db 유전자의 단일 열성 변이 마우스로서, 비만·과식·고인슐린혈증 등 현저한 당뇨병 증상을 자연 발증하는 2형 당뇨병 모델 마우스로 알려져 있다 (죠스린 당뇨병학, 1995년, p.317-349). db/db 마우스는 생후 4∼5주령 경부터 비만이 시작되어, 체중의 증가에 따라 혈당치는 상승되기 때문에, 고혈당 상태부터 전신의 장기에 염증 등의 조직 파괴를 야기하고 있는 것으로 추측된다. 그래서, db/db 마우스에 X선을 조사하고, 나루토그라스팀에 의해 말초혈에 동원된 세포가 조직 수복에 기여하고 있는지 여부를 확인하였다.
(1) X선 조사 db/db 마우스로의 골수세포의 이식
우선, 나루토그라스팀에 의해 말초혈에 동원된 세포를 이식하기 전에, 골수세포를 이식하였다.
db/db 마우스로는, C57BL/KsJ-db/db (일본쿠레아사) 의 6주령된 암컷의 개체를 사용하여, 이식 전 날에, X선 조사장치 (히타치메디코사 제조) 를 사용하여 12Gy 의 선량의 X선을 조사하였다. 다음날, 이 마우스에 대하여, 전신 세포에 GFP 유전자가 주입되어 GFP 단백질이 발현되어 있는 마우스 (C57BL/6×129 계통) 의 8주령된 개체의 골수로부터 단리된 세포3×106개를 꼬리정맥으로부터 이식하였다.
이식하여 4주 경과 후, 마우스를 해부하여 관류고정시켜, 각 장기를 적출하였다.
구체적으로는, 우선 넨부탈 (다이닛폰제약사 제조) 을 복강내 주사하여 마취하고, 개복 개흉하여 심장을 노출시켜, 25G 의 테루모 제조 날개 부착 정맥 주사 바늘을 좌심실에 삽입한 후, 우심이를 잘라 PBS 를 20mL 흘려넣어, 전신을 관류시켰다. PBS 를 전량 흘려넣은 후, 동일한 조작에 의해 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 을 20mL 흘려넣어 고정시켰다.
그 후, 고정된 마우스로부터 각 장기를 적출하여, 4℃ 에서 2시간 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 중에 담근 후, PBS 로 린스하여, 고자당 용액 [20% Sucrose, PBS] 중에 담가 4℃ 에서 하룻밤 두고, 다음날, 가로 세로 수 mm 인 블록으로 절단하여, OCT (optimum cutting temperature) 화합물 (MILES사 제조) 로 포매하여, 드라이아이스로 냉각한 이소펜탄으로 동결하였다.
이렇게 하여 동결시킨 조직을, 크라이오스텟을 사용하여 두께 10㎛ 로 잘라, APS 코트 부착 슬라이드 글래스 (MATSUNAMI사 제조) 에 부착하고, 충분히 건조시켜 동결 절편을 제작하였다.
이렇게 해서 제작한 각 장기의 동결 절편에 대하여, 여러 가지의 항체에 의한 면역염색을 하였다.
그 결과, 간장의 절편에 대해서는, GFP 양성이면서 알부민 항체 양성인 세포가 관찰되었다. 또한, 췌장의 절편에 대하여는, GFP 양성이면서 인슐린 항체 양성인 세포가, 심근의 절편에 대해서는, GFP 양성이면서 잘코마α-액틴 항체 양성 세포가 각각 관찰되었다. 또 뇌의 절편에 대해서는, 뉴런형의 형태를 갖는 GFP 양성 세포 및 플루킨에 세포 특유의 수상(樹狀) 형태를 갖는 GFP 양성 세포가 관찰되었다.
즉, X선 조사된 db/db 마우스에게 이식한다는 실험계에 있어서, 골수세포가 간 실질세포, 췌β세포, 심근세포, 뉴런, 플루킨에 세포에 신생된 것을 확인하였다.
(2) 나루토그라스팀 투여에 의해 말초혈 중에 동원된 세포의, X선 조사 db/db 마우스로의 이식
다음에 나루토그라스팀 투여에 의해 말초혈 중에 동원된 세포를, (1) 과 동일한 방법에 의해 X선 조사한 db/db 마우스에 이식하였다.
우선, 전신 세포에 GFP 유전자가 삽입되어 GFP 단백질이 발현되어 있는 마우스 (C57BL/6×129계통) 의 8주령된 개체에 대하여, 5일간 연속으로 매일 1마리당, 나루토그라스팀 10㎍ 을 피하 주사하였다. 나루토그라스팀으로는, 노이압 100 (교와발효공업 제조) 을 농도 100㎍/mL 가 되도록, PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH7.4) (LIFE TECHNOLOGIES사 제조) 에 용해하여 사용하였다.
마지막에 나루토그라스팀을 투여한 다음날, 디에틸에테르를 사용하여 마우스를 마취하여, 안(眼) 정맥으로부터 말초혈을 채취하고, 미리 헤파린나트륨 (다케다약품공업사 제조) 을 분주한 튜브에 회수하고, 100㎛ 셀·스트레이나 (BECTON DICKINSON사 제조) 를 통과시켜 두었다.
이렇게 해서 채취한 말초혈을, 아래와 같이 하여 db/db 마우스에게 꼬리정맥으로부터 주입하여 이식하였다.
우선, 이식을 받는 db/db 마우스는 C57BL/KsJ-db/db (일본쿠레아사) 의 6주령된 암컷의 개체로 하여, 이식 전일에, X선 조사장치 (히타치메디코사 제조) 를 사용하여 9.5Gy 의 선량의 X선을 조사하였다. 다음날, 이 마우스에 대하여, 채취한 말초혈을 1마리당 300㎕ 꼬리정맥으로부터 이식하였다.
이식하여 4주 경과 후, (1) 에 나타낸 것과 동일한 방법으로 마우스를 해부하여 관류 고정하고, 각 장기를 적출하여 포매하여 동결 절편을 제작하였다.
이렇게 해서 제작된 각 장기의 동결 절편에 대하여, 여러 가지 항체에 의한 면역염색을 하였다.
그 결과, 간장의 절편에 대하여는, GFP 양성이면서 알부민 항체 양성인 세포가 관찰되었다. 또한, 췌장의 절편에 대하여는, GFP 양성이면서 인슐린항체 양성인 세포가, 심근의 절편에 대하여는, GFP 양성이면서 잘코마α-액틴 항체 양성 세포가, 소장 및 위의 절편에 대하여는, GFP 양성이면서 사이토케라틴 항체 양성 세포가 각각 관찰되었다. 또한, 뇌의 절편에 대하여는, 뉴런양의 형태를 나타내고 NeuN 항체 양성이면서 GFP 양성 세포가 관찰되었다. 또한 폐의 절편에 대하여는, 폐포 상피 세포에 위치하는 GFP 양성 세포가 관찰되었다.
즉, X선 조사된 db/db 마우스에게 이식하는 실험계에서, 나루토그라스팀에 의해 말초혈 중으로 동원된 세포가 간 실질세포, 췌β세포, 심근세포, 소장 상피 세포, 위 상피 세포, 뉴런, 폐포 상피 세포에 신생된 것을 확인하였다.
시험예 9 골수 키메라 마우스에 대한 나루토그라스팀의 효과
암컷 C57BL/6마우스 6주령 (일본쿠레아) 및 암컷 C57BL/KsJ-db/db 마우스6주령 (일본쿠레아) 에, X선 조사장치 (히타치메디코사 제조) 를 사용하여 9.5 Gy 의 선량의 X선을 조사하였다. 다음날, 이 마우스에 대하여, 수컷 GFP 단백질 발현 트랜스제닉 마우스 (C57BL/6x129 계통) 6-8주령의 골수로부터 단리한 3x106개의 세포를 꼬리정맥으로부터 이식하였다.
이들 마우스를 나루토그라스팀 투여군과 컨트롤군으로 나눠, 다음과 같은 처치를 행하였다. 나루토그라스팀 투여군에서는, 이식하여 7일 후부터, 나루토그라스팀 10㎍/체를 1일 1회, 14일간 연속으로 피하에 반복투여하였다. 나루토그라스팀은 노이압 (교와발효공업 제조) 을 농도 100㎍/mL 이 되도록 PBS에 용해하여 사용하였다. 한편, 컨트롤군에서는, 이식하여 7일 후부터, 나루토그라스팀 대신에 PBS 를 14일간 연속 투여하였다.
골수 이식하여 1개월 후에, 각 마우스를 해부하여 관류고정시켜, 간장, 폐 및 신장을 적출하였다. 구체적으로는, 우선 넨부탈 (다이닛폰제약사 제조) 의 복강내 주사에 의해 마취하고, 개복 개흉하여 심장을 노출시켜, 25G 의 테루모 제조의 날개 부착 정맥 주사 바늘을 좌심실에 삽입한 후, 우심이를 잘라 PBS 를 20㎖ 흘려넣어, 전신을 관류시켰다. 그 후, 동일한 조작에 의해 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 을 20㎖ 흘려넣어 고정시켰다. 그 후, 우선 기관을 붙인 채로 폐를 적출하여, PBS 로 2배 희석한 OCT (optimum cutting temperature) 화합물 (MILES사 제조) 를 함유한 테루모 제조 서플로우 고정 바늘 (20G) 부속의 카테터를 장착한 20㎖ 시린지를 기관으로부터 삽입하여, 카테터의 끝과 기관을 견제봉합사 (나쓰메제작소사 제조) 로 결합하여, PBS 로 2배 희석한 OCT 용액 10㎖ 를 기관을 통과시켜 폐에 주입하였다. 주입후, 가로 세로 수 mm 정도의 블록으로 절단하고, OCT 화합물로 포매하여, 드라이아이스로 냉각한 이소펜탄으로 동결하였다. 또한, 간장·신장에 관해서도 개체로부터 적출하여, 4℃ 에서 2시간 고정액 [4% PFA (파라포름알데히드), PBS] 중에 담근 후, PBS 로 린스하여, 고자당 용액 [20% Sucrose, PBS] 중에 담가 4℃ 에서 하룻밤 두고, 다음날, 가로 세로 수 mm 정도의 블록으로 절단하고, OCT 화합물로 포매하여, 드라이아이스로 냉각한 이소펜탄으로 동결하였다. 이렇게 하여 동결시킨 조직을, 크라이오스텟을 사용하여 두께 6㎛ 로 잘라, APS 코트 부착 슬라이드 글래스 (MATSUNAMI사 제조) 에 접착하고, 충분히 건조시켜 동결 절편을 제작하였다.
이렇게 해서 제작한 동결 절편 중 간장의 절편에 대하여, 이하와 같이 하여 항 알부민 항체에 의한 면역염색을 하였다. 알부민은 간 실질세포의 마커이다. 간장을 적출하여 제작한 동결 절편을 얹은 슬라이드 글래스를 PBS 로 5분간 담그는 것을 3회 실행함으로써 세정한 후, 블로킹액 [10% 돼지 혈청 (DAKO사 제조), PBS] 에 실온에서 1시간 담그고, 다음에 일차 항체 [Anti-mouse albumin rabbit polyclonal] (Biogenesis사 제조) 를, 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 200배 희석한 용액과 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS 로 4회 세정한 후, 이차 항체 (AlexaFluor594-anti rabbit IgG) (Molecular Probe사 제조) 를 1.5% 돼지 혈청을 함유하는 PBS 로 800배 희석한 용액과, 실온에서 1시간 반응시켰다. 또한 PBS 로 4회 세정한 후, VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (VECTOR LABORATORIES사 제조) 를 절편에 적하하여, 커버 유리를 씌워 봉입하고, 형광현미경으로 관찰하였다.
각 개체로부터 각각 30절편을 제작하여, GFP 양성 또한 알부민 양성 세포수를 계측하였다. 도 4 에 단위면적으로 나눈 GFP 양성 또한 알부민 양성 세포수를 평균치＋표준오차에 의해 나타내었다. 도 4 가 나타내는 바와 같이, C57BL/6 마우스에 있어서는 나루토그라스팀 투여에 의해 약 4.5배의 증가를 확인할 수 있고, C57BL/KsJ-db/db 마우스에 있어서는 나루토그라스팀 투여에 의해 약 4.8배의 증가를 확인할 수 있었다. 요컨대, 나루토그라스팀 투여에 의해 간세포로 분화한 골수 유래 세포가 증가하였다.
또한, 폐 및 신장의 동결 절편으로부터도, GFP 양성의 수를 계측하였다. 그 결과, 나루토그라스팀 투여에 의해 GFP 양성 세포수가 증가하고 있는 것을 발견하였다.
도 1 은 엘라스타아제 투여에 의한 폐포의 평균 2점간 거리의 변화와, 필그라스팀 투여에 의한 작용을 나타낸다. 세로축은 평균 2점간 거리 (㎛) 를 나타낸다.
도 2 는 엘라스타아제 투여에 의한 폐포의 평균 2점간 거리의 변화와, 나루토그라스팀 투여에 의한 작용을 나타낸다. 세로축은 평균 2점간 거리 (㎛) 를 나타낸다. 또한, ## 은 P〈0.01 (엘라스타아제 투여군 대비, 윌콕슨 순위합검정) 을 나타낸다.
도 3 은 엘라스타아제 투여에 의한 폐포의 평균 2점간 거리의 변화와, 레티노인산 또는 레티노인산/나루토그라스팀 투여에 의한 작용을 나타낸다. 세로축은 평균 2점간 거리 (㎛) 를 나타낸다. 또한, ## 은 P〈0.01 (엘라스타아제 투여군 대비, 윌콕슨 순위합검정) 을 나타낸다.
도 4 는 나루토그라스팀 투여 유무에 의한 단위면적당의 GFP 양성 또한 알부민 양성의 세포수를 나타낸다. 세로축의 단위는 (cells/㎠) 이다. # 은 P〈0.05 (스튜던트 티 (Student's t) 검정) 을 나타낸다. 또한, WT, db 는 C57BL/6 마우스군, C57BL/KsJ-db/db 마우스군을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
실시예 1 : 주사제 (나루토그라스팀)
통상적인 방법에 의해, 다음 조성으로 이루어지는 주사제를 조제하였다.
나루토그라스팀 25㎍
일본약국방 폴리소르베이트 80 2.5g
일본약국방 젖당 5㎎
일본약국방 생리식염액 0.5mL
실시예 2 : 주사제 (나루토그라스팀과 전체 trans-레티노인산의 단제)
통상적인 방법에 의해, 다음 조성으로 이루어지는 주사제를 조정한다.
나루토그라스팀 25㎍
전체 trans-레티노인산 1.0㎎
일본약국방 폴리소르베이트80 2.5g
일본약국방 젖당 5㎎
일본약국방 생리식염액 0.5mL
본 발명에 의해, 과립구 콜로니 자극인자를 유효성분으로 함유하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제가 제공된다.
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Claims (35)

  1. 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제.
  2. 제 1 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 예방 및/또는 치료제.
  3. 제 1 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 예방 및/또는 치료제.
  4. 제 1 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 예방 및/또는 치료제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 화학 수식된 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩 티드인 예방 및/또는 치료제.
  6. 제 5 항에 있어서, 화학 수식이 폴리알킬렌글리콜 수식인 예방 및/또는 치료제.
  7. (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) 레티노인산 또는 레티노인산 유도체로 이루어지고, 동시에, 시간을 두고 따로따로, 또는 (a) 와 (b) 의 양쪽을 함유하는 하나의 약제로서 투여하기 위한 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제.
  8. (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) CXCR4 저해제로 이루어지고, 동시에, 시간을 두고 따로따로 또는 (a) 와 (b) 의 양쪽을 함유하는 하나의 약제로서 투여하기 위한 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제.
  9. 제 8 항에 있어서, CXCR4 저해제가 AMD-3100 또는 그 유도체인 예방 및/또는 치료제.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 파괴를 수반하는 질환이 신경질환, 순환기계 질환, 간장 질환, 췌장 질환, 소화관계 질환, 신장 질환, 피부 질환 및 폐 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환인 예방 및/또는 치료제.
  11. 제 10 항에 있어서, 신경질환이 뇌경색, 뇌혈관장해, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병, 척수손상, 우울병, 조울병의 어느 하나인 예방 및/또는 치료제.
  12. 제 10 항에 있어서, 순환기계 질환이 폐색성혈관병, 심근경색, 심부전, 관동맥 질환의 어느 하나인 예방 및/또는 치료제.
  13. 제 10 항에 있어서, 간장 질환이 B형 간염, C형 간염, 알코올성 간염, 간경변, 간부전의 어느 하나인 예방 및/또는 치료제.
  14. 제 10 항에 있어서, 췌장 질환이 당뇨병, 췌염의 어느 하나인 예방 및/또는 치료제.
  15. 제 10 항에 있어서, 소화관계 질환이 클론병, 궤양성 대장염의 어느 하나인 예방 및/또는 치료제.
  16. 제 10 항에 있어서, 신장 질환이 IgA신증, 신장염, 신부전의 어느 하나인 예 방 및/또는 치료제.
  17. 제 10 항에 있어서, 피부 질환이 욕창, 열상, 봉합창, 열상, 절개창, 교상, 피부염, 비후성반흔, 케로이드, 당뇨병성궤양, 동맥성궤양, 정맥성궤양의 어느 하나인 예방 및/또는 치료제.
  18. 제 10 항에 있어서, 폐 질환이 폐기종, 만성기관지염, 만성폐색성 폐 질환, 낭포성선유증, 특발성 간질성 폐렴 (폐선유증), 비만성 폐선유증, 결핵 또는 천식인 예방 및/또는 치료제.
  19. 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제.
  20. 제 19 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 약제.
  21. 제 19 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 약제.
  22. 제 19 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 서열번호 1 기재의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 약제.
  23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 화학 수식된 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드인 약제.
  24. 제 23 항에 있어서, 화학 수식이 폴리알킬렌글리콜 수식인 약제.
  25. (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) 레티노인산 또는 레티노인산 유도체로 이루어지고, 동시에, 시간을 두고 따로따로, 또는 (a) 와 (b) 의 양쪽을 함유하는 하나의 약제로서 투여하기 위한 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제.
  26. (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) CXCR4 저해제로 이루어지고, 동시에, 시간을 두고 따로따로, 또는 (a) 와 (b) 의 양쪽을 함유하는 하나의 약제로서 투여하기 위한 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제.
  27. 제 26 항에 있어서, CXCR4 저해제가 AMD-3100 인 약제.
  28. 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료방법.
  29. (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) 레티노인산 또는 레티노인산 유도체를, 동시에, 또는 시간을 두고 따로따로 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료방법.
  30. (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) CXCR4 저해제를, 동시에, 또는 시간을 두고 따로따로 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료방법.
  31. 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드를 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 방법.
  32. (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) 레티노인산 또는 레티노인산 유도체를, 동시에, 또는 시간을 두고 따로따로 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 방법.
  33. (a) 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드와, (b) CXCR4 저해제를, 동시에, 또는 시간을 두고 따로따로 투여하는 것을 특징으로 하는 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 방법.
  34. 조직 파괴를 수반하는 질환의 예방 및/또는 치료제의 제조를 위한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드의 사용.
  35. 조직 중에서 다기능성 줄기세포를 말초혈에 동원하는 약제의 제조를 위한 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드의 사용.
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