JP3537151B2 - 脳機能障害による疾患の予防・治療薬 - Google Patents
脳機能障害による疾患の予防・治療薬Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、脳機能障害による疾
患を予防し、また、治療するために使用される治療薬に
係り、更に詳しくは、エリスロポイエチン、顆粒球コロ
ニー刺激因子又はマクロファージコロニー刺激因子を有
効成分とする脳機能障害による疾患の予防・治療薬に関
する。
患を予防し、また、治療するために使用される治療薬に
係り、更に詳しくは、エリスロポイエチン、顆粒球コロ
ニー刺激因子又はマクロファージコロニー刺激因子を有
効成分とする脳機能障害による疾患の予防・治療薬に関
する。
【０００２】
【従来の技術】脳機能障害による疾患には、遺伝性で進
行が早いアルツハイマー病や、老人になって発病し、非
遺伝性で進行が遅いアルツハイマー型老人性痴呆症や、
脳梗塞、脳出血等の脳虚血障害、脳循環障害に伴うと考
えられている記憶障害、知能障害、意欲低下、注意力低
下等の脳血管性痴呆症が知られている。そして、これら
の疾患では、その大きな特徴として発病初期に記憶障害
という症状が顕著に現れるが、これは、疾患の進行の初
期に大脳基底核のコリン作動性の神経細胞が比較的選択
的に変性脱落することに起因するものと考えられてい
る。この様な脳機能障害による疾患は、特に近年におけ
る老年人口が急増する中で社会問題化しつつあり、医薬
業界においてもこれらの疾患を根本的に予防し、治療す
るための治療薬の開発が急務とされている。
行が早いアルツハイマー病や、老人になって発病し、非
遺伝性で進行が遅いアルツハイマー型老人性痴呆症や、
脳梗塞、脳出血等の脳虚血障害、脳循環障害に伴うと考
えられている記憶障害、知能障害、意欲低下、注意力低
下等の脳血管性痴呆症が知られている。そして、これら
の疾患では、その大きな特徴として発病初期に記憶障害
という症状が顕著に現れるが、これは、疾患の進行の初
期に大脳基底核のコリン作動性の神経細胞が比較的選択
的に変性脱落することに起因するものと考えられてい
る。この様な脳機能障害による疾患は、特に近年におけ
る老年人口が急増する中で社会問題化しつつあり、医薬
業界においてもこれらの疾患を根本的に予防し、治療す
るための治療薬の開発が急務とされている。
【０００３】そこで、従来においても、この様な疾患の
発病のメカニズムと共にその治療薬の開発も種々の方面
から検討され、幾つかの治療薬の開発の試みがされてい
る。例えば、アルツハイマー型老人性痴呆症が脳内のコ
リン作動性神経系の機能低下、すなわち脳内のアセチル
コリン量の低下を伴うことから、この脳内のアセチルコ
リン量を増加させる目的で、アセチルコリン前駆体物質
やアセチルコリン分解酵素であるアセチルコリンエステ
ラーゼの活性を阻害するアセチルコリンエステラーゼ阻
害剤の使用が提案され、実際にもアセチルコリンエステ
ラーゼ阻害剤としてフィゾスチグミン、テトラヒドロア
ミノアクリジン等の使用が提案されている。しかしなが
ら、これらの薬剤は、アルツハイマー型老人性痴呆症を
始めとする脳機能障害による疾患に対する治療効果が十
分でなく、しかも、好ましくない副作用がある等の問題
がある。
発病のメカニズムと共にその治療薬の開発も種々の方面
から検討され、幾つかの治療薬の開発の試みがされてい
る。例えば、アルツハイマー型老人性痴呆症が脳内のコ
リン作動性神経系の機能低下、すなわち脳内のアセチル
コリン量の低下を伴うことから、この脳内のアセチルコ
リン量を増加させる目的で、アセチルコリン前駆体物質
やアセチルコリン分解酵素であるアセチルコリンエステ
ラーゼの活性を阻害するアセチルコリンエステラーゼ阻
害剤の使用が提案され、実際にもアセチルコリンエステ
ラーゼ阻害剤としてフィゾスチグミン、テトラヒドロア
ミノアクリジン等の使用が提案されている。しかしなが
ら、これらの薬剤は、アルツハイマー型老人性痴呆症を
始めとする脳機能障害による疾患に対する治療効果が十
分でなく、しかも、好ましくない副作用がある等の問題
がある。
【０００４】また、最近では、上記と同様に脳内のアセ
チルコリン量を増加させる目的ではあるが、上記のアセ
チルコリンエステラーゼ阻害作用を利用するものではな
く、アセチルコリン合成酵素であるアセチルコリントラ
ンスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の活性を賦活するアセチル
コリントランスフェラーゼ賦活作用（ＣｈＡＴ賦活作
用）を有する物質の使用が提案され、実際に、インター
ロイキン３（ＩＬ−３）を有効成分とする老人性痴呆症
の治療・予防薬〔特開平３−９３，７２８号公報、Ｋａ
ｍｅｇａｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ，４，４２９〜
４３６（Ｍａｒｃｈ １９９０）、Ｋａｍｅｇａｉ ｅ
ｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３２，３
２３〜３２５（１９９０）〕や、神経成長因子（ｎｅｒ
ｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）が交感神
経、感覚神経、前脳コリン作動性神経細胞等に作用して
その分化や成熟を促進し、生存、機能維持に有効である
こと〔Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９，４５〜５２
（１９８３）〕、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏ
ｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ−ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦ
ａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ）がｉｎ ｖｉｔｒｏで神経
の栄養因子としての作用を有すること〔Ｋａｍｅｇａｉ
ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３
２，３２３〜３２５（１９９０）〕等が報告されてい
る。
チルコリン量を増加させる目的ではあるが、上記のアセ
チルコリンエステラーゼ阻害作用を利用するものではな
く、アセチルコリン合成酵素であるアセチルコリントラ
ンスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の活性を賦活するアセチル
コリントランスフェラーゼ賦活作用（ＣｈＡＴ賦活作
用）を有する物質の使用が提案され、実際に、インター
ロイキン３（ＩＬ−３）を有効成分とする老人性痴呆症
の治療・予防薬〔特開平３−９３，７２８号公報、Ｋａ
ｍｅｇａｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ，４，４２９〜
４３６（Ｍａｒｃｈ １９９０）、Ｋａｍｅｇａｉ ｅ
ｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３２，３
２３〜３２５（１９９０）〕や、神経成長因子（ｎｅｒ
ｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）が交感神
経、感覚神経、前脳コリン作動性神経細胞等に作用して
その分化や成熟を促進し、生存、機能維持に有効である
こと〔Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９，４５〜５２
（１９８３）〕、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏ
ｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ−ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦ
ａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ）がｉｎ ｖｉｔｒｏで神経
の栄養因子としての作用を有すること〔Ｋａｍｅｇａｉ
ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３
２，３２３〜３２５（１９９０）〕等が報告されてい
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、脳機能障害による疾患がその特徴として発病初期に
記憶障害という症状を伴い、大脳基底核のコリン作動性
の神経細胞が比較的選択的に変性脱落することに着目
し、このコリン作動性の神経細胞の変性脱落を予防し、
また、治療できる治療薬の開発について鋭意研究を重ね
た結果、造血因子であるエリスロポイエチン（ＥＰ
Ｏ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びマク
ロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）が優れた細
胞生存延長作用とアセチルコリントランスフェラーゼ賦
活作用とを有し、脳機能障害による疾患の予防と治療に
有効であることを見出し、本発明に到達した。
は、脳機能障害による疾患がその特徴として発病初期に
記憶障害という症状を伴い、大脳基底核のコリン作動性
の神経細胞が比較的選択的に変性脱落することに着目
し、このコリン作動性の神経細胞の変性脱落を予防し、
また、治療できる治療薬の開発について鋭意研究を重ね
た結果、造血因子であるエリスロポイエチン（ＥＰ
Ｏ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びマク
ロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）が優れた細
胞生存延長作用とアセチルコリントランスフェラーゼ賦
活作用とを有し、脳機能障害による疾患の予防と治療に
有効であることを見出し、本発明に到達した。
【０００６】従って、本発明の目的は、脳機能障害によ
る各種の疾患の予防と治療に有効である予防・治療薬を
提供することにある。また、本発明の目的は、細胞生存
延長作用及び／又はアセチルコリントランスフェラーゼ
賦活作用が有効な疾患の予防と治療に有効である予防・
治療薬を提供することにある。更に、本発明の目的は、
アルツハイマー病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は
脳血管性痴呆症の予防と治療に有効である予防・治療薬
を提供することにある。
る各種の疾患の予防と治療に有効である予防・治療薬を
提供することにある。また、本発明の目的は、細胞生存
延長作用及び／又はアセチルコリントランスフェラーゼ
賦活作用が有効な疾患の予防と治療に有効である予防・
治療薬を提供することにある。更に、本発明の目的は、
アルツハイマー病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は
脳血管性痴呆症の予防と治療に有効である予防・治療薬
を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、エリスロポイ
エチン、顆粒球コロニー刺激因子及びマクロファージコ
ロニー刺激因子から選ばれた１種又は２種以上の造血因
子を有効成分として含有する脳機能障害による疾患の予
防・治療薬である。
エチン、顆粒球コロニー刺激因子及びマクロファージコ
ロニー刺激因子から選ばれた１種又は２種以上の造血因
子を有効成分として含有する脳機能障害による疾患の予
防・治療薬である。
【０００８】本発明で有効成分として使用する造血因子
のエリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子及びマ
クロファージコロニー刺激因子については、造血因子と
しての本質的作用を奏する限り、それが如何なる方法で
製造されたものでもよいと考えられる。すなわち、天然
から抽出したものでもよいし、遺伝子組換技術により製
造したものでもよい。また、この際、その形質転換細胞
は原核細胞又は真核細胞の何れであってもよい。
のエリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子及びマ
クロファージコロニー刺激因子については、造血因子と
しての本質的作用を奏する限り、それが如何なる方法で
製造されたものでもよいと考えられる。すなわち、天然
から抽出したものでもよいし、遺伝子組換技術により製
造したものでもよい。また、この際、その形質転換細胞
は原核細胞又は真核細胞の何れであってもよい。
【０００９】すなわち、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）
については、例えば、ヒト再生不良性貧血患者の尿から
抽出して得られた天然のヒトＥＰＯ（特公平１−３８，
８００号公報）や、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列に対応す
るメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を採取し、そのｍ
ＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、次いで適当な
宿主（例えば、大腸菌の如き菌類や、酵母類や、植物の
細胞株や、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ）、マウスＣ−１２７細胞等の動物の細胞株
等）で生産させる遺伝子組換技術により製造されたもの
〔例えば、特公平１−４４，３１７号公報、Ｋｅｎｎｅ
ｔｈ Ｊａｃｏｂｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，３１３，８０６
〜８１０（１９８５）〕等を挙げることができる。そし
て、具体的には、例えば、天然ヒト尿ＥＰＯ、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を宿主として産生さ
せた遺伝子組換ヒトＥＰＯであるｒｈＥＰＯ／ＣＨＯ等
のＥＰＯが挙げられる。
については、例えば、ヒト再生不良性貧血患者の尿から
抽出して得られた天然のヒトＥＰＯ（特公平１−３８，
８００号公報）や、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列に対応す
るメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を採取し、そのｍ
ＲＮＡを利用して組換ＤＮＡ体を作成し、次いで適当な
宿主（例えば、大腸菌の如き菌類や、酵母類や、植物の
細胞株や、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ）、マウスＣ−１２７細胞等の動物の細胞株
等）で生産させる遺伝子組換技術により製造されたもの
〔例えば、特公平１−４４，３１７号公報、Ｋｅｎｎｅ
ｔｈ Ｊａｃｏｂｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，３１３，８０６
〜８１０（１９８５）〕等を挙げることができる。そし
て、具体的には、例えば、天然ヒト尿ＥＰＯ、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を宿主として産生さ
せた遺伝子組換ヒトＥＰＯであるｒｈＥＰＯ／ＣＨＯ等
のＥＰＯが挙げられる。
【００１０】また、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳ
Ｆ）については、例えば、ヒトＧ−ＣＳＦ産生細胞を培
養し、その培養上澄から抽出、分離、精製して得られた
天然のヒトＧ−ＣＳＦ（特公平１−４４，２００号公
報）や、遺伝子組換によって大腸菌や動物細胞等の宿主
を形質転換して得た形質転換体から産生せしめこれを単
離精製したもの又はそれを化学修飾したもの等を挙げる
ことができる（例えば、特公平２−５，３９５号、特開
昭６２−１２９，２９８号、特開昭６２−１３２，８９
９号、特開昭６２−２３６，４８８号、特開昭６４−８
５，０９８号の各公報）。そして、具体的には、例え
ば、天然ヒトＧ−ＣＳＦ、チャイニーズハムスター卵巣
細胞（ＣＨＯ）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒト
Ｇ−ＣＳＦであるｒｈＧ−ＣＳＦ／ＣＨＯ、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ．）を宿主として産生させた遺伝子組換
ヒトＧ−ＣＳＦであるｒｈＧ−ＣＳＦ／Ｅ．ｃｏｌｉ．
等のＧ−ＣＳＦが挙げられる。
Ｆ）については、例えば、ヒトＧ−ＣＳＦ産生細胞を培
養し、その培養上澄から抽出、分離、精製して得られた
天然のヒトＧ−ＣＳＦ（特公平１−４４，２００号公
報）や、遺伝子組換によって大腸菌や動物細胞等の宿主
を形質転換して得た形質転換体から産生せしめこれを単
離精製したもの又はそれを化学修飾したもの等を挙げる
ことができる（例えば、特公平２−５，３９５号、特開
昭６２−１２９，２９８号、特開昭６２−１３２，８９
９号、特開昭６２−２３６，４８８号、特開昭６４−８
５，０９８号の各公報）。そして、具体的には、例え
ば、天然ヒトＧ−ＣＳＦ、チャイニーズハムスター卵巣
細胞（ＣＨＯ）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒト
Ｇ−ＣＳＦであるｒｈＧ−ＣＳＦ／ＣＨＯ、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ．）を宿主として産生させた遺伝子組換
ヒトＧ−ＣＳＦであるｒｈＧ−ＣＳＦ／Ｅ．ｃｏｌｉ．
等のＧ−ＣＳＦが挙げられる。
【００１１】更に、マクロファージコロニー刺激因子
（Ｍ−ＣＳＦ）についても、例えば、人の尿等の生体試
料から抽出、分離、精製して得られた天然のヒトＭ−Ｃ
ＳＦ（例えば、特開昭６４−２２，８９９号、特開平３
−１７，０２１号の各公報）や、遺伝子組換技術により
製造されたもの（例えば、特表昭６２−５０１，６０７
号、特表平１−５０２，３９７号の各公報）等を挙げる
ことができる。そして、具体的には、例えば、天然ヒト
Ｍ−ＣＳＦ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒトＭ−ＣＳＦ
であるｒｈＭ−ＣＳＦ／ＣＨＯ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ．）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒトＭ−ＣＳ
ＦであるｒｈＭ−ＣＳＦ／Ｅ．ｃｏｌｉ．等のＭ−ＣＳ
Ｆが挙げられる。
（Ｍ−ＣＳＦ）についても、例えば、人の尿等の生体試
料から抽出、分離、精製して得られた天然のヒトＭ−Ｃ
ＳＦ（例えば、特開昭６４−２２，８９９号、特開平３
−１７，０２１号の各公報）や、遺伝子組換技術により
製造されたもの（例えば、特表昭６２−５０１，６０７
号、特表平１−５０２，３９７号の各公報）等を挙げる
ことができる。そして、具体的には、例えば、天然ヒト
Ｍ−ＣＳＦ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒトＭ−ＣＳＦ
であるｒｈＭ−ＣＳＦ／ＣＨＯ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ．）を宿主として産生させた遺伝子組換ヒトＭ−ＣＳ
ＦであるｒｈＭ−ＣＳＦ／Ｅ．ｃｏｌｉ．等のＭ−ＣＳ
Ｆが挙げられる。
【００１２】この様なＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ又はＭ−ＣＳ
Ｆの投与経路としては、外科的に脳内に直接薬剤を投与
する脳内投与や、脳脊髄液内に直接薬剤を注射する脳脊
髄液内投与が考えられ、また、静脈内注射等も可能性が
期待される。
Ｆの投与経路としては、外科的に脳内に直接薬剤を投与
する脳内投与や、脳脊髄液内に直接薬剤を注射する脳脊
髄液内投与が考えられ、また、静脈内注射等も可能性が
期待される。
【００１３】そして、これらＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ又はＭ
−ＣＳＦの投与量については、対象となる疾患やその病
状等を配慮して適宜決定できるものであるが、投与量に
ついては、ＥＰＯの場合が通常成人１人当たり０．１〜
５００μｇ、好ましくは５〜１００μｇであり、また、
Ｇ−ＣＳＦの場合が通常成人１人当たり０．１〜１，０
００μｇ、好ましくは１〜７００μｇであり、更に、Ｍ
−ＣＳＦの場合が通常成人１人当たり０．１〜１，００
０μｇ、好ましくは１〜７００μｇである。
−ＣＳＦの投与量については、対象となる疾患やその病
状等を配慮して適宜決定できるものであるが、投与量に
ついては、ＥＰＯの場合が通常成人１人当たり０．１〜
５００μｇ、好ましくは５〜１００μｇであり、また、
Ｇ−ＣＳＦの場合が通常成人１人当たり０．１〜１，０
００μｇ、好ましくは１〜７００μｇであり、更に、Ｍ
−ＣＳＦの場合が通常成人１人当たり０．１〜１，００
０μｇ、好ましくは１〜７００μｇである。
【００１４】更に、本発明のＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ又はＭ
−ＣＳＦを有効成分とする製剤については、その投与方
法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、
安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤等を添加する
ことができる。ここで、懸濁化剤の例としては例えばメ
チルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチ
ルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート等を挙げることができ、溶解補
助剤としては例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、
ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマ
シ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができ、安定
化剤としては例えばヒト血清アルブミン、デキストラン
４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウ
ム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができ、等張
化剤としては例えばＤ−マンニトール、ソルビトール等
を挙げることができ、また、保存剤としては例えばパラ
オキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソ
ルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール
等を挙げることができ、更に、吸着防止剤としては例え
ばヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチ
レンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒド
ロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオ
キシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等
を挙げることができる。
−ＣＳＦを有効成分とする製剤については、その投与方
法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、
安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤等を添加する
ことができる。ここで、懸濁化剤の例としては例えばメ
チルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチ
ルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート等を挙げることができ、溶解補
助剤としては例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、
ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマ
シ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができ、安定
化剤としては例えばヒト血清アルブミン、デキストラン
４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウ
ム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができ、等張
化剤としては例えばＤ−マンニトール、ソルビトール等
を挙げることができ、また、保存剤としては例えばパラ
オキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソ
ルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール
等を挙げることができ、更に、吸着防止剤としては例え
ばヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチ
レンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒド
ロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオ
キシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等
を挙げることができる。
【００１５】次に、以下に本発明の効果を確認するため
の実験例を示す。 〔１〕初代培養細胞の調製 胎児期１５日のＢＡＬＢ／マウス（三共実験サービス、
東京）から前脳基底を含んだ中隔野を得た。ハンクスの
平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ溶液、ｐＨ７．４）中で組織を
摘出して細断し、これを３７℃で３分間０．０３％のト
リプシンを含んだＨＢＳＳ溶液（ｐＨ６．５）で処理し
た。６３μｍのナイロンメッシュで濾過した後、無血清
培地に再度懸濁した。培養は、細胞６×１０5 個／ｍｌ
で開始した。細胞の培養開始時にマウスβＮＧＦ（ｍβ
ＮＧＦ、シグマ社、ミズリー州）１００ｎｇ／ｍｌ、リ
コンビナントヒトマクロファージコロニー刺激因子（ｒ
ｈＭ−ＣＳＦ）（ゲンザイム社製、米国マサチューセッ
ツ州）１０ＣＦＵ／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ又は１００
ＣＦＵ／ｍｌ、リコンビナントヒト顆粒球コロニー刺激
因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）（中外製薬株式会社製）１０Ｃ
ＦＵ／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ又は１００ＣＦＵ／ｍ
ｌ、若しくはリコンビナントヒトエリスロポイエチン
（ｒｈＥＰＯ）（中外製薬株式会社製）１ＩＵ／ｍｌ、
５ＩＵ／ｍｌ又は１０ＩＵ／ｍｌをそれぞれ加え、３日
後に培養液交換を行い、５日目に細胞をラバーポリスマ
ン（ガラス管の先にゴムを嵌め込んだ器具）で回収し、
下記の方法でコリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈ
ＡＴ）活性を測定した。結果を表１に示す。なお、無血
清培地は、４．５ｇ／ｌのグルコースを含むダルベッコ
の修正したイーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ社製、米
国ニューヨーク州）と下記の成分を補足したＨａｍのＦ
１２（ギブコ社製）（ｐＨ７．４）との１：１の混合物
であった。すなわち、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、３
０ｎＭのセレン酸ナトリウム、１％のペニシリン−スト
レプトマイシン溶液（ギブコ社製）、１００μｇ／ｍｌ
のヒトトランスフェリン、２５μ／ｍｌのウシ結晶化イ
ンシュリン、２０ｎＭのプロゲステロン、２０ｎＭのヒ
ドロコルチゾン−２１−燐酸塩、１０ｍＭのＬ−カルニ
チン、３０ｎＭの３，３’，５−トリヨード−Ｌ−サイ
ロニン、７ｎｇ／ｍｌのトコフェロール、７ｎｇ／ｍｌ
のレチノール、１μＭのチオクト酸、及び、１μｌ／ｍ
ｌのミネラル混合物〔Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓら，Ｐ．Ｎ．
Ａ．Ｓ．，７５，９０１〜９０４（１９７８）〕であ
る。化合物は、特別に記載がない限り、シグマ社（米国
ルイジアナ州又はミズリー州）製を使用した。
の実験例を示す。 〔１〕初代培養細胞の調製 胎児期１５日のＢＡＬＢ／マウス（三共実験サービス、
東京）から前脳基底を含んだ中隔野を得た。ハンクスの
平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ溶液、ｐＨ７．４）中で組織を
摘出して細断し、これを３７℃で３分間０．０３％のト
リプシンを含んだＨＢＳＳ溶液（ｐＨ６．５）で処理し
た。６３μｍのナイロンメッシュで濾過した後、無血清
培地に再度懸濁した。培養は、細胞６×１０5 個／ｍｌ
で開始した。細胞の培養開始時にマウスβＮＧＦ（ｍβ
ＮＧＦ、シグマ社、ミズリー州）１００ｎｇ／ｍｌ、リ
コンビナントヒトマクロファージコロニー刺激因子（ｒ
ｈＭ−ＣＳＦ）（ゲンザイム社製、米国マサチューセッ
ツ州）１０ＣＦＵ／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ又は１００
ＣＦＵ／ｍｌ、リコンビナントヒト顆粒球コロニー刺激
因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）（中外製薬株式会社製）１０Ｃ
ＦＵ／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ又は１００ＣＦＵ／ｍ
ｌ、若しくはリコンビナントヒトエリスロポイエチン
（ｒｈＥＰＯ）（中外製薬株式会社製）１ＩＵ／ｍｌ、
５ＩＵ／ｍｌ又は１０ＩＵ／ｍｌをそれぞれ加え、３日
後に培養液交換を行い、５日目に細胞をラバーポリスマ
ン（ガラス管の先にゴムを嵌め込んだ器具）で回収し、
下記の方法でコリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈ
ＡＴ）活性を測定した。結果を表１に示す。なお、無血
清培地は、４．５ｇ／ｌのグルコースを含むダルベッコ
の修正したイーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ社製、米
国ニューヨーク州）と下記の成分を補足したＨａｍのＦ
１２（ギブコ社製）（ｐＨ７．４）との１：１の混合物
であった。すなわち、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、３
０ｎＭのセレン酸ナトリウム、１％のペニシリン−スト
レプトマイシン溶液（ギブコ社製）、１００μｇ／ｍｌ
のヒトトランスフェリン、２５μ／ｍｌのウシ結晶化イ
ンシュリン、２０ｎＭのプロゲステロン、２０ｎＭのヒ
ドロコルチゾン−２１−燐酸塩、１０ｍＭのＬ−カルニ
チン、３０ｎＭの３，３’，５−トリヨード−Ｌ−サイ
ロニン、７ｎｇ／ｍｌのトコフェロール、７ｎｇ／ｍｌ
のレチノール、１μＭのチオクト酸、及び、１μｌ／ｍ
ｌのミネラル混合物〔Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓら，Ｐ．Ｎ．
Ａ．Ｓ．，７５，９０１〜９０４（１９７８）〕であ
る。化合物は、特別に記載がない限り、シグマ社（米国
ルイジアナ州又はミズリー州）製を使用した。
【００１６】〔２〕ＳＮ6.10.2.2の培養細胞の調製
米国シカゴ大学に保管されており、この大学のＷａｉｎ
ｅｒ博士から提供されたＳＮ6.10.2.2細胞は、マウス中
隔野神経細胞とマウス神経芽細胞腫Ｎ１８ＴＧ２との融
合雑種細胞として樹立されたＳＮ６細胞〔Ｈａｎｍｏｎ
ｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４，１２３７〜１２４０
（１９８６）〕のサブクローンである。細胞は、１０％
ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。使用の前
に、細胞２×１０5 個／ｍｌをＨＢＳＳ溶液（ｐＨ７．
４）で２回、無血清培地で１回洗浄した。ｒｈＭ−ＣＳ
Ｆ、ｒｈＧ−ＣＳＦ又はｒｈＥＰＯを含んだ試験培地で
３５ｍｍ皿（ベクトン ディッキンソン社製、米国ニュ
ージャージー州）中で２日間培養した後、３日目に細胞
をラバーポリスマンで回収し、下記の方法でＣｈＡＴ活
性を測定した。結果を表２に示す。
ｅｒ博士から提供されたＳＮ6.10.2.2細胞は、マウス中
隔野神経細胞とマウス神経芽細胞腫Ｎ１８ＴＧ２との融
合雑種細胞として樹立されたＳＮ６細胞〔Ｈａｎｍｏｎ
ｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４，１２３７〜１２４０
（１９８６）〕のサブクローンである。細胞は、１０％
ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。使用の前
に、細胞２×１０5 個／ｍｌをＨＢＳＳ溶液（ｐＨ７．
４）で２回、無血清培地で１回洗浄した。ｒｈＭ−ＣＳ
Ｆ、ｒｈＧ−ＣＳＦ又はｒｈＥＰＯを含んだ試験培地で
３５ｍｍ皿（ベクトン ディッキンソン社製、米国ニュ
ージャージー州）中で２日間培養した後、３日目に細胞
をラバーポリスマンで回収し、下記の方法でＣｈＡＴ活
性を測定した。結果を表２に示す。
【００１７】〔３〕Ｆｉｍｂｒｉａ（海馬采）−Ｆｏｒ
ｎｉｘ（脳弓）切断による脳内ｉｎｖｉｖｏモデルの作
製 体重３００〜３５０ｇのＷｉｓｔｅｒ系アルビノ雄ラッ
ト（日本クレア、東京）を３０〜５０ｍｇ／ｋｇのペン
トバルビタールナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｎｔｏ
ｂａｒｂｉｔａｌ）で麻酔し、頭部を脳定位装置（ナリ
シゲ器械社、東京）に固定した。次いで、以下に示す手
順でＦｉｍｂｒｉａ−Ｆｏｒｎｉｘ切断を行った。すな
わち、左側頭蓋骨のＢｒｅｇｍａより０．５ｍｍ後方の
線及び正中線を直交二辺とする３ｍｍ角の部分を切除
し、左背側のＦｉｍｂｒｉａとＦｏｒｎｉｘを皮質と共
に吸引除去した。右側頭蓋骨のＢｒｅｇｍａから０．２
ｍｍ前方及び正中線より１ｍｍ右側の位置に穿孔し、こ
の孔に直径１ｍｍのカニューレ（クニイ社、東京）を挿
入した。このカニューレを通じて、１２５Ｉ．Ｕ．／１
５μｌ／ｄａｙあるいは１２．５Ｉ．Ｕ．／１５μｌ／
ｄａｙの２ｄｏｓｅのｒｈＥＰＯを各々ラット３匹から
なる実験群に４日間連続投与した。対照群として、５μ
ｇ／１５μｌ／ｄａｙのβ−ＮＧＦあるいは１５μｌ／
ｄａｙの生理食塩水を上記と同じ条件下で投与した。
ｎｉｘ（脳弓）切断による脳内ｉｎｖｉｖｏモデルの作
製 体重３００〜３５０ｇのＷｉｓｔｅｒ系アルビノ雄ラッ
ト（日本クレア、東京）を３０〜５０ｍｇ／ｋｇのペン
トバルビタールナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｎｔｏ
ｂａｒｂｉｔａｌ）で麻酔し、頭部を脳定位装置（ナリ
シゲ器械社、東京）に固定した。次いで、以下に示す手
順でＦｉｍｂｒｉａ−Ｆｏｒｎｉｘ切断を行った。すな
わち、左側頭蓋骨のＢｒｅｇｍａより０．５ｍｍ後方の
線及び正中線を直交二辺とする３ｍｍ角の部分を切除
し、左背側のＦｉｍｂｒｉａとＦｏｒｎｉｘを皮質と共
に吸引除去した。右側頭蓋骨のＢｒｅｇｍａから０．２
ｍｍ前方及び正中線より１ｍｍ右側の位置に穿孔し、こ
の孔に直径１ｍｍのカニューレ（クニイ社、東京）を挿
入した。このカニューレを通じて、１２５Ｉ．Ｕ．／１
５μｌ／ｄａｙあるいは１２．５Ｉ．Ｕ．／１５μｌ／
ｄａｙの２ｄｏｓｅのｒｈＥＰＯを各々ラット３匹から
なる実験群に４日間連続投与した。対照群として、５μ
ｇ／１５μｌ／ｄａｙのβ−ＮＧＦあるいは１５μｌ／
ｄａｙの生理食塩水を上記と同じ条件下で投与した。
【００１８】術後１４日目のラットに２ｍｇ／ｋｇのジ
イソプロピルフルオロフォスフェート（ｄｉｉｓｏｐｒ
ｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を筋肉内
投与し、４時間後に１００ｍｌの生理食塩水並びに３０
０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍ
ａｌｄｅｈｙｄｅ）及び０．１％のグルタールアルデヒ
ド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を含む冷却した
０．１Ｍリン酸緩衝液で灌流した。脳を摘出して、２％
ザンボーニ（Ｚａｍｂｏｎｉ）液で４日間固定した後、
４℃の１０％蔗糖溶液中に一晩静置した。厚さ２０μｍ
の脳冠状切片を作成し、ブッチャーらの方法〔Ｂｕｔｃ
ｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｎ，７，１９７〜２
０８（１９９１）〕の改法で染色した。ゲイジらの方法
〔Ｇａｇｅ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１９，２４１〜２５５（１９８６）〕に従い、アセ
チルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）陽性細胞、すなわ
ち内側中隔野の主軸沿いに存在する最小直径１２μｍの
神経細胞を画像解析ソフトウエア（オリンパス光学社、
東京）を用いて調べた。個々の動物のＦｉｍｂｒｉａ−
Ｆｏｒｎｉｘ切断側及び反対側の両方の中隔野領域につ
いて、ＡｃｈＥ陽性細胞の数を計測し、切断側に存在す
るＡｃｈＥ陽性細胞数を反対側に存在する細胞数で割っ
たパーセンテージをアセチルコリン作動性神経細胞の生
存率とした。結果を図１に示す。なお、図中のカラムは
Ｍｅａｎ±１Ｓ．Ｄ．であり、＊＊はｐ＜０．０１を示
し、また、ＥＰＯ−Ｈは１２５Ｉ．Ｕ．／１５μｌ／ｄ
ａｙ投与群を、ＥＰＯ−Ｌは１２．５Ｉ．Ｕ．／１５μ
ｌ／ｄａｙ投与群をそれぞれ示す。
イソプロピルフルオロフォスフェート（ｄｉｉｓｏｐｒ
ｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を筋肉内
投与し、４時間後に１００ｍｌの生理食塩水並びに３０
０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍ
ａｌｄｅｈｙｄｅ）及び０．１％のグルタールアルデヒ
ド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を含む冷却した
０．１Ｍリン酸緩衝液で灌流した。脳を摘出して、２％
ザンボーニ（Ｚａｍｂｏｎｉ）液で４日間固定した後、
４℃の１０％蔗糖溶液中に一晩静置した。厚さ２０μｍ
の脳冠状切片を作成し、ブッチャーらの方法〔Ｂｕｔｃ
ｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｎ，７，１９７〜２
０８（１９９１）〕の改法で染色した。ゲイジらの方法
〔Ｇａｇｅ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１９，２４１〜２５５（１９８６）〕に従い、アセ
チルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）陽性細胞、すなわ
ち内側中隔野の主軸沿いに存在する最小直径１２μｍの
神経細胞を画像解析ソフトウエア（オリンパス光学社、
東京）を用いて調べた。個々の動物のＦｉｍｂｒｉａ−
Ｆｏｒｎｉｘ切断側及び反対側の両方の中隔野領域につ
いて、ＡｃｈＥ陽性細胞の数を計測し、切断側に存在す
るＡｃｈＥ陽性細胞数を反対側に存在する細胞数で割っ
たパーセンテージをアセチルコリン作動性神経細胞の生
存率とした。結果を図１に示す。なお、図中のカラムは
Ｍｅａｎ±１Ｓ．Ｄ．であり、＊＊はｐ＜０．０１を示
し、また、ＥＰＯ−Ｈは１２５Ｉ．Ｕ．／１５μｌ／ｄ
ａｙ投与群を、ＥＰＯ−Ｌは１２．５Ｉ．Ｕ．／１５μ
ｌ／ｄａｙ投与群をそれぞれ示す。
【００１９】〔４〕コリンアセチルトランスフェラーゼ
（ＣｈＡＴ）活性の測定及び蛋白質の定量 ＣｈＡＴ活性は、Ｆｏｎｎｕｍの方法〔Ｆ．Ｆｏｎｎｕ
ｍ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２４，４０７〜４０９
（１９７５）〕に基づいて求めた。すなわち、上記の初
代培養細胞あるいはＳＮ6.10.2.2培養細胞をラバーポリ
スマンで回収した後、３０μｌの１０ｍＭ−ＥＤＴＡ液
中でホモジナイズし、更に最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えたものを酵素源とした。
酵素反応溶液は３００ｍＭ−ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ−ＥＤＴＡ
に基質として０．２ｍＭ〔１−14Ｃ〕ａｃｅｔｙｌ−Ｃ
ｏＡ（アマシャム ジャパン社より購入）及び８ｍＭ−
Ｃｈｏｌｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ及びアセチルコリンエ
ステラーゼ阻害剤として０．１ｍＭ−Ｐｈｙｓｏｓｔｉ
ｇｍｉｎｅを加えたものである。この反応溶液５μｌを
１．５ｍｌのマイクロチューブ（エッペンドルフ社製、
ドイツ）に入れ、酵素液サンプル２μｌを加えて軽く振
とう攪拌し、３７℃で１５分間反応させた。氷冷するこ
とによって反応を停止させ、マイクロチューブを液体シ
ンチレーション用バイアルの中に入れて中身の反応混液
を５ｍｌの１０ｍＭ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅ
ｒで洗いだした。このバイアルに１０ｍｇ／ｍｌのカリ
グノスト（Ｓｏｄｉｕｍ Ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｂｏ
ｒａｔｅ）を含む２ｍｌのアセトニトリルと１０ｍｌの
トルエン系シンチレーターを加え、１分間軽く振とうし
た。バイアルを１０分間静置した後、液体シンチレーシ
ョンカウンターによって14Ｃで標識されたアセチルコリ
ンの量を決定し、ＣｈＡＴ活性を求めた。
（ＣｈＡＴ）活性の測定及び蛋白質の定量 ＣｈＡＴ活性は、Ｆｏｎｎｕｍの方法〔Ｆ．Ｆｏｎｎｕ
ｍ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２４，４０７〜４０９
（１９７５）〕に基づいて求めた。すなわち、上記の初
代培養細胞あるいはＳＮ6.10.2.2培養細胞をラバーポリ
スマンで回収した後、３０μｌの１０ｍＭ−ＥＤＴＡ液
中でホモジナイズし、更に最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えたものを酵素源とした。
酵素反応溶液は３００ｍＭ−ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ−ＥＤＴＡ
に基質として０．２ｍＭ〔１−14Ｃ〕ａｃｅｔｙｌ−Ｃ
ｏＡ（アマシャム ジャパン社より購入）及び８ｍＭ−
Ｃｈｏｌｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ及びアセチルコリンエ
ステラーゼ阻害剤として０．１ｍＭ−Ｐｈｙｓｏｓｔｉ
ｇｍｉｎｅを加えたものである。この反応溶液５μｌを
１．５ｍｌのマイクロチューブ（エッペンドルフ社製、
ドイツ）に入れ、酵素液サンプル２μｌを加えて軽く振
とう攪拌し、３７℃で１５分間反応させた。氷冷するこ
とによって反応を停止させ、マイクロチューブを液体シ
ンチレーション用バイアルの中に入れて中身の反応混液
を５ｍｌの１０ｍＭ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅ
ｒで洗いだした。このバイアルに１０ｍｇ／ｍｌのカリ
グノスト（Ｓｏｄｉｕｍ Ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌｂｏ
ｒａｔｅ）を含む２ｍｌのアセトニトリルと１０ｍｌの
トルエン系シンチレーターを加え、１分間軽く振とうし
た。バイアルを１０分間静置した後、液体シンチレーシ
ョンカウンターによって14Ｃで標識されたアセチルコリ
ンの量を決定し、ＣｈＡＴ活性を求めた。
【００２０】また、蛋白質の定量は、ローリー法〔Ｌｏ
ｗｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５
〜２７５（１９５１）〕に従って行った。この目的で上
述の酵素液サンプルの１０μｌを使用した。そして、こ
れらの値を基に比活性、総蛋白量及び総ＣｈＡＴ活性を
それぞれ算出した。ＣｈＡＴ活性、タンパク質濃度及び
生存率についてはｔ−ｔｅｓｔを行った。
ｗｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５
〜２７５（１９５１）〕に従って行った。この目的で上
述の酵素液サンプルの１０μｌを使用した。そして、こ
れらの値を基に比活性、総蛋白量及び総ＣｈＡＴ活性を
それぞれ算出した。ＣｈＡＴ活性、タンパク質濃度及び
生存率についてはｔ−ｔｅｓｔを行った。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】上記表１に示す結果から明らかなように、
中隔野神経細胞の初代培養系に本発明のｒｈＭ−ＣＳ
Ｆ、ｒｈＧ−ＣＳＦ又はｒｈＥＰＯを表中に示すＤｏｓ
ｅで添加したときの５日後のＣｈＡＴ比活性、総蛋白量
及び総ＣｈＡＴ活性を調べた結果は、ｒｈＭ−ＣＳＦの
場合にはＣｏｎｔｒｏｌに対してＤｏｓｅ：１０ＣＦＵ
／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び１００ＣＦＵ／ｍｌで総
蛋白量をそれぞれ２５％、４４％及び１５％増加させ、
ｒｈＧ−ＣＳＦの場合にはＣｏｎｔｒｏｌに対してＤｏ
ｓｅ：１０ＣＦＵ／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び１００
ＣＦＵ／ｍｌで総蛋白量をそれぞれ１２％、２４％及び
１８％増加させ、また、ｒｈＥＰＯの場合にはＣｏｎｔ
ｒｏｌに対してＤｏｓｅ：１ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ
及び１０ＩＵ／ｍｌで総蛋白量をそれぞれ３１％、２５
％及び３８％増加させた。これらの値は、対照として実
験したｍβＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の場合の効果２
３％と同等あるいはそれ以上の結果を示すものであり、
本発明で使用する造血因子類が神経栄養因子のｍβＮＧ
Ｆと類似の作用を発揮し、初代培養神経細胞の生存を促
進することが判明した。
中隔野神経細胞の初代培養系に本発明のｒｈＭ−ＣＳ
Ｆ、ｒｈＧ−ＣＳＦ又はｒｈＥＰＯを表中に示すＤｏｓ
ｅで添加したときの５日後のＣｈＡＴ比活性、総蛋白量
及び総ＣｈＡＴ活性を調べた結果は、ｒｈＭ−ＣＳＦの
場合にはＣｏｎｔｒｏｌに対してＤｏｓｅ：１０ＣＦＵ
／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び１００ＣＦＵ／ｍｌで総
蛋白量をそれぞれ２５％、４４％及び１５％増加させ、
ｒｈＧ−ＣＳＦの場合にはＣｏｎｔｒｏｌに対してＤｏ
ｓｅ：１０ＣＦＵ／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び１００
ＣＦＵ／ｍｌで総蛋白量をそれぞれ１２％、２４％及び
１８％増加させ、また、ｒｈＥＰＯの場合にはＣｏｎｔ
ｒｏｌに対してＤｏｓｅ：１ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ
及び１０ＩＵ／ｍｌで総蛋白量をそれぞれ３１％、２５
％及び３８％増加させた。これらの値は、対照として実
験したｍβＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の場合の効果２
３％と同等あるいはそれ以上の結果を示すものであり、
本発明で使用する造血因子類が神経栄養因子のｍβＮＧ
Ｆと類似の作用を発揮し、初代培養神経細胞の生存を促
進することが判明した。
【００２４】また、ＣｈＡＴ比活性に関しては、Ｃｏｎ
ｔｒｏｌに対して、ｒｈＭ−ＣＳＦがＤｏｓｅ：５０Ｃ
ＦＵ／ｍｌ及び１００ＣＦＵ／ｍｌでそれぞれ１７％増
加させ、ｒｈＧ−ＣＳＦがＤｏｓｅ：１０ＣＦＵ／ｍ
ｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び１００ＣＦＵ／ｍｌでそれぞ
れ１％、２５％及び１４％増加させ、また、ｒｈＥＰＯ
がＤｏｓｅ：５ＩＵ／ｍｌ及び１０ＩＵ／ｍｌでそれぞ
れ２０％及び１８％増加させた。更に、総ＣｈＡＴ活性
については、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して、ｒｈＭ−ＣＳＦ
がＤｏｓｅ：１０ＣＦＵ／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び
１００ＣＦＵ／ｍｌでそれぞれ２０％、７０％及び３７
％増加させ、ｒｈＧ−ＣＳＦがＤｏｓｅ：１０ＣＦＵ／
ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び１００ＣＦＵ／ｍｌでそれ
ぞれ１４％、５５％及び３３％増加させ、また、ｒｈＥ
ＰＯがＤｏｓｅ：１ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ及び１０
ＩＵ／ｍｌでそれぞれ１９％、４９％及び６２％増加さ
せた。これらの結果から、本発明で使用する造血因子、
ｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ又はｒｈＥＰＯは、Ｃ
ｈＡＴ賦活作用においても優れた効果を発揮することが
判明した。
ｔｒｏｌに対して、ｒｈＭ−ＣＳＦがＤｏｓｅ：５０Ｃ
ＦＵ／ｍｌ及び１００ＣＦＵ／ｍｌでそれぞれ１７％増
加させ、ｒｈＧ−ＣＳＦがＤｏｓｅ：１０ＣＦＵ／ｍ
ｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び１００ＣＦＵ／ｍｌでそれぞ
れ１％、２５％及び１４％増加させ、また、ｒｈＥＰＯ
がＤｏｓｅ：５ＩＵ／ｍｌ及び１０ＩＵ／ｍｌでそれぞ
れ２０％及び１８％増加させた。更に、総ＣｈＡＴ活性
については、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して、ｒｈＭ−ＣＳＦ
がＤｏｓｅ：１０ＣＦＵ／ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び
１００ＣＦＵ／ｍｌでそれぞれ２０％、７０％及び３７
％増加させ、ｒｈＧ−ＣＳＦがＤｏｓｅ：１０ＣＦＵ／
ｍｌ、５０ＣＦＵ／ｍｌ及び１００ＣＦＵ／ｍｌでそれ
ぞれ１４％、５５％及び３３％増加させ、また、ｒｈＥ
ＰＯがＤｏｓｅ：１ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ及び１０
ＩＵ／ｍｌでそれぞれ１９％、４９％及び６２％増加さ
せた。これらの結果から、本発明で使用する造血因子、
ｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ又はｒｈＥＰＯは、Ｃ
ｈＡＴ賦活作用においても優れた効果を発揮することが
判明した。
【００２５】更に、表２は、ＳＮ6.10.2.2細胞のＣｈＡ
Ｔ比活性、総蛋白量及び総ＣｈＡＴ活性に対する本発明
のｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯの影
響を示すもので、この系では、総蛋白量がＣｏｎｔｒｏ
ｌの場合と造血因子を添加した場合とでほとんど変化し
ていないことからも分かるように、造血因子類の分化形
質に対してのみの影響を単独で観察することができる。
この実験の結果から明らかなように、ｒｈＭ−ＣＳＦ
（５０ＣＦＵ／ｍｌ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ（５０ＣＦＵ／
ｍｌ）及びｒｈＥＰＯ（１０ＩＵ／ｍｌ）は、ＣｈＡＴ
比活性をそれぞれ６１％、６８％及び８０％上昇させ、
また、総ＣｈＡＴ活性をそれぞれ８０％、５８％及び７
４％上昇させた。
Ｔ比活性、総蛋白量及び総ＣｈＡＴ活性に対する本発明
のｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯの影
響を示すもので、この系では、総蛋白量がＣｏｎｔｒｏ
ｌの場合と造血因子を添加した場合とでほとんど変化し
ていないことからも分かるように、造血因子類の分化形
質に対してのみの影響を単独で観察することができる。
この実験の結果から明らかなように、ｒｈＭ−ＣＳＦ
（５０ＣＦＵ／ｍｌ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ（５０ＣＦＵ／
ｍｌ）及びｒｈＥＰＯ（１０ＩＵ／ｍｌ）は、ＣｈＡＴ
比活性をそれぞれ６１％、６８％及び８０％上昇させ、
また、総ＣｈＡＴ活性をそれぞれ８０％、５８％及び７
４％上昇させた。
【００２６】また、図１に示したように、ｒｈＥＰＯ投
与群では、対照群（生理食塩水、０．１％ＢＳＡ）に比
べて片側性にＦｉｍｂｒｉａ−Ｆｏｒｎｉｘ切断したラ
ットの中隔野におけるＡｃｈＥ陽性細胞の生存率が有意
に改善された。片側性にＦｉｍｂｒｉａ−Ｆｏｒｎｉｘ
切断したラットの中隔野で、ｒｈＥＰＯのアセチルコリ
ン作動性神経細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏの効果が確認
されたことは、実際の臨床的展開を考える上で意義深
い。
与群では、対照群（生理食塩水、０．１％ＢＳＡ）に比
べて片側性にＦｉｍｂｒｉａ−Ｆｏｒｎｉｘ切断したラ
ットの中隔野におけるＡｃｈＥ陽性細胞の生存率が有意
に改善された。片側性にＦｉｍｂｒｉａ−Ｆｏｒｎｉｘ
切断したラットの中隔野で、ｒｈＥＰＯのアセチルコリ
ン作動性神経細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏの効果が確認
されたことは、実際の臨床的展開を考える上で意義深
い。
【００２７】
【作用】以上の実験から明らかなように、本発明のｒｈ
Ｍ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯは、元々血
液細胞系に対して作用を有するものとして発見された造
血因子であるが、中枢神経細胞系に対してもｍβＮＧＦ
と同様の活性を有することが判明した。すなわち、マウ
ス中隔野神経細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ初代培養において
総蛋白量を顕著に増加させると共にＣｈＡＴ比活性や総
ＣｈＡＴ活性を増加させ、また、マウス中隔野由来コリ
ン作動性神経細胞株ＳＮ6.10.2.2細胞においてもＣｈＡ
Ｔ比活性や総ＣｈＡＴ活性を増加させ、従って、これら
の造血因子、ｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈ
ＥＰＯは、優れた細胞生存延長作用を発揮すると共にＣ
ｈＡＴ賦活作用を発揮するという二通りの作用を発揮す
る。更に、ｉｎ ｖｉｖｏの実験、すなわちＦｉｍｂｒ
ｉａ−Ｆｏｒｎｉｘの神経経路切断系においてもアセチ
ルコリン作動性神経細胞の生存を支持する効果が認めら
れた。この系では、海馬で産生され軸索を逆行性に運ば
れてくるＮＧＦの供給が切断によって途絶えるために、
中隔野のアセチルコリン作動性神経細胞はその供給を受
けることができなくなり死滅する。従って、ｉｎ ｖｉ
ｖｏにおいてｒｈＥＰＯがＮＧＦ様のＮｅｕｒｏｔｒｏ
ｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ活性を持つことが明らかとなっ
た。
Ｍ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯは、元々血
液細胞系に対して作用を有するものとして発見された造
血因子であるが、中枢神経細胞系に対してもｍβＮＧＦ
と同様の活性を有することが判明した。すなわち、マウ
ス中隔野神経細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ初代培養において
総蛋白量を顕著に増加させると共にＣｈＡＴ比活性や総
ＣｈＡＴ活性を増加させ、また、マウス中隔野由来コリ
ン作動性神経細胞株ＳＮ6.10.2.2細胞においてもＣｈＡ
Ｔ比活性や総ＣｈＡＴ活性を増加させ、従って、これら
の造血因子、ｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈ
ＥＰＯは、優れた細胞生存延長作用を発揮すると共にＣ
ｈＡＴ賦活作用を発揮するという二通りの作用を発揮す
る。更に、ｉｎ ｖｉｖｏの実験、すなわちＦｉｍｂｒ
ｉａ−Ｆｏｒｎｉｘの神経経路切断系においてもアセチ
ルコリン作動性神経細胞の生存を支持する効果が認めら
れた。この系では、海馬で産生され軸索を逆行性に運ば
れてくるＮＧＦの供給が切断によって途絶えるために、
中隔野のアセチルコリン作動性神経細胞はその供給を受
けることができなくなり死滅する。従って、ｉｎ ｖｉ
ｖｏにおいてｒｈＥＰＯがＮＧＦ様のＮｅｕｒｏｔｒｏ
ｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ活性を持つことが明らかとなっ
た。
【００２８】このため、本発明のｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒｈ
Ｇ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯは、コリン作動性の神経細胞
が変性脱落して記憶障害をもたらすような疾患、例えば
アルツハイマー病やアルツハイマー型老人性痴呆症等に
対して有効であるほか、脳梗塞、脳出血等の脳虚血障
害、脳循環障害に伴うと考えられている記憶障害、知能
障害、意欲低下、注意力低下等の脳血管性痴呆症等に対
しても有効である。しかるに、本発明の造血因子、ｒｈ
Ｍ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯの適応疾患
は、上記の如きコリン作動性神経細胞が関与する疾患に
限られるものではない。すなわち、中枢神経細胞系に対
するｍβＮＧＦはその作用が末梢交感神経あるいは感覚
神経や脳のコリン作動性神経に限られて比較的狭い細胞
特異性を有するのに対し、本発明のｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒ
ｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯは元来血球系の細胞に対す
る因子であり、脳のより広範な種類の神経細胞にたいし
て生存促進因子として作用する可能性を有するものと考
えられ、これが優れた細胞生存延長作用を発揮する要因
であると考えられる。このため、本発明のｒｈＭ−ＣＳ
Ｆ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯは、単にコリン作動
性神経細胞が関与する疾患に限られるものではなく、例
えば、大脳基底核黒質のドパミン作動性神経細胞が変性
脱落して生じるパーキンソン病や、大脳基底核の線条体
（尾状核、被殻）のＧＡＢＡ作動性神経細胞が変性脱落
して生じるハンチントン舞踏病等、広く脳機能障害によ
る疾患の予防薬として、又は、治療薬として有望であ
る。
Ｇ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯは、コリン作動性の神経細胞
が変性脱落して記憶障害をもたらすような疾患、例えば
アルツハイマー病やアルツハイマー型老人性痴呆症等に
対して有効であるほか、脳梗塞、脳出血等の脳虚血障
害、脳循環障害に伴うと考えられている記憶障害、知能
障害、意欲低下、注意力低下等の脳血管性痴呆症等に対
しても有効である。しかるに、本発明の造血因子、ｒｈ
Ｍ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯの適応疾患
は、上記の如きコリン作動性神経細胞が関与する疾患に
限られるものではない。すなわち、中枢神経細胞系に対
するｍβＮＧＦはその作用が末梢交感神経あるいは感覚
神経や脳のコリン作動性神経に限られて比較的狭い細胞
特異性を有するのに対し、本発明のｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒ
ｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯは元来血球系の細胞に対す
る因子であり、脳のより広範な種類の神経細胞にたいし
て生存促進因子として作用する可能性を有するものと考
えられ、これが優れた細胞生存延長作用を発揮する要因
であると考えられる。このため、本発明のｒｈＭ−ＣＳ
Ｆ、ｒｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＥＰＯは、単にコリン作動
性神経細胞が関与する疾患に限られるものではなく、例
えば、大脳基底核黒質のドパミン作動性神経細胞が変性
脱落して生じるパーキンソン病や、大脳基底核の線条体
（尾状核、被殻）のＧＡＢＡ作動性神経細胞が変性脱落
して生じるハンチントン舞踏病等、広く脳機能障害によ
る疾患の予防薬として、又は、治療薬として有望であ
る。
【００２９】
【実施例】以下、製剤に関する実施例を示す。
実施例１
エリスロポイエチン ８μｇ
注射用蒸留水にて全量 ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注
し、密封した。
し、密封した。
【００３０】実施例２
エリスロポイエチン ８μｇ
注射用蒸留水にて全量 ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥して密封した。
し、凍結乾燥して密封した。
【００３１】実施例３
エリスロポイエチン １６μｇ
注射用蒸留水にて全量 ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注
し、密封した。
し、密封した。
【００３２】実施例４
エリスロポイエチン １６μｇ
注射用蒸留水にて全量 ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥して密封した。
し、凍結乾燥して密封した。
【００３３】実施例５
エリスロポイエチン ８μｇ
ヒト血清アルブミン ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量 ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注
し、密封した。
し、密封した。
【００３４】実施例６
エリスロポイエチン ８μｇ
ヒト血清アルブミン ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量 ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥して密封した。
し、凍結乾燥して密封した。
【００３５】実施例７
エリスロポイエチン １６μｇ
ヒト血清アルブミン ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量 ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注
し、密封した。
し、密封した。
【００３６】実施例８
エリスロポイエチン １６μｇ
ヒト血清アルブミン ５ｍｇ
注射用蒸留水にて全量 ２ｍｌ
上記組成比で無菌的に溶液を調製し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥して密封した。
し、凍結乾燥して密封した。
【００３７】実施例９〜１２
実施例５〜８におけるヒト血清アルブミンに代えて５ｍ
ｇのデキストラン４０を用い、これら実施例５〜８と同
様にして注射剤を調製した。
ｇのデキストラン４０を用い、これら実施例５〜８と同
様にして注射剤を調製した。
【００３８】実施例１３
注射用蒸留水１００ｍｌ中にＤ−マンニトール５ｇ、エ
リスロポイエチン１ｍｇ、ヒト血清アルブミン１００ｍ
ｇを無菌的に溶解して水溶液を調製し、１ｍｌずつバイ
アル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
リスロポイエチン１ｍｇ、ヒト血清アルブミン１００ｍ
ｇを無菌的に溶解して水溶液を調製し、１ｍｌずつバイ
アル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。
【００３９】実施例１４
ｐＨ７．０の０．０５Ｍ−リン酸緩衝液５０ｍｌ中にエ
リスロポイエチン０．５ｍｇとソルビトール１ｇとを無
菌的に溶解して水溶液を調製し、０．５ｍｌずつバイア
ル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。別に０．１％−
メチルセルロース水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつ
アンプルに分注し、溶解用溶液とした。
リスロポイエチン０．５ｍｇとソルビトール１ｇとを無
菌的に溶解して水溶液を調製し、０．５ｍｌずつバイア
ル瓶に分注し、凍結乾燥して密封した。別に０．１％−
メチルセルロース水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつ
アンプルに分注し、溶解用溶液とした。
【００４０】実施例１５
精製されたヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭ−リン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０）の７５μｇ／ｍｌ及びＤ−マンニトールの１
５ｍｇ／ｍｌを注射用蒸留水に溶解して０．３ｍｌとし
た後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフ
ィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理した
バイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半
打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射
用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は１０℃
以下の冷暗所で行う。
Ｈ７．０）の７５μｇ／ｍｌ及びＤ−マンニトールの１
５ｍｇ／ｍｌを注射用蒸留水に溶解して０．３ｍｌとし
た後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフ
ィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理した
バイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半
打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射
用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は１０℃
以下の冷暗所で行う。
【００４１】実施例１６
精製されたヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭ−リン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０）の５０μｇ／ｍｌをＮａＣｌで浸透圧比を１
に調整した後、０．２２μｍのポアサイズを有するメン
ブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌
処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴ
ム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締め
て注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は
１０℃以下の冷暗所で行う。
Ｈ７．０）の５０μｇ／ｍｌをＮａＣｌで浸透圧比を１
に調整した後、０．２２μｍのポアサイズを有するメン
ブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌
処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴ
ム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締め
て注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は
１０℃以下の冷暗所で行う。
【００４２】実施例１７
精製されたヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭ−リン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０）の１００μｇ／ｍｌをＮａＣｌで浸透圧比を
１に調整した後、０．２２μｍのポアサイズを有するメ
ンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅
菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理した
ゴム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締
めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存
は１０℃以下の冷暗所で行う。
Ｈ７．０）の１００μｇ／ｍｌをＮａＣｌで浸透圧比を
１に調整した後、０．２２μｍのポアサイズを有するメ
ンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅
菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理した
ゴム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締
めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存
は１０℃以下の冷暗所で行う。
【００４３】実施例１８
精製されたヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭ−リン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０）の５０μｇ／ｍｌにＨＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍ
ｌ及びＤ−マンニトール濃度５０ｍｇ／ｍｌとなるよう
に加えて溶解した後、０．２２μｍのポアサイズを有す
るメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液
を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理
したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに
巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤
は室温以下の温度条件で保存し、使用時に注射用蒸留水
で希釈して使用する。
Ｈ７．０）の５０μｇ／ｍｌにＨＳＡ濃度１０ｍｇ／ｍ
ｌ及びＤ−マンニトール濃度５０ｍｇ／ｍｌとなるよう
に加えて溶解した後、０．２２μｍのポアサイズを有す
るメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液
を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理
したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャップに
巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤
は室温以下の温度条件で保存し、使用時に注射用蒸留水
で希釈して使用する。
【００４４】実施例１９
精製されたヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭ−リン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０）の１００μｇ／ｍｌにゼラチン濃度１０ｍｇ
／ｍｌ及びＤ−マンニトール濃度５０ｍｇ／ｍｌとなる
ように加えて溶解した後、０．２２μｍのポアサイズを
有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた
溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌
処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャッ
プに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液
製剤は室温以下の温度条件で保存し、使用時に注射用蒸
留水で希釈して使用する。
Ｈ７．０）の１００μｇ／ｍｌにゼラチン濃度１０ｍｇ
／ｍｌ及びＤ−マンニトール濃度５０ｍｇ／ｍｌとなる
ように加えて溶解した後、０．２２μｍのポアサイズを
有するメンブランフィルターで濾過滅菌した。得られた
溶液を滅菌処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌
処理したゴム栓を半打栓し、続いてアルミニウムキャッ
プに巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液
製剤は室温以下の温度条件で保存し、使用時に注射用蒸
留水で希釈して使用する。
【００４５】実施例２０
精製されたヒトＭ−ＣＳＦ（１０ｍＭ−リン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０）の７５μｇ／ｍｌ及びＤ−マンニトールの１
５ｍｇ／ｍｌを注射用蒸留水に溶解して０．３ｍｌとし
た後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフ
ィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理した
バイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半
打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射
用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は１０℃
以下の冷暗所で行う。
Ｈ７．０）の７５μｇ／ｍｌ及びＤ−マンニトールの１
５ｍｇ／ｍｌを注射用蒸留水に溶解して０．３ｍｌとし
た後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフ
ィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌処理した
バイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半
打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締めて注射
用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は１０℃
以下の冷暗所で行う。
【００４６】実施例２１
精製されたヒトＭ−ＣＳＦ（１０ｍＭ−リン酸緩衝液ｐ
Ｈ７．０）の５０μｇ／ｍｌをＮａＣｌで浸透圧比を１
に調整した後、０．２２μｍのポアサイズを有するメン
ブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌
処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴ
ム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締め
て注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は
１０℃以下の冷暗所で行う。
Ｈ７．０）の５０μｇ／ｍｌをＮａＣｌで浸透圧比を１
に調整した後、０．２２μｍのポアサイズを有するメン
ブランフィルターで濾過滅菌した。得られた溶液を滅菌
処理したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴ
ム栓を打栓し、続いてアルミニウムキャップに巻き締め
て注射用溶液製剤を得た。この注射用溶液製剤の保存は
１０℃以下の冷暗所で行う。
【００４７】
【発明の効果】本発明のｒｈＭ−ＣＳＦ、ｒｈＧ−ＣＳ
Ｆ又はｒｈＥＰＯを有効成分として含有する予防・治療
薬は、優れた細胞生存延長作用及びＣｈＡＴ賦活作用を
有し、しかも、副作用が低いことから、アルツハイマー
病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症
を始とする脳機能障害による各種の疾患に適用する医薬
として有用である。
Ｆ又はｒｈＥＰＯを有効成分として含有する予防・治療
薬は、優れた細胞生存延長作用及びＣｈＡＴ賦活作用を
有し、しかも、副作用が低いことから、アルツハイマー
病、アルツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症
を始とする脳機能障害による各種の疾患に適用する医薬
として有用である。
【図１】 図１は実験例〔３〕で得られた脳内ｉｎ ｖ
ｉｖｏモデルにおけるｒｈＥＰＯの細胞生存延長効果を
示すグラフ図であり、図中、縦軸は細胞の相対的な生存
率を、また、横軸は実験群をそれぞれ示す。
ｉｖｏモデルにおけるｒｈＥＰＯの細胞生存延長効果を
示すグラフ図であり、図中、縦軸は細胞の相対的な生存
率を、また、横軸は実験群をそれぞれ示す。
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平４−198134（ＪＰ，Ａ)
特許3156236（ＪＰ，Ｂ２)
Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，1990年，509,
119−124
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，1988年,
８，4707−4717
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．,
1987年，18（１），155−171
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，1988
年，13，1082
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 38/22
A61P 25/28
ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 エリスロポイエチンを有効成分として含
有する脳機能障害の予防・治療薬。 - 【請求項２】 脳機能障害が、細胞生存延長作用及び／
又はアセチルコリントランスフェラーゼ賦活作用が有効
な痴呆症である請求項１記載の脳機能障害の予防・治療
薬。 - 【請求項３】 脳機能障害が、アルツハイマー病、アル
ツハイマー型老人性痴呆症又は脳血管性痴呆症である請
求項１記載の脳機能障害の予防・治療薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35753992A JP3537151B2 (ja) | 1991-12-26 | 1992-12-24 | 脳機能障害による疾患の予防・治療薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35666291 | 1991-12-26 | ||
| JP3-356662 | 1991-12-26 | ||
| JP35753992A JP3537151B2 (ja) | 1991-12-26 | 1992-12-24 | 脳機能障害による疾患の予防・治療薬 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003363124A Division JP3954005B2 (ja) | 1991-12-26 | 2003-10-23 | 脳機能障害による疾患の予防・治療薬 |
| JP2003363123A Division JP3954004B2 (ja) | 1991-12-26 | 2003-10-23 | 脳機能障害による疾患の予防・治療薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05246885A JPH05246885A (ja) | 1993-09-24 |
| JP3537151B2 true JP3537151B2 (ja) | 2004-06-14 |
Family
ID=32774159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35753992A Expired - Fee Related JP3537151B2 (ja) | 1991-12-26 | 1992-12-24 | 脳機能障害による疾患の予防・治療薬 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3537151B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2036571A1 (de) | 2007-09-13 | 2009-03-18 | Sygnis Bioscience GmbH & Co. KG | Verwendung von G-CSF für die Behandlung von Schlaganfall |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE19857609A1 (de) * | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Hannelore Ehrenreich | Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen |
| US7345019B1 (en) | 1999-04-13 | 2008-03-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin |
| US7309687B1 (en) | 1999-04-13 | 2007-12-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Methods for treatment and prevention of neuromuscular and muscular conditions by peripherally administered erythropoietin |
| DE60140054D1 (de) * | 2000-06-30 | 2009-11-12 | Tokyo Metropolitan Inst Of Ger | Präventiva und therapeutika für mit demyelinisierung-assozierten erkrankungen |
| DE10033219A1 (de) * | 2000-07-07 | 2002-01-24 | Univ Heidelberg | Neuroprotektive Wirkung von Granulocyten-Colony Stimmulierendem Faktor (G-CSF) |
| AU2002366023B2 (en) * | 2001-11-19 | 2007-10-25 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Drug mobilizing pluripotent stem cells from tissue into peripheral blood |
| US7785601B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-31 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| US7695723B2 (en) * | 2002-12-31 | 2010-04-13 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| CN1816345A (zh) * | 2003-05-16 | 2006-08-09 | 协和发酵工业株式会社 | 伴有组织破坏的疾病的预防剂和/或治疗剂 |
| EA010650B1 (ru) | 2003-09-29 | 2008-10-30 | Уоррен Фармасьютикалз, Инк. | Защищающие ткань цитокины для лечения и профилактики сепсиса и образования спаек |
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| JP5792240B2 (ja) * | 2012-08-27 | 2015-10-07 | 武夫 西 | 注射シミュレータ用模擬剤及びその製造方法と製造装置 |
-
1992
- 1992-12-24 JP JP35753992A patent/JP3537151B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１９９０年，５０９，１１９−１２４ |
| Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９８８年，８，４７０７−４７１７ |
| Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，１９８７年，１８（１），１５５−１７１ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2036571A1 (de) | 2007-09-13 | 2009-03-18 | Sygnis Bioscience GmbH & Co. KG | Verwendung von G-CSF für die Behandlung von Schlaganfall |
| EP2412381A1 (de) | 2007-09-13 | 2012-02-01 | SYGNIS Bioscience GmbH & Co KG | Verwendung von G-CSF für die Behandlung von Schlaganfall |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05246885A (ja) | 1993-09-24 |
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|---|---|---|
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