PT2200621E

PT2200621E - Métodos, composições farmacêuticas e artigos de fabrico para administrar células terapêuticas no sistema nervoso central do animal

Info

Publication number: PT2200621E
Application number: PT08831016T
Authority: PT
Inventors: William H Ii Frey; Lusine Danielyan; Christoph H Gleiter
Original assignee: William H Ii Frey; Lusine Danielyan; Christoph H Gleiter
Priority date: 2007-09-11
Filing date: 2008-09-04
Publication date: 2012-07-31
Also published as: HRP20120560T1; US20160206554A1; RU2468818C2; KR20150039197A; MX2010002738A; SG184724A1; JP5600294B2; DK2200621T3; EP2200621B1; US8283160B2; IL204371A; EP2200621A1; KR20100094450A; BRPI0816325A2; PL2200621T3; CN101801397A; EP2200621A4; AU2008299124B2; JP2010539084A; ES2388403T3

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ARTIGOS DE FABRICO PARA ADMINISTRAR CÉLULAS TERAPÊUTICAS NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL DO ANIMAL"

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção A presente invenção é dirigida a células terapêuticas e composições farmacêuticas para administração no terço superior da cavidade nasal de um mamífero, permitindo desse modo que as células terapêuticas contornem a barreira hematoencefálica, para prevenir e/ou tratar o sistema nervoso central lesionado e/ou degenerescente e/ou ferido do mamífero.

Descrição da Técnica Relacionada

Muitos estados neurológicos resultam da lesão ou perda, i. e., morte, de determinadas populações celulares do sistema nervoso central através do envelhecimento, doença ou ferimento. As células lesionadas ou destruídas nestas condições não são intrinsecamente substituídas, assim, o sistema nervoso central está lesionado e/ou degenerescente, com perda de função resultante. Provas recentes demonstram que a substituição neuronal e reconstrução parcial dos circuitos neuronais são possíveis por meio de terapias de transplantação celular. Muito do trabalho inicial na área utilizou terapias de célula fetal. 1

Mais recentemente, contudo, tornou-se evidente que o sistema nervoso do mamífero em desenvolvimento e mesmo o adulto, contém uma população de células estaminais neurais não diferenciadas, multipotentes que apresentam propriedades plásticas que são vantajosas para a concepção de estratégias regenerativas neurais mais eficazes para muitos destes estados neurológicos.

Os estados, doenças e/ou ferimentos neurológicos resultando em SNC lesionado e/ou degenerescente, i. e., morte celular, compreendem doença de Alzheimer, insuficiência cognitiva moderada, disfunção da memória associada à idade, doença de Parkinson, doença vascular cerebral, incluindo AVC, doença de Creutzfeldt-Jakob, esclerose lateral amiotrófica familiar, demência de corpo de Lewy, aterosclerose, esquizofrenia, autismo, disquinesia tardia, esclerose múltipla, distúrbios compulsivos, doença de Wilson, paralisia supranuclear progressiva, síndrome de Hallervorden-Spatz, atrofia multissistémica, doença de Huntington, degeneração dos gânglios basais familiar, síndrome de Down, cataratas, hemocromatose, talassemia, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnóica, ferimento da cabeça e ferimento da medula espinal. Além disso, determinados processos médicos, por exemplo, cirurgia de enxerto de bypass da artéria coronária (CABG), estão associados a complicações neurológicas que resultam em lesão e/ou degeneração do sistema nervoso central e concomitante morte celular. No caso de CABG, a cirurgia é realizada em mais de 800000 doentes em todo o mundo, todos os anos. Muitos dos processos de CABG realizados estão associados a complicações neurológicas. Estas complicações variam desde o AVC, em até 16% dos doentes, até ao declínio cognitivo geral, com 50% dos doentes apresentam deteriorização pós-cirúrgica e com declínio progressivo ocorrendo em alguns doentes ao longo dos cinco anos seguintes. 2

Além disso, a insuficiência física e comportamental manifesta-se em alguns doentes de CABG. Newman M F et al. , N. Eng. J. Med. 344:395-402 (2001); Brillman J., Neurol. Clin. 11:475-495 (1993); e Seines, 0. A, Ann. Thorac. Surg. 67:1669-1676 (1999) são instrutivos.

Demonstrou-se que as células estaminais neurais substituem células perdidas e moribundas e circuitos neurais perdidos no SNC lesionado e/ou degenerescente em terapias de substituição celular. Por exemplo, o tratamento de murganhos com MPTP, um fármaco que destrói selectivamente células dopaminérgicas no tronco cerebral, seguido de enxerto com uma população celular estaminal neural, resultou numa população celular dopaminérgica reconstituída, composta por células de dador e hospedeiras. Estudos semelhantes em murganhos utilizando um modelo de ferimento cerebral de hipoxia-isquemia mostraram que a transplantação de células estaminais neurais melhorou a recuperação do sistema lesionado (Park et al. (1999) J. Neurotrauma 16:675-687 e Park et al. (1997) Soc. Neurosci. Abst. 23:346) . Em doentes com AVC, a transplantação de células de uma linha celular neuronal humana mostrou melhoramento da função neurológica. (Kondziolka D., et al., (2000) "Transplantação de células neuronais humanas cultivadas em doentes com AVC". Neurology. 55:565-9). Num modelo de murganho da doença de Alzheimer, a transplantação de células estaminais neurais nos córtices pré-frontal e parietal aliviou dramaticamente os défices colinérgicos e perturbação da memória recente associada a AD. (Wang, Q., et al., (2006) "Transplantação de células estaminais neurais no córtex num modelo de murganho da doença de Alzheimer". J Med Invest., 53:61-9). 3

Além disso, na doença de Parkinson, os neurónios que degeneram no sistema nervoso central de mamífero compreendem os neurónios dopaminérgicos da substância negra. As estratégias correntes de substituição celular, para doentes com doença de Parkinson avançada, compreendem enxertos intra-estriários de neurónios dopaminérgicos da substância negra de embriões humanos de 6 a 9 semanas de idade. As melhoras clínicas desenvolvem-se gradualmente ao longo dos primeiros 6-24 meses após transplantação (Olanow et al. (1996) Trends Neurosci. 19:102-109 e Lindvall et al. (1999) Mov. Disord. 14:201-205). Mostrou-se que os transplantes de células estaminais de origem diferente, e. g., hematopoiética, embrionária, resultam em vários benefícios clínicos em doentes com doença de Parkinson grave. (Freed, CR, et al. (Transplantação de neurónios de dopamina embrionários para doença de Parkinson grave. N Engl J Med 2001; 344:710-719).

Benefícios semelhantes foram realizados com doentes de esclerose múltipla progressiva. (Ni XS, et al., (2006) "Transplantação de células estaminais hematopoiéticas autólogas para esclerose múltipla progressiva: relato de eficácia e segurança em três anos de seguimento em 21 doentes" Clin Transplant. 20:485-9) (sugerindo ainda que o tratamento da MS deve combinar imunomodulação com modulações neuroprotectoras, tal como terapia de base celular, para alcançar o máximo benefício clínico).

Além disso, o primeiro estudo de transplantação estriária de feto em adulto humano foi realizado em três doentes não dementes, com doença de Huntington moderadamente avançada. A avaliação de imagiologia de ressonância magnética a 1 ano documentou sobrevivência de enxerto e crescimento sem 4 deslocamento de tecido circundante. Todos os doentes melhoraram de alguma forma da função cognitiva. (Kopyov et al. (1998) J. Exp. Neurol. 149 : 97-108). Ver também Date et al. (1997) J. Exp. Neurol. 147:10-17.

Cada dos modelos e métodos conhecidos para terapias baseadas em células terapêuticas requer intervenção cirúrgica, i. e., transplantação de células estaminais neurais, utilizando técnicas de enxerto invasivas e/ou métodos de distribuição sistémica que não visam as áreas lesionadas do sistema nervoso central. Seria altamente vantajoso proporcionar células ou uma composição farmacêutica que proporcionasse células terapêuticas, incluindo, mas não limitadas a, células estaminais neurais, num modo não invasivo e altamente direccionado.

Por exemplo, seria vantajoso distribuir essas células terapêuticas no sistema nervoso central degenerescente de tal modo que evitasse a exposição sistémica. Nenhuma composição farmacêutica conhecida proporciona actualmente essas vantagens. A presente invenção proporciona células terapêuticas para aplicar no terço superior da cavidade nasal contornando, desse modo, a barreira hematoencefálica e administrar as células terapêuticas e outros compostos directamente no sistema nervoso central.

Determinadas formas de realização da presente invenção compreendem antibióticos nasais e/ou mucósicos para auxiliar na protecção do indivíduo doente das bactérias nasais que migram ao longo da via neural, seguido das células terapêuticas aplicadas e/ou o composto farmacêutico. Esses antibióticos são bem conhecidos enquanto aplicados topicamente, mas nenhum é administrado como um pré-tratamento, co-tratamento e/ou 5 pós-tratamento, sistemicamente e/ou intranasalmente, em conjunto com aplicação intranasal de células terapêuticas e/ou o composto farmacêutico.

Por exemplo, num estudo, um esfregaço de mupirocina dentro do nariz baixou as taxas de infecção de para metade ou mais de Staphylococcus aureus é um germe largamente distribuído que reside, normalmente, nas narinas de uns estimados 25 a 30 por cento de todos os doentes hospitalizados, sem causar dano. Mas estas bactérias podem contaminar locais cirúrgicos, causando infecções graves e, frequentemente, mortais, especialmente em pessoas com sistemas imunitários enfraquecidos.

Outro estudo verificou que o xilitol nasal, um medicamento de venda livre, comercializado em lojas de alimentos saudáveis, pode reduzir as bactérias nasais e sua capacidade para se fixarem e infectarem células na mucosa nasal. Ainda outros estudos verificaram que as defensinas, um antibiótico natural identificado na mucosa de humano, pode proteger contra a infecção bacteriana e melhorar a função protectora imunitária. As defensinas de mamífero são pequenos péptidos, catiónicos, antimicrobianos, codificados pelo hospedeiro que são considerados importantes efectores, semelhantes aos antibióticos de imunidade inata. Através da utilização de receptores de quimiocina em células dendríticas e células T, as defensinas também poderão contribuir para a regulação da imunidade adaptativa do hospedeiro contra a invasão microbiana. As defensinas têm considerável actividade adjuvante imunológica e a ligação de defensinas beta ou quimiocinas seleccionadas a um antigénio de linfoma idiotípico produziu potentes vacinas antitumorais. A sobreposição funcional entre defensinas e quimiocinas é reforçada por relatos de que algumas quimiocinas 6 têm actividades antimicrobianas. Embora mostrando semelhança em actividade e estrutura terciária global, a relação evolutiva entre defensinas e quimiocinas permanece por determinar. (De Yang, et al. , Defensinas mamíferas na imunidade: mais do que apenas microbicidas. Trends Immunol. Junho de 2002; 23 (6):291-6 12072367).

Além disso, é bem conhecido que os agentes reguladores compreendendo factores tróficos e de crescimento, tais como eritropoeitina (EPO), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), factor de crescimento nervoso (NGF), factor de crescimento de fibroblastos (FGF) e factor de crescimento epidérmico (EGF) , desempenham um papel crucial na sobrevivência e diferenciação in vitro e in vivo de células estaminais (Erickson et al., Funções da insulina e transferência na sobrevivência e proliferação progenitora neural. J Neurosci Res. 21 de Fevereiro de 2008; Bossolasco et al., Diferenciação neuroglial de células estaminais de medula óssea humana in vitro. Exp Neurol. Junho de 2005; 193(2):312-25). A melhor sobrevivência de células cirurgicamente transplantadas foi mostrada no caso de aplicação simultânea de EPO (Kanaan et al., A eritropoietina exógena proporciona neuroprotecção de neurónios de dopamina enxertados num modelo de roedor da doença de Parkinson. Brain Res. 12 de Janeiro de 2006; 1068(1):221-9). Contudo, não se conhece a introdução desses factores ou agentes reguladores em conjunto com a aplicação intranasal de células terapêuticas e/ou as suas composições farmacêuticas no terço superior da cavidade nasal contornando, deste modo, a barreira hematoencefálica.

Além disso, é bem conhecido que agentes reguladores compreendendo diversos factores de crescimento, incluindo 7 factor I de crescimento semelhante à insulina (IGF-I), factor de crescimento nervoso (NGF) e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), regulam a sobrevivência e diferenciação de células nervosas durante o desenvolvimento dos sistemas nervoso central e periférico. Agentes reguladores, tal como neurotrofinas, também são requeridos para o crescimento nervoso durante o desenvolvimento (Tucker et al. (2001) Nature Neurosci. 4:29-37). No sistema nervoso maduro, estes factores tróficos mantêm as características morfológicas e neuroquímicas das células nervosas e fortalecem as ligações sinápticas funcionalmente activas. Esses factores reguladores encontram utilização no melhoramento dos métodos de terapias de substituição celular de acordo com a presente invenção.

Por exemplo, o bFGF melhora a sobrevivência e crescimento de neurónios in vitro. Além disso, o bFGF produz um potente efeito de promoção do crescimento em neurónios implantados in vivo, quando os neurónios implantados são geneticamente manipulados para expressarem o bFGF (Takayama et al. (1995) Nat. Med. 1: 53-8). Além disso, a implantação de bastonetes bioactivos à base de polímeros que segregam o factor de crescimento epidérmico e bFGF para o tecido mesencifálico ventral fetal transplantado, resulta em características funcionais melhoradas e sobrevivência celular melhorada (Tornquvist et al. (2000) Exp. Neurol. 164: 130-138).

Também se mostrou que o factor de crescimento nervoso (NGF) influencia o tecido enxertado no SNC. Por exemplo, a actividade de ChAT, um ensaio indicativo de actividade celular colinérgica, estava significativamente elevada em neurónios colinérgicos que foram transplantados para o tecido do cérebro que continha um grânulo de libertação de NGF adjacente às células enxertadas (Mahoney et al. (1999) Med. Sei. 96:4536-4539). Também se mostrou que o IGF-I promove a diferenciação de células estaminais neuronais pós-mitóticas mamíferas do SNC e influencia a apoptose de células progenitoras eritróides humanas. Ver, por exemplo, Arsenijevic et al. (1998) J. Neurosci. 18:2118-2128; Tanigachi et al. (1997) Blood 90:2244-2252; Reboarcetetal. (1996) J. Biol. Reprod. 55:1119-1125; Muta et al. (1994) J. Clin. Invest. 94 :34-43; e Muta et al. (1993) J. Cell. Phys. 156:264-271. Adicionalmente, mostrou-se que determinadas proteínas associadas ao crescimento, tais como GAP-43 e CAP-23, actuam para promover a regeneração de axónios feridos e podem suportar a regeneração na medula espinal e SNC. Ver, por exemplo, Bomze et al. (2001) Nature Neurosci. 4:38-43 e Woolf et al. (2001) Nature Neurosci. 4:7-9. A administração de agentes reguladores como um meio de melhoramento do resultado clínico de um mamífero tendo sido submetido a uma estratégia regenerativa neural, i. e., de base celular, tem, contudo, encontrado dificuldades. Em geral, estes agentes não podem ser administrados sistemicamente. Além disso, muitos destes agentes reguladores não atravessam a barreira hematoencefálica eficientemente. A administração intracerebroventricular, embora possivelmente um método eficaz para distribuir agentes reguladores, é uma técnica invasiva que, num quadro clínico, não é preferida. A implantação de polímeros contendo agentes reguladores também é invasiva e está ainda limitada pelo raio relativamente pequeno circundando o implante de polímero no qual o agente regulador é capaz de induzir um efeito. Adicionalmente, embora a engenharia genética das células transplantadas para expressar agentes reguladores tenha sido realizada, a transfecção e sobrevivência estáveis das células após implantação continuam a ser problemáticas. 9

Sumário da Invenção

Os problemas acima mencionados são, inter alia, resolvidos pelas células terapêuticas de acordo com a reivindicação 1 e a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11. As células terapêuticas de acordo com as reivindicações dependentes 2-10 e a composição farmacêutica de acordo com as reivindicações dependentes 12-15, representam formas de realização preferidas da invenção.

Dada a situação descrita acima, existe uma necessidade para células terapêuticas e/ou composições farmacêuticas para utilização na distribuição eficiente e não invasiva no sistema nervoso central lesionado e/ou degenerescente. A presente invenção é dirigida, inter alia, à prevenção e/ou tratamento do sistema nervoso central lesionado e/ou degenerescente, devido a uma doença ou outro estado que cause a perda ou morte de células do SNC. Especificamente, a presente invenção proporciona células terapêuticas, composição farmacêutica e artigo de fabrico para utilização no transporte de uma quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos, uma célula terapêutica para o SNC, por aplicação intranasal no terço superior da cavidade nasal contornando, desse modo, a barreira hematoencefálica e evitando exposição sistémica indesejada, assim como métodos de distribuição invasiva.

Diversas formas de realização da presente invenção compreendem prevenção, pré-tratamento, pós-tratamento intranasal e/ou como um componente da composição farmacêutica compreendendo células terapêuticas de uma quantidade terapeuticamente eficaz de agente(s) de melhoramento de distribuição, para melhorar a 10 distribuição de célula(s) terapêutica(s) no SNC. Outras formas de realização compreendem ainda, pelo menos, um antibiótico aplicado intranasalmente e/ou sistemicamente como um pré-tratamento, um co-tratamento (administrado simultaneamente ou como um componente da composição terapêutica compreendendo células terapêuticas) e/ou um dispositivo de pós-tratamento, para proteger o doente durante a terapia de célula terapêutica. Outras formas de realização compreendem ainda uma quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos, um agente regulador para administrar no terço superior da cavidade nasal de mamífero como um pré-tratamento, pós-tratamento e/ou como parte da composição farmacêutica compreendendo as células terapêuticas. Outras formas de realização compreendem ainda, pelo menos, um agente imunossupressor aplicado intranasalmente e/ou sistemicamente como um pré-tratamento, um co-tratamento (administrado simultaneamente ou como um componente da composição terapêutica compreendendo células terapêuticas) e/ou um dispositivo de pós-tratamento, para melhorar a viabilidade de células terapêuticas in vivo durante a terapia de célula terapêutica. A presente invenção encontra utilização no melhoramento do resultado clínico de um mamífero tendo sido submetido a uma estratégia regenerativa neural, compreendendo o contorno da barreira hematoencefálica de células terapêuticas transportadas directamente para o SNC do mamífero.

Diversas formas de realização da invenção referem-se a células terapêuticas e composições farmacêuticas para prevenção e tratamento de lesão e degeneração neurológicas, i. e., perda e morte celular no SNC e os efeitos resultantes, incluindo mas não limitados a tratamento de perda de memória e melhoramento da perda de memória, devido a isquemia e/ou neurodegeneração cerebral para doentes em risco, ou diagnosticados com 11 determinados estados médicos, tais como doença de Alzheimer, insuficiência cognitiva moderada, disfunção da memória associada à idade, doença de Parkinson, doença vascular cerebral, incluindo AVC, doença de Creutzfeldt-Jakob, esclerose lateral amiotrófica familiar, demência de corpo de Lewy, aterosclerose, esquizofrenia, autismo, disquinesia tardia, esclerose múltipla, distúrbios compulsivos, doença de Wilson, paralisia supranuclear progressiva, sindrome de Hallervorden-Spatz, atrofia multissistémica, doença de Huntington, degeneração dos gânglios basais familiar, sindrome de Down, cataratas, hemocromatose, talassemia, hemorragia cerebral, hemorragia subaracnóica, ferimento da cabeça, ferimento da medula espinal e distúrbios metabólicos afectando o SNC.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições

Como aqui utilizado, "sistema nervoso central" (SNC) refere-se ao cérebro e medula espinal e tecidos associados.

Como aqui utilizado, "distúrbios e doenças neurológicas do SNC" refere-se a doenças e estados do cérebro que compreendem isquemia, i. e., isquemia cerebral, isquemia, AVC, neurodegeneração, complicações neurológicas surgindo, tais como da doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Wilson, demência de corpo de Lewy, esclerose múltipla, distúrbios compulsivos, ataxia cerebelosa, paralisia supranuclear progressiva, esclerose lateral amiotrófica, autismo, distúrbios afectivos, distúrbios de ansiedade, distúrbios metabólicos que afectam o SNC e/ou esquizofrenia; lesão celular, lesão nervosa 12 de distúrbios cerebrovasculares, taisl como AVC no cérebro ou medula espinal, de infecções do SNC, incluindo meningite e HIV, de tumores do cérebro e medula espinal, doenças de prião e distúrbios do SNC resultando do envelhecimento ordinário (e. g., anosmia), ferimento da cabeça e/ou cérebro, ou ferimento da medula espinal e quaisquer outras doenças e estados médicos aqui mencionados com perda, lesão e/ou degeneração celulares neurológicas.

Uma "quantidade eficaz" de células e/ou agente é uma quantidade suficiente para prevenir, tratar, reduzir e/ou melhorar os sintomas e/ou causas subjacentes de quaisquer dos distúrbios ou doenças anteriores. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" é suficiente para eliminar os sintomas dessas doenças e, talvez, superar a própria doença. De um modo preferido, uma quantidade eficaz da célula em questão, na gama de dosagem de 50-108 células para aplicação crónica ou única e/ou uma quantidade eficaz de agente na gama de dosagem de 0,001-2,0 mg/kg, produz uma concentração tecidular de 10-105 células por mL de tecido e de agente na gama de cerca de IO-13 molar a cerca de 1CT5 molar, mas as concentrações podem ser maiores, desde que essa toxicidade seja evitada.

No contexto da presente invenção, os termos "tratar" e "terapia" e semelhantes, referem-se a aliviar, abrandar a progressão, profilaxia, atenuação ou cura de doença ou estado existente que tenha causado ou cause a morte celular no SNC. "Prevenir", como aqui utilizado, refere-se a evitar, retardar, abrandar, inibir ou, de outro modo, parar, reduzir ou melhorar o inicio dessas doenças ou distúrbios. É preferido, que uma quantidade suficientemente grande da(s) célula(s) e/ou agente(s) seja aplicada em níveis não tóxicos, de modo a proporcionar um 13 nível de actividade eficaz contra a doença. As células terapêuticas da presente invenção podem ser utilizadas com qualquer animal, tais como um mamífero ou uma ave (aviária) , de um modo mais preferido, um mamífero. As aves domésticas são uma ave preferida. Os mamíferos exemplificativos incluem mas não estão limitados a ratos, murganhos, gatos, cães, cavalos, vacas, ovelhas, porcos e, de um modo mais preferido, humanos. "Célula(s) terapêutica(s)", é aqui definido como compreendendo, pelo menos, uma célula ou tipo de célula, por exemplo e, sem limitação, uma célula estaminal neural que é transportada por meio de aplicação intranasal para o terço superior da cavidade nasal do indivíduo e para o SNC lesionado e/ou degenerescente do indivíduo submetido a terapia de substituição celular. A(s) célula(s) terapêutica(s) pode(m) ser derivada(s) de qualquer fonte e pode(m) estar em diversos estádios de diferenciação do desenvolvimento, desde que a(s) célula(s) terapêutica(s) seja(m) suficiente(s) para prevenir ou reduzir os sintomas neurológicos morfológicos e/ou comportamentais do distúrbio, doença e/ou estado neurológico a ser tratado com terapia de substituição celular. Além disso, é reconhecido que a(s) célula(s) terapêutica(s) pode(m) ser heteróloga(s) ou autóloga(s) ao hospedeiro. Por heterólogo, significa-se que a célula terapêutica é derivada de um mamífero que não o indivíduo doente, enquanto uma célula terapêutica autóloga é derivada do indivíduo doente, manipulada ex vivo e transportada de novo para o SNC do indivíduo doente por métodos da presente invenção. Os linfócitos terapêuticos também podem ser administrados no terço superior da cavidade nasal, utilizando a presente invenção para visar o sistema nervoso central e vasos linfáticos. Os linfócitos funcionam como parte das defesas do corpo e incluem células assassinas naturais 14 (células NK) , células T e células B. Essas células podem ser úteis no tratamento de tumores do cérebro e outros distúrbios do SNC e linfáticos. Uma discussão adicional de células terapêuticas é empreendida infra, cada desses aspectos está incluído na definição de "células terapêuticas". Na presente invenção, as células terapêuticas não compreendem células estaminais embrionárias humanas.

Como aqui utilizado, "agente regulador" refere-se a qualquer molécula que tem um efeito de crescimento, proliferativo, diferenciativo ou trófico numa célula de dador transplantada da presente invenção. Pode ser administrado qualquer agente regulador que seja capaz de regular o desenvolvimento da célula de dador transplantada pode ser administrado. Ver, por exemplo, Mackay-Sim et al. (2000) Prog. Neurobiol. 62:527-559, aqui incorporado por referência. Uma discussão adicional de agente(s) regulador(s) é empreendida infra, cada desses aspectos está incluído na definição de "agente regulador" .

No contexto da presente invenção, os termos "tratar" e "terapia" e "terapêutico" e semelhantes, referem-se a aliviar, abrandar a progressão, profilaxia, atenuação ou cura de um SNC lesionado ou degenerescente, envolvendo perda ou morte de células do SNC. A definição compreende ainda evitar, retardar, abrandar, inibir ou, de outro modo, parar, reduzir ou melhorar o SNC lesionado ou degenerescente, envolvendo perda ou morte de células do SNC. As células terapêuticas da presente invenção podem ser utilizadas com qualquer animal, tais como um mamífero ou uma ave (aviária), de um modo mais preferido, um mamífero. As aves domésticas são uma ave preferida. Os mamíferos exemplificativos incluem mas não estão limitados a ratos, 15 murganhos, gatos, cães, cavalos, vacas, ovelhas, porcos e, de um modo mais preferido, humanos.

Como aqui utilizados, os termos "diferenciar" e "amadurecer", referem-se à progressão de uma célula desde um estádio tendo o potencial para se diferenciar em, pelo menos, duas linhagens celulares diferentes para se tornar numa célula especializada. Para os efeitos da presente invenção, esses termos podem ser utilizados com o mesmo significado. 0 termo "linhagem" refere-se à totalidade dos estádios do tipo de célula em desenvolvimento, desde a primeira célula precursora até uma célula completamente madura (i. e., uma célula especializada). Consequentemente, as células terapêuticas transportadas da presente invenção podem ser derivadas de uma linhagem celular multipotente, de um modo preferido, uma linhagem neural e podem estar em qualquer estádio de diferenciação. Deste modo, a presente invenção inclui células terapêuticas que estão naturalmente programadas para se diferenciarem apenas num tipo de linhagem. Estes tipos de células podem incluir algumas espécies de fibroblastos ou simplesmente astróglia diferenciada, neurónios, oligodendrócitos, células da micróglia ou endoteliais e podem ser derivadas ou apenas isoladas do tecido de um dador morto.

Aspectos adicionais destes termos são discutidos infra, cada desses aspectos está incluído dentro da definição dos termos.

Como aqui utilizado, o termo "célula estaminal multipotente", refere-se a uma célula capaz de se diferenciar numa variedade de linhagens. As células multipotentes terapêuticas, e. g., estaminais, são caracterizadas pela sua 16 capacidade de sofrerem proliferação celular continua, regenerarem cópias exactas delas próprias (auto-renovação) , gerarem um grande número de progénia celular regional e de elaborarem novas células em resposta a ferimento ou doença. Na presente invenção, a definição de "célula estaminal multipotente" exclui células estaminais embrionárias humanas. Uma "população de células multipotentes" refere-se a uma composição de células capazes de se diferenciarem em menos de todas as linhagens de células mas, pelo menos, em duas linhagens celulares. Estudos correntes demonstraram que as células estaminais multipotentes de uma região não neurológica não são restringidas a linhagem, à sua origem de desenvolvimento, mas podem gerar neurónios específicos de região quando expostas aos sinais ambientais apropriados (Lamga et ai. (2001) J. Neurosci. 20:8727-8735).

Uma "célula estaminal neural" é aqui definida como uma célula multipotente que é uma célula multipotente imatura e não comprometida que existe no sistema nervoso (Ourednik et al. (1999) Clinicai Genetics 56:267-278). Sob condições específicas, a célula estaminal neural é capaz de produzir células filhas que se podem diferenciar, de um modo terminal, em neurónios e glia (i. e., astrócitos (tipo I e II) e oligodendrócitos) . Existem no sistema nervoso em desenvolvimento e no sistema nervoso adulto. Uma caracterização detalhada das propriedades das células estaminais neurais pode ser encontrada em, por exemplo, Mcinnes et al. (1999) Clin. Genet. 56:267-278.

Uma "célula progenitora neuronal" é uma célula não diferenciada que é derivada de uma célula estaminal neural e que se comprometeu com uma via de diferenciação particular, não exibe auto-manutenção e, sob condições apropriadas, irá 17 diferenciar-se em neuroblastos (células produtoras de neurónios) ou fibroblastos (células produtoras de glia). A utilização dessas linhagens celulares neuronais multipotentes para transplantação é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, Snyder et al. (1992) Cell 68:33, onde as linhas celulares neuronais multipotentes foram enxertadas no cerebelo de rato para formar neurónios e células gliais. Ver, também, Campell et al. (1995) Neuron 15:1259-1273; Fishell et al. (1995) Development 121: 803-812; e Olsson et al. (1995) Eur. J. Neurosci. 10:71-85. "Isquemia" ou episódio ou estado isquémico é aqui definido como compreendendo um estado isquémico onde o cérebro ou partes do cérebro não recebem suficiente fluxo sanguíneo para manterem a função neurológica normal, resultando numa perda ou morte de células do SNC e concomitante lesão e/ou degeneração do SNC. Diversos estados e/ou doenças podem causar isquemia, incluindo mas não limitados a AVC. Alguns distúrbios e doenças neurológicos do SNC aqui definidos e discutidos são caracterizados por algum nível de isquemia. Os distúrbios e doenças neurológicos do SNC aqui definidos e discutidos são passíveis de tratamento com a célula terapêutica da presente invenção.

Uma "quantidade eficaz" de células e/ou componente (s) terapêutico (s) da composição farmacêutica da presente invenção compreendendo células terapêuticas, é uma quantidade suficiente para prevenir, tratar, reduzir e/ou melhorar os sintomas, lesão neuronal e/ou causas subjacentes de qualquer dos distúrbios ou doenças referenciados. Em alguns casos, uma "quantidade eficaz" é suficiente para eliminar os sintomas dessas doenças e superar a própria doença. Apenas para efeitos ilustrativos, os regimes de tratamento exemplificativos referentes, em geral, aos agentes 18 terapêuticos aqui divulgados, incluindo gamas, volumes e frequência de dosagem, são proporcionados abaixo: A gama de dosagem eficaz para agentes de melhoramento de distribuição, agentes reguladores, agentes imunossupressores e/ou antibióticos compreende 0,0001-1,0 mg/kg.

Uma gama de dosagem mais preferida pode ser 0,005-1,0 mg/kg. A gama de dosagem mais preferida pode ser 0,05-1,0 mg/kg. A "quantidade eficaz" de células terapêuticas, i. e., gama de dosagem eficaz, compreende 50 células - 108 células.

Uma gama de dosagem mais preferida para células terapêuticas compreende 103 células - 108 células. A gama de dosagem mais preferida para células terapêuticas compreende 104 células - 108 células. A gama de volume de dosagem (aplicável a sprays ou gotas nasais) pode ser 0,015 mL-1,0 mL. A gama de volume de dosagem preferida (aplicável a sprays ou gotas nasais) pode ser 0,013 mL-0,6 mL.

As concentrações cerebrais que são susceptíveis de ser alcançadas com as gamas de dosagem proporcionadas acima são, para uma dose única: 10 - 108 células por mL de tecido e 0,1 nM - 5 μΜ. Ao longo da duração e um plano de tratamento 19 multidose, a concentração cerebral máxima pode ser tão elevada quanto 106 células por mL de tecido e 50 μΜ para agentes de melhoramento de distribuição, agentes reguladores, agentes imunossupressores e antibióticos. A presente invenção, por conseguinte, proporciona células terapêuticas e composições farmacêuticas para melhorar terapias de base celular, utilizadas para regenerar tecido neural que foi lesionado ou que está sujeito a degeneração por qualquer doença ou distúrbio do SNC, i. e., perda ou morte de células do SNC. Os distúrbios do SNC que estão no âmbito da presente invenção compreendem, por exemplo, ferimento da cabeça, ferimento da medula espinal, AVC e isquemia. Os distúrbios do SNC dentro do âmbito da presente invenção também compreendem doenças neurodegenerativas, tais como mas não limitadas a doenças e estados cerebrais que compreendem isquemia, i. e., isquemia cerebral, isquemia, AVC, neurodegeneração, complicações neurológicas que surgem de doenças, tais como de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Wilson, demência de corpo de Lewy, esclerose múltipla, ataxia cerebelosa, paralisia supranuclear progressiva, esclerose lateral amiotrófica, distúrbios afectivos, distúrbios da ansiedade, autismo e/ou esquizofrenia; lesão celular; lesão nervosa de distúrbios cerebrovasculares, tais como AVC no cérebro ou medula espinal, de infecções do SNC, incluindo meningite e HIV, de tumores do cérebro e medula espinal, doenças de prião e distúrbios do SNC resultando de envelhecimento ordinário (e. g., anosmia), ferimento do cérebro, ferimento da medula espinal e/ou distúrbios metabólicos afectando o SNC.

Consequentemente, as formas de realização da presente invenção encontram utilidade no melhoramento da regeneração ou 20 reparação de tecido neuronal lesionado, num animal que foi submetido a estratégia regenerativa neural, i. e., de base celular que compreende a aplicação intranasal por meio do terço superior da cavidade nasal do indivíduo animal, contornando, desse modo, a barreira hematoencefálica de, pelo menos, uma célula terapêutica para o SNC do mamífero, para tratar uma doença ou distúrbio neurológico do SNC envolvendo isquemia e/ou perda ou morte celular do SNC.

As estratégias regenerativas neurais compreendendo a

transplantação de células de dador para o SNC de um hospedeiro são conhecidas na técnica. Contudo, não é conhecido o contorno da barreira hematoencefálica com células terapêuticas, deste modo transportando essas células directamente para o SNC lesionado ou degenerescente de um indivíduo hospedeiro por aplicação intranasal no terço superior da cavidade nasal. A célula terapêutica pode ser auxiliada no transporte por, pelo menos, um agente de melhoramento de distribuição, na viabilidade de, pelo menos, um agente imunossupressor e/ou regulada em termos de desenvolvimento por, pelo menos, um agente regulador, enquanto o doente pode ser protegido de bactérias mucósicos contornando a barreira hematoencefálica, através da utilização de, pelo menos, um antibiótico, como será ainda discutido abaixo, alguns dos componentes podem ser administrados sistemicamente e/ou intranasalmente. 21

Via de Transporte para Hematoencefálica

Contornar a

Barreira 0 Nervo Olfactivo

As células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas para administração a tecido inervado pelo nervo olfactivo que se localiza no terço superior da cavidade nasal. As células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção podem ser distribuídas na área olfactiva por meio de aplicação no terço superior da cavidade nasal.

As fibras do nervo olfactivo são axónios não mielinizados de células receptoras olfactivas que se localizam no terço superior da mucosa nasal. As células receptoras olfactivas são neurónios bipolares com protuberâncias cobertas por cílios semelhantes a cabelo que se projectam para dentro da cavidade nasal. Na outra extremidade, axónios destas células recolhem-se em agregados e entram na cavidade craniana no tecto do nariz. Rodeados por uma trompa fina de pia, os nervos olfactivos atravessam o espaço subaracnóide contendo CSF e entram nos aspectos inferiores dos bolbos olfactivos. Assim que as células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção são aplicadas no terço superior da cavidade nasal, as células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção podem ser submetidas a transporte através da mucosa nasal e para no bolbo olfactivo e outras zonas do SNC, tais como o núcleo olfactivo anterior, córtex frontal, formação hipocampal, núcleos amigdalóides, nucleus basalis de Meynert, hipotálamo, mesencéfalo, cerebelo, medula espinal cervical e semelhantes. 22

Transporte Neuronal

As células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas ao indivíduo por aplicação no terço superior da cavidade nasal do indivíduo. A aplicação das células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção garante, neste modo que as células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas são transportadas para o SNC, cérebro e/ou medula espinal ao longo de uma via neural, com perda sistémica e exposição sistémica reduzidas. Uma via neural inclui transporte no ou ao longo de um neurónio, através ou por meio de vasos linfáticos correndo com um neurónio, através ou por meio de um espaço perivascular de um vaso sanguíneo correndo com um neurónio ou via neural, através ou por meio de uma adventícia de um vaso sanguíneo correndo com um neurónio ou via neural ou através de um sistema hemangiolinfático. A presente invenção compreende as células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas para utilização no transporte por meio de uma via neural, e não através do sistema circulatório, de modo que os agentes reguladores que são incapazes, ou apenas fracamente, de atravessarem a barreira hematoencefálica da corrente sanguínea para no cérebro possam ser distribuídos no sistema linfático, SNC, cérebro e/ou medula espinal. As células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção, uma vez passada a barreira hematoencefálica e no SNC, podem, depois, ser distribuídas para diversas áreas do cérebro ou medula espinal através de canais linfáticos, através de um espaço perivascular ou transportadas através ou ao longo de neurónios. Numa forma de realização, as 23 células terapêuticas migram para a região de lesão e/ou degeneração no SNC. A utilização de uma via neural para transportar um agente regulador para o cérebro, medula espinal ou outros componentes do sistema nervoso central obvia o obstáculo apresentado pela barreira hematoencef álica, de modo que as medicações, i. e., células terapêuticas e/ou composições farmacêuticas da presente invenção que normalmente não atravessam essa barreira, podem ser distribuídas directamente no SNC, e. g., o cérebro e medula espinal. Além disso, a presente invenção pode proporcionar distribuição de um nível mais concentrado das células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção a células neurais, visto que as células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção não se tornam diluídas em fluidos presentes na corrente sanguínea. Como tal, a invenção proporciona distribuição melhorada das células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção no SNC, incluindo o cérebro e/ou medula espinal. A Via Neural Olfactiva

Uma forma de realização inclui a distribuição do agente regulador no indivíduo de tal modo que o agente regulador é transportado para o SNC, e. g., o cérebro, e/ou medula espinal ao longo de uma via neural olfactiva. Tipicamente, essa forma de realização inclui administrar o agente regulador em tecido innervado pelo nervo olfactivo e no interior da cavidade nasal. A via neural olfactiva inerva, principalmente, o epitélio olfactivo no terço superior da cavidade nasal, como descrito acima. A aplicação do agente regulador num tecido inervado pelo nervo olfactivo pode distribuir o agente regulador em neurónios ou células lesionadas do SNC, cérebro, e/ou medula espinal. Pensa-se que os neurónios olfactivos inervam este tecido e podem proporcionar uma ligação directa ao SNC, cérebro, e/ou medula espinal devido ao seu papel no olfacto. A distribuição através da via neural olfactiva pode empregar vasos linfáticos que viajam com o nervo olfactivo para as diversas áreas do cérebro e dai para os vasos linfáticos durais associados com porções do SNC, tal como a medula espinal. 0 transporte ao longo do nervo olfactivo também pode distribuir agentes reguladores a um bolbo olfactivo. Uma via perivascular e/ou uma via hemangiolinfática, tal como canais linfáticos correndo dentro da adventícia de vasos sanguíneos cerebrais, pode proporcionar um mecanismo adicional para transporte de agentes reguladores terapêuticos para o cérebro e medula espinal de tecido inervado pelo nervo olfactivo.

As células terapêuticas e/ou as suas composições farmacêuticas podem ser administradas no nervo olfactivo, por exemplo, através do epitélio olfactivo, localizado no terço superior da cavidade nasal. Essa administração pode empregar transporte extracelular ou intracelular (e. g., transneuronal) anterógrado e retrógrado do agente regulador entrando através dos nervos olfactivos para o cérebro e suas meninges, para o tronco cerebral ou para a medula espinal. Assim que as células terapêuticas e/ou sua composição farmacêutica seja dispensada em ou no tecido inervado pelo nervo olfactivo, as células terapêuticas e/ou composição farmacêutica e/ou os seus componentes podem ser transportadas através do tecido e viajar ao longo de neurónios olfactivos para as zonas do SNC, incluindo 25 o tronco cerebral, cerebelo, medula espinal, fluido cerebrospinal, bolbo olfactivo e estruturas corticais e subcortiçais. A barreira hematoencefálica é contornada, na presente invenção, pelas células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas compreendendo células terapêuticas por aplicação no terço superior da cavidade nasal. As células terapêuticas e/ou composição farmacêutica da invenção migram desde a mucosa nasal através das forâmenes na placa cribriforme ao longo da via neural olfactiva e para o SNC. Ver o Exemplo 1 infra, proporcionando evidência experimental de que a barreira hematoencefálica é contornada no modo admitido por hipótese. A administração na cavidade nasal empregando uma via neural pode, deste modo, distribuir células terapêuticas, incluindo mas não limitadas a células eucarióticas e células estaminais e/ou composição farmacêutica compreendendo as células terapêuticas da presente invenção, no sistema linfático, tronco cerebral, cerebelo, medula espinal e estruturas corticais e subcorticais. As células terapêuticas e/ou a composição farmacêutica da presente invenção podem, isoladamente, facilitar este movimento para o SNC, i. e., cérebro e/ou medula espinal. Alternativamente, um transportador e/ou o(s) agente(s) de melhoramento de distribuição podem auxiliar no transporte das células terapêuticas e/ou composição farmacêutica da presente invenção para a e ao longo da via neural. A administração de células terapêuticas e/ou composição farmacêutica da presente invenção no terço superior da cavidade nasal contorna, deste modo, a barreira hematoencefálica através de um sistema de transporte desde a mucosa nasal e/ou epitélio até ao SNC, i. e., cérebro e medula espinal. 26

As células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção, podem ser utilizadas para administração a tecido inervado pelos nervos olfactivos. Esses sistemas nervosos podem proporcionar uma ligação directa entre o ambiente exterior e o cérebro proporcionando, deste modo, distribuição vantajosa de um agente regulador no SNC, incluindo cérebro, tronco cerebral e/ou medula espinal. As células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção são incapazes de atravessarem, ou atravessam ineficientemente, a barreira hematoencefálica da corrente sanguínea para dentro cérebro. Deste modo, as células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas inventivas podem ser distribuídas por meio do nervo olfactivo e não através do sistema circulatório. Isto permite a distribuição eficiente das células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção no SNC, cérebro ou medula espinal, sem perda ou exposição sistémicas. 0(s) agente(s) imunossupressor(es) e/ou antibiótico(s) pode(m) ser distribuído(s) de acordo com diversas formas de realização da presente invenção, sistemicamente ou no terço superior da cavidade nasal, isoladamente ou na combinação farmacêutica compreendendo célula(s) terapêutica(s) .

Vias Alternativas

As vias alternativas ao nervo olfactivo discutido acima compreendem vias ao longo de outros nervos que inervam a cavidade nasal, e. g., a via trigeminal, bem conhecida pelo especialista na técnica. 27 Células Terapêuticas A(s) célula(s) terapêutica(s) da presente invenção pode(m) ser derivada(s) de quaisquer tecidos mamíferos fetais ou adultos, incluindo medula óssea, ou tecidos neurais, incluindo tecido do hipocampo, epitélio olfactivo, bolbo olfactivo, zona subventricular, cerebelo, medula espinal, córtex (i. e., córtex motor ou somatossensorial), estriado, prosencéfalo basal (neurónios colinérgicos), mesencéfalo ventral (células da substância negra) e o locus ceruleus (células de neuroadrenalina do sistema nervoso central). Além disso, a(s) célula(s) terapêutica(s) pode(m) incluir mas não está (estão) limitada(s) a células estaminais neurais e/ou multipotentes, células progenitoras neurais, células geneticamente manipuladas, células T e/ou células autólogas. Na presente invenção, as células terapêuticas não compreendem células estaminais embrionárias humanas. 0 sistema nervoso central em desenvolvimento, e adulto animal, contém uma população de células estaminais neurais e células progenitoras que são de particular interesse na presente invenção como células terapêuticas. Os métodos de isolamento e transplantação de diversas células progenitoras neurais derivadas de diferentes tecidos, em diferentes estádios de desenvolvimento, são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, córtex estriado (Winkleretal. (1998) Mol. Cell. Neurosci. 11:99-116; Hammang et al. (1997) Exp. Neurol. 147:84-95); córtex (Brustle et al. (1998) Nat. Biotechnol 16:1040-1044 e Sabate et al. (1995) Nat. Genet 9:256-260); telencéfalo humano (Flax et al. (1998) Nature 392: 18-24 e Vescovi et al. (1999) Neuron 11 :951-966); hipocampo (Gage et al. (1995) J. Neuroblol. 36:249-266 e Suhonen et al. (1996) 28

Nature 383:624-62 7); prosencéfalo basal (Minger et al. (1996) Exp. Neurol. 141: 12-24); mesencéfalo ventral (Winkler et al. (1998) Mol. Cell. Neurosci. 11: 99-116; Svendsen et al. (1996) Exp. Neurol 137:376-388; Hammang et al. (1997) Exp. Neurol. 147:84-95; Studer et al. (1997) Nat. Neurosci. 1: 290-295;

Milward et al. (1997) J. Neurosci. Res. 50:862-871); e zona subventricular (Milward et al. (1997) Milward et al. ( 1997) J.

Neurosci. Res. 50:862-871). Cada destas referências é aqui incorporada por referência. Além disso, os métodos para o isolamento da progénie de célula estaminal neural e método para promover a sua diferenciação também podem ser consultados na Pat. U.S. N° 6071889 e Pat. U.S. N° 6103530, ambas as quais são aqui incorporadas por referência.

As células terapêuticas da presente invenção também podem ser de origem paraneural. Um exemplo preferido, dessa célula é a célula de cromafina medular ad-renal. Ver, por exemplo, Bjorklund et al. (1985) Enxerto Neural no SNC Mamifero (Amesterdão: Elsevier) , p. 3-11 e Lindvall et al. (1997) Ann.

Neurol 22: 457-468 que demonstram a utilidade de células de cromafina para o tratamento da doença de Parkinson.

As células terapêuticas da presente invenção que não são de origem neural, mas que tenham sido alteradas para produzir uma substância de interesse neurológico, também estão dentro do âmbito da invenção. Um tipo de célula preferido, é um fibroblasto de prepúcio humano que é facilmente obtido e cultivado (ver, por exemplo, a Pat. U.S. N° 6060048 ). Essas células são, de um modo preferido, geneticamente alteradas, utilizando métodos conhecidos na técnica para expressar factores de crescimento neuronais, neurotransmissores, neuropéptidos ou enzimas envolvidas no metabolismo do cérebro. Ver, por exemplo, 29

Gage et al. (1987) Neurosci. 23: 795-807; Rosenberg et al. (1988) Science 242: 1575-1578; Shimohama et al. (1989) Mol. Brain Res. 5: 271-278; os guais são, por este meio, incorporados por referência. Alternativamente, as células terapêuticas derivadas de uma origem não neuronal, tal como células epidérmicas, podem ser convertidas ou transdiferenciadas em diferentes tipos de células neuronais. Ver, por exemplo, a Pat. U.S. N° 6087168. A(s) célula(s) terapêutica(s) da presente invenção pode(m) ser geneticamente alterada(s) antes de transplantação para o hospedeiro. Como aqui utilizado, o termo "geneticamente alterado" refere-se a uma célula dentro da qual foi introduzido um ácido nucleico estranho, e. g., ADN. O ácido nucleico estranho pode ser introduzido por uma variedade de técnicas, incluindo mas não limitadas a transfecção mediada por fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE, micro-injecção, transformação virai, fusão de protoplastos e lipofecção. A célula geneticamente alterada pode expressar o ácido nucleico estranho num modo transiente ou a longo prazo. Em geral, a expressão transiente ocorre quando o ADN estranho não se integra, de um modo estável, no ADN cromossómico da célula transfectada. Em contraste, a expressão de longo prazo de ADN estranho ocorre quando o ADN estranho foi integrado, de um modo estável, no ADN cromossómico da célula transfectada.

Esses genes de interesse incluem enzimas sintetizadoras de neurotransmissores (i. e., tirosina hidrolase (TH) e acetilcolinatransferase). Esses métodos são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as células de dador terapêuticas de diversas regiões do cérebro e em diferentes estádios de desenvolvimento foram isoladas e foram imortalizadas 30 por meio de alteração genética. Por exemplo, as células olfactivas e do cerebelo foram imortalizadas utilizando o oncogene myc (v-myc) virai para produzir linhas celulares com fenótipos neuronais e gliais (Ryder et al. (1990) J. Neurobiol. 21: 356). Estudos semelhantes por Snyder et al. ((1992) Cell 68:33) resultaram em linhas celulares neuronais multipotentes gue foram enxertadas no cerebelo de rato para formar neurónios e células gliais. Noutros estudos, as células neuroepiteliais murinas foram imortalizadas com um vector de retrovirus contendo c-myc e foram cultivadas com factores de crescimento para formar tipos de neurónios 85:3255). células (Barlett diferenciadas et al. (1988) semelhantes Proc. Natl. a astrócitos e Acad. Sei. USA Além disso, as células terapêuticas geneticamente manipuladas, distribuídas intranasalmente, da presente invenção podem compreender fábricas biológicas gue podem entrar no SNC e libertar substâncias que são deficientes ou estão em falta no SNC do doente. Por exemplo, em doenças de armazenamento de lípido e distúrbios metabólicos hereditários, tais como fenilcetonúria (PKU), doença de Wilson, Tay Sachs, doenças de armazenamento lisossomal ou doença de Nieman Pick, pode haver uma enzima em falta no cérebro desde o nascimento. As células terapêuticas da presente invenção podem compreender essa enzima específica em falta. Essas células terapêuticas geneticamente manipuladas, podem ser, depois, distribuídas no terço superior da cavidade nasal, onde as células contornam a barreira hematoencefálica e entram no cérebro para efectuarem a função metabólica em falta. Mais geralmente, as células terapêuticas, geneticamente manipuladas, da presente invenção podem actuar como minifábricas biológicas que produzem e libertam um ou mais dos seguintes: uma enzima, um factor de crescimento, um agente 31 anti-inflamatório, um neurotransmissor, um neuromodulador, um antioxidante, etc. que pode beneficiar o indivíduo que dele necessita. Alternativamente, as células terapêuticas geneticamente manipuladas da presente invenção podem compreender células segregando a hormona de libertação de gonadotropina geneticamente manipulada para aumentar a fertilidade em indivíduos que dela necessitam.

Agentes de Melhoramento de Distribuição

Determinados compostos, i. e., agentes de melhoramento de distribuição, podem ser utilizados pela presente invenção para auxiliar as células terapêuticas na distribuição para o sistema nervoso central e regiões lesionadas. Um agente de melhoramento de distribuição preferido, compreende hialuronidase que se observou aumentar muito significativamente a distribuição de células terapêuticas no SNC, quando aplicada no terço superior da cavidade nasal, como um pré-tratamento, administrado numa quantidade eficaz antes da célula terapêutica da presente invenção, ou como um componente da composição farmacêutica compreendendo células terapêuticas da presente invenção, ou como um composto separado administrado intranasalmente no terço superior da cavidade nasal substancialmente, simultaneamente, como as células terapêuticas e/ou composição farmacêutica. Pensa-se que a hialuronidase actua no ácido hialurónico na matriz extracelular, para melhorar a distribuição de células terapêuticas e/ou composições farmacêuticas compreendendo células terapêuticas no SNC. 0 exemplo 2 infra ilustra o aumento da eficácia através desse agente de melhoramento de distribuição na distribuição de células terapêuticas no SNC. 32

Os agentes de melhoramento de distribuição alternativos compreendem neuregulina, actividade de indução de migração e factor inibidor de leucemia. Estes agentes de melhoramento de distribuição, e. g., hialuronidase, agentes lipofílicos, neuregulina, actividade de indução de migração e factor inibidor de leucemia, podem ser utilizados individualmente, ou em qualquer combinação, para melhorar a distribuição das células terapêuticas no SNC de acordo com a presente invenção. Por conseguinte, pelo menos, um agente de melhoramento de distribuição pode ser utilizado como um pré-tratamento para o transporte das células terapêuticas e/ou composição farmacêutica e/ou como um componente da composição farmacêutica compreendendo células terapêuticas.

Os agentes de melhoramento de distribuição alternativos que melhoram ainda a distribuição mucosal de células terapêuticas e/ou composição farmacêutica compreendendo células terapêuticas da presente invenção, compreendem um inibidor enzimático, particularmente inibidores de proteases, como é bem conhecido na técnica. Os inibidores de proteases podem, mas estão limitados, a antipaina, arfamenina A e B, benzamidina HC1, AEBSF, CA-074, inibidor I e II de calpaína, calpeptina, pepstatina A, actinonina, amastatina, bestatina, boroleucina, captopril, cloroacetil-H0Leu-Ala-Gly-NH2, DAPT, diprotina A e B, ebelactona A e B, foroximitina, leupeptina, pepstatina A, fosforamidon, aprotinina, puromicina, BBI, inibidor de tripsina de soja, fluoreto de fenilmetilssulfonilo, E-64, quimiostatina, 1,10-fenantrolina, EDTA e EGTA.

Os agentes de melhoramento de distribuição ainda mais alternativos podem incluir, mas não estão limitados, a surfactantes, sais biliares, di-hidrofusidatos, agentes 33 bioadesivos, aditivos fosfolipidicos, micelas mistas, lipossomas, ou veículos, álcoois, enaminas, polímeros catiónicos, compostos dadores de NO, moléculas anfifílicas de cadeia longa, pequenos estimuladores de penetração hidrófobos; derivados de sódio ou um ácido salicílico, ésteres de glicerol de ácido acetoacético, ciclodextrina ou derivados de ciclodextrina beta, ácidos gordos de cadeia média, agentes quelantes, aminoácidos ou seus sais, ácidos N-acetilamino ou os seus sais, agentes mucolíticos, enzimas especificamente direccionadas para um componente de membrana seleccionado, inibidores da síntese de ácidos gordos e inibidores da síntese de colesterol. A presente invenção contempla a utilização de um ou mais, i. e., pelo menos um, dos agentes de melhoramento de distribuição acima, isoladamente ou em combinação com as células terapêuticas, como um composto farmacêutico numa quantidade eficaz.

Agentes Reguladores

Determinados agentes reguladores para regular, inter alia, o crescimento e diferenciação das células terapêuticas distribuídas no SNC, estão dentro do âmbito da presente invenção e incluem, por exemplo, uma quantidade eficaz de agentes reguladores que promovem a sobrevivência das células de dador através da modulação da resposta imunitária e inflamatória. Esses agentes reguladores incluem, por exemplo, ciclosporina e diversos outros imunomoduladores, incluindo interleucinas (i. e., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10); factor de necrose tumoral (i. e., TNF alfa e TNF beta); e interferões (i. e., IFN alfa, IFN beta, IFN gama, IFN ómega e IFN tau); e quaisquer seus variantes biologicamente activos. 34

Detalhes adicionais com respeito à administração destes agentes imunomoduladores podem consultar-se na patente U.S. com o N° de Série 09/733168, intitulada "Métodos para Administração de uma Citocina ao Sistema Nervoso Central e o Sistema Linfático", apresentada em 9 de Dezembro de 2000, aqui incorporada por referência.

Os agentes reguladores adicionais que encontram utilização na invenção, incluem CAP23, uma importante proteína de ligação de calmodulina associada ao citoesqueleto, e GAP43, uma proteína associada ao crecimento neural. Ver, por exemplo, Frey et al. (2000) J. Cell. Biol. 7:1443-1453. Agentes de interesse adicionais incluem a Proteína 1 Osteogénica (OP-1) que é uma proteína morfogénica que estimula o crescimento, diferenciação e a manutenção da diferenciação (Pat. U.S. N° 6153583); sonic hedgehog, um polipéptido que mostrou promover a sobrevivência de neurónios dopaminérgicos (Miao et al. (1996) Cell Transplant 55:2-17); diversos outros factores de crescimento gliais (Pat. U.S. N° 5716930; 6147190; e 5530109); e quaisquer seus variantes biologicamente activos. Todas estas referências são aqui incorporadas por referência.

Outros agentes reguladores de interesse e dentro do âmbito da presente invenção compreendem factores de crescimento. Como aqui utilizado, "factor de crescimento", refere-se a um polipéptido capaz de regular o desenvolvimento da célula de dador transplantada. Os factores de crescimento úteis na presente invenção incluem mas não estão limitados a membros da família da neurotrofina (i. e., factor de crescimento nervoso (NGF), factor neurotrófico derivado do cérebro (BON F), neurotrofina 3 (NT-3) e neurotrofina 4 (NT 4, também conhecido por NT-4/5 ou NT-5); factores de crescimento de fibroblastos 35 (FGFs, i. e., factor de crescimento de fibroblastos básico); família do factor de crescimento epidérmico (i. e., EGF, TGF alfa, anfiregulina, factor de crescimento semelhante a EGF de ligação de heparina (HB-EGF), bataceluina (BTC) e o grupo neuregulina); factor de crescimento derivado de plaquetas; insulina; factores de crescimento semelhantes a insulina (i. e., IGF-I e IGF-2); factor neurotrófico ciliar (CNTF), família do factor neurotrófico derivado da linha celular da glia (GONF) (i. e., GONF e neurturina (NTN), persefina (PSP) e artemina (ART)); superfamília do factor do crescimento transformante beta (i. e., as subfamílias incluem TGF beta 1, TGF beta 2, TGF beta 3, TGF beta 4, TGF beta 5, activina, inibina, decapentaplégico) ; factores de diferenciação do crescimento (GOF) (i. e., G0F1, G0F2, G0F3, G0F5, G0F6, G0F7, G0F8, G0F9, G0F9B, GOFIO, G0F11 e G0F15); nexina derivada da glia; factor neurotrófico dependente de actividade (AONF); factor de crescimento glial (GGF); e semelhantes. É ainda reconhecido que qualquer variante biologicamente activo destes factores de crescimento também é útil na presente invenção. 0 agente regulador da presente invenção pode ser de qualquer espécie animal, incluindo mas não limitada a roedora, aviária, canina, bovina, suína, equina e, de um modo preferido, humana. De um modo preferido, o agente regulador é da mesma espécie que o animal submetido a tratamento.

Os variantes biologicamente activos de polipéptidos reguladores (i. e., factores de crescimento, tais como IGF-I, NGF e FGF básico, citocinas, etc.) também estão abrangidos pelas células terapêuticas e composições farmacêuticas da presente invenção. Esses variantes devem reter a actividade biológica do agente regulador, particularmente a capacidade para regular o 36 desenvolvimento da célula de dador (i. e., promover a sobrevivência, manter o fenótipo desejado e/ou regular os sinais do desenvolvimento produzidos pela célula de dador). Por exemplo, quando o polipéptido regulador é um factor de crescimento, tais como IGF-I, NGF-I, ou um membro da família FGF, a capacidade para ligar os seus respectivos sítios de receptor será retida. Essa actividade de ligação de receptor pode ser medida utilizando bioensaios correntes.

Um desses agentes reguladores, um factor de crescimento que é útil na presente invenção é o IGF-I. 0 termo "IGF-I", como aqui utilizado, refere-se ao factor I de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), um péptido de cadeia única tendo 70 aminoácidos e um peso molecular de cerca de 7600 daltons. O factor I de crescimento, semelhante a insulina, estimula a mitose e processos de crescimento associados ao desenvolvimento celular. A sequência de aminoácidos e nucleotídica para IGF-I é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, a Pat. U.S. N° 5324639 que divulga a sequência de IGF-I humano; Acesso Genbank N° X15726 que divulga a sequência de IGF-I bovino; e Acesso Genbank N° X06043 que divulga a sequência de IGF-I de rato. Cada destas referências é aqui incorporada por referência.

Noutra forma de realização da presente invenção, o agente regulador pode compreender um membro da família de FGF de factores de crescimento e/ou os seus variantes biologicamente activos. A família do factor de crescimento de fibroblastos abrange um grupo de proteínas estruturalmente relacionadas que se ligam a heparina com uma elevada afinidade. Os membros da família de FGF têm actividade mitogénica e induzem a proliferação de uma ampla variedade de tipos de células. Os membros da família de FGF também participam na angiogénese, 37 diferenciação, migração celular, desenvolvimento embrionário e manutenção/sobrevivência neuronal. 0 termo "FGF", como aqui utilizado, refere-se a um membro família do factor de crescimento de fibroblastos incluindo, por exemplo, FGF-1 (FGF acídico), FGF-2 (FGF básico), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-8, FGF-9, FGF-98 ou um seu fragmento ou variante biologicamente activo. A sequência de aminoácidos e métodos para a preparação de muitos dos membros da família de FGF são bem conhecidos na técnica.

Noutra forma de realização da presente invenção, o agente regulador pode ser o factor de crescimento nervoso (NGF) ou um seu variante biologicamente activo. 0 NGF foi originalmente isolado como um complexo, tendo um peso molecular de 130 kDa e um coeficiente de sedimentação de 7S. Este complexo de 7S incluída três tipos de subunidades, com a subunidade "beta" transportando todas as actividades biológicas de NGF. O factor de crescimento nervoso estimula a mitose e processos de crescimento de células, particularmente células nervosas e regula o desenvolvimento (i. e., influencia a reparação, sobrevivência e diferenciação). A sequência de aminoácidos preferida para NGF pre-pro humano e NGF maduro humano é proporcionada na Pat. U.S. N° 5288622 que é aqui incorporada por referência. O NGF utilizado na presente invenção pode estar na sua forma substancialmente purificada, nativa, recombinantemente produzida ou numa forma quimicamente sintetizada. Por exemplo, o NGF pode ser isolado directamente de células expressando naturalmente o NGF. O NGF também pode ser recombinantemente produzido em sistemas de expressão celulares eucarióticos ou procarióticos, como descrito em Edwards et ai. (1988) Mol. Cell. 38

Biol. 8:2456; Pat. U.S. N° 5986070; e Pat. U.S. N° 6005081; todos estes são aqui incorporados por referência. Alternativamente, o agente regulador da presente invenção pode compreender eritropoietina (EPO), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e factor de crescimento epidérmico (EGF). Cada dos agentes reguladores aqui descritos desempenha um papel crucial na sobrevivência e diferenciação in vivo das células terapêuticas dos presentes métodos e composições farmacêuticas inventivos. A administração de uma quantidade eficaz de, pelo menos, um agente regulador, i. e., intranasalmente no terço superior da cavidade nasal, isoladamente e/ou em combinação com as células terapêuticas, irá regular o desenvolvimento da célula terapêutica transportada para o SNC. A expressão "regular o desenvolvimento" pretende aqui significar, inter alia que o agente regulador potência a sobrevivência, diferenciação, desenvolvimento axonal, desenvolvimento dendritico e/ou proliferação da célula terapêutica transportada; melhora a adesão das células terapêuticas transportadas para tecidos circundantes (i. e., incorporação dentro de tecido parenquimatoso) ; melhora a capacidade de as células terapêuticas transportadas estabelecerem ligação sináptica com os neurónios hospedeiros (i. e., estimula a formação de fibra nervosa nas células de dador; aumenta as distâncias de projecção de fibra nervosa das células de dador; ou melhora o destino da fibra nervosa das células de dador); e/ou informa a célula terapêutica transportada para se comprometer com uma linhagem neural especifica (i. e., adoptar um destino celular neuronal (neurónios GABA-érgicos, neurónios dopaminergicos, neurónios colinérgicos, neurónios hipocampais e semelhantes) astrocitico ou oligodendritico). É ainda reconhecido que um agente regulador 39 pode potenciar a sobrevivência de um célula de dador transplantada através da modulação da resposta imunitária do indivíduo. Por "modular" significa-se a regulação negativa da resposta imunitária ou inflamatória (i. e., influência da função imunitária sistémica, apresentação de antigénio, produção de citocina, proliferação de linfócito e entrada de linfócitos e macrófagos no SNC).

Além disso, sabe-se que a administração do agente regulador "regula o desenvolvimento" da célula de dador transplantada invasiva, influenciando os sinais de desenvolvimento libertados pelas células de dador transplantadas (i. e., estimula a célula de dador a libertar neurotransmissores, tais como dopamina, acetilcolina, GABA ou outros factores neuroprotectores). Como tal, a função e reparação (i. e., formação de fibra nervosa, distâncias de projecção de fibra nervosa e/ou densidade de fibra nervosa melhoradas) do tecido hospedeiro circundante podem ser melhoradas. A distribuição de uma quantidade eficaz de um ou mais, i. e., pelo menos um, agente regulador no SNC de um mamífero pode ser alcançada por meio da administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz deste agente. Alternativamente, uma quantidade eficaz do, pelo menos um, agente regulador pode ser distribuída intranasalmente no terço superior da cavidade nasal e/ou sistemicamente como um pré-tratamento, co-tratamento e/ou pós-tratamento para aplicação da composição farmacêutica e/ou célula(s) terapêutica(s) da presente invenção. Por "quantidade eficaz" entende-se, inter alia, a concentração de agente regulador que é suficiente para induzir o efeito terapêutico desejado, com respeito à regulação do desenvolvimento de uma célula de dador, como aqui 40 descrito. Consequentemente, uma quantidade eficaz do agente regulador aumenta o resultado clinico da terapia de substituição celular, em comparação com animais tratados apenas com a estratégia de substituição celular. Como tal, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser ensaiada por meio de uma redução nos défices neurais associados ao distúrbio do SNC a ser tratado e, por este motivo, é caracterizada por um melhoramento nos sintomas clínicos.

Os métodos para quantificar a extensão da lesão neurológica e determinar se o distúrbio do SNC foi tratado são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Esses métodos incluem mas não estão limitados a métodos histológicos, ensaios de marcadores moleculares e análise funcional/comportamental. Por exemplo, a integração funcional melhorada das células de dador e/ou função e reparação melhoradas do tecido neuronal circundante podem ser ensaiadas através da avaliação do restabelecimento de diversas funções, incluindo cognitiva, sensorial, motora e endócrina. Os testes motores incluem os que quantificam o movimento rotacional para fora do lado degenerativo do cérebro e os que ensaiam para equilíbrio, coordenação, lentidão de movimento, rigidez e tremores. Os testes cognitivos incluem testes de memória e aprendizagem espacial. Os ensaios específicos utilizados para determinar o tratamento de uma doença neurológica variarão, dependendo do distúrbio.

As actividades biológicas desejadas benéficas para a regulação do desenvolvimento de célula terapêutica transportada incluem, por exemplo, a potenciação da sobrevivência e/ou proliferação das células terapêuticas transportadas; melhoramento na capacidade da célula terapêutica transportada 41 estabelecer ligação sináptica com os neurónios hospedeiros; e/ou instrução da célula terapêutica transportada para se comprometer com uma linhagem neural específica. Os métodos para ensaiar esses eventos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um melhoramento na sobrevivência das células terapêuticas transportadas, após a administração do agente regulador, pode ser ensaiado utilizando diversas tomografias não invasivas, tais como tomografia axial computorizada (tomografia CAT ou tomografia CT), tomografias de ressonância magnética nuclear ou imagiologia de ressonância magnética (RMN ou MRS) ou tomografia de emissão de positrões (PET). Alternativamente, a sobrevivência da célula terapêutica transportada pode ser ensaiada post mortem, por exame microscópico da região de transplantação da célula terapêutica transportada. A região das células terapêuticas transportadas pode ser identificada, por exemplo, através do ensaio para marcadores moleculares específicos das células terapêuticas transportadas ou, alternativamente, por incorporação anterior de corantes de rastreio. Esses corantes incluem, por exemplo, microsferas marcadas com rodamina ou fluoresceína, azul rápido ou marcadores histoquímicos retroviralmente introduzidos. A quantidade eficaz irá depender de muitos factores incluindo, por exemplo, o distúrbio do SNC a ser tratado, o tipo de célula transplantada de dador para o mamífero e a resposta do indivíduo submetido a tratamento. Reconhece-se, ainda que a quantidade terapeuticamente eficaz irá depender do tipo de regulação do desenvolvimento da célula terapêutica transportada que é desejada (i. e., potenciação da sobrevivência e/ou proliferação da célula terapêutica transportada; melhoramento da capacidade de a célula terapêutica transportada estabelecer ligação sináptica com os neurónios hospedeiros; regulação dos 42 sinais de desenvolvimento libertados pelas células terapêuticas transportadas; ou função e reparação melhoradas do tecido neural circundante). Os métodos para determinar a eficácia e dosagem são conhecidos pelos especialistas na técnica.

Por exemplo, na doença de Parkinson, os neurónios que degeneram são os neurónios dopaminérgicos da substância negra. As estratégias de substituição celular para doentes com doença de Parkinson avançada são conhecidas e incluem, por exemplo, enxertos intra-estriários de neurónios dopaminérgicos da substância negra de embriões humanos de 6 a 9 semanas de idade (Olanow et ai. (1996) Trends Neurosci. 19: 102-109 e Lindvall et al. (1999) Mov. Disord. 14:201-205). A distribuição de agentes reguladores farmacologicamente activos em regiões do cérebro afectadas pela doença de Parkinson (i. e., mesencéfalo e substância negra) é conhecida na técnica, contudo não em combinação com a distribuição intranasal de células terapêuticas, de tal modo que a barreira hematoencefálica seja contornada.

Como aqui utilizado, uma "quantidade eficaz" de um agente regulador, em combinação com células terapêuticas e/ou composições farmacêuticas transportadas compreendendo células terapêuticas da presente invenção, para o tratamento da doença de Parkinson, utilizando o método de administração da presente invenção, será suficiente para reduzir ou diminuir os sintomas clínicos da doença de Parkinson. Como tal, uma quantidade eficaz do agente regulador (i. e., factor de crescimento), administrada pelos métodos da presente invenção, irá aumentar as estratégias de substituição celular realizadas sob a presente invenção, para o tratamento da doença de Parkinson. Consequentemente, os métodos da invenção melhoram a sobrevivência e/ou melhoram o 43 estado clínico dos animais tratados, em comparação com animais tratados apenas com a estratégia de substituição celular. 0 melhoramento no estado clínico da doença de Parkinson inclui, por exemplo, o melhoramento na eficácia de enxerto mesencefálico ventral em termos de diminuição rotacional induzida por apomorfina, um aumento na densidade da reinervação estriária e um melhoramento na sobrevivência neuronal (Tornqvist et al. (2000) Exp. Neurol. 164: 130-138). A doença de Huntington é caracterizada por neurodegeneração progressiva, particularmente no estriado e córtex que induz graves deficiências nas funções motora e cognitiva. As actuais terapias de substituição celular substituem as ligações de inibidor do estriado com outras estruturas, tal como o globus pallidus, através da implantação de células precursoras estriárias. A distribuição de agentes reguladores farmacologicamente activos, em regiões do cérebro que são afectadas pela doença de Huntington (i. e., caudado-putâmen, tálamo, diencéfalo, cerebelo e córtex frontal) é conhecida na técnica, embora nunca com respeito a células terapêuticas e/ou composições farmacêuticas compreendendo células terapêuticas da presente invenção, em que a barreira hematoencefálica é contornada.

Como aqui utilizado, uma "quantidade eficaz" de um agente regulador para o tratamento da doença de Huntington, utilizando o método de administração da presente invenção, será suficiente para reduzir ou diminuir os sintomas clínicos da doença de Huntington. Deste modo, uma quantidade eficaz do agente regulador (i. e., factor de crescimento), irá aumentar as estratégias de substituição celular, realizadas sob a presente invenção, para o tratamento da doença de Huntington. Como tal, 44 os métodos descritos acima melhoram a sobrevivência e/ou melhoram o estado clinico dos animais tratados, em comparação com animais tratados apenas com a estratégia de substituição celular. 0 melhoramento no estado clinico inclui, por exemplo, a desinibição da produção palidal, hiperactividade locomotora reduzida, recuperação de comportamento motor e cognitivo complexo e restituição de sistemas de aprendizagem de novos hábitos no estriado lesionado. Ver, por exemplo, Bjorklund et al. (1994) Transplantação Neural Funcional (Raven, N.Y.), p. 157-195; Dunnett et ai. (1995) Behav. Brain Res. 66:133-142; Kendall et al. (1998) Nat. Med. 4:727-729; Palfi et al. (1998)

Nat. Med. 4:963-966; Brasted et al. (1999) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 96:10524-10529; e Wictorin et al. (1992) Prog.

Neurobiol. 38:611-639; todos estes são aqui incorporados por referência. A administração de agentes reguladores pelos métodos da presente invenção será suficiente para melhorar o resultado clinico da terapia de substituição celular. Esses ensaios podem ser facilmente utilizados por um especialista na técnica para determinar a gama de dosagem e/ou agente regulador apropriado de escolha, para o tratamento eficaz da doença de Huntington. A lesão isquémica ao SNC (e resultante perda e morte celular) pode resultar de, por exemplo, paragem cardíaca ou oclusão da artéria coronária, ou oclusão da artéria cerebral ou AVC. Os circuitos neurais do SNC lesionados após um evento isquémico foram reconstruídos utilizando diversas estratégias de substituição celular. Por exemplo, para eventos de isquemia focal, foi realizada a implantação de estriado embrionário no estriado lesionado (Hodges et al. (1994) Transplantação Neural

Funcional (Raven, N.I.), p. 347-386) e a implantação de neurónios derivados de uma linha celular de teratocarcinoma humana (Borlongan et al. (1998) Exp. Neurol. 149:310-321 e 45

Borlongan et al. (1998) Neuroreport 9:3703-3709). Ver também, por exemplo, Hodges et al. (1996) Neurosci. 72 : 959-988, Sorensen et al. (1996) Exp. Neurol. 138:227-235, e Sinden et al. (1997) Neurosci. 81:599-608.

Como aqui utilizado, uma "quantidade eficaz" de um agente regulador para o tratamento de lesão isquémica será suficiente reduzir ou diminuir os sintomas clínicos do evento isquémico. Como tal, uma quantidade eficaz do agente regulador irá aumentar as células terapêuticas de acordo com a presente invenção, para o tratamento de uma lesão isquémica. O melhoramento no estado clínico inclui, por exemplo, uma redução no tamanho do enfarte, edema e/ou défices neurológicos (i. e., recuperação melhorada da função motora, sensorial, vestibulomotora e/ou somatossensorial) . Os melhoramentos abrangem ainda uma redução em défices neurais e, por este motivo, recuperação melhorada da função motora, sensorial, vestibulomotora e/ou somatossensorial.

Os métodos para determinar se um evento isquémico foi tratado, particularmente com respeito a redução de lesão isquémica, incluindo tamanho de enfarte, edema e desenvolvimento de défices neurais, são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, após lesão isquémica, há um aumento significativo na densidade de sítios de ligação de ómega 3 (benzodiazepina de tipo periférico) (Benazodes et al. (1990) Brain Res. 522:275-289) . Os métodos para detectar sítios de ómega 3 são conhecidos e podem ser utilizados para determinar a extensão da lesão isquémica. Ver, por exemplo, Gotti et al. (1990) Brain Res. 522:290-307 e referências aí citadas. Alternativamente, a Proteína 43 Associada ao Crescimento (GAP-43) pode ser utilizada com oum marcador para crescimento axonal novo após um evento isquémico. Ver, por exemplo, Stroemer 46 et al. (1995) Stroke 26:2135-2144 e Vaudano et al. (1995) J. Neurosci 15:3594-3611. O efeito terapêutico também pode ser medido por capacidades motoras melhoradas, função cognitiva, percepção sensorial, discurso e/ou uma diminuição na propensão para ataques, no mamífero submetido a tratamento. Esses testes funcionais/comportamentais, utilizados para avaliar a função sensório-motora e reflexa, são descritos, por exemplo, em Bederson et al. (1986) Stroke 17:472-476, OeRyck et al. (1992)

Brain Res. 573:44-60, Markgraf et al. (1992) Brain Res. 575:238-246, Alexis et al. (1995) Stroke 26:2338-2346. O melhoramento da sobrevivência neuronal também pode ser medido utilizando a Escala de AVC Escandinava (SSS) ou o índice de

Barthel. Esses ensaios podem ser facilmente utilizados por um especialista na técnica, para determinar a gama de dosagem e/ou agente regulador apropriado de escolha, para o tratamento eficaz de um evento isquémico.

Para efeitos de regulação do desenvolvimento de uma ou mais células terapêuticas da presente invenção, após transporte intranasal para o SNC, com contorno da barreira hematoencefálica num mamífero, a quantidade terapeuticamente eficaz ou dose de um agente regulador pode compreender cerca de 0,002 mg/kg a cerca de 2,0 mg/kg de peso corporal ou desde cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,6 mg/kg de peso corporal. Alternativamente, o agente regulador pode ser administrado a 0,0004, 0,001, 0,005, 0,007, 0, 009, 0, 01, 0, 04, 0, 06, 0, 08, 0, 1, 0,2, 0, 4, 0,6, 0, 8, 1, 0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 ou 2,0 mg/kg de peso corporal. É ainda reconhecido que uma gama de dose inferior de determinados agentes reguladores (i. e., ADNF) pode ser preferida. Nestas formas de realização, o agente regulador pode ser administrado desde cerca de 0,1 ng/kg a cerca de 20 ng/kg. Alternativamente, o agente regulador pode ser administrado a 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 1, 2, 4, 8, 12, 15, 18 e 19 ng/kg de peso corporal.

Agentes Antibióticos

Em diversas formas de realização, a presente invenção pode ainda compreender uma quantidade eficaz de, pelo menos, um antibiótico ou, alternativamente, pode ser utilizado, pelo menos, um pré-tratamento de antibiótico(s), administrado antes da composição farmacêutica no terço superior da cavidade nasal, ou qualquer sua combinação, para proteger o doente submetido a terapia celular terapêutica. Além disso, o(s) antibiótico (s) pode(m) ser distribuído(s) como um pré-tratamento, co-tratamento e/ou pós-tratamento sistemicamente e/ou por aplicação no terço superior da cavidade nasal. A utilidade desse elemento antibiótico dentro da presente invenção é reduzir o risco de que as bactérias encontradas na cavidade nasal possam entrar nos tecidos nasais no terço superior da cavidade nasal durante a aplicação da(s) célula (s) terapêutica (s) e/ou composição farmacêutica, atravessem a barreira hematoencefálica e infectem outros tecidos no SNC. Os tecidos particulares de interesse incluem mas não estão limitados ao cérebro, meninges, sangue, medula espinal e outros tecidos periféricos. É preferido, pré-tratar e/ou simultaneamente tratar o doente com antibiótico(s), quando o agente(s) de melhoramento de distribuição, e. g., hialuronidase, é (são) aplicado(s) no terço superior da cavidade nasal.

Os antibióticos exemplificativos para utilização na presente invenção compreendem mupirocina, defensina, gentamicina, geneticina, cefminoxima, penicilina, 48 estreptomicina, xilitol ou outro antibiótico, isoladamente ou em combinação, para auxiliar na protecção do doente que está a receber a(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica da presente invenção. A utilização desses antibióticos nos tratamentos nasais é largamente referida na literatura, como será facilmente reconhecido pelo especialista na técnica, contudo nenhum desses tratamentos é referido em conjunto com a aplicação intranasal de células terapêuticas e/ou composições farmacêuticas compreendendo células terapêuticas no terço superior da cavidade nasal, pelo que a barreira hematoencefálica é contornada.

Agentes Imunossupressores

Formas de realização alternativas da presente invenção podem ainda compreender uma quantidade eficaz de, pelo menos, um agente imunossupressor para melhorar a viabilidade da célula(s) terapêutica(s) , através de protecção a partir da resposta inflamatória e/ou activação as células imunocompetentes hospedeiras. 0(s) agente(s) imunossupressor(es) pode(m) ser distribuído(s) como um pré-tratamento, simultaneamente com a(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica e/ou pós-tratamento da(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica. Essa terapia imunossupressora, em combinação com a(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica, aplicada(s) no terço superior da cavidade nasal, melhorará a sobrevivência dessas células.

Quando as células imunocompetentes hospedeiras do SNC, mucosa nasal e da via neural entre a mucosa nasal e o SNC detectam as células terapêuticas aplicadas da presente invenção, 49 pode resultar a resposta inflamatória e/ou activação das células imunocompetentes hospedeiras. Esta série de eventos diminuirá a sobrevivência da(s) célula(s) terapêutica(s). Por conseguinte, o(s) agente(s) de imunossupressão pode(m) ser empregue(s), antes, durante e/ou após a aplicação de célula(s) terapêutica(s) no terço superior da cavidade nasal, para desempenhar(em) um papel crucial na sobrevivência e viabilidade das células terapêuticas. 0(s) agente(s) de imunossupressão pode(m) ser aplicado(s) intranasalmente no terço superior da cavidade nasal e/ou sistemicamente. Os agentes imunossupressores convencionais e bem conhecidos que podem ser utilizados isoladamente, ou em combinação, na presente invenção, compreendem ciclosporina A, tacrolimus, prednisolona, azatioprina, metilprednisolona, micofenilato de mofetilo e sirolimus. Outros agentes imunossupressores compreendem a aplicação de células geneticamente manipuladas expressando o ligando Fas.

Composição Farmacêutica

Além da quantidade eficaz de, pelo menos, uma célula terapêutica administrada no terço superior da cavidade nasal do mamífero, uma composição farmacêutica pode ser aplicada ou administrada no terço superior da cavidade nasal. Essa composição farmacêutica pode compreender, além da quantidade eficaz de, pelo menos, uma célula terapêutica, por exemplo, a composição pode compreender, pelo menos, um agente regulador como descrito supra, pelo menos, um agente de melhoramento de distribuição como descrito supra, pelo menos, um antibiótico e/ou, pelo menos, um agente imunossupressor, todos como descrito supra e como será ainda discutido infra. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser combinada com pré-, 50 co- e pós-tratamento com qualquer combinação de aplicação sistémica e/ou no terço superior da cavidade nasal do, pelo menos, um agente regulador, agente de melhoramento de distribuição, antibiótico e/ou agente imunossupressor.

Entre as alternativas que podem ser combinadas com as células terapêuticas na composição farmacêutica, estão agentes de melhoramento de distribuição, tal como agentes lipofilicos que podem melhorar a absorção do agente regulador através da mucosa ou epitélio da cavidade nasal, para alcançar células lesionadas e/ou degenerescentes no SNC. 0 agente regulador pode ser misturado com um agente lipofílico ou adjuvante, isoladamente ou em combinação com um transportador, ou pode ser combinado com um ou vários tipos de substâncias micelares ou lipossomais. Entre as substâncias lipofilicas preferidas estão lipossomas catiónicos, incluindo um ou mais de fosfatidilcolina, lipofectina, DOTAP ou semelhantes.

Um agente de melhoramento de distribuição preferido, compreende hialuronidase que se observou aumentar muito significativamente a distribuição de células terapêuticas no SNC, quando aplicada no terço superior da cavidade nasal, como um pré-tratamento na célula terapêutica da presente invenção, ou como um componente da composição farmacêutica compreendendo células terapêuticas da presente invenção. Os agentes de melhoramento de distribuição alternativos compreendem neuregulina e actividade de indução de migração. Estes agentes de melhoramento de distribuição, e. g., hialuronidase, agentes lipofilicos, neuregulina e actividade de indução de migração, podem ser utilizados individualmente, ou em qualquer combinação, para melhorar a distribuição das células terapêuticas no SNC de acordo com a presente invenção. Por conseguinte, pelo menos, um 51 agente de melhoramento de distribuição pode ser utilizado como um pré-tratamento para o transporte das células terapêuticas e/ou composição farmacêutica e/ou como um componente da composição farmacêutica compreendendo células terapêuticas. A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender, pelo menos, um antibiótico ou, alternativamente, pode ser utilizado um pré-tratamento de antibiótico antes da aplicação da composição farmacêutica no terço superior da cavidade nasal, ou qualquer sua combinação, para proteger o doente submetido a terapia celular terapêutica. Além disso, o antibiótico pode ser distribuído como um pré-tratamento, co-tratamento e/ou pós-tratamento, dado intranasalmente e/ou sistemicamente. A utilidade desse elemento antibiótico dentro da presente invenção é reduzir o risco de que as bactérias encontradas na cavidade nasal possam entrar nos tecidos nasais no terço superior da cavidade nasal durante a aplicação da(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica, atravessem a barreira hematoencefálica e infectem outros tecidos no SNC. Os tecidos particulares de interesse incluem mas não estão limitados ao cérebro, meninges, sangue, medula espinal e outros tecidos periféricos. É preferido, pré-tratar e/ou simultaneamente tratar o doente com antibiótico, quando o agente de melhoramento de distribuição, tal como hialuronidase, é aplicado, isoladamente ou numa composição farmacêutica, no terço superior da cavidade nasal.

Os antibióticos exemplificativos para utilização na presente invenção compreendem mupirocina, defensina, gentamicina, geneticina, cefminoxima, penicilina, estreptomicina, xilitol ou outro antibiótico, isoladamente ou em combinação, para auxiliar na protecção do doente que está a 52 receber a(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica da presente invenção. A utilização desses antibióticos em tratamentos nasais é largamente referida na literatura, como será facilmente reconhecido pelo especialista na técnica. A presente invenção pode ainda compreender, pelo menos, um agente imunossupressor, distribuído como um pré-tratamento, simultaneamente com a(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica e/ou pós-tratamento da(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica. Essa terapia imunossupressora, em combinação com a(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica, aplicada(s) no terço superior da cavidade nasal, melhorará a sobrevivência dessas células. Quando as células imunocompetentes hospedeiras do SNC, mucosa nasal e a via neural entre a mucosa nasal e o SNC detectam as células terapêuticas aplicadas, da presente invenção, pode resultar resposta inflamatória e/ou activação das células imunocompetentes hospedeiras. Esta série de eventos diminuirá a sobrevivência da célula(s) terapêutica(s). Por conseguinte, o(s) agente(s) de imunossupressão pode(m) ser empregue(s), antes, durante e/ou após a aplicação de célula (s) terapêutica(s) no terço superior da cavidade nasal, para desempenhar(em) um papel crucial na sobrevivência e viabilidade das células terapêuticas. 0(s) agente(s) de imunossupressão pode(m) ser aplicado(s) intranasalmente no terço superior da cavidade nasal e/ou sistemicamente. Os agentes imunossupressores convencionais e bem conhecidos que podem ser utilizados isoladamente, ou em combinação, na presente invenção compreendem ciclosporina A, tacrolímus, prednisolona, azatioprina, metilprednisolona, micofenilato mofetilo e sirolímus. Outros 53 agentes imunossupressores compreendem a aplicaçao de células geneticamente manipuladas expressando o ligando Fas.

Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender qualquer aditivo, veiculo e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável que possa promover a transferência deste agente em ou através de um tecido inervado pelo nervo trigeminal ou nervo olfactivo ou ao longo ou através de uma via neural.

Por "veículo farmaceuticamente aceitável" significa-se um transportador que é utilizado de modo convencional na técnica, para facilitar o armazenamento, administração e/ou a actividade biológica de célula(s) terapêutica (s), agente(s) regulador(s), agente(s) de melhoramento de distribuição, antibiótico (s) e/ou agente imunossupressor dentro de uma composição farmacêutica da presente invenção. Um veiculo também pode reduzir quaisquer efeitos secundários indesejáveis dos componentes dessa composição farmacêutica. Um veiculo adequado deve ser estável, i. e., incapaz de reagir com outros ingredientes na formulação. Não deve produzir efeito adverso, local ou sistémico, significativo em receptores, às dosagens e concentrações empregues para tratamento. Esses veículos são, em geral, conhecidos na técnica.

Os transportadores adequados para as diversas formas de realização da presente invenção incluem os utilizados de modo convencional para macromoléculas de grandes dimensões estáveis, tais como albumina, gelatina, colagénio, polissacárido, monossacáridos, polivinilpirrolidona, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, aminoácidos poliméricos, óleos fixos, oleato de etilo, lipossomas, glucose, sacarose, lactose, manose, dextrose, 54 dextrano, celulose, manitol, sorbitol, polietilenoglicol (PEG) e semelhantes. Uma composição farmacêutica adicional pode compreender microparticulas, compostos orgânicos e inorgânicos, servindo como um material de aderência para a(s) célula(s) e conglomerados celulares que podem ser transportados para o SNC em diversas formas de realização da presente invenção diminuindo, deste modo, a perda de células transportadas da mucosa nasal para o SNC. Estes compostos podem incluir vários tipos de moléculas adesivas, géis (servindo como um material de encapsulação/inclusão para as células), componentes de matriz ou matrizes extracelulares e partículas orgânicas e/ou inorgânicas, tais como partículas de fibrina ou fibronectina carbono ou argila e dextrano e sua composição. Água, solução salina, dextrose aquosa e glicóis são transportadores líquidos preferidos, particularmente (quando isotónicas) para soluções. 0 veículo pode ser seleccionado de diversos óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, celulose, talco, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, cré, sílica gel, estearato de magnésio, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propilenoglicol, água, etanol e semelhantes. As composições podem ser submetidas a expedientes farmacêuticos convencionais, tal como esterilização, e podem conter aditivos farmacêuticos convencionais, tais como conservantes, agentes estabilizadores, agentes molhantes ou emulsionantes, sais para ajustar a pressão osmótica, tampões e semelhantes. Quando o veículo for um líquido, prefere-se que o transportador seja hipotónico ou 55 isotónico com fluidos corporais e tenha um pH dentro da gama de 4,5-8,5.

Outros componentes aceitáveis na composição farmacêutica compreendem, sem limitação, agentes de modificação de isotonicidade, tais como água, solução salina, e tampões incluindo fosfato, citrato, succinato, ácido acético e outros ácidos orgânicos ou seus sais. Tipicamente, o veiculo farmaceuticamente aceitável também inclui um ou mais estabilizantes, agentes de redução, antioxidantes e/ou agentes quelantes antioxidantes. A utilização de tampões, estabilizantes, agentes de redução, antioxidantes e agentes quelantes na preparação de composições à base de proteína, particularmente composições farmacêuticas, é bem conhecida na técnica. Ver, Wang et al. (1980) J. Parent. Drug Assn. 34 (6) : 452462; Wang et al. (1988) J. Parent. Sei. Tech. 42:S4-S26 (Suplemento); Lachman et al. (1968) Drug and Cosmetic Industry 102 (1) :36-38, 40 e 146-148; Akers (1988) J. Parent. Sei. Tech. 36 (5) : 222-228; e Methods in Enzymology, Vol. XXV, ed. Colowick e Kaplan, "Redução de Ligações Dissulfureto em Proteínas com Ditiotreitol" por Konigsberg, p. 185-188.

Diversas formas de realização da composição farmacêutica, da presente invenção, compreendem tampões adequados, tais como acetato, adipato, benzoato, citrato, lactato, maleato, fosfato, tartarato, borato, tri(hidroximetilaminometano), succinato, glicina, histidina, os sais de diversos aminoácidos, ou semelhantes, ou as suas combinações. Ver Wang (1980) supra, na página 455. Os sais e isotonificantes adequados incluem cloreto de sódio, dextrose, manitol, sacarose, trealose ou semelhantes. 56

Diversas formas de realização da composição farmacêutica da presente invenção podem ainda compreender agentes de redução adequados que mantêm a redução de cisteinas reduzidas, incluem ditiotreitol (DTT, também conhecido por reagente de Cleland) ou ditioeritritol a 0,01% a 0,1% p/p; acetilcisteina ou cisterna a 0,1% a 0,5% (pH 2-3); e tioglicerol a 0,1% a 0,5% (pH 3,5 a 7,0) e glutationo. Antioxidantes adequados incluem bissulfito de sódio, sulfito de sódio, metabissulfito de sódio, tiossulfato de sódio, formaldeido sulfoxilato de sódio e ácido ascórbico. Agentes quelantes adequados que queletam oligometais, para prevenir a oxidação, catalisada por oligometal, de cisteinas reduzidas, incluem citrato, tartarato, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), nos seus sais dissódico, tetrassódico e dissódico de cálcio e ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA). Ver, e. g., Wang (1980) supra, nas páginas 457-458 e 460-461 e Akers (1988) supra, nas páginas 224-227.

Diversas formas de realização da composição farmacêutica da presente invenção podem ainda compreender um ou mais conservantes, tais como fenol, cresol, ácido para-aminobenzóico, BDSA, sorbitarato, cloro-hexidina, cloreto de benzalcónio ou semelhantes. Estabilizantes adequados incluem hidratos de carbono, tais como trealose ou glicerol. A composição pode incluir um estabilizante, tais como um ou mais de celulose microcristalina, estearato de magnésio, manitol ou sacarose para estabilizar, por exemplo, a forma física da composição; e um ou mais de glicina, arginina, colagénio hidrolisado, ou inibidores de protease para estabilizar, por exemplo, a estrutura química da composição. 57

Diversas formas de realização da composição farmacêutica da presente invenção também podem compreender agentes de suspensão adequados, tais como carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, ácido hialurónico, alginato, sulfato de condroitina, dextrano, maltodextrina, sulfato de dextrano ou semelhantes. A composição pode incluir um emulsionante, tais como polissorbato 20, polissorbato 80, plurónico, trioleina, óleo soja, lecitinas, esqualeno e esqualanos, sorbitano treioleato ou semelhantes. A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender, pelo menos, um antimicrobiano, tais como álcool feniletílico, fenol, cresol, cloreto de benzalcónio, fenoxietanol, cloro-hexidina, timerosal ou semelhantes.

Espessantes adequados incluem polissacáridos naturais, tais como mananas, arabinanas, alginato, ácido hialurónico, dextrose ou semelhantes; e os sintéticos, como os hidrogéis de PEG de baixo peso molecular; e os supramencionados agentes de suspensão podem ser incluídos na composição farmacêutica da presente invenção. A composição farmacêutica inventiva pode ainda compreender e incluir um adjuvante, tais como brometo de cetiltrimetilamónio, BDSA, colato, desoxicolato, polissorbato 20 e 80, ácido fusídico ou semelhantes. Açúcares adequados incluem glicerol, treose, glucose, galactose, manitol e sorbitol.

Diversas formas de realização da composição farmacêutica da presente invenção podem ainda compreender um ou mais de um aditivo de melhoramento de solubilidade, de um modo preferido, uma ciclodextrina; um aditivo hidrofílico, de um modo preferido, um monossacárido ou oligossacárido; um aditivo de promoção da 58 absorção, de um modo preferido, um colato, um desoxicolato, um ácido fusidico ou um quitosano; um surfactante catiónico, de um modo preferido, um brometo de cetiltrimetilamónio; um aditivo de melhoramento de viscosidade, de um modo preferido, para promover o tempo de permanência da composição no local de administração, de um modo preferido, uma carboximetilcelulose, uma maltodextrina, um ácido alginico, um ácido hialurónico, ou um sulfato de condroitina; ou uma matriz de libertação prolongada, de um modo preferido, um polianidrido, um poliortoéster, um hidrogel, um sistema particulado depo de libertação lenta, de um modo preferido, uma polilactida coglicolida (PLG), uma espuma depo, uma microsfera de amido, ou um sistema bucal derivado de celulose; um transportador à base de lípido, de um modo preferido, uma emulsão, um lipossoma, um niossoma ou uma micela. A composição pode incluir um aditivo desestabilizante de bicamada, de um modo preferido, uma fosfatidiletanolamina; um aditivo fusogénico, de um modo preferido, um hemissuccinato de colesterol. A composição farmacêutica pode incluir, adicionalmente, um composto solubilizante para melhorar a estabilidade do agente regulador ou seu variante biologicamente activo. Para IGF-I, um agente solubilizante preferido, inclui um grupo guanidinio que é capaz de melhorar a sua solubilidade. Exemplos desses compostos solubilizantes incluem o aminoácido arginina, assim como análogos de aminoácidos de arginina que retêm a capacidade de melhorar a solubilidade de IGF-I ou seu variante biologicamente activo, a pH 5,5 ou maior. Esses análogos incluem, sem limitação, dipéptidos e tripéptidos que contêm arginina. Por "melhorando a solubilidade" significa-se o aumento da quantidade de factor de crescimento, ou seu variante biologicamente activo que pode ser dissolvido em solução, a pH 5,5 ou maior, na 59 presença de um composto contendo guanidínio, comparativamente com a quantidade desta proteína que pode ser dissolvida a pH 5,5 ou maior, numa solução com os mesmos componentes mas desprovida do composto contendo guanidínio. A capacidade de um composto contendo guanidínio para melhorar a solubilidade do factor de crescimento, ou seu variante biologicamente activo, pode ser determinada utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Em geral, sabe-se proporcionar a concentração do composto solubilizante presente na composição na gama de cerca de 10 mM a cerca de 1 M e, por exemplo, no caso do composto arginina, numa gama de concentração de cerca de 20 mM a cerca de 200 mM.

Estas listas de veículo e aditivos não estão, de forma alguma, completas e um especialista na técnica pode escolher excipientes da lista GRAS (considerada, em geral, como segura) de substâncias químicas permitidas nas preparações farmacêuticas e as que são correntemente permitidas em formulações tópicas e parentéricas.

Além disso, o método para formular uma composição farmacêutica é, em geral, conhecido na técnica. Uma discussão exaustiva da formulação e selecção de veículos, estabilizantes e isomolitos farmaceuticamente aceitáveis pode consultar-se no Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a sup.th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pa., 1990), aqui incorporado por referência.

Para efeitos desta invenção, a composição farmacêutica, como aqui descrita, pode ser formulada numa dosagem unitária e numa forma, tais como uma solução, suspensão ou emulsão, para aplicação no terço superior da cavidade nasal. A composição farmacêutica a ser aplicada e administrada no terço superior da 60 cavidade nasal, no tecido inervado pelos neurónios olfactivos, pode ser na forma de um pó, um grânulo, uma solução, um spray (e. g., um aerossol), um pomada, uma infusão, uma gota ou uma composição de libertação prolongada, tal como um disco polimérico. Outras formas de composições para administração incluem uma suspensão de um particulado, tais como uma emulsão, um lipossoma, um inserção que liberta a composição farmacêutica lentamente e semelhantes. As formas em pó ou granulares da composição farmacêutica podem ser combinadas com uma solução e com um agente regulador diluente, dispersante ou tensioactivo. A composição também pode ser na forma de pó liofilizado que pode ser convertido em solução, suspensão ou emulsão, antes da administração. A composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um agente regulador é, de um modo preferido, esterilizada por filtração de membrana e é armazenada em recipientes de dose unitária ou multidose, tais como frasquinhos de vidro ou ampolas seladas.

Administração de Células Terapêuticas e/ou Compostos Farmacêuticos A administração de células terapêuticas de acordo com a invenção pode incluir a aplicação de células terapêuticas isoladamente, ou formulando as células terapêuticas com um ou mais dos compostos descritos supra, como composições farmacêuticas e administrando as composições farmacêuticas a um indivíduo animal ou hospedeiro, incluindo um doente humano, intranasalmente no terço superior da cavidade nasal. As células terapêuticas e outros componentes da sua composição farmacêutica, e. g., agente de melhoramento de distribuição, agente regulador, antibiótico e/ou agente imunossupressor, podem 61 ser administrados a uma de uma variedade de doses suficientes para proporcionar uma quantidade eficaz no ponto de acção desejado da célula terapêutica e/ou componente de composição farmacêutica. As doses para humanos e outros mamíferos podem variar desde cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, de um modo preferido, desde cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, de um modo preferido, desde cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 1-10 mg/kg. Como notodo, agente(s) de melhoramento de distribuição, agente(s) regulador(s), antibiótico(s) e/ou agente(s) imunossupressor(es) pode(m) ser distribuído(s) como pré-tratamento, co-tratamento e/ou pós-tratamento com a(s) célula(s) terapêutica(s) e/ou composição farmacêutica, isoladamente ou como um componente da composição farmacêutica e, quando não compreendido(s) dentro da composição farmacêutica, pode(m) ser distribuído(s) sistemicamente ou no terço superior da cavidade nasal.

Para aplicação no terço superior da cavidade nasal como suspensões, aerossóis, sprays ou gotas, a(s) célula(s) terapêutica (s) e/ou composição ou composições farmacêuticas pode(m) ser preparada(s) de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica da formulação farmacêutica. As composições podem ser preparadas como suspensões de células em soluções que podem compreender sais, tal como solução salina, componentes, tais como tampões fosfato, succinato ou citrato, para manter o pH, agentes osmorreguladores e osmóticos, tal como taurina e conservantes adequados, promotores de absorção para melhorar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes conhecidos na técnica. Os meios de aplicação de uma composição farmacêutica intranasalmente no terço superior da cavidade nasal podem ser numa variedade de formas, tais como um pó, spray, gel ou gotas nasais. 62

Outras formas de composições para administração de células terapêuticas e/ou composições farmacêuticas ou seus elementos incluem uma suspensão de um particulado, tais como uma emulsão, um lipossoma, ou numa forma de libertação prolongada, para prolongar a presença do agente farmaceuticamente activo num indivíduo. As formas em pó ou granulares da composição farmacêutica podem ser combinadas com uma solução e com um agente diluente, dispersante ou tensioactivo. Composições adicionais para administração incluem um bioadesivo para reter o agente no local de administração no terço superior da cavidade nasal, por exemplo um spray, tinta ou esfregaço, aplicado na mucosa. Um bioadesivo pode referir-se a polímeros hidrófilos, naturais ou sintéticos , que, segundo a designação hidrófila, podem ser solúveis em água ou dilatáveis e que são compatíveis com a composição farmacêutica. Esses adesivos funcionam para aderirem as formulações aos tecidos mucósicos do terço superior da cavidade nasal. Esses adesivos podem incluir mas não estão limitados a hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose, etilcelulose, carboximetilcelulose, dextrano, goma de guar, polivinilpirrolidona, pectinas, amidos, gelatina, caseína, polímeros de ácido acrílico, polímeros de ésteres de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico, polímeros vinílicos, copolímeros vinílicos, polímeros de álcoois vinílicos, alcoxipolímeros, polímeros de óxido de polietileno, poliéteres e as suas combinações. A composição também pode ser na forma de pó liofilizado que pode ser convertido em solução, suspensão ou emulsão, antes da administração. A composição farmacêutica é, de um modo preferido, esterilizada por filtração de membrana e é armazenada em recipientes de dose unitária ou multidose, tais como frasquinhos de vidro ou ampolas seladas. 63 A composição farmacêutica pode ser formulada numa forma de libertação prolongada, para prolongar a presença do agente activo no indivíduo tratado. Muitos métodos de preparação de uma formulação de libertação prolongada são conhecidos na técnica e são divulgados no Remington's Pharmaceutical Sciences. Em geral, as células terapêuticas, composição farmacêutica e/ou componentes da composição farmacêutica, i. e., agente de melhoramento de distribuição, agente regulador, antibiótico e/ou agente imunossupressor, podem ser aprisionados em matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos. As matrizes podem ser moldadas em filmes ou microcápsulas. As matrizes podem incluir mas não estão limitadas a poliésteres, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato, polilactidas, poliglicolato de polilactato, hidrogéis, acetato de etileno vinílico não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, géis de ácido hialurónico e suspensões de ácido algínico. As microcápsulas adequadas também podem incluir hidroximetilcelulose ou gelatina e poli-metacrilato de metilo. Também podem ser utilizadas microemulsões ou sistemas de distribuição de fármacos coloidais, tais como lipossomas e microsferas de albumina.

Sistemas de Distribuição

As células terapêuticas e/ou uma composição farmacêutica compreendendo células terapêuticas e/ou componentes da composição farmacêutica da presente invenção podem ser ainda dispensadas e aplicadas intranasalmente no terço superior da cavidade nasal, como um spray nasal de pó ou líquido, suspensão, gotas nasais, um gel, filme ou pomada, através de um tubo ou cateter, por seringa, por packtail, por pequena compressa (uma pequena almofada absorvente achatada), por tampão nasal ou por infusão submucosal. As células terapêuticas e/ou uma sua composição farmacêutica podem ser administradas no terço superior da cavidade nasal por meio de um dispositivo de distribuição. A distribuição de fármaco nasal pode ser efectuada utilizando dispositivos, incluindo mas não limitados a recipientes de dose unitária, sprays de bomba, conta-gotas, garrafas de compressão, sprays sem ar e isentos de conservantes, nebulizadores (dispositivos utilizados para alterar a medicação líquida numa forma particulada de aerossol), inaladores de dose calibrada e inaladores de dose calibrada pressurizados. Em alguns aspectos, uma quantidade de dosagem eficaz precisa está contida dentro de um emplastro bioadesivo que é colocado directamente dentro e no terço superior de uma cavidade nasal.

As células terapêuticas e/ou uma composição farmacêutica compreendendo células terapêuticas e/ou componentes da composição terapêutica da presente invenção podem ser convenientemente distribuídas no terço superior da cavidade nasal, na forma de um spray de aerossol, utilizando uma embalagem pressurizada ou um nebulizador e um propulsor adequado, incluindo mas não limitado a diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, hidrocarbonetos, ar comprimido, azoto ou dióxido de carbono. Um sistema de aerossol requer que o propulsor seja inerte para as células terapêuticas e/ou composição farmacêutica, como será facilmente reconhecido pelo especialista na técnica. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser controlada através do provimento de uma válvula para distribuir uma quantidade calibrada de um modo preciso. 65

Os meios para distribuir as células terapêuticas ou composição farmacêutica compreendendo as células terapêuticas e/ou componentes da composição farmacêutica da presente invenção, no terço superior da cavidade nasal, como um pó, podem ser numa forma, tal como microsferas distribuídas por um dispositivo insuflador nasal (um dispositivo para soprar um gás, pó ou vapor para dentro de uma cavidade do corpo) ou lata de aerossol pressurizada. 0 insuflador produz uma nuvem finamente dividida do pó ou microsfera, secos. 0 insuflador pode estar dotado de meios para garantir a administração de uma quantidade substancialmente calibrada da composição farmacêutica. 0 pó ou microsferas devem ser administrados numa forma seca, dispensável ao ar. 0 pó ou microsferas podem ser utilizados directamente com um insuflador que está dotado com uma garrafa ou recipiente para o pó ou microsferas. Alternativamente, o pó ou microsferas podem ser introduzidos numa cápsula, tais como uma cápsula de gelatina, ou outro dispositivo de dose única adaptado para administração nasal. 0 insuflador pode ter meios, tal como uma agulha, para abrir a cápsula ou outro dispositivo para proporcionar orifícios, através dos quais jactos da composição em pó podem ser distribuídos para o terço superior da cavidade nasal. Nesta forma de realização, as células terapêuticas podem ser desidratadas e/ou liofilizadas, com subsequente reidratação na mucosa nasal.

Doseamento Intermitente e Cíclico

Em diversas formas de realização da invenção, as células terapêuticas e/ou uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz das células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica, podem ser administradas como uma 66 dose única e uma vez ou, alternativamente, as células terapêuticas e/ou os componentes da composição farmacêutica podem ser administrados mais de uma vez e intermitentemente. Por "administração intermitente" significa-se administração de uma quantidade eficaz de células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica, seguida de um período de tempo de interrupção que é, depois, seguido de outra administração de uma quantidade eficaz e assim por diante. A administração da quantidade eficaz de células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica pode ser alcançada num modo contínuo como, por exemplo, com uma formulação de libertação prolongada, ou pode ser alcançada de acordo com um regime de dosagem diário desejado como, por exemplo, com uma, duas, três ou mais administrações por dia. Por "período de tempo de interrupção" significa-se uma interrupção da administração continua de libertação prolongada ou diária das células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica. 0 período de tempo de interrupção pode ser mais longo ou mais curto do que o período de administração contínua de libertação prolongada ou diária. Durante o período de tempo de interrupção, o nível das células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica no tecido relevante está substancialmente abaixo do nível máximo obtido durante o tratamento. A duração preferida do período de interrupção depende da concentração da dose eficaz e da forma das células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica utilizada. 0 período de interrupção pode ser, pelo menos, 2 dias, de um modo preferido, é, pelo menos, 4 dias, de um modo mais preferido, é, pelo menos, 1 semana e, em geral, não excede um período de 4 semanas. Quando é utilizada uma formulação de libertação prolongada, o período de interrupção deve ser alargado, para se ter em conta o maior tempo de permanência do agente regulador no local de ferimento. 67

Alternativamente, a frequência de administração da dose eficaz da formulação de libertação prolongada pode ser diminuída em conformidade. Um programa de administração intermitente de células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica pode continuar até se alcançar o efeito terapêutico desejado e, em última análise, o tratamento da doença ou distúrbio.

Ainda noutra forma de realização, a administração intermitente da(s) quantidade(s) eficaz(es) de células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica é cíclica. Por "cíclica" significa-se administração intermitente, acompanhada de intervalos na administração, com ciclos variando entre cerca de 1 mês a cerca de 2, 3, 4, 5 ou 6 meses. Por exemplo, o programa de administração poderá ser administração intermitente da dose eficaz de células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica, em que uma única dose de curto prazo é administrada uma vez por semana, durante 4 semanas, seguida de um intervalo na administração intermitente durante um período de 3 meses, seguido de administração intermitente por administração de uma única dose de curto prazo administrada uma vez por semana, durante 4 semanas, seguida de um intervalo na administração intermitente durante um período de 3 meses e assim por diante. Como outro exemplo, uma única dose de curto prazo pode ser administrada uma vez por semana, durante 2 semanas, seguida de um intervalo na administração intermitente durante um período de 1 mês, seguido de uma única dose de curto prazo administrada uma vez por semana, durante 2 semanas, seguida de um intervalo na administração intermitente durante um período de 1 mês e assim por diante. Um programa de administração intermitente cíclico de células terapêuticas e/ou dos componentes da composição farmacêutica a um indivíduo pode 68 continuar até se alcançar o efeito terapêutico desejado e, em última análise, o tratamento do distúrbio ou doença.

Para efeitos de regulação do desenvolvimento da célula terapêutica e, desse modo, a redução ou prevenção da manifestação clinica do distúrbio neurológico a ser tratado, a administração intranasal de uma ou mais doses terapeuticamente eficazes de, pelo menos, um agente regulador pode ocorrer no espaço de minutos, horas, dias ou até semanas da aplicação inicial das células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção. Por exemplo, a dose terapêutica inicial do, pelo menos, um agente regulador pode ser administrada no espaço de cerca de 2 a 4 horas, no espaço de cerca de 2 a 6 horas, no espaço de cerca de 8 horas, no espaço de cerca de 10 horas, cerca de 15 horas, cerca de 24 horas, no espaço de cerca de 36 horas, 48 horas, 72 horas ou cerca de 96 horas, ou superior, após aplicação das células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção. Após a dose inicial, uma ou mais doses adicionais do agente regulador podem ser administradas durante horas, dias ou semanas. Além disso, ao animal submetido a uma terapia de regeneração de substituição celular, de acordo com as formas de realização da presente invenção, agentes reguladores e/ou células terapêuticas e/ou composições farmacêuticas adicionais podem ser administrados intermitentemente ao longo do tempo de acordo com a estratégia de tratamento de um doente. Deste modo, por exemplo, a um animal submetido a uma terapia de substituição celular podem ser administradas uma ou mais doses terapeuticamente eficazes do(s) agente (s) regulador(s), células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da sua presente invenção antes, durante ou após a aplicação inicial. De um modo semelhante, o agente de melhoramento de distribuição, 69 agente(s) imunossupressor(es) e/ou agente(s) antibiótico(s) pode ser administrado antes, durante ou após a aplicação inicial das células terapêuticas e/ou composição ou composições farmacêuticas da presente invenção. Os cenários de administração intermitente e ciclica, agui proporcionados, são apenas exemplificativos e, em nenhuma instância, se pretende gue sejam limitativos. Os especialistas na técnica reconhecerão diversos cenários/frequências de administração para casos individuais. A presente invenção pode ser mais bem compreendida fazendo referência aos seguintes exemplos. Pretende-se que estes exemplos sejam representativos de formas de realização específicas da invenção e não devem ser vistos como limitando o âmbito da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Células Terapêuticas Contornando a Barreira Hematoencefálica Após Aplicação Intranasal no Terço Superior da Cavidade Nasal num Modelo de Rato da Doença de Parkinson A hipótese de que as células terapêuticas poderiam, de facto, contornar a barreira hematoencefálica foi testada pela requerente em roedores saudáveis (murganhos e ratos) e em ratos tratados com 6-OHDA, para criar um modelo da doença de Parkinson. Neste exemplo, células estaminais mesenquimatosas, i. e., células eucarióticas, foram administradas intranasalmente no terço superior da cavidade nasal de murganhos adultos saudáveis e a ratos lesionados unilateralmente com β-hidroxidopamina (6-OHDA) para modelar o SNC lesionado e/ou degenerescente de doentes com doença de Parkinson. 70

Adicionalmente, células de glioma foram intranasalmente administradas no terço superior da cavidade nasal de ratos jovens saudáveis. No espaço de uma (1) hora da administração/aplicação, ambos os tipos de células atingiram o bolbo olfactivo, córtex, hipocampo, estriado e o cerebelo dos animais saudáveis. No modelo de rato de 6-OHDA da doença de Parkinson, as células foram detectadas 4 horas após a administração. É provável que as células possam ter atingido o cérebro em ambos os casos em menos de uma hora. Depois de as células atravessarem a placa cribriforme, foram observadas duas rotas de migração: (1) migração para dentro do bolbo olfactivo e também para outras partes do cérebro, incluindo o córtex e estriado; e (2) entrada no fluido cerebrospinal, com movimento ao longo da superfície do córtex, seguido de entrada dentro do parênquima do cérebro.

Exemplo 2 - Efeito do Agente de Melhoramento de Distribuição no Transporte de Células Terapêuticas Após Aplicação Intranasal no Terço Superior da Cavidade Nasal

Foi avaliada a eficácia da distribuição células terapêuticas no cérebro, após aplicação células estaminais mesenquimatosas de rato CFDA ou corante de Hoechst no terço superior de murganhos C57 bl/6 de sete semanas de desse modo, a barreira hematoencefálica na aplicação e transporte das células terapêuticas.

Inicialmente, os animais (n = 5 em cada grupo) : 1) o terapêuticas intranasais; 2) intranasal de intranasal de (MSC), marcadas com da cavidade nasal idade contornando, administração e foram divididos em três grupos grupo A recebeu apenas células o grupo B recebeu o agente de 71 melhoramento de distribuição hialuronidase, intranasalmente, 30 minutos antes da aplicação intranasal das células; 3) o grupo C recebeu veiculo intranasalmente (24 1-11 PBS). Uma hora após a aplicação das células, os animais foram sacrificados sob anestesia, os crânios foram cogelados a -80 °C e seccionados mais tarde em cortes sagitais ou horizontais (201-Im) montados com meio contendo DAPI ou PI e analisados por microscopia fluorescente.

As células marcadas com corante de Hoechst surgiram em todas as camadas do bolbo olfactivo, estriado, córtex, na parede e vizinhança do ventrículo lateral e cerebelo dos animais no grupo A, as células terapêuticas distribuídas intranasalmente isoladamente. No bolbo olfactivo, as células estavam distribuídas ao longo de todas as camadas em animais do grupo A e B. A administração intranasal de hialuronidase (100 U/animal no grupo B) aumentou o número de MSC no cérebro, especialmente no bolbo olfactivo, quando comparado com o do grupo A. A distribuição de MSC em diferentes camadas de córtex nos grupos A e B sugere migração de células terapêuticas desde a superfície para dentro do parênquima. Numerosas células estavam localizadas no espaço subaracnóide, em estreita vizinhança com MSC que já tinham atingido a camada superior do córtex. Algumas destas células tinham processos sugerindo o progresso na sua diferenciação. Uma grande quantidade das MSC marcadas com CFDA, intranasalmente aplicadas, permaneceu na cavidade nasal superior (setas na Fig. 2 D) , 1 h após aplicação, indicando que a migração de células terapêuticas desde a mucosa nasal através da placa cribriforme para no cérebro poderia, possivelmente, continuar durante várias horas e talvez mesmo dias. 72

Foi observada uma migração por etapas de células desde a superfície do córtex para as camadas mais profundas, após uma determinada densidade de células ser atingida numa camada; agregados de células nas camadas mais profundas surgem apenas na vizinhança de filas de células, colocadas mais próximo da superfície do córtex.

Exemplo 3 - Migração Direccionada de Células Terapêuticas para Lesão O SNC Após Aplicação Intranasal no Terço Superior da Cavidade Nasal

Visto que os resultados obtidos e descritos acima no Exemplo 2 mostram que, além do córtex, bolbo olfactivo e cerebelo, as células terapêuticas intranasalmente aplicadas também surgiram na área do estriado, decidiu-se investigar se a neurodegeneração poderia direccionar a migração de células aplicadas no lado da lesão, utilizando um modelo com uma lesão unilateral com 6-OHDA em ratos adultos. A lesão estriária foi induzida em ratos adultos por injecção unilateral (hemisfério esquerdo) da neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA), para induzir um modelo de tipo Parkinson. As células foram aplicadas em dois grupos de animais (n = 5 em cada) : 1) sem ou 2) com tratamento de hialuronidase intranasal (200 U/animal), 30 minutos antes da administração intranasal das células, três dias após a lesão. Os cérebros dos animais foram retirados 4 h após aplicação das células e congelados a -80 °C. Para mostrar as alterações degenerativas no estriado esquerdo (lesionado) após lesão de 6-OHDA, 10 cortes horizontais de cada animal foram retirados da área 5 mm a 8 mm do bregma e foram corados para tirosina hidroxilase (TH). 73

Em contraste com a forte coloração de quase todo o estriado com TH no lado não lesionado, a expressão de TH no lado lesionado foi claramente diminuída. 0 rastreio dos cortes do cérebro com microscopia fluorescente revelou uma notável diferença no número de células entre os lados lesionado e contralateral: a maioria das MSC marcadas com CFDA foi verificada no bolbo olfactivo (08), no córtex ao nível da lesão e dentro do estriado lesionado, ao passo que apenas muito poucas células se verificaram no estriado, córtex e OB do hemisfério contralateral. Algumas MSC foram ocasionalmente verificadas nos cortes corados para TH: De modo interessante, muito poucas das MSC que se verificaram em OB expressaram TH, ao passo que a maioria das células localizadas no córtex na vizinhança da lesão eram positivas para TH.

Estes resultados proporcionam evidência da migração preferencial de células estaminais direccionadas para o local da lesão em roedores lesionados com 6-OHDA. Além disso, melhor distribuição de células estaminais de medula óssea no cérebro foi mostrada no hemisfério lesionado, em comparação com as no lado não lesionado, utilizando uma forma de realização da presente invenção.

Exemplo 4 - Células Terapêuticas Compreendendo Células

Tumorais Contornando a Barreira Hematoencefálica Após Aplicação Intranasal no Terço Superior da Cavidade Nasal no Modelo de Parkinson

Este estudo terapêuticas mas distribuídas no

investiga se apenas as células estaminais também células tumorais, podem ou não, ser cérebro após administração intranasal. A 74 administração intranasal de células Phi-Yellow humanas e de glioma T406 marcadas com CFDA no terço superior da cavidade nasal de ratos de 1 dia de idade (n =5) foi alcançada. Uma hora após administração, os animais foram sacrificados. As secções sagitais (20 !-lm) das cabeças intactas dos animais (incluindo o crânio e cérebro) foram processadas por microscopia fluorescente. Células de glioma marcadas com CFDA identificadas na cavidade nasal, placa cribriforme, bolbo olfactivo, córtex frontal e área hipocampal.

Neste estudo, a distribuição intranasal de células eucarióticas (células estaminais, assim como células tumorais) para dentro dos cérebros intacto e lesionado de roedores foi demonstrada. Os tumores cerebrais consistem em tumores intracranianos que resultam de divisão celular anormal ou descontrolada. Isto não pode ocorrer no cérebro, nas meninges, nos nervos cranianos ou em vasos sanguíneos ou vasos linfáticos do sistema nervoso central. A maior parte dos tumores cerebrais primários ocorre na fossa craniana posterior em crianças (i. e., glioma estaminal cerebral) e na porção anterior dos hemisférios cerebrais em adultos. Os tumores cerebrais pediátricos representam cerca de um quarto dos cancros pediátricos. Há cerca de mais de 10000 mortes por ano nos Estados Unidos devido a tumores cerebrais. A maior parte dos tumores cerebrais primários tem origem em células gliais no sistema nervoso central. Contudo, os tumores cerebrais secundários que se desenvolvem a partir de cancros em qualquer outra parte no corpo e se metastizam para o cérebro são ainda mais comuns. Os tumores podem metastizar-se para o cérebro a partir dos pulmões, pele, rim, mama, cólon e outros órgãos. 75

Os tumores cerebrais são difíceis de tratar, porque a maior parte dos agentes quimioterapêuticos não atravessa facilmente a barreira hematoencefálica e não é possível remover, de um modo seguro e bem-sucedido, determinados tipos de tumores cerebrais, e. g., gliomas estaminais cerebrais, devido à sua localização próxima de áreas do cérebro que controlam funções autónomas chave, tais como respiração, função cardíaca, etc.

Actualmente, investigadores desenvolvendo e testando novas terapêuticas para tumores cerebrais, necessitam de implantar cirurgicamente células tumorais no cérebro de um animal, para criar um modelo animal de tumor cerebral que possa ser utilizado para testar novos fármacos. Demonstra-se aqui que as células tumorais podem ser introduzidas, de um modo não invasivo, no cérebro, através da sua administração no terço superior da cavidade nasal e que a hialuronidase e outros agentes podem ser utilizados para facilitar este processo. Deste modo, este exemplo demonstra que um modelo de tumor do cérebro pode ser criado de um modo não invasivo, sem os problemas associados à neurocirurgia e implantação directa de células tumorais, utilizando formas de realização da presente invenção.

Lisboa, 13 de Julho de 2012 76

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Células terapêuticas, mas não células estaminais embrionárias humanas, para utilização no tratamento de um sistema nervoso central lesionado ou degenerescente ou ferido de um animal, sendo a lesão ou degeneração provocada por uma doença ou estado neurológico que resulta na perda ou morte de células do sistema nervoso central, o referido tratamento compreendendo: aplicar as células terapêuticas no terço superior da cavidade nasal do animal; e permitir que as células terapêuticas acedam ao sistema nervoso central lesionado através do contorno da barreira hematoencefálica.
2. Células terapêuticas para utilização de acordo com a reivindicação 1, o referido tratamento compreendendo, adicionalmente, administrar as células terapêuticas a um tecido inervado pelo nervo olfactivo, em que a, pelo menos, uma, célula terapêutica contorna a barreira hematoencefálica para aceder ao sistema nervoso central lesionado; e minimizar a distribuição sistémica das células terapêuticas no exterior do sistema nervoso central.
3. Células terapêuticas para utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, o referido tratamento compreendendo, adicionalmente, aplicar no terço superior da cavidade nasal do animal, pelo menos, um agente de melhoramento de distribuição, numa quantidade eficaz numa composição farmacêutica compreendendo as células 1 terapêuticas ou antes da aplicaçao das células terapêuticas.
4. Células terapêuticas para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o, pelo menos um, agente, de melhoramento de distribuição compreende um do grupo consistindo de hialuronidase, agentes lipofílicos, factor inibidor de leucemia, actividade de indução de migração e neuregulina.
5. Células terapêuticas para utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que as células terapêuticas compreendem, pelo menos, um do grupo consistindo de células eucarióticas e células estaminais.
6. Células terapêuticas para utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, o referido tratamento compreendendo, adicionalmente, aplicar a, pelo menos uma, célula terapêutica no terço superior da cavidade nasal do animal, numa quantidade fisiologicamente eficaz, para proporcionar acção terapêutica compreendendo a substituição de células perdidas e/ou moribundas no sistema nervoso central lesionado.
7. Células terapêuticas para utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que a doença ou estado neurológico compreende, pelo menos, um do grupo consistindo de doença de Parkinson, doença de Alzheimer e isquemia.
8. Células terapêuticas para utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, o referido tratamento compreendendo, adicionalmente, pré-tratar o terço superior 2 da cavidade nasal com, pelo menos, um antibiótico, numa quantidade eficaz, antes da aplicação das células terapêuticas.
9. Células terapêuticas para utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, o referido tratamento compreendendo, adicionalmente, proporcionar, numa quantidade eficaz, pelo menos, um do grupo consistindo de antibiótico, agente regulador e agente imunossupressor, numa composição farmacêutica compreendendo as células terapêuticas ou antes da aplicação das células terapêuticas.
10. Células terapêuticas para utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, o referido tratamento compreendendo, adicionalmente, aplicar uma composição farmacêutica compreendendo as células terapêuticas no terço superior da cavidade nasal do animal, numa quantidade fisiologicamente eficaz, para proporcionar acção terapêutica compreendendo a substituição de células perdidas e/ou moribundas no sistema nervoso central lesionado.
11. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de um sistema nervoso central lesionado ou degenerescente ou ferido de um animal, sendo a lesão ou degeneração provocada por uma doença ou estado neurológico que resulta na perda ou morte de células do sistema nervoso central, compreendendo: células terapêuticas, mas não células estaminais embrionárias humanas, em que o tratamento compreende 3 administrar a composição farmacêutica no terço superior da cavidade nasal do animal; e permitir que as células terapêuticas acedam ao sistema nervoso central lesionado através do contorno da barreira hematoencefálica.
12. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 11, compreendendo células terapêuticas de acordo com uma das reivindicações 1-10.
13. Composição farmacêutica para utilização de acordo com uma das reivindicações 11 ou 12 compreendendo, adicionalmente, pelo menos, um do grupo consistindo de agente de melhoramento de distribuição, antibiótico, agente imunossupressor e agente regulador.
14. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o agente de melhoramento de distribuição é, pelo menos, um do grupo consistindo de hialuronidase, agentes lipofílicos, factor inibidor de leucemia, actividade de indução de migração e neuregulina.
15. Células terapêuticas ou composição farmacêutica para utilização de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que o animal é um mamífero. Lisboa, 13 de Julho de 2012 4