ES2252993T3 - Administracion de agentes neurotroficos al sistema nervioso central. - Google Patents

Abstract

Uso de un agente neurotrófico o variante biológicamente activa del mismo en la fabricación de un medicamento para suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo al sistema nervioso central de un mamífero mediante una cavidad nasal, comprendiendo dicho medicamento una dosis unitaria de 0, 1 nmol a 1.000 nmol de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo, en el que la administración de dicho medicamento a dicha cavidad nasal de dicho mamífero proporciona el transporte de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo al sistema nervioso central de dicho mamífero en una cantidad eficaz para proporcionar un efecto protector o terapéutico a una célula del sistema nervioso central, estando seleccionado dicho agente neurotrófico del grupo constituido por un factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), un factor de crecimiento nervioso (NGF) y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y teniendo dicha variante biológicamente activa del mismo al menos un 70% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de dicho agente neurotrófico, y en el que dicha variante biológicamente activa de IGF es una variante biológicamente activa de factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I).

Description

Administración de agentes neurotróficos al sistema nervioso central.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida al uso en la fabricación de un medicamento para suministrar agentes neurotróficos al sistema nervioso central mediante la cavidad nasal. Dicho medicamento puede ser útil en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central y/o el cerebro.

Antecedentes de la invención

El sistema nervioso central (SNC) incluye varios tejidos y órganos tales como el cerebro, el tronco cerebral y la médula espinal. Cada uno de estos órganos y tejidos está constituido por una variedad de diferentes tipos de células y estructuras subcelulares, por ejemplo, neuronas, células gliales, dendritas, axones, mielina y diversas membranas. El SNC está aislado del mundo exterior por diversas membranas que amortiguan y protegen estos órganos, tejidos, células y estructuras. Por ejemplo, las membranas que forman la barrera hematoencefálica protegen al cerebro de ciertos contenidos de la sangre. La barrera sangre-fluido cefalorraquídeo protege a otras porciones del SNC de muchas sustancias químicas y microbios.

El acceso al SNC para algunas sustancias se proporciona mediante sistemas de transporte activo especializado o mediante difusión pasiva a través de la membrana protectora en el SNC. Los métodos actuales para suministrar agentes terapéuticos deseados al SNC son típicamente invasivos. Por ejemplo, una bomba implantada en el cráneo (una bomba intracerebroventricular) puede suministrar eficazmente una variedad de compuestos útiles al cerebro. Sin embargo, implantar dicha bomba requiere cirugía cerebral, que puede conllevar una variedad de complicaciones graves. Ciertos compuestos (por ejemplo los analgésicos epidurales) pueden inyectarse directamente a través de la membrana protectora en el SNC. Sin embargo, dichas inyecciones son impracticables para la mayoría de las medicacio-
nes.

Son necesarios mejores métodos para administrar los agentes deseados al SNC, el cerebro y/o la médula espinal.

El documento WO 97/07947 da a conocer un método para transportar agentes neurológicos terapéuticos y/o neurológicos de diagnóstico al cerebro mediante la ruta neural olfatoria y una composición farmacéutica útil en el tratamiento y el diagnóstico de trastornos cerebrales.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de un agente neurotrófico o variante biológicamente activa del mismo en la fabricación de un medicamento para suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo al sistema nervioso central de un mamífero mediante una cavidad nasal, comprendiendo dicho medicamento una dosis unitaria de 0,1 nmol a 1.000 nmol de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo, en el que la administración de dicho medicamento a dicha cavidad nasal de dicho mamífero proporciona el transporte de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo al sistema nervioso central de dicho mamífero en una cantidad eficaz para proporcionar un efecto protector o terapéutico en una célula del sistema nervioso central, estando seleccionado dicho agente neurotrófico del grupo constituido por un factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), un factor de crecimiento nervioso (NGF) y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y teniendo dicha variante biológicamente activa del mismo al menos un 70% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de dicho agente neurotrófico, y en el que dicha variante biológicamente activa de IGF es una variante biológicamente activa de factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I).

La presente invención puede utilizarse en la administración de una dosis terapéuticamente eficaz del agente neurotrófico a la cavidad nasal del sujeto, preferiblemente al tercio superior de la cavidad nasal. El agente neurotrófico puede absorberse después a través de una mucosa o epitelio y transportarse al sistema nervioso central del mamífero, preferiblemente sin cruzar la barrera hematoencefálica.

En otra realización, la dosis terapéuticamente eficaz del agente neurotrófico puede administrarse de manera tal que se absorba el agente neurotrófico a través del tejido y se transporte al sistema nervioso central del mamífero mediante una ruta neural, y en una cantidad eficaz para proporcionar un efecto protector o terapéutico en una célula del sistema nervioso central.

La invención puede utilizarse para proporcionar la administración mediante estas rutas utilizando una composición que incluye un vehículo que facilita la absorción del agente neurotrófico, el transporte del agente neurotrófico mediante una ruta neural y/o el transporte del agente neurotrófico al SNC, el cerebro y/o la médula espinal. Las composiciones preferidas incluyen uno o más de un aditivo potenciador de la solubilidad, un aditivo hidrófilo, un aditivo promotor de la absorción, un tensioactivo catiónico, un aditivo potenciador de la viscosidad o una matriz o composición de liberación sostenida, un vehículo basado en lípidos, preferiblemente una composición micelar o liposómica, un aditivo desestabilizador de la bicapa o un aditivo fusogénico.

Los agentes neurotróficos que pueden utilizarse en la invención son factor de crecimiento de fibroblastos, particularmente factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento similar a la insulina, particularmente factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I) y factor de crecimiento nervioso (NGF).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra una relación lineal entre la concentración de NGF en el bulbo olfatorio y las dosis administradas mediante administración nasal.

La Figura 2 ilustra una relación lineal entre la concentración de NGF en la membrana dural del bulbo olfatorio y las dosis administradas mediante administración nasal.

La Figura 3 ilustra una relación lineal entre la concentración de NGF en el epitelio olfatorio y las dosis administradas mediante administración nasal.

La Figura 4 ilustra una relación lineal entre la concentración de NGF en la médula espinal cervical y las dosis administradas mediante administración nasal.

La Figura 5 ilustra una relación lineal entre la concentración de NGF en los nódulos linfáticos cervicales profundos y las dosis administradas mediante administración nasal.

Descripción detallada de la invención Vías de administración

La invención puede utilizarse para administrar el agente a tejido inervado por los nervios trigémino y olfatorio y dentro de la cavidad y/o senos nasales. Dichos sistemas nerviosos pueden proporcionar una conexión directa entre el entorno externo y el cerebro, proporcionando así un suministro ventajoso de un agente neurotrófico al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal.

El nervio olfatorio

La invención puede utilizarse para la administración de un agente a tejido inervado por el nervio olfatorio y dentro de la cavidad nasal. Preferiblemente, el agente se suministra al área olfatoria en el tercio superior de la cavidad nasal y, particularmente, al epitelio olfatorio.

Las fibras del nervio olfatorio son axones no mielinizados de células receptoras olfatorias que están localizadas en el tercio superior de la mucosa nasal. Las células receptoras olfatorias son neuronas bipolares con prominencias cubiertas por cilios similares a pelo que se proyectan en la cavidad nasal. En el otro extremo, los axones de estas células se reúnen en agregados y entran en la cavidad craneal por el techo de la nariz. Rodeados por un fino tubo de membrana pial, los nervios olfatorios cruzan el espacio subaracnoideo que contiene LCR y entran en los aspectos inferiores de los bulbos olfatorios. Una vez dispensado el agente en la cavidad nasal, el agente puede experimentar transporte a través de la mucosa nasal y al bulbo olfatorio y zonas interconectadas del cerebro, tales como la formación hipocámpica, los núcleos amigdaloides, el núcleo basal de Meynert, el locus ceruleus, el tronco cerebral y similares.

El nervio trigémino

La invención puede utilizarse también para la administración de un agente a tejido inervado por el nervio trigémino y dentro de la cavidad nasal. Dentro de la cavidad nasal, el nervio trigémino inerva principalmente los dos tercios inferiores de la mucosa nasal. El nervio trigémino tiene tres ramas principales, el nervio oftálmico, el nervio maxilar y el nervio mandibular. La invención puede utilizarse para administrar el agente a tejido dentro de la cavidad nasal inervada por una o más de estas ramas.

El nervio oftálmico y sus ramas

La invención puede utilizarse para administrar el agente a tejido dentro de la cavidad y/o senos nasales inervados por la rama del nervio oftálmico del nervio trigémino. El nervio oftálmico tiene tres ramas conocidas como el nervio nasociliar, el nervio frontal y el nervio lacrimal. El nervio etmoideo anterior, una rama del nervio nasociliar, inerva, entre otros tejidos, el seno etmoideo y regiones de los dos tercios inferiores de la mucosa nasal, incluyendo la porción anterior del tabique nasal y la pared lateral de la cavidad nasal. Preferiblemente, la invención puede utilizarse para administrar el agente a tejido inervado por el nervio etmoideo anterior.

El nervio maxilar y sus ramas

La invención puede utilizarse para administrar el agente a tejido dentro de la cavidad y/o senos nasales inervados por la rama del nervio maxilar del nervio trigémino. El nervio maxilar tiene varias ramas que inervan la cavidad y senos nasales, incluyendo el nervio nasopalatino, el nervio palatino mayor, los nervios alveolares superiores posteriores, el nervio alveolar superior medio y el nervio alveolar superior interior. El seno maxilar está inervado por los nervios alveolares superiores posterior, medio y anterior. La membrana mucosa del tabique nasal está abastecida principalmente por el nervio nasopalatino, y la pared lateral de la cavidad nasal está abastecida por el nervio palatino mayor. Preferiblemente, la invención puede utilizarse para administrar el agente a tejido inervado por el nervio nasopalatino y/o el nervio palatino mayor.

Agentes neurotróficos para suministro al sistema nervioso central

Puede administrarse una variedad de diferentes agentes neurotróficos al sistema nervioso central utilizando la invención. En general, la invención puede utilizarse para administrar un agente neurotrófico que puede emplearse para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno que afecte al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal; que puede promover el crecimiento, la regeneración o la supervivencia de una célula o tejido en el SNC, el cerebro y/o la médula espinal; o similar. Como se utiliza en la presente memoria, "agente neurotrófico" designa proteínas tales como factores de crecimiento, neurotrofinas, factores neurotróficos y similares, que tienen estas actividades.

En particular, el agente neurotrófico incluye factor de crecimiento nervioso (NGF), neurotrofinas 3, 4 y/o 5 (NT-3, NT-4 y/o NT-5), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos básico), insulina, factores de crecimiento similares a la insulina (IGF, por ejemplo, IGF-I y/o IGF-II), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de glía (GDNF), nexina derivada de glía, factor neurotrófico dependiente de la actividad y combinaciones de los mismos.

Ciertos agentes neurotróficos no se transportan, o sólo en pequeña medida, a través de la barrera hematoencefálica. Para dichos agentes, una cantidad eficaz del agente neurotrófico no cruza fácilmente, y quizás nunca, la barrera hematoencefálica. La presente invención puede utilizarse eficazmente para suministrar dichos agentes neurotróficos al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal.

La administración de agentes neurotróficos utilizando la invención puede suministrar más eficazmente el agente neurotrófico al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal, puede reducir la cantidad de agente neurotrófico administrada fuera del SNC, el cerebro y/o la médula espinal y, preferiblemente, puede reducir los efectos sistémicos indeseables del agente neurotrófico. Un suministro más eficaz o eficiente del agente neurotrófico al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal puede reducir la dosis total de agente neurotrófico administrada. Como alternativa, dicho suministro eficaz de agente neurotrófico puede reducir la cantidad de agente neurotrófico que alcanza destinos indeseados dentro del sujeto pero fuera del SNC, el cerebro y/o la médula espinal. Este suministro más eficaz da como resultado menos de dicho agente neurotrófico en localizaciones dentro del sujeto en que pueda tener efectos indeseados.

IGF-I

El término "IGF-I", como se utiliza en la presente memoria, designa factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I), un péptido monocatenario que tiene 70 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 7.600 Da. El factor de crecimiento similar a la insulina I estimula la mitosis y los procesos de crecimiento asociados al desarrollo celular.

En una realización de la invención, se consigue aumentar la cantidad de IGF-I a un nivel terapéuticamente eficaz mediante la administración de una composición farmacéutica que incluye una dosis terapéuticamente eficaz. El IGF-I que se va a administrar puede ser de cualquier especie animal incluyendo, pero sin limitación, roedores, aves, perros, vacas, cerdos, caballos y, preferiblemente, seres humanos. Preferiblemente, el IGF-I es de una especie de mamífero, y más preferiblemente es de un mamífero de la misma especie que el mamífero que experimenta tratamiento.

Las variantes biológicamente activas de IGF-I están también abarcadas por el método de la presente invención. Dichas variantes deberían retener las actividades de IGF-I, particularmente la capacidad de unirse a sitios receptores de IGF-I. La actividad de IGF-I puede medirse utilizando bioensayos de IGF-I estándar. Los ensayos representativos incluyen ensayos de radioreceptores conocidos que utilizan membranas de placenta (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.324.639; Hall et al. (1974), J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39: 973-976; y Marshall et al. (1974), J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39: 283-292), un bioensayo que mide la capacidad de la molécula de potenciar la incorporación de timidina tritiada, de manera dependiente de la dosis, al ADN de fibroblastos 3T3 de BALB/c (véase, por ejemplo, Tamura et al. (1989) J. Biol. Chem. 262: 5616-5621). Preferiblemente, la variante tiene al menos la misma actividad que la molécula nativa.

Las variantes biológicamente activas adecuadas pueden ser fragmentos, análogos y derivados de IGF-I. Por "fragmento de IGF-I", se pretende una proteína constituida por sólo una parte de la secuencia y estructura de IGF-I intacto, y puede ser una deleción C-terminal o deleción N-terminal de IGF-I. Por "análogo" se pretende un análogo de IGF-I o un fragmento de IGF-I que incluye una secuencia y estructura de IGF-I nativo que tiene una o más sustituciones, inserciones o deleciones aminoacídicas. Los péptidos que tienen uno o más peptoides (miméticos de péptidos) están también abarcados por el término análogo (véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO 91/04282). Por "derivado" se pretende cualquier modificación adecuada de IGF-I, fragmentos de IGF-I o sus análogos respectivos, tal como glicosilación, fosforilación u otra adición de restos extraños, a condición de que se retenga la actividad de IGF-I. Los métodos para preparar fragmentos, análogos y derivados de IGF-I están disponibles en la técnica. Véanse, en general, las patentes de EE.UU. nº 4.738.921, 5.158.875 y 5.077.276; las publicaciones internacionales nº WO 85/00831,
WO 92/04363, WO 87/01038 y WO 89/05822; y las patentes europeas nº EP 135094, EP 123228 y EP 128733.

Las variantes de IGF-I tienen al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 85%, aún más preferiblemente un 90% a 95% o más, y lo más preferiblemente un 98% o más de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de la molécula IGF-I de referencia. Una variante puede diferir, por ejemplo, tan solo en 1 a 10 restos aminoacídicos, tales como 6-10, tan sólo en 5, tan sólo en 4, 3, 2 o incluso en 1 resto aminoacídico.

Por "identidad de secuencia" se pretende que cuando se alinea un segmento contiguo especificado de la secuencia aminoacídica de la variante y se compara con la secuencia aminoacídica de la secuencia de referencia, se encuentren los mismos restos aminoacídicos en la secuencia variante y en una secuencia de referencia. Los métodos para alineación de secuencia y para la determinación de la identidad entre secuencias son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 19 (Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York); y el programa ALIGN (Dayhoff (1978) en "Atlas of Protein Sequence and Structure" 5; supl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.). Están disponibles una serie de algoritmos para alinear secuencias y determinar la identidad de secuencia e incluyen, por ejemplo, el algoritmo de alineación de homología de Needleman et al. (1970), J. Mol. Biol. 48: 443; el algoritmo de homología local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; el método de búsqueda de similitud de Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444; el algoritmo de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997) y los algoritmos BLASTP, BLASTN y BLASTX (véase Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410). Están también disponibles programas informáticos que utilizan estos algoritmos e incluyen, pero sin limitación: GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA, disponibles en el paquete de Genetics Computing Group (GCG), versión 8, Madison, Wisconsin, EE.UU.; y CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California. Preferiblemente, la identidad de secuencia se determina utilizando los parámetros por defecto determinados por el programa.

Con respecto a la alineación óptima de dos secuencias aminoacídicas, el segmento contiguo de la secuencia aminoacídica variante puede tener restos aminoacídicos adicionales o restos aminoacídicos eliminados con respecto a la secuencia aminoacídica de referencia. El segmento continuo utilizado para comparación con la secuencia aminoacídica de referencia incluirá al menos 20 restos aminoacídicos contiguos, y pueden ser 30, 40, 50 o más restos aminoacídicos. Las correcciones para identidad de secuencia aumentada asociadas a la inclusión de huecos en la secuencia aminoacídica de la variante pueden realizarse asignando penalizaciones de hueco.

Cuando se considera el porcentaje de identidad de secuencia aminoacídica, algunas posiciones de restos aminoacídicos pueden diferir como resultado de sustituciones aminoacídicas conservativas, que no afectan a las propiedades de la función proteica. En estos casos, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse al alza para dar cuenta de la similitud en aminoácidos sustituidos conservativamente. Dichos ajustes son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Meyers & Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4 :11-17.

La técnica proporciona directrices sustanciales respecto a la preparación y uso de dichas variantes de IGF-I, como se discute adicionalmente a continuación. Un fragmento de IGF-I incluirá generalmente al menos aproximadamente 10 restos aminoacídicos contiguos de la molécula completa, preferiblemente aproximadamente 15-25 restos aminoacídicos contiguos de la molécula completa, y lo más preferiblemente aproximadamente 20-50 o más restos aminoacídicos contiguos del IGF-I completo.

Son conocidos en la técnica varios análogos y fragmentos de IGF-I, e incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 4904-4907; Biochem. Biophys. Res. Commun. 149 (1987), 398-404; J. Biol. Chem. 263 (1988), 6233-6239; Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989), 766-771; Forsbert et al. (1990), Biochem. J. 271: 357-363; patentes de EE.UU. nº 4.876.242 y 5.077.276; y las publicaciones internacionales nº WO 87/01038 y WO 89/05822. Los análogos representativos incluyen uno con una eliminación de Glu-3 de la molécula madura, análogos con hasta 5 aminoácidos truncados de la terminación N, un análogo con un truncamiento de los tres primeros aminoácidos N-terminales (designado como des(1-3)-IGF-I, des-IGF-I, tIGF-I o IGF cerebral), y un análogo que incluye los primeros 17 aminoácidos de la cadena B de insulina humana en lugar de los primeros 16 aminoácidos de IGF-I humano.

El IGF-I utilizado en la presente invención puede estar en sus formas sustancialmente purificada, nativa, producida recombinantemente o sintetizada químicamente. El IGF-I puede aislarse y purificarse a partir de suero o plasma (véanse Phillips (1980) New Eng. J. Med. 302: 371-380 y la patente europea nº EP 123.228). El IGF-I puede sintetizarse químicamente también mediante el método de fase sólida (véase Li et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2216-2220).

La ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante puede ser el modo más eficiente de producir IGF-I. La secuencia de ADN humano que codifica IGF-I es conocida, y puede introducirse en células hospedadoras para expresión. El IGF-I puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante en E. coli, células de levadura, insecto y mamífero. El IGF-I secretado puede prepararse añadiendo una secuencia señal a la secuencia de ADN que codifica IGF-I. Además, la secuencia de ADN que codifica IGF-I puede manipularse para preparar fragmentos, análogos o derivados de IGF-I. Dichas técnicas de ADN recombinante están generalmente disponibles en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO 96/07424, en la que se produce proteína IGF-I humana recombinante en levadura. El IGF-I puede producirse también recombinantemente en la cepa de levadura Pichia pastoris, y purificarse esencialmente como se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.324.639, 5.324.660 y 5.650.496 y en la publicación internacional nº WO 96/40776.

FGF

Por el término "FGF", como se utiliza en la presente memoria, se pretende una proteína factor de crecimiento de fibroblastos, tal como FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-6, FGF-8, FGF-9 o FGF-98, o un fragmento o muteína biológicamente activo del mismo. Típicamente, el FGF es FGF-1 humano (h), FGF-1 bovino (b), hFGF-2, bFGF-2, hFGF-4 o hFGF-5. En una realización alternativa, el agente activo en la dosis unitaria es hFGF-6, hFGF-8, hFGF-9 o hFGF-98. En una realización de la invención, se consigue aumentar la cantidad de FGF a un nivel terapéuticamente eficaz mediante la administración de una composición farmacéutica que incluye una dosis terapéuticamente eficaz. El FGF que se va a administrar puede ser de cualquier especie animal incluyendo, pero sin limitación, roedores, aves, perros, vacas, cerdos, caballos y, preferiblemente, seres humanos. Preferiblemente, el FGF es de una especie de mamífero, y más preferiblemente es de un mamífero de la misma especie que el mamífero que experimenta tratamiento.

Las secuencias aminoacídicas y el método de preparación de muchos de los FGF que se emplean en una dosis unitaria o composición farmacéutica utilizada en la presente invención son bien conocidos en la técnica. En particular, se discuten secuencialmente a continuación las referencias que dan a conocer la secuencia aminoacídica y la expresión recombinante de FGF 1-9 y FGF-98.

FGF-1: Se dan a conocer la secuencia aminoacídica de hFGF-1 y un método para su expresión recombinante en la patente de EE.UU. nº 5.604.293 (Fiddes) titulada "Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor", que se expidió el 18 de febrero de 1997. Véase la Fig. 2d de la patente 5.604.293. La secuencia aminoacídica de bFGF-1 se da a conocer en la patente de EE.UU. 5.604.293 (Fiddes) en la Fig. 1b, así como un método para su expresión. Las formas maduras tanto de hFGF-1 como de bFGF-1 tienen 140 restos aminoacídicos. El bFGF-1 difiere del hFGF-1 en 19 posiciones de resto: 5 Pro a Leu, 21 His a Tyr, 31 Tyr a Val, 35 Arg a Lys, 40 Gln a Gly, 45 Gln a Phe, 47 Ser a Cys, 51 Tyr a Ile, 54 Tyr a Val, 64 Tyr a Phe, 80 Asn a Asp, 106 Asn a His, 109 Tyr a Val, 116 Ser a Arg, 117 Cys a Ser, 119 Arg a Leu, 120 Gly a Glu, 125 Tyr a Phe y 137 Tyr a Val. En la mayoría de los casos, se conservan las diferencias. Además, las diferencias en las posiciones de resto 116 y 119 meramente intercambian la posición de la Arg.

FGF-2: Se dan a conocer la secuencia aminoacídica de FGF-2 humano (hFGF-2) y métodos para su expresión recombinante en la patente de EE.UU. 5.439.818 (Fiddes) titulada "DNA Encoding Human Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor", que se expidió el 8 de agosto de 1995 (véase la Fig. 4 en la misma). Se dan a conocer la secuencia aminoacídica del FGF-2 bovino (bFGF-2) y diversos métodos para su expresión recombinante en la patente de EE.UU. 5.155.214 titulada "Basic Fibroblast Growth Factor", que se expidió el 13 de octubre de 1992. Cuando se comparan las formas de 146 restos de hFGF-2 y bFGF-2, sus secuencias aminoacídicas son casi idénticas, con sólo dos restos diferentes. En particular, al ir de hFGF-2 a bFGF-2, las únicas diferencias aparecen en las posiciones de resto 112 (Thr a Ser) y 128 (Ser a Pro).

FGF-3: Se identificó FGF-3 por primera vez como un producto de expresión de un tumor mamario int-2 de ratón, y se da a conocer su secuencia aminoacídica en Dickson et al., "Potential Oncogene Product Related to Growth Factors", Nature 326: 833 (30 de abril de 1987). El FGF-3, que tiene 243 restos cuando se excluye la Met N-terminal, es sustancialmente más largo tanto que FGF-1 (humano y bovino) como FGF-2 (humano y bovino). Se presenta una comparación de los restos aminoacídicos de mFGF-3 respecto a bFGF-1 y bFGF-2 de forma superpuesta en Dickson et al. (1987). Cuando se compara la secuencia aminoacídica de mFGF-3 con bFGF-1 y bFGF-2, el FGF-3 tiene 5 localizaciones que contienen insertos de restos respecto tanto a FGF-1 como a FGF-2. El más significativo de estos insertos es un inserto de 12 a 14 restos respecto a FGF-2 y FGF-1, respectivamente, empezando en las posiciones de resto 135 de FGF-3. Permitiendo los insertos, Dickson da a conocer que el mFGF-3 tiene 53 restos idénticos respecto al FGF-1 e identifica 69 restos respecto al FGF-2. Además, el FGF-3 contiene una extensión N-terminal hidrófoba de 10 restos respecto a la terminación N de la secuencia señal tanto en FGF-1 como FGF-2. Respecto a la terminación C de bFGF-1 y bFGF-2, el mFGF-3 contiene una extensión de aproximadamente 60 restos. Es improbable que la extensión C-terminal de mFGF-3 sea necesaria para la actividad. Más probablemente, sea un moderador de la actividad para conferir especificidad de receptor al FGF.

FGF-4: La secuencia aminoacídica de la proteína hst, ahora conocida como hFGF-4, se dio a conocer por primera vez por Yoshida et al., "Genomic Sequence of hst, a Transforming Gene Enclosing a Protein Homologous to Fibroblast Growth Factors and the int-2 Enclosed Protein", PHAS USA, 84: 7305-7309 (octubre de 1987) en la Fig. 3. Incluyendo su secuencia líder, el hFGF-4 tiene 206 restos aminocídicos. Cuando se comparan las secuencias aminoacídicas de hFGF-4, hFGF-1, hFGF-2 y mFGF-3, los restos 72-204 de hFGF-4 tienen un 43% de homología con hFGF-2; los restos 79-204 tienen un 38% de homología con hFGF-1; y los restos 72-174 tienen un 40% de homología con mFGF-3. Se muestra una comparación de estas cuatro secuencias en forma superpuesta en Yoshida (1987) en la Figura 3. Además, la Cys en las posiciones de resto 88 y 155 de hFGF-4 está altamente conservada entre hFGF-1, hFGF-2, mFGF-3 y hFGF-4, y se encuentran en una región homóloga.

Los dos supuestos sitios de unión celular de hFGF-2 aparecen en las posiciones de resto 36-39 y 77-81 del mismo. Véase Yoshida (1987) en la Fig. 3. Los dos supuestos sitios de unión de heparina de hFGF-2 aparecen en las posiciones de resto 18-22 y 107-111 del mismo. Véase Yoshida (1987) en la Fig. 3. Dada la sustancial similitud entre las secuencias aminoacídicas para FGF-2 humano y bovino, se esperaría que los sitios de unión celular de bFGF-2 estuvieran también en las posiciones de resto 36-39 y 77-81 del mismo, y que los sitios de unión de heparina estuvieran en las posiciones de resto 18-22 y 107-111 del mismo. Con respecto a hFGF-1, los supuestos sitios de unión celular aparecen en los restos 27-30 y 69-72, y los supuestos sitios de unión de heparina aparecen en los restos 9-13 y 98-102. En la medida en que la bFGF-1 madura tiene aminoácidos idénticos en las posiciones de resto 9-13, 27-30, 69-72 y 98-102 que el hFGF-2 maduro, se esperaría que el bFGF-1 tuviera los mismos sitios de unión celular y de heparina que hFGF-1.

FGF-5: Se dan a conocer el ADNc y las secuencias aminoacídicas deducidas de hFGF-5 en Zhan et al., "The Human FGF-5 Oncogene Encodes a Novel Protein Related to Fibroblast Growth Factors", Molec. And Cell. Biol., 8(8): 3847-3495 (agosto de 1988) en la Fig. 1. Zhan da a conocer también un método para clonar hFGF-5. Otro hFGF-5 tiene una secuencia aminoacídica que difiere de la secuencia de Zhan en la posición de resto 236 (que tiene una Lys en vez de la Asn de Zhan) y en la posición de resto 243 (que tiene una Pro en lugar de la Ser de Zhan). Ambas secuencias aminoacídicas de hFGF-5 tienen 266 restos aminoacídicos que incluyen una secuencia líder de 67 restos cadena arriba del primer residuo del FGF-2 maduro y una secuencia de cola que se extiende aproximadamente 47 residuos más allá de la terminación C de hFGF-2. Se presenta una comparación entre las secuencias aminoacídicas de hFGF-1, hFGF-2, mFGF-3, hFGF-4 y FGF-5 en la Fig. 2 de Zhan (1988). En la Fig. 2 de Zhan, hFGF-1, hFGF-2, mFGF-3 y hFGF-4 se identifican como aFGF (concretamente bFGF ácido), bFGF (concretamente FGF básico), int-2 y hstKS3, respectivamente, concretamente por sus nombres originales. En la comparación referida anteriormente, dos bloques de restos aminoacídicos de FGF-5 (90 a 180 y 187-207) mostraron homología sustancial con FGF 1-4, concretamente 50,4% con FGF-4, 47,5% con FGF-3, 43,4% con FGF-2 y 40,2% con hFGF-1. Véase Zhan (1988) en la Fig. 2. Las patentes de EE.UU. 5.155.217 (Goldfarb) y 5.238.916 (Goldfarb), que corresponden a la publicación Zhan, designan la FGF-5 de Zhan como FGF-3. Sin embargo, la técnica (como se evidencia por Coulier a continuación) ha llegado a reconocer el hFGF de Zhan (y de las patentes de Goldfarb) como FGF-5 y no como FGF-3. Las dos patentes de Goldfarb contienen la misma secuencia aminoacídica para hFGF-5 que la reseñada anteriormente por Zhan.

FGF-6: Se dan a conocer el ADNc y la secuencia aminoacídica deducida para hFGF-6 en Coulier et al., "Putative Structure of the FGF-6 Gene Product and Role of Signal Peptide", Oncogene 6:1437-1444 (1991) en la Fig. 2. Coulier da a conocer también un método para clonar FGF-6. El hFGF-6 es uno de los FGF más grandes, teniendo 208 restos aminoacídicos. Cuando se comparan las secuencias aminoacídicas de FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6 y FGF-7 humanos, existen fuertes similitudes en los dos tercios C-terminales de las moléculas (correspondientes, por ejemplo, a los residuos 78-208 de hFGF-6). En particular, 23 restos de FGF-6, incluyendo las dos cisteínas en las posiciones de resto 90-157 de hFGF-6, eran idénticos entre los siete miembros de la familia. Este número aumenta a 33 restos cuando se consideran restos aminoacídicos conservados. Las similitudes totales entre estos siete FGF humanos estaban en el intervalo de 32 a 70% de restos idénticos y 48 a 79% de restos conservados para los dos tercios C-terminales de las moléculas. Las comparaciones de secuencia de hFGF-1 con hFGF-5 y hFGF-7 respecto a hFGF-6 se muestran en la Tabla FGF en la presente memoria.

TABLA FGF Comparación de la secuencia aminoacídica de hFGF-6 con otros hFGF

	Residuos idénticos*	Residuos conservados**	Residuos idénticos* (%)	Residuos conservados** (%)
hFGF-4	91	103	70	79
hFGF-5	64	82	49	63
hFGF-3	55	78	42	60
hFGF-2	54	69	42	53
hFGF-7	47	68	36	52
hFGF-1	42	62	32	48
* \hskip0.18cm \begin{minipage}[t]{155mm}El número y los porcentajes de restos idénticos o conservados se calcularon para los dos tercios C-terminales de la molécula hFGF-6 (restos 78-208)\end{minipage}
** \begin{minipage}[t]{155mm} Los restos conservados se definen según la estructura - matriz genética de Feng et al., J. Mol. Evol. 21: 112-125 (1985).\end{minipage}

Respecto a la Tabla FGF, el FGF-6 tiene la correspondencia más alta (91 restos idénticos/103 restos conservados) con FGF-4. Ésta asciende a un 70% de restos idénticos y un 79% de restos conservados. El hFGF-6 difería más de hFGF-3, hFGF-2, hFGF-7 y hFGF-1, con 42, 42, 36 y 32 restos idénticos, respectivamente.

Se muestra una comparación superpuesta de las secuencias aminoacídicas de los FGF 1-7 en la Figura 3 incorporada por Coulier (1991). La Figura 3 de Coulier muestra que cuando los dos tercios C-terminales de las moléculas de FGF están alineados, existen 23 posiciones de resto en las que los restos de los siete miembros de FGF son idénticos. Existen también diez posiciones de resto en las que los restos de los siete miembros de FGF están conservados. Coulier (1991) en la Figura 3. En combinación, estos restos idénticos y conservados forman aproximadamente 6 localizaciones de tres a cinco restos en los dos tercios terminales de cada uno de los FGF 1-7, en los que tres a cinco restos están agrupados conjuntamente en las siete especies de FGF humano (concretamente, hFGF 1-7).

FGF-7: La secuencia aminoacídica de hFGF-7 es bien conocida en la técnica y se da a conocer en Miyamoto et al. "Molecular Cloning of a Novel Cytokine cDNA Encoding the Ninth Member of the Fibroblast Growth Factor Family, Which has a Unique Secretion Property", Mol. And Cell. Biol. 13(7): 4251-4259 (1993) en la Fig. 2. En Miyamoto, el hFGF-7 se designaba por su antiguo nombre "KGF". El FGF-7 tiene 191 secuencias aminoacídicas de hFGF-106 y el hFGF-9 muestra que los dos tercios carboxi-terminales de FGF-7 tienen homología comparable con los dos tercios distales de los otros miembros del grupo. Véase Miyamoto (1993) en la página 4254 (Fig. 2).

FGF-8: El ADNc y la secuencia aminoacídica deducida de mFGF-8 son bien conocidos en la técnica y se dan a conocer en Tanaka et al., "Cloning and Characterization of an Androgen-Induced Growth Factor Essential for the Growth of Mouse Mammary Carcinoma Cells", PNAS USA, 89: 8928-8932 (1992) en la Fig. 2. Tanaka da a conocer también un método para preparar FGF-8 recombinante. El mFGF-8 de Tanaka tiene 215 restos aminoacídicos. MacArthur et al., "FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development", Development, 1212: 3603-3613 (1995) da a conocer que el FGF-8 tiene 8 isoformas diferentes que difieren en la terminación N madura pero que son idénticas en la región C-terminal. Las 8 isoformas surgen porque el FGF-8 tiene 6 exones de los cuales los cuatro primeros (que corresponden al primer exón de la mayoría de los otros genes FGF) da como resultado un ayuste alternativo.

FGF-9: El ADNc y las secuencias aminoacídicas deducidas de FGF-9 humano y de múrido son conocidos en la técnica, y se dan a conocer métodos para sus expresiones recombinantes en Santos-Ocamp, et al., "Expression and Biological Activity of Mouse Fibroblast Growth Factor", J. Biol. Chem. 271(3): 1726-1731 (1996). Ambas moléculas de FGF-9 humana y de múrido tienen 208 restos aminoacídicos y secuencias que difieren sólo en dos residuos. En particular, el hFGF-9 tiene Ser y Asn en los restos 9 y 34, respectivamente. El FGF-9 tiene una conservación completa de los aminoácidos conservados que definen la familia FGF. Santos-Ocamp (1996) en la página 1726. Se observa la activación semimáxima de FGF-9 a 185 ng/ml de heparina, mientras que se observa la activación semimáxima de FGF-1 a 670 ng/ml de heparina. Santos-Ocamp (1996) en la página 1730. Cuando se compara con FGF-1, ambos FGF-1, ambos FGF-2 y FGF-9 requieren menores concentraciones de heparina para una actividad óptima.

FGF-98: Se dan a conocer el ADNc y la secuencia aminoacídica de hFGF-98 y un método para su expresión recombinante en la solicitud de patente provisional nº de serie 60/083.553, que se incorpora por la presente a la presente memoria como referencia en su totalidad. El hFGF-98, que es también conocido como hFGF-18, tiene 207 restos aminoacídicos. Por tanto, el hFGF-6 (207 restos), el hFGF-9 (208 restos) y el hFGF-98 (207 restos) son de tamaño similar.

El bFGF-2 y otros FGF pueden preparase como se describe en la patente de EE.UU. 5.155.214 ("la patente 5.155.214"). El bFGF-2 recombinante y otros FGF pueden purificarse hasta calidad farmacéutica (98% de pureza o más) utilizando las técnicas descritas con detalle en la patente de EE.UU. 4.956.455 ("la patente 4.956.455"), titulada "Bovine Fibroblast Growth Factor", que se expidió el 9-11-90.

Las variantes biológicamente activas de FGF están también abarcadas por el método de la presente invención. Dichas variantes deben retener las actividades de FGF, particularmente la capacidad de unirse a sitios de receptor de FGF. La actividad de FGF puede medirse utilizando bioensayos de FGF estándar, que son conocidos por los expertos en la técnica. Los ensayos representativos incluyen ensayos de radioreceptores conocidos utilizando membranas, un bioensayo que mide la capacidad de la molécula de potenciar la incorporación de timidina tritiada, de manera dependiente de la dosis, al ADN de células, y similares. Preferiblemente, la variante tiene al menos la misma actividad que la molécula nativa.

Además de los FGF anteriormente descritos, el agente neurotrófico incluye también un fragmento activo de cualquiera de los FGF anteriormente descritos. En su forma más simple, el fragmento activo se prepara mediante la retirada de la metionina N-terminal utilizando técnicas bien conocidas para la retirada de Met N-terminal, tales como un tratamiento con una metionina aminopeptidasa. Un segundo truncamiento deseable incluye un FGF sin su secuencia líder. Los expertos en la técnica reconocen la secuencia líder como la serie de restos hidrófobos en la terminación N de una proteína que facilitan su paso a través de una membrana celular, pero que no son necesarios para la actividad y que no se encuentran en la proteína madura.

Los truncamientos preferidos en los FGF se determinan respecto al hFGF-2 maduro (o el bFGF-2 análogo) que tiene 146 restos. Como regla general, la secuencia aminoacídica de un FGF se alinea con FGF-2 para obtener la homología máxima. Las porciones del FGF que se extienden más allá de la correspondiente terminación N del FGF-2 alineado son generalmente adecuadas para deleción sin efectos adversos. Igualmente, las porciones del FGF que se extienden más allá de la terminación C del FGF-2 alineado pueden eliminarse también sin efectos adversos.

Pueden emplearse también en la presente invención fragmentos de FGF que son menores que los descritos, a condición de que retengan las porciones de unión celular de FGF y al menos un segmento de unión de heparina. En el caso de FGF-2 maduro que tiene los restos 1-146, los dos supuestos sitios de unión celular aparecen en las posiciones de resto 36-39 y 77-81 del mismo. Véase Yoshida et al., "Genomic Sequence of hst, a Transforming Gene Encoding a Protein Homologous to Fibroblast Growth Factors and the int-2-Encoded Protein", PNAS USA, 84: 7305-7309 (octubre de 1987) en la Fig. 3. Los dos supuestos sitios de unión de heparina de hFGF-2 aparecen en las posiciones de resto 18-22 y 107-111 del mismo. Véase Yoshida (1987) en la Fig. 3. En consecuencia, los fragmentos activos de un FGF abarcan típicamente aquellos fragmentos truncados terminalmente de un FGF que, cuando se alinean con FGF-2
maduro (que tiene los restos 1-146) para maximizar la homología, tienen al menos restos que corresponden a las posiciones de resto 30-110 de FGF-2; más típicamente, al menos restos que corresponden a los restos 18-146 de FGF-2.

Las variantes biológicamente activas adecuadas pueden ser análogos o derivados de FGF. Por "análogo" se pretende un análogo de FGF o un fragmento de FGF que incluya una secuencia y estructura nativa de FGF que tenga una o más sustituciones, inserciones o deleciones aminoacídicas. Los análogos que tienen una o más secuencias peptoides (secuencias miméticas de péptidos) están también incluidos (véase la publicación internacional nº WO 91/04282). Por "derivado" se pretende cualquier modificación adecuada de FGF, fragmentos de FGF o sus análogos respectivos, tales como glicosilación, fosforilación u otra adición de restos extraños, a condición de que se retenga la actividad de FGF. Los métodos para preparar fragmentos, análogos y derivados de FGF están disponibles en la técnica.

Además de los FGF descritos anteriormente, el método de la presente invención puede emplear también una muteína activa o variante de la misma. Por el término muteína activa, como se utiliza junto con un FGF, se pretende una forma mutada del FGF de origen natural. Las muteínas o variantes de FGF tendrán al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 85%, aún más preferiblemente un 90 a 95% o más, y lo más preferiblemente un 98% o más identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de la molécula FGF de referencia. Una muteína o variante puede diferir, por ejemplo, en tan sólo 1 a 10 restos aminoacídicos, tales como 6-10, en tan sólo 5, en tan sólo 4, 3, 2 o incluso en 1 resto aminoacídico.

La identidad de secuencia puede determinarse como se describe anteriormente en la presente memoria. Para FGF, un método preferido para determinar la identidad de secuencia emplea el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)) como se implementa en el programa MSPRCH (Oxford Molecular) utilizando una búsqueda de hueco afín con los siguientes parámetros de búsqueda: penalización de abertura de hueco de 12, y penalización de extensión de hueco de 1. Preferiblemente, las mutaciones son "sustituciones aminoacídicas conservativas" que utilizan L-aminoácidos, en las que un aminoácido se reemplaza por otro aminoácido biológicamente similar. Como se observó anteriormente, las sustituciones aminoacídicas conservativas son aquellas que conservan la carga general, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o impedimento estérico del aminoácido que se está sustituyendo. Son ejemplos de sustituciones conservativas aquellas entre los siguientes grupos: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Lys/Arg, Asn/Gln, Glu/Asp, Ser/Cys/Thr y Phe/Trp/Tyr. En el caso de FGF-2, un ejemplo de dicha sustitución aminoacídica conservativa incluye la sustitución de serina por una o ambas de las cisteínas en las posiciones de resto que no están implicadas en la formación de disulfuro, tales como los restos 87 y 92 en FGF-2 maduro (que tiene los restos 1-146).

Un experto en la técnica, utilizando técnicas conocidas en la técnica, es capaz de preparar una o más mutaciones puntuales en el ADN que codifica cualquiera de los FGF para obtener la expresión de una muteína polipeptídica de FGF (o muteína de fragmento) que tiene actividad angiogénica para uso en el método de la presente invención. Para preparar una muteína biológicamente activa de un FGF, se utilizan técnicas estándar de mutagénesis dirigida a sitio, como es conocido en la técnica y/o se enseña en Gilman et al., Gene 8: 81 (1979) o Roberts et al., Nature 328: 731 (1987), para introducir una o más mutaciones puntuales en el ADNc que codifica el FGF.

NGF

El término "NGF" como se utiliza en la presente memoria designa factor de crecimiento nervioso (NGF). El NGF se aisló originalmente como un complejo de peso molecular 130 kDa y un coeficiente de sedimentación de 7S. Este complejo 7S incluía tres tipos de subunidades, portando la subunidad "\beta" todas las actividades biológicas de NGF. El término \beta-NGF puede utilizarse para indicar NGF, y el término NGF designa típicamente \beta-NGF. El NGF es un dímero de dos cadenas peptídicas idénticas que tienen cada una 118 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 26,5 kDa. El factor de crecimiento nervioso estimula los procesos de mitosis y crecimiento asociados al desarrollo de células, particularmente células nerviosas.

En una realización de la invención, se consigue aumentar la cantidad de NGF a un nivel terapéuticamente eficaz mediante la administración de una composición farmacéutica que incluye una dosis terapéuticamente eficaz. El NGF que se va a administrar puede ser de cualquier especie animal incluyendo, pero sin limitación, roedores, aves, perros, vacas, cerdos, caballos y, preferiblemente, seres humanos. Preferiblemente, el NGF es de una especie de mamífero, y más preferiblemente es de un mamífero de la misma especie que el mamífero que experimenta tratamiento.

Las variantes biológicamente activas de NGF pueden utilizarse también en la presente invención. Dichas variantes deben retener las actividades de NGF, particularmente la capacidad de unirse a sitios de receptor de NGF. La actividad de NGF puede medirse utilizando bioensayos de NGF estándar, que son conocidos por los expertos en la técnica. Los ensayos representativos incluyen ensayos de radioreceptores conocidos que utilizan membranas, un bioensayo que mide la capacidad de la molécula de potenciar la incorporación de timidina tritiada, de manera dependiente de la dosis, al ADN de células, y similares. Las actividades biológicas del NGF incluyen aumentar los niveles de acetilcolina transferasa. Preferiblemente, la variante tiene al menos la misma actividad que la molécula nativa.

Las variantes biológicamente activas adecuadas pueden ser fragmentos, análogos y derivados de NGF. Por "fragmento de NGF" se pretende una proteína constituida por sólo una parte de la secuencia y estructura de NGF intacta, y puede ser una deleción C-terminal o deleción N-terminal de NGF. Por "análogo" se pretende un análogo de NGF o un fragmento de NGF que incluye una secuencia y estructura nativa de NGF que tiene una o más sustituciones, inserciones o deleciones aminoacídicas. Se incluyen también análogos que tienen una o más secuencias peptoides (secuencias miméticas de péptidos) (véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO 91/04282). Por "derivado" se pretende cualquier modificación adecuada de NGF, fragmentos de NGF o sus respectivos análogos, tal como glicosilación, fosforilación u otra adición de restos extraños, a condición de que se retenga la actividad de NGF. Los métodos para preparar fragmentos, análogos y derivados de NGF están disponibles en la técnica.

Las variantes de NGF tendrán al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 85%, aún más preferiblemente un 90 a 95% o más, y lo más preferiblemente un 98% o más identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de la molécula de NGF de referencia. Una variante puede diferir, por ejemplo, en tan solo 1 a 10 restos aminoacídicos, tales como 6-10, en tan sólo 5, en tan sólo 4, 3, 2 o incluso en 1 resto aminoacídico. La identidad de secuencia y la alineación pueden determinarse como se describe anteriormente en la presente memo-
ria.

La técnica proporciona directrices sustanciales respecto a la preparación y uso de variantes de NGF. Un fragmento de NGF incluirá generalmente al menos aproximadamente 10 restos aminoacídicos contiguos de la molécula completa, preferiblemente aproximadamente 15-25 restos aminoacídicos contiguos de la molécula completa, y lo más preferiblemente aproximadamente 20-50 o más restos aminoacídicos contiguos de NGF completo.

El NGF utilizado en la presente invención puede estar en sus formas sustancialmente purificada, nativa, producida recombinantemente o sintetizada químicamente. El NGF puede aislarse y purificarse a partir de suero, plasma u otros tejidos mediante métodos conocidos en la técnica. El NGF puede sintetizarse también químicamente mediante el método de fase sólida (véase Li et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2216-2220).

La ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante puede ser el modo más eficiente de producir NGF. La secuencia de ADN humano que codifica NGF es conocida y puede introducirse en células hospedadoras para expresión. El NGF puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante en E. coli, células de levadura, insecto y mamífero. El NGF secretado puede prepararse añadiendo una secuencia señal a la secuencia de ADN que codifica NGF. Además, la secuencia de ADN que codifica NGF puede manipularse para preparar fragmentos, análogos o derivados de NGF. Dichas técnicas de ADN recombinante están generalmente disponibles en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación internacional nº WO 96/07424.

Composición farmacéutica

Pueden conseguirse aumentos en la cantidad de agente neurotrófico en el SNC, el cerebro y/o la médula espinal hasta un nivel terapéuticamente eficaz mediante la administración de una composición farmacéutica que incluya una dosis terapéuticamente eficaz de este agente. Por "dosis terapéuticamente eficaz" se pretende una dosis de agente neurotrófico que consiga el objetivo deseado de aumentar la cantidad de este agente en una porción relevante del SNC, el cerebro y/o la médula espinal a un nivel terapéuticamente eficaz que posibilite una actividad biológica deseada del agente. Las actividades biológicas deseadas incluyen un aumento de la fosforilación de proteína, particularmente del receptor de IGF-I, en respuesta al IGF-I; y un aumento de acetilcolina transferasa en respuesta al NGF.

La invención está dirigida, particularmente, al uso en la fabricación de un medicamento o una composición que puede emplearse para suministro de un agente neurotrófico al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal tras la administración a la cavidad nasal. La composición puede incluir, por ejemplo, cualquier aditivo, vehículo y/o coadyuvante farmacéuticamente aceptable que sea adecuado para administrar un agente neurotrófico a través de la mucosa o el epitelio de la cavidad nasal. Preferiblemente, la composición farmacéutica puede emplearse en el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de una enfermedad, trastorno o lesión del SNC, el cerebro y/o la médula espinal. Preferiblemente, la composición incluye un agente neurotrófico en combinación con un vehículo, aditivo y/o coadyuvante farmacéutico que pueda promover la transferencia del agente neurotrófico dentro o a través de la mucosa o el epitelio de la cavidad nasal, o a lo largo o a través de un sistema neural. Como alternativa, el agente neurotrófico puede combinarse con sustancias que pueden ayudar al transporte del agente neurotrófico a sitios de daño de célula nerviosa. La composición puede incluir uno o varios agentes neurotróficos.

La composición contiene típicamente un vehículo farmacéuticamente aceptable mezclado con el agente neurotrófico y otros componentes en la composición farmacéutica. Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se pretende un vehículo que se utiliza convencionalmente en la técnica para facilitar el almacenamiento, administración y/o el efecto curativo del agente neurotrófico. Un vehículo puede reducir también cualquier efecto secundario indeseable del agente neurotrófico. Un vehículo adecuado debería ser estable, concretamente, incapaz de reaccionar con los demás ingredientes en la formulación. No debería producir efectos adversos locales o sistémicos significativos en los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas para tratamiento. Dichos vehículos son generalmente conocidos en la técnica.

Los vehículos adecuados para esta invención incluyen aquellos utilizados convencionalmente para grandes macromoléculas estables tales como albúmina, gelatina, colágeno, polisacárido, monosacáridos, polivinilpirrolidona, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, aminoácidos poliméricos, aceites no volátiles, oleato de etilo, liposomas, glucosa, sacarosa, lactosa, manosa, dextrosa, dextrano, celulosa, manitol, sorbitol y polietilenglicol (PEG).

Agua, solución salina, dextrosa acuosa y glicoles son vehículos líquidos preferidos, particularmente (cuando son isotónicos) para soluciones. El vehículo puede seleccionarse de diversos aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche desnatada desecada, glicerol, propilenglicol, agua y etanol. Las composiciones pueden someterse a procedimientos farmacéuticos convencionales tales como esterilización, y pueden contener aditivos farmacéuticos convencionales tales como conservantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes o emulsionantes, sales para ajustar la presión osmótica y tampones.

Otros componentes aceptables en la composición incluyen, pero sin limitación, tampones que potencian la isotonicidad tales como agua, solución salina, fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales. Típicamente, el vehículo farmacéuticamente aceptable incluye también uno o más estabilizantes, agentes reductores, agentes antioxidantes y/o antioxidantes quelantes. El uso de tampones, estabilizantes, agentes reductores, agentes antioxidantes y quelantes en la preparación de composiciones basadas en proteína, particularmente composiciones farmacéuticas, es bien conocido en la técnica. Véanse, Wang et al., "Review of Excipients and pHs for Parenteral Products Used in the United States", J. Parent Drug Assn., 34(6): 452-462 (1980); Wang et al., "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", J. Parent. Sci. and Tech., 42: S4-S26 (suplemento 1988); Lachman et al., "Antioxidants and Chelating Agents as Stabilizers in Liquid Dosage Forms- Part 1", Drug and Cosmetic Industry, 102(1): 36-38, 40 y 146-148 (1968); Akers, M.J., "Antioxidants in Pharmaceutical Products", J. Parent. Sci. and Tech., 36(5): 222-228 (1988); y "Methods in Enzymology", vol. XXV, Colowick y Kaplan eds., "Reduction of Disulfide Bonds in Proteins with Dithiotreitol", por Konigsberg, páginas 185-188.

Los tampones adecuados incluyen acetato, adipato, benzoato, citrato, lactato, maleato, fosfato, tartrato, borato, tris(hidroximetilaminometano), succinato, glicina, histidina, las sales de diversos aminoácidos o similares o combinaciones de los mismos. Véase Wang (1980) en la página 455. Las sales e isotonificantes adecuados incluyen cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sacarosa, trehalosa o similares. Cuando el vehículo es un líquido, se prefiere que el vehículo sea hipotónico o isotónico con los fluidos orales, conjuntivales o dérmicos y que tenga un pH en el intervalo de 4,5-8,5. Cuando el vehículo está en forma de polvo, se prefiere que el vehículo esté también en un intervalo de pH no tóxico aceptable.

Los agentes reductores adecuados, que mantienen la reducción de las cisteínas reducidas, incluyen ditiotreitol (DTT, también conocido como reactivo de Cleland) o ditioeritritol al 0,01% al 0,1% p/p; acetilcisteína o cisteína al 0,1 al 0,5% (pH 2-3); y tioglicerol al 0,1 al 0,5% (pH 3,5-7,0) y glutation. Véase Akers (1988) en las páginas 225 a 226. Los antioxidantes adecuados incluyen bisulfito de sodio, sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, formaldehidosulfoxilato de sodio y ácido ascórbico. Véase Akers (1988) en la página 225. Los agentes quelantes adecuados, que quelan metales traza para evitar la oxidación de las cisteínas reducidas catalizada por metales traza, incluyen citrato, tartrato, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en sus sales disódica, tetrasódica y cálcica disódica, y ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA). Véase, por ejemplo, Wang (1980) en las páginas 457-458 y 460-461, y Akers et al. (1988) en las páginas 224-227.

La composición puede incluir uno o más conservantes tales como fenol, cresol, ácido paraaminobenzoico, BDSA, sorbitrato, clorhexidina, cloruro de benzalconio o similares. Los estabilizantes adecuados incluyen carbohidratos tales como trehalosa o glicerol. La composición puede incluir un estabilizante tal como uno o más de celulosa microcristalina, estearato de magnesio, manitol o sacarosa para estabilizar, por ejemplo, la forma física de la composición; y uno o más de glicina, arginina, colágeno hidrolizado o inhibidores de proteasa para estabilizar, por ejemplo, la estructura química de la composición. Los agentes de suspensión adecuados incluyen carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, ácido hialurónico, alginato, sulfato de condroitina, dextrano, maltodextrina, sulfato de dextrano o similares. La composición puede incluir un emulsionante tal como polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic, trioleína, aceite de soja, lecitinas, escualeno y escualanos, trioletato de sorbitán o similares. La composición puede incluir un antimicrobiano tal como alcohol feniletílico, fenol, cresol, cloruro de benzalconio, fenoxietanol, clorhexidina, timerosol o similares. Los espesantes adecuados incluyen polisacáridos naturales tales como mananos, arabinanos, alginato, ácido hialurónico, dextrosa o similares; y sintéticos como hidrogeles PEG de bajo peso molecular; y los agentes de suspensión anteriormente citados.

La composición puede incluir un coadyuvante tal como bromuro de cetiltrimetilamonio, BDSA, colato, desoxicolato, polisorbato 20 y 80, ácido fusídico y, en el caso de suministro de ADN, preferiblemente un lípido catiónico. Los azúcares adecuados incluyen glicerol, treosa, glucosa, galactosa y manitol o sorbitol. Es una proteína adecuada la albúmina de suero humana.

Las composiciones preferidas incluyen uno o más de un aditivo potenciador de la solubilidad, preferiblemente una ciclodextrina; un aditivo hidrófilo, preferiblemente un mono- u oligosacárido; un aditivo promotor de la absorción, preferiblemente un colato, desoxicolato, ácido fusídico o quitosano; un tensioactivo catiónico, preferiblemente un bromuro de cetiltrimetilamonio; un aditivo potenciador de la viscosidad, preferiblemente para promover el tiempo de residencia de la composición en el sitio de administración, preferiblemente una carboximetilcelulosa, una maltodextrina, un ácido algínico, un ácido hialurónico o un sulfato de condroitina; o una matriz de liberación sostenida, preferiblemente un polianhídrido, un poliortoéster, un hidrogel, un sistema de depósito particulado de liberación lenta, preferiblemente polilactida-co-glicólida (PLG), una espuma de depósito, una microesfera de almidón o un sistema bucal derivado de celulosa; un vehículo basado en lípidos, preferiblemente una emulsión, un liposoma, un niosoma o una micela. La composición puede incluir un aditivo desestabilizador de bicapa, preferiblemente una fosfatidiletanolamina; un aditivo fusogénico, preferiblemente un hemisuccinato de colesterol.

Estas listas de vehículos y aditivos no son en modo alguno completas, y un trabajador experto en la técnica puede elegir excipientes de la lista GRAS (considerados generalmente como seguros) de compuestos químicos permitidos en las preparaciones farmacéuticas y aquellos que están permitidos actualmente en formulaciones tópicas y parenterales.

Con los fines de esta invención, la composición farmacéutica que incluye agente neurotrófico puede formularse en una dosificación unitaria y en una forma tal como una solución, suspensión o emulsión. El agente neurotrófico puede administrarse a la cavidad nasal en forma de un polvo, un gránulo, una solución, una crema, un pulverizador (por ejemplo un aerosol), un gel, un ungüento, una infusión, una inyección, una gota o una composición de liberación sostenida, tal como un disco polimérico.

Otras formas de composiciones para administración incluyen una suspensión de partículas, tal como una emulsión, un liposoma, un inserto que libera el agente neurotrófico lentamente y similares. Las formas de polvo o granular de la composición farmacéutica pueden combinarse con una solución y con un agente neurotrófico diluyente, dispersante o tensioactivo. Las composiciones adicionales preferidas para administración incluyen un bioadhesivo para retener el agente neurotrófico en el sitio de administración; un pulverizador, pintura o torunda aplicado a la mucosa o epitelio. La composición puede estar también en forma de polvo liofilizado, que puede convertirse en solución, suspensión o emulsión antes de la administración. La composición farmacéutica que tiene agente neurotrófico se esteriliza preferiblemente mediante filtración por membrana y se almacena en envases de dosis unitaria o multidosis tales como viales o ampollas sellados.

El método para formular una composición farmacéutica es generalmente conocido en la técnica. Puede encontrarse una discusión detallada de la formulación y selección de los vehículos, estabilizantes e isomolitos farmacéuticamente aceptables en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (18ª edición; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).

El agente neurotrófico de la presente invención puede formularse también en una forma de liberación sostenida para prolongar la presencia del agente neurotrófico farmacéuticamente activo en el mamífero tratado, generalmente durante más de un día. Son conocidos en la técnica muchos métodos de preparación de una formulación de liberación sostenida, y se dan a conocer en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (18ª edición; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).

Generalmente, el agente neurotrófico puede atraparse en matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos. Las matrices pueden conformarse en películas o microcápsulas. Los ejemplos de dichas matrices incluyen, pero sin limitación, poliésteres, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-L-glutamato de etilo (Sidman et al. (1983) Biopolymers 22: 547-556), polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.919 y documento EP 58.481), polilactato-poliglicolato (PLGA) tales como polilactida-co-glicolida (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.767.628 y 5.654.008), hidrogeles (véase, por ejemplo, Langer et al., (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12: 98-105), vinilacetato de etileno no degradable (por ejemplo, discos de vinilacetato de etileno y poli(etileno-co-acetato de vinilo)), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como Lupron Depot™, ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988), geles de ácido hialurónico (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 4.636.524) y suspensiones de ácido algínico.

Las microcápsulas adecuadas pueden incluir también microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo) preparadas mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfásica. Véase la solicitud en tramitación junto con la presente titulada "Method for Producing Sustained-Release Formulations", solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/187.780, presentada el 6 de noviembre de 1998, en la que se encapsula un agente neurotrófico en microesferas de PLGA. Además, pueden utilizarse también microemulsiones o sistemas de suministro de fármaco coloidal tales como liposomas y microesferas de albúmina. Véase "Remington's Pharmaceutical Sciences" (18ª edición; Mack Publishing Company Co., Eaton, Pennsylvania, 1990). Otras composiciones de liberación sostenida emplean un bioadhesivo para retener el agente neurotrófico en el sitio de administración.

Entre las sustancias opcionales que pueden combinarse con el agente neurotrófico en la composición farmacéutica están las sustancias lipófilas que pueden potenciar la absorción del agente neurotrófico a través de la mucosa o el epitelio de la cavidad nasal a las células nerviosas dañadas en el SNC. El agente neurotrófico puede mezclarse con un coadyuvante lipófilo solo o en combinación con un vehículo, o puede combinarse con uno o varios tipos de micelas o sustancias liposómicas. Entre las sustancias lipófilas preferidas están los liposomas catiónicos, incluyendo uno o más de fosfatidilcolina, lipofectina, DOTAP o similares. Estos liposomas pueden incluir otras sustancias lipófilas tales como gangliósidos y fosfatidilserina (PS). Se prefieren también aditivos micelares tales como gangliósidos GM-1 y fosfatidilserina (PS), que pueden combinarse con el agente neurotrófico solo o en combinación. El gangliósido GM-1 puede incluirse en un porcentaje de 1-10% en moles en cualquier composición liposómica o en cantidades superiores en estructuras micelares. Los agentes proteicos pueden encapsularse también en estructuras particuladas o incorporarse como parte de la porción hidrófoba de la estructura, dependiendo de la hidrofobicidad del agente proteico. Una formulación liposómica preferida emplea Depofoam. Un agente neurotrófico puede encapsularse en liposomas multivesiculares, como se da a conocer en la solicitud en tramitación junto con la presente titulada "High and Low Load Formulations of IGF-I in Multivesicular Liposomes", solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 08/925.531, presentada el 8 de septiembre de 1997.

Cuando el agente neurotrófico es un FGF y el vehículo farmacéuticamente aceptable es un vehículo líquido, una composición farmacéutica típica puede incluir aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 ng/ml, más típicamente aproximadamente 50 a 1.500 ng/ml, de un FGF o un fragmento activo o muteína del mismo, tioglicerol 10 mM, NaCl 135 mM, citrato de sodio 10 mM y EDTA 1 mM, pH 5. Es un diluyente o agente de aclarado adecuado para la composición descrita anteriormente cualquiera de los vehículos descritos anteriormente. Típicamente, el diluyente es la solución de vehículo misma, que en este ejemplo incluye tioglicerol 10 mM, NaCl 135 mM, citrato de sodio 10 mM y EDTA 1 mM, pH 5.

Cuando se proporciona en forma líquida, dicho FGF u otro agente neurotrófico, composición o dosis unitaria, puede volverse inestable cuando se almacena durante periodos extensos de tiempo. Para maximizar la estabilidad y la vida de almacenamiento, las composiciones farmacéuticas y las composiciones de dosis unitaria deben congelarse a -60ºC. Cuando se descongela, la solución puede ser estable durante 6 meses en condiciones refrigeradas. Un vial típico de la composición farmacéutica incluiría aproximadamente 1,0 a 100 ml (más típicamente, aproximadamente 1,0 a 25 ml; lo más típicamente, aproximadamente 1,0 a 10 ml) del vehículo farmacéuticamente aceptable descrito anteriormente que contiene en el mismo de aproximadamente 5 ng a aproximadamente 10.000 mg de FGF u otro agente neurotrófico, o un fragmento activo o muteína del mismo.

Cuando el agente neurotrófico es IGF-I u otro agente neurotrófico, la composición farmacéutica puede incluir adicionalmente un compuesto solubilizante. Para IGF-I, un agente solubilizante preferido incluye un grupo guanidinio y es capaz de potenciar la solubilidad de un agente neurotrófico como IGF-I. Los ejemplos de dichos compuestos solubilizantes incluyen el aminoácido arginina, así como análogos aminoacídicos de arginina que retienen la capacidad de potenciar la solubilidad de un agente neurotrófico a pH 5,5 o mayor. Dichos análogos incluyen, sin limitación, dipéptidos y tripéptidos que contienen arginina. Por "potenciar la solubilidad" de un agente neurotrófico, se pretende aumentar la cantidad de agente neurotrófico que puede disolverse en una solución a pH 5,5 o mayor en presencia de un compuesto que contiene guanidinio comparada con la cantidad de agente neurotrófico que puede disolverse a pH 5,5 o mayor en una solución con los mismos componentes pero que carece del compuesto que contiene guanidinio. La capacidad de un compuesto que contiene guanidinio de potenciar la solubilidad de un agente neurotrófico puede determinarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. En general, la concentración del compuesto solubilizante presente en la composición será de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M y, por ejemplo, en el caso del compuesto arginina, estará en un intervalo de concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM, como se da a conocer en la solicitud en tramitación junto con la presente titulada "Compositions Providing for Increased IGF-1 Solubility", solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/188.051, presentada el 6 de noviembre de 1998.

Una realización preferida de la presente composición incluye una cantidad eficaz de NGF con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable que contiene una cantidad apropiada de micelas que incluyen gangliósido GM-1. Se cree que GM-1 actúa sinérgicamente con el factor de crecimiento nervioso (NGF) para proteger neuronas y promover la regeneración y reparación nerviosas. Otra realización preferida incluye un oligonucleótido sin sentido para tratar tumores cerebrales. Otra realización preferida de la composición incluye la combinación de una cantidad eficaz de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento similar a la insulina-I (IGF-I) con poli(etileno-co-acetato de vinilo), proporcionando la liberación controlada de los agentes neurotróficos, por ejemplo, para el tratamiento de apoplejía.

Administración del agente neurotrófico

El agente neurotrófico se administra típicamente en una dosis suficiente para proporcionar un nivel terapéuticamente eficaz en la porción del SNC, el cerebro y/o la médula espinal que puede beneficiarse del agente. Un agente neurotrófico exhibe generalmente actividad biológica en o alrededor de un tejido a una concentración de aproximadamente 10^{-12} M a aproximadamente 10^{-9} M, preferiblemente aproximadamente 10^{-11} M a aproximadamente 10^{-9} M, preferiblemente aproximadamente 10^{-10} M. Unos pocos de los agentes neurotróficos más potentes (por ejemplo, el factor neurotrófico dependiente de la actividad ADNF), exhiben su actividad biológica en un intervalo de tan sólo aproximadamente 10^{-15} M. Los agentes neurotróficos preferidos, tales como NGF, IGF-I y bFGF, exhiben efectos biológicos en tejidos relevantes del SNC, cerebro y/o médula espinal a concentraciones de aproximadamente 10^{-11} M a aproximadamente 10^{-9} M.

Estas concentraciones de agente neurotrófico pueden conseguirse en tejidos relevantes del SNC, el cerebro y/o la médula espinal de una rata después de la administración nasal de una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 0,1 nmol a aproximadamente 10 nmol. Por ejemplo, puede encontrase NGF a concentraciones relevantes en el SNC, el cerebro y/o la médula espinal de rata después de la administración de aproximadamente 0,5 nmol a aproximadamente 10 nmol de este agente y, se cree, a concentraciones inferiores. El IGF-I y el bFGF pueden encontrarse a concentraciones relevantes en el SNC, el cerebro y/o la médula espinal de rata después de la administración de aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 10 nmol de este agente y, se cree, a concentraciones inferiores. En algunos regímenes, las dosis terapéuticamente eficaces para administración de un agente neurotrófico a una rata incluyen aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nmol. Estas dosis dependen de factores que incluyen la eficiencia con que se transporta el agente desde la cavidad nasal al cerebro. Puede suministrarse una dosis total mayor mediante administraciones múltiples de agente.

Basándose en consideraciones que incluyen el tamaño relativo y la masa de porciones de los cerebros de rata y seres humanos que son dianas ventajosas para el suministro de un agente neurotrófico, las dosis terapéuticamente eficaces para seres humanos de agente neurotrófico pueden estar en el intervalo de aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 1.000 nmol. En particular, NGF, bFGF e IGF-I pueden administrarse a un ser humano a dosis terapéuticamente eficaces de aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 1.000 nmol. En algunos regímenes, las dosis terapéuticamente eficaces para administración de un agente neurotrófico a un ser humano incluyen aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1.000 nmol. Estas dosis dependen de factores que incluyen la eficiencia con la que se transporta el agente desde la cavidad nasal hasta el cerebro. Puede suministrarse una dosis total mayor mediante administraciones múltiples de agente.

La composición farmacéutica que tiene una dosis unitaria de agente neurotrófico puede estar, por ejemplo, en forma de una solución, suspensión, emulsión o formulación de liberación sostenida. Preferiblemente, el volumen total de una dosis de la composición farmacéutica está en el intervalo de aproximadamente 10 \mul a aproximadamente 0,2 ml, preferiblemente de aproximadamente 50 \mul a aproximadamente 200 \mul. Resulta evidente que el volumen adecuado puede variar con factores tales como el tamaño de la cavidad nasal a la que se administra el agente y la solubilidad de los componentes en la composición.

Dicha dosis terapéuticamente eficaz puede suministrar agente neurotrófico a una porción del SNC, el cerebro o la médula espinal relevante para tratar una enfermedad, trastorno o lesión de estos tejidos. Por ejemplo, suministrar un agente neurotrófico a los bulbos olfatorios, a la formación hipocámpica y/o al córtex frontal puede ser beneficioso para tratar la enfermedad de Alzheimer. De forma similar, suministrar un agente neurotrófico al cerebro medio, incluyendo la sustancia negra y el locus ceruleus y/o al tronco cerebral puede ser beneficioso para tratar la enfermedad de Parkinson. Los trastornos del movimiento conocidos como ataxias pueden beneficiarse del tratamiento dirigido al cerebelo. La apoplejía o lesión pueden afectar a la mayoría de las partes del SNC, el cerebro y/o la médula espinal. La invención puede utilizarse para suministrar cantidades terapéuticamente eficaces de un agente neurotrófico a porciones del cerebro y del SNC, incluyendo los bulbos olfatorios, la formación hipocámpica, el córtex frontal, el cerebro medio, el tronco cerebral y la médula espinal, siendo dichas porciones relevantes para diversas enfermedades o trastornos del SNC, el cerebro y/o la médula espinal.

Se reconoce que la cantidad total de agente neurotrófico administrada como dosis unitaria a un tejido particular dependerá del tipo de composición farmacéutica que se esté administrando, es decir, si la composición está en forma de, por ejemplo, una solución, una suspensión, una emulsión o una formulación de liberación sostenida. Por ejemplo, cuando la composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de agente neurotrófico está en una formulación de liberación sostenida, el agente neurotrófico se administra a una concentración mayor.

Debería ser evidente para un experto en la técnica que pueden ser aceptables variaciones con respecto a la dosis terapéuticamente eficaz y la frecuencia de administración del agente neurotrófico en esta realización de la invención. La cantidad del agente neurotrófico administrada estará correlacionada inversamente con la frecuencia de administración. Por tanto, un aumento en la concentración de agente neurotrófico en una dosis administrada una vez, o un aumento en el tiempo medio de residencia en el caso de una forma de liberación sostenida de agente neurotrófico, estará generalmente acoplado con una reducción de la frecuencia de administración.

Se apreciará por los expertos en la técnica que la dosis real del agente neurológico dependerá de una variedad de factores que pueden ser específicos del sujeto que experimente la dosificación. Estos factores deberán tenerse en consideración cuando se determine la dosis terapéuticamente eficaz de agente neurotrófico y la frecuencia de su administración. Por ejemplo, la dosis eficaz puede depender de la especie, la edad, el peso o el estado de salud general del sujeto; de la gravedad de la enfermedad o el trastorno; del tamaño y la localización de la porción del cerebro en la que debe conseguirse una cantidad eficaz de agente; de la frecuencia y duración de la dosificación; del tipo de formulación administrada; de las características, tales como lipofilicidad, del agente y la composición; de la naturaleza del agente y sus receptores, si los hay; y similares. Generalmente, se prefiere una dosificación mayor si la enfermedad o trastorno es más grave. Se cree que la velocidad de transporte a través de una neurona puede ser independiente de la especie y el agente.

Puede requerirse cierto grado menor de experimentación para determinar la dosis y frecuencia de administración de la dosis más eficaz, estando ésta dentro de la capacidad de un experto en la técnica una vez informado de la presente memoria descriptiva.

Dosificación intermitente

En otra realización de la invención, la composición farmacéutica que comprende la dosis terapéuticamente eficaz de agente neurotrófico se administra intermitentemente. Por "administración intermitente", se pretende la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de agente neurotrófico, seguida por un periodo de tiempo de interrupción, que es seguido después por otra administración de una dosis terapéuticamente eficaz, y así. La administración de la dosis terapéuticamente eficaz puede conseguirse de manera continua como, por ejemplo, con una formulación de liberación sostenida, o puede conseguirse según un régimen de dosificación diaria deseado como, por ejemplo, con una, dos, tres o más administraciones al día. Por "periodo de tiempo de interrupción" se pretende una interrupción de la administración de liberación sostenida continua o diaria de agente neurotrófico. El periodo de tiempo de interrupción puede ser más largo o más corto que el periodo de liberación sostenida continua o administración diaria. Durante el periodo de tiempo de interrupción, el nivel de agente neurotrófico en el tejido relevante es sustancialmente menor que el nivel máximo obtenido durante el tratamiento. La longitud preferida del periodo de interrupción depende de la concentración de la dosis eficaz y de la forma del agente neurotrófico utilizada. El periodo de interrupción puede ser de al menos 2 días, preferiblemente es de al menos 4 días, más preferiblemente es de al menos 1 semana y generalmente no supera un periodo de 4 semanas. Cuando se utiliza una formulación de liberación sostenida, el periodo de interrupción debe extenderse para dar cuenta del mayor tiempo de residencia del agente neurotrófico en el sitio de lesión. Como alternativa, la frecuencia de administración de la dosis eficaz de la formulación de liberación sostenida puede reducirse en consecuencia. Puede continuarse un programa intermitente de administración de agente neurotrófico hasta que se consigue el efecto terapéutico deseado, y en última instancia el tratamiento de la enfermedad o trastorno.

En aún otra realización, la administración intermitente de la dosis terapéuticamente eficaz de agente neurotrófico es cíclica. Por "cíclica" se pretende la administración intermitente acompañada por paradas en la administración, con ciclos en el intervalo de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2, 3, 4, 5 ó 6 meses, más preferiblemente aproximadamente 3 meses a aproximadamente 6 meses. Por ejemplo, el programa de administración podría ser la administración intermitente de la dosis eficaz de agente neurotrófico, en el que se administra una sola dosis a corto plazo una vez por semana durante 4 semanas, seguido de una parada de la administración intermitente durante un periodo de 3 meses, seguido por la administración intermitente mediante administración de una sola dosis a corto plazo administrada una vez por semana durante 4 semanas, seguido por una parada en la administración intermitente durante un periodo de 3 meses, y así. Como otro ejemplo, puede administrarse una sola dosis a corto plazo una vez por semana durante 2 semanas, seguido de una parada en la administración intermitente durante un periodo de 1 mes, seguido por una sola dosis a corto plazo administrada una vez por semana durante 2 semanas, seguido por una parada en la administración intermitente durante un periodo de 1 mes, y así. El programa de administración intermitente cíclica de agente neurotrófico al sujeto puede continuar hasta que se consiga el efecto terapéutico deseado, y en última instancia el tratamiento del trastorno o enfermedad.

Transporte neuronal

Una realización de la presente invención incluye el uso en la fabricación de un medicamento para uso de tal manera que el agente neurotrófico se transporte al SNC, el cerebro y/o la médula espinal a lo largo de una ruta neural. Una ruta neural incluye el transporte dentro o a lo largo de una neurona, a través o mediante los vasos linfáticos que discurren con una neurona, a través o mediante un espacio perivascular de un vaso sanguíneo que discurre con una neurona o ruta neural, a través o mediante una adventicia de un vaso sanguíneo que discurre con una neurona o ruta neural, o a través de un sistema hemangiolinfático. La invención prefiere el transporte de un agente neurotrófico mediante una ruta neural, en lugar de a través del sistema circulatorio, de modo que los agentes neurotróficos que son incapaces de cruzar, o sólo débilmente, la barrera hematoencefálica desde la corriente sanguínea al cerebro pueden suministrarse al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal. El agente neurotrófico, una vez pasada la barrera hematoencefálica y en el SNC, puede suministrarse después a diversas zonas del cerebro o la médula espinal a través de canales linfáticos, a través de un espacio perivascular o transportarse a través o a lo largo de neuronas. En una realización, el agente neurotrófico se acumula preferiblemente en zonas que tienen la mayor densidad de receptor o sitios de unión para ese agente neurotrófico.

El uso de una ruta neural para transportar un agente neurotrófico al cerebro, la médula espinal u otros componentes del sistema nervioso central obvia el obstáculo presentado por la barrera hematoencefálica, de modo que medicaciones como el factor de crecimiento nervioso (NGF), una proteína que normalmente no puede cruzar esa barrera, pueden suministrarse directamente al cerebro, cerebelo, tronco cerebral o médula espinal. Aunque el agente neurotrófico que se administra puede ser absorbido en la corriente sanguínea así como en la ruta neural, el agente neurotrófico proporciona preferiblemente efectos sistémicos mínimos. Además, la invención puede proporcionar el suministro de un nivel más concentrado del agente neurotrófico a células neurales, ya que el agente neurotrófico no se diluye en los fluidos presentes en la corriente sanguínea. Como tal, la invención proporciona un método mejorado para suministrar un agente neurotrófico al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal. Además, el suministro de un agente neurotrófico terapéutico al SNC mediante una ruta neural puede reducir el suministro sistémico y los efectos secundarios sistémicos indeseados. Esto puede mantenerse tanto si el agente neurotrófico cruza la barrera hematoencefálica como
si no.

La ruta neural olfatoria

Una realización de la presente invención incluye el uso en la fabricación de un medicamento para uso de una manera tal que el agente neurotrófico se transporte al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal a lo largo de una ruta neural olfatoria. Típicamente, dicha realización incluye la administración del agente neurotrófico a tejido inervado por el nervio olfatorio y dentro de la cavidad nasal. La ruta neural olfatoria inerva principalmente el epitelio olfatorio en el tercio superior de la cavidad nasal, como se describe anteriormente. La aplicación del agente neurotrófico a un tejido inervado por el nervio olfatorio puede suministrar el agente neurotrófico a neuronas o células del SNC, cerebro y/o médula espinal dañadas. Las neuronas olfatorias inervan este tejido y pueden proporcionar una conexión directa con el SNC, el cerebro y/o la médula espinal debido, se cree, a su papel en el olfato.

El suministro a través de la ruta neural olfatoria puede emplear vasos linfáticos que viajan con el nervio olfatorio a la protuberancia y otras zonas cerebrales, y desde allí a los vasos linfáticos durales asociados a porciones del SNC tales como la médula espinal. El transporte a lo largo del nervio olfatorio puede suministrar también agentes neurotróficos a un bulbo olfatorio. Una ruta perivascular y/o una ruta hemangiolinfática, tal como canales linfáticos que discurren dentro de las adventicias de vasos sanguíneos cerebrales, pueden proporcionar un mecanismo adicional para el transporte de agentes neurotróficos terapéuticos a la médula espinal desde el tejido inervado por el nervio olfatorio.

Puede administrarse un agente neurotrófico al nervio olfatorio, por ejemplo, a través del epitelio olfatorio. Dicha administración puede emplear transporte anterógrado o retrógrado extracelular o intracelular (por ejemplo, transneuronal) del agente neurotrófico que entra a través de los nervios olfatorios al cerebro y sus meninges, al tronco cerebral o a la médula espinal. Una vez dispensado el agente neurotrófico en o a tejido inervado por el nervio olfatorio, el agente neurotrófico puede transportarse a través el tejido y viajar a lo largo de las neuronas olfatorias a zonas del SNC que incluyen tronco cerebral, cerebelo, médula espinal, bulbo olfatorio y estructuras corticales y subcorticales.

El suministro a través de la ruta neural olfatoria puede emplear el movimiento de un agente neurotrófico en o a través de la mucosa o epitelio al nervio olfatorio o a un vaso linfático, un espacio perivascular de vaso sanguíneo, una adventicia de vaso sanguíneo o un vaso linfático de vaso sanguíneo que viaja con el nervio olfatorio a la protuberancia, y desde allí a los vasos linfáticos meníngeos asociados a porciones del SNC tales como la médula espinal. Los vasos linfáticos sanguíneos incluyen canales linfáticos que están alrededor de los vasos sanguíneos en el exterior de los vasos sanguíneos. Esto se designa también como el sistema hemangiolinfático. La introducción de un agente neurotrófico en el vaso linfático del vaso sanguíneo no introduce necesariamente el agente neurotrófico en la sangre.

La ruta neural trigeminal

Una realización de la presente invención incluye el uso en la fabricación de un medicamento para uso de tal manera que el agente neurotrófico se transporte al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal a lo largo de una ruta neural trigeminal. Típicamente, dicha realización incluye administrar el agente neurotrófico a una porción de la cavidad nasal inervada por el nervio trigémino, como se describe anteriormente. La aplicación del agente neurotrófico a un tejido inervado por el nervio trigémino puede suministrar el agente neurotrófico a neuronas o células del SNC, cerebro y/o médula espinal dañadas. Las neuronas trigeminales inervan la cavidad nasal y pueden proporcionar una conexión directa con el SNC, el cerebro y/o la médula espinal debido, se cree, a su papel en la sensación química común, incluyendo sensación mecánica, sensación térmica y nocicepción (por ejemplo, detección de especias picantes y de productos químicos perjudiciales).

El suministro a través de la ruta neural trigeminal puede emplear vasos linfáticos que viajan con el nervio trigémino a la protuberancia y otras zonas cerebrales, y desde allí a los vasos linfáticos durales asociados a porciones del SNC tales como la médula espinal. El transporte a lo largo del nervio trigémino puede suministrar también agentes neurotróficos a un bulbo olfatorio. Una ruta perivascular y/o una ruta hemangiolinfática, tal como canales linfáticos que discurren por las adventicias de los vasos sanguíneos cerebrales, puede proporcionar un mecanismo adicional para el transporte de agentes neurotróficos terapéuticos a la médula espinal desde el tejido inervado por el nervio trigémino.

El nervio trigémino incluye axones de gran diámetro que median la sensación mecánica, por ejemplo el tacto, y axones de pequeño diámetro que median el dolor y la sensación térmica, estando ambos cuerpos celulares localizados en el ganglio semilunar (o trigeminal) o el núcleo mesencefálico trigeminal en el cerebro medio. Ciertas porciones del nervio trigémino se extienden en la cavidad nasal. Las fibras individuales del nervio trigémino se recogen en un gran haz, viajan por debajo del cerebro y entran por el aspecto ventral de la protuberancia. Puede administrarse un agente neurotrófico al nervio trigémino, por ejemplo, a través de la mucosa y/o epitelio de la cavidad nasal. Dicha administración puede emplear el transporte anterógrado y retrógrado extracelular o intracelular (por ejemplo, transneuronal) del agente neurotrófico que entra a través de los nervios trigéminos al cerebro y sus meninges, al tronco cerebral, o a la médula espinal. Una vez dispensado el agente neurotrófico en o al tejido inervado por el nervio trigémino, el agente neurotrófico puede transportarse a través del tejido y viajar a lo largo de las neuronas trigeminales a zonas del SNC que incluyen tronco cerebral, cerebelo, médula espinal, bulbo olfatorio y estructuras corticales y subcorticales.

El suministro a través de la ruta neural trigeminal puede emplear el movimiento de un agente neurotrófico a través de la mucosa o epitelio nasal al nervio trigémino o a un vaso linfático, un espacio perivascular de vaso sanguíneo, una adventicia de vaso sanguíneo o un vaso linfático de vaso sanguíneo que viaja con el nervio trigémino a la protuberancia, y desde allí a los vasos linfáticos meníngeos asociados a porciones del SNC tales como la médula espinal. Los vasos linfáticos de vasos sanguíneos incluyen canales linfáticos que están alrededor de los vasos sanguíneos en el exterior de los vasos sanguíneos. Esto se designa también como el sistema hemangiolinfático. La introducción de un agente neurotrófico en el vaso linfático de vaso sanguíneo no introduce necesariamente el agente neurotrófico en la sangre.

Rutas neurales y administración nasal

En una realización, la invención puede utilizarse para proporcionar el suministro mediante una ruta neural, por ejemplo, una ruta neural trigeminal u olfatoria, después de la administración a la cavidad nasal. Tras la administración a la cavidad nasal, el suministro mediante la ruta neural trigeminal puede emplear el movimiento de un agente neurotrófico a través de la mucosa y/o epitelio nasal para alcanzar un nervio trigeminal o un canal perivascular y/o linfático que viaja con el nervio. Tras la administración a la cavidad nasal, el suministro mediante la ruta neural olfatoria puede emplear el movimiento de un agente neurotrófico a través de la mucosa y/o epitelio nasal para alcanzar el nervio olfatorio o un canal perivascular y/o linfático que viaja con el nervio.

Por ejemplo, el agente neurotrófico puede administrarse a la cavidad nasal de manera que se emplee transporte anterógrado y retrógrado extracelular o intracelular (por ejemplo, transneuronal) en y a lo largo de los nervios trigeminales y/u olfatorios para alcanzar el cerebro, el tronco cerebral o la médula espinal. Una vez dispensado el agente neurotrófico en o a la mucosa y/o epitelio nasal inervado por el nervio trigeminal y/u olfatorio, el agente neurotrófico puede transportarse a través de la mucosa y/o epitelio nasal y viajar a lo largo de las neuronas trigeminales y/u olfatorias a zonas del SNC que incluyen tronco cerebral, cerebelo, médula espinal, bulbo olfatorio y estructuras corticales y subcorticales. Como alternativa, la administración a la cavidad nasal puede dar como resultado el suministro de un agente neurotrófico a un espacio perivascular de vaso sanguíneo o vaso linfático que viaja con el nervio trigémino y/o nervio olfatorio a la protuberancia, bulbo olfatorio y otras zonas cerebrales, y desde allí a vasos linfáticos meníngeos asociados a porciones del SNC tales como la médula espinal. El transporte a lo largo del nervio trigémino y/u olfatorio puede suministrar también agentes administrados a la cavidad nasal al bulbo olfatorio, al cerebro medio, al diencéfalo, a la médula y al cerebelo. Un agente administrado a la cavidad nasal puede entrar en la membrana dural ventral del cerebro y viajar por los canales linfáticos dentro de la membrana dural.

Además, la invención puede llevarse a cabo de un modo que emplea una ruta perivascular y/o una ruta hemangiolinfática, tal como un canal linfático que discurre dentro de la adventicia de un vaso sanguíneo cerebral, para proporcionar un mecanismo adicional de transporte de agente neurotrófico a la médula espinal desde la mucosa y/o epitelio nasal. Un agente neurotrófico transportado por la ruta hemangiolinfática no entra necesariamente en la circulación. Los vasos linfáticos de vasos sanguíneos asociados al círculo de Willis, así como los vasos sanguíneos que siguen el nervio trigémino y/u olfatorio, pueden estar también implicados en el transporte del agente neurotrófico.

La administración a la cavidad nasal empleando una ruta neural puede suministrar un agente neurotrófico al tronco cerebral, al cerebelo, a la médula espinal y a estructuras corticales y subcorticales. El agente neurotrófico solo puede facilitar este movimiento al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal. Como alternativa, el vehículo u otros factores promotores de la transferencia pueden ayudar al transporte del agente neurotrófico en y a lo largo de la ruta neural trigeminal y/o olfatoria. La administración a la cavidad nasal de un agente neurotrófico terapéutico puede rodear la barrera hematoencefálica mediante un sistema de transporte desde la mucosa y/o epitelio nasal al cerebro y médula espinal.

Trastornos del sistema nervioso central

El presente método puede emplearse para suministrar agentes neurotróficos al cerebro para diagnóstico, tratamiento o prevención de trastornos o enfermedades del SNC, el cerebro y/o la médula espinal. Estos trastornos pueden ser trastornos neurológicos o psiquiátricos. Estos trastornos o enfermedades incluyen enfermedades cerebrales tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, demencia de cuerpos de Lewy, esclerosis múltiple, epilepsia, ataxia cerebelar, parálisis supranuclear progresiva, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos afectivos, trastornos de ansiedad, trastornos obsesivo-compulsivos, trastornos de personalidad, trastorno de déficit de atención, trastorno de déficit de atención con hiperactividad, síndrome de la Tourette, Tay-Sachs, Nieman-Pick y otras enfermedades de almacenamiento de lípidos y cerebrales genéticas y/o esquizofrenia. La invención puede emplearse también en sujetos que padecen o están en riesgo de lesión nerviosa por trastornos cerebrovasculares tales como apoplejía en el cerebro o la médula espinal, por infecciones del SNC incluyendo meningitis y VIH, por tumores del cerebro y la médula espinal, o por una enfermedad priónica. La invención puede emplearse también para suministrar agentes neurotróficos para contrarrestar trastornos del SNC resultantes del envejecimiento ordinario (por ejemplo, anosmia o pérdida del sentido químico general), lesión cerebral o lesión de médula espinal.

La presente invención puede emplearse para suministrar agentes neurotróficos al cerebro para diagnóstico, tratamiento o prevención de trastornos neurodegenerativos. La administración nasal de un agente neurotrófico a células nerviosas periféricas de las rutas neurales olfatoria y/o trigeminal que inervan la cavidad nasal, vía de entrada indicada para agentes causantes de enfermedades cerebrales, puede ayudar a proteger frente a la enfermedad en estas células nerviosas y a regenerar células nerviosas dañadas, impidiendo así la posterior difusión de la enfermedad a zonas susceptibles del SNC, el cerebro y/o la médula espinal.

La aplicación de un agente neurotrófico a la cavidad nasal puede ayudar también a prevenir la difusión de ciertos trastornos del SNC, el cerebro y/o la médula espinal mediante el tratamiento directo de células y neuronas periféricas que están dañadas por neurotoxinas y otros ataques. El tratamiento profiláctico de estas células nerviosas remotas ayuda a evitar la entrada de agentes causantes de la enfermedad en el SNC, el cerebro y/o la médula espinal. Este método de tratamiento es particularmente beneficioso en casos de enfermedad de Alzheimer en los que se sospecha que un factor ambiental es uno de los agentes causantes de la enfermedad. La aplicación de un agente neurotrófico a las neuronas sensoras trata o previene en parte también la pérdida del olfato o del sentido químico general que puede estar asociada a enfermedades neurodegenerativas y envejecimiento ordinario.

La invención puede utilizarse también para la prevención de trastornos cerebrales, particularmente en casos en que el factor causante entra en el cerebro a través de neuronas olfatorias. Se prefiere emplear tratamientos profilácticos cuando la evidencia indique degeneración neuronal en las neuronas olfatorias, como en el caso de enfermedad de Alzheimer y otros trastornos cerebrales relacionados. El tratamiento profiláctico de enfermedad cerebral puede implicar la aplicación directa o indirecta de un agente neurotrófico al epitelio olfatorio o nasal. Dichos factores pueden absorberse en las células nerviosas olfatorias periféricas para proteger a esas neuronas del daño por neurotoxinas y otros ataques, y evitar así la difusión de un agente causante de la enfermedad en otras zonas de la ruta neural olfatoria y tratar o prevenir la pérdida de olfato que puede estar asociada a enfermedades neurodegenerativas y envejecimien-
to.

El tratamiento de la anosmia es otro uso potencial muy importante para el método de suministro olfatorio intranasal. Más del 75% de los individuos de más de 80 años padecen una pérdida completa o parcial de su sentido del olfato. Muchos individuos más jóvenes, incluyendo aquellos con enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, experimentan también pérdidas en la detección olfatoria. El olfato es crítico para nuestra experiencia del gusto y por tanto tiene efectos significativos sobre la nutrición.

El tratamiento de la enfermedad de Parkinson puede ser también una aplicación importante de la presente invención, ya que la ruta del nervio trigémino puede suministrar agentes neurotróficos desde la cavidad nasal a la protuberancia en el tronco cerebral. La diana terapéutica principal en el cerebro para la enfermedad de Parkinson es la sustancia negra, que se extiende hacia delante sobre la superficie dorsal del pedúnculo base desde el borde rostral de la protuberancia hacia el núcleo subtalámico. Otras zonas diana terapéuticas son el locus ceruleus que está localizado en la región de la protuberancia rostral y la zona tegmental ventral que está localizada dorsomedial a la sustancia
negra.

"Una cantidad eficaz" de agente neurotrófico es una cantidad suficiente para prevenir, tratar, reducir y/o mejorar los síntomas y/o causas subyacentes de cualquiera de los trastornos o enfermedades anteriores. En algunos casos, una "cantidad eficaz" es suficiente para eliminar los síntomas de esas enfermedades y, quizás, superar la enfermedad misma. En el contexto de la presente invención, los términos "tratar" y "terapia" y similares designan aliviar, retardar la progresión, profilaxis, atenuación o cura de una enfermedad existente. Prevenir, como se utiliza en la presente memoria, designa aplazar, retrasar, retardar, inhibir o detener de otro modo, reducir o mejorar el inicio de dichas enfermedades o trastornos cerebrales. Se prefiere aplicar una cantidad suficientemente grande de agente neurotrófico a niveles no tóxicos para proporcionar un nivel eficaz de actividad en el sistema neural contra la enfermedad. El método de la presente invención puede utilizarse con cualquier mamífero. Los mamíferos ejemplares incluyen, pero sin limitación, ratas, gatos, perros, caballos, vacas, ovejas, cerdos y, más preferiblemente, seres humanos.

Artículos y métodos de fabricación

La presente invención puede utilizarse para proporcionar un artículo manufacturado que proporciona un agente neurotrófico para administración al SNC, al cerebro y/o a la médula espinal. El artículo manufacturado puede incluir un vial u otro envase que contiene una composición adecuada para el presente método, junto con cualquier vehículo, en forma seca o líquida. El artículo manufacturado incluye adicionalmente instrucciones en forma de una etiqueta en el envase y/o en forma de un inserto incluido en una caja en la que está empaquetado el envase, para llevar a cabo el método de la invención. Las instrucciones pueden estar también impresas en la caja en la que se empaqueta el vial. Las instrucciones contienen información tal como la dosificación suficiente e información de administración para permitir a un sujeto o a un profesional en el campo administrar el agente neurotrófico. Se anticipa que un profesional en el campo abarca cualquier médico, enfermero, técnico, cónyuge u otro cuidador que pueda administrar el agente neurotrófico. El agente neurotrófico puede autoadministrarse también por el sujeto.

Según la invención, puede utilizarse un agente neurotrófico para fabricar una composición o medicamento de agente neurotrófico adecuado para administración nasal. La invención se refiere también a métodos para la fabricación de una composición o medicamento de agente neurotrófico adecuado para administración nasal. Por ejemplo, puede fabricarse una composición líquida o sólida de varios modos, utilizando técnicas convencionales. Puede fabricarse una composición líquida disolviendo un agente neurotrófico en un disolvente adecuado, tal como agua, a un pH apropiado, incluyendo tampones u otros excipientes, por ejemplo, formando una solución descrita anteriormente en la presente memoria.

La presente invención puede entenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se pretenden representativos de realizaciones específicas de la invención, y no se pretenden limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Administración intranasal de IGF-I al cerebro Introducción

Administrar factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I) es un medio eficaz para suministrar este agente neurotrófico al cerebro de un animal.

Materiales y métodos

Suministro intranasal al cerebro: Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho de 200-310 g con pentobarbital intraperitoneal (40 mg/kg). El suministro de fármaco al cerebro se evaluó después de la administración intranasal de 7,4 nmol de ^{125}I-IGF-I en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Se dispusieron las ratas sobre sus lomos y se les administraron \sim25 \mul de ^{125}I-IGF-I a cada orificio nasal durante 10-22 minutos, alternando las gotas cada 2-3 minutos entre los orificios nasales izquierdo y derecho. Posteriormente, las ratas experimentaron perfusión-fijación minutos después de la terminación de la administración de ^{125}I-IGF-I. Se realizó la perfusión-fijación con 50-100 ml de solución salina fisiológica seguida de 500 ml de fijador que contenía 1,25% de glutaraldehído y 1% de paraformaldehído y tampón fosfato de Sorenson 0,1 M, pH 7,4, antes de la disección de la médula espinal y la medida del ^{125}I mediante recuento gamma. Las zonas diseccionadas incluían bulbos olfatorios, médula, protuberancia y cerebelo.

Resultados

Se observó una rápida aparición de radiomarcaje en el cerebro, observándose las mayores concentraciones en los bulbos olfatorios (3,0 \pm 0,47 nM), médula (0,62 \pm 0,16 nM), protuberancia (0,31 \pm 0,07 nM) y cerebelo (0,30 \pm 0,10 nM).

Conclusiones

Estos resultados indican el transporte directo de IGF-I a lo largo de una o más rutas neurales al cerebro. Los altos niveles de IGF-I en los bulbos olfatorios y el cerebelo, tejidos que contienen algunas de las cantidades más altas de ARNm de IGF-I y receptores del cerebro, indican que el IGF-I se transporta rápidamente desde la submucosa nasal con acumulación preferida en tejidos con los niveles más altos de receptor. Niveles de IGF-I de tan sólo 10-100 pM muestran efectos neuroprotectores, indicando que el presente método suministra niveles protectores eficaces de IGF-I al cerebro.

Ejemplo 2 Administración intranasal de IGF-I a la médula espinal Introducción

La administración intranasal de productos terapéuticos proteicos, tales como factor de crecimiento similar a la insulina I (IFG-I), se ha mostrado eficaz en el suministro de agentes neurotróficos al cerebro. La administración intranasal evita la barrera hematoencefálica, lo que de otro modo impide el IGF-I administrado periféricamente. Adicionalmente, el IGF-I puede suministrarse también a la médula espinal mediante suministro intranasal.

Materiales y métodos

Suministro intranasal a la médula espinal: Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho de 200-310 g con pentobarbital intraperitoneal (40 mg/kg). Se evaluó el suministro de fármaco a la médula espinal después de la administración intranasal de 7,4-8,2 nmol de ^{125}I-IGF-I en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Se dispusieron las ratas sobre sus lomos y se les administraron \sim25 \mul de ^{125}I-IGF-I a cada orificio nasal durante 15-20 minutos, alternando las gotas cada 2-3 minutos entre el orificio nasal izquierdo y derecho. Posteriormente, las ratas experimentaron perfusión-fijación minutos después de la terminación de la administración de ^{125}I-IGF-I. La perfusión-fijación se realizó con 50-100 ml de solución salina fisiológica seguida de 500 ml de fijador que contenía 1,25% de glutaraldehído y 1% de paraformaldehído en tampón fosfato de Sorenson 0,1 M, pH 7,4, antes de la disección de la médula espinal y la medida de ^{125}I mediante recuento gamma. Las zonas diseccionadas incluían los segmentos cervical, torácico y lumbosacro de la médula espinal.

Suministro intravenoso a la médula espinal: Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho de 200-310 g con pentobarbital intraperitoneal (40 mg/kg). Se evaluó el suministro de fármaco a la médula espinal después de la administración intravenosa de 15 pmol de ^{125}I-IGF-I en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, para evaluar la penetración de ^{125}I-IGF-I en la médula espinal desde del sistema vascular. Estas dosis, que daba como resultado un contenido total de ^{125}I-IGF-I en sangre comparable al obtenido anteriormente con el suministro intranasal, se determinó mediante el análisis del área bajo la curva de concentración en sangre frente al tiempo, como se describe por Frey et al., Drug Delivery 4: 87-92, (1997). Se dispusieron las ratas sobre sus lomos y se les administraron \sim500 \mul de ^{125}I-IGF-I durante 1 minuto mediante una cánula de calibre 24 insertada en la vena femoral. Posteriormente, las ratas experimentaron perfusión-fijación 20 minutos después de la terminación de la administración de ^{125}I-IGF-I. La perfusión-fijación se realizó con 50-100 ml de solución salina fisiológica seguida de 500 ml de fijador que contenía 1,25% de glutaraldehído y 1% de paraformaldehído en tampón fosfato de Sorenson 0,1 M, pH 7,4, antes de la disección de la médula espinal y la medida de ^{125}I mediante recuento gamma. Las zonas diseccionadas incluían los segmentos cervical, torácico y lumbosacro de la médula espinal.

Suministro intranasal al líquido cefalorraquídeo (LCR): Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho de 200-310 g con pentobarbital intraperitoneal (40 mg/kg). Se determinó el suministro de fármaco al LCR después de la administración intranasal de 12,4-12,8 nmol de ^{125}I-IGF-I en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, para evaluar el mecanismo de transporte. Se dispusieron las ratas sobre sus lomos y se les administraron \sim25 \mul de ^{125}I-IGF-I a cada orificio nasal durante 15-20 minutos, alternando las gotas cada 2-3 minutos entre los orificios nasales izquierdo y derecho. A los 2 minutos o 17 minutos después de la terminación de la administración intranasal, las ratas experimentaron punción cisternal y se aspiraron 70-100 \mul de LCR. Se midió después el ^{125}I-IGF-I en el LCR mediante recuento gamma.

Resultados

Las ratas administradas con ^{125}I-IGF-I mediante administración intranasal mostraron un transporte significativo del marcaje a la médula espinal (véase la Tabla 1). Las concentraciones de ^{125}I-IGF-I fueron mayores en la región cervical (aproximadamente 4 nM) y exhibieron un gradiente decreciente de forma caudal, con una concentración en la médula torácica de aproximadamente 0,7 nM. La Tabla 2 muestra un experimento de control en el que se administró por vía intravenosa ^{125}I-IGF-I con concentraciones muy bajas de marcaje que alcanzan la médula espinal (concentración de 2-3 órdenes de magnitud menor que la observada después de la administración intranasal de una dosis que proporciona niveles en sangre similares). Los análisis de LCR después de la administración intranasal no consiguieron mostrar marcaje detectable en el LCR (véase la Tabla 3).

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TABLA 1 Suministro de ^{125}I-IGF-I a la médula espinal después de administración intranasal (análisis estadístico para la médula espinal (los valores enumerados son concentraciones de ^{125}I-IGF-I))

^{125}I-IGF-I administrado (nmol)	Médula espinal cervical (nM)	Médula espinal torácica (nM)	Sangre (nM)
7,4	0,46	0,09	0,27
7,4	3,82	1,16	0,7
8,2	7,3	0,91	0,92
media	3,86	0,72	0,63
error típico	1,97	0,32	0,19

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TABLA 2 Administración intravenosa de ^{125}I-IGF-I

^{125}I-IGF-I administrado (nmol)	Médula espinal cervical (nM)	Médula espinal torácica (nM)	Sangre (nM)
14,75	0,0062	0,0072	0,33

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TABLA 3 Niveles en líquido cefalorraquídeo después de administración intranasal de ^{125}I-IGF-I

^{125}I-IGF-I administrado (nmol)	Muestra de LCR (\mul)	LCR (nM)	Sangre (nM)
12,8	92,5 (17 min tras admin.)	ND	1,6
12,4	67,4 (2 min tras admin.)	ND	1,2
ND: no detectado

Conclusiones

Se suministra IGF-I a la médula espinal mediante administración intranasal. Esto indica la utilidad de la administración intranasal no invasiva para suministrar agentes neurotróficos terapéuticos a la médula espinal. La administración intranasal de IGF-I no dio como resultado el suministro al líquido cefalorraquídeo, lo que indica un sistema de transporte desde la submucosa nasal al cerebro y la médula espinal, excluyendo el líquido cefalorraquídeo. Esto sugiere que los canales linfáticos, así como quizás las rutas hemangiolinfáticas, son el mecanismo más probable para el transporte de IGF-I a la médula espinal desde la submucosa nasal.

Ejemplo 3 Administración intranasal de IGF-I mediante el nervio trigémino Introducción

Administrar factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I) por vía intranasal puede suministrar este agente neurotrófico al cerebro o la médula espinal mediante el nervio trigémino de un animal.

Materiales y métodos

Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho de 200-310 g con pentobarbital intraperitoneal (40 mg/kg). Se evalúa el suministro de fármaco al cerebro y la médula espinal a lo largo del nervio trigémino después de la administración intranasal de 7,4-8,2 nmol de ^{125}I-IGF-I en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Se dispusieron las ratas sobre sus lomos y se les administraron \sim25 \mul de ^{125}I-IGF-I a cada orificio nasal durante 15-20 minutos, alternando las gotas cada 2-3 minutos entre los orificios nasales izquierdo y derecho. Posteriormente, las ratas experimentaron perfusión-fijación minutos después de la terminación de la administración de ^{125}I-IGF-I. La perfusión-fijación se realizó con 50-100 ml de solución salina fisiológica seguida de 500 ml de fijador que contenía 1,25% de glutaraldehído y 1% de paraformaldehído en tampón fosfato de Sorenson 0,1 M, pH 7,4, antes de la disección y la medida del ^{125}I mediante recuento gamma. Las zonas diseccionadas incluían el nervio trigémino, zonas cerebrales seleccionadas y la médula espinal.

Resultados

Se localizó el IGF radiomarcado en el cerebro, el tronco cerebral, la médula espinal y a lo largo del nervio trigémino. Se observaron cantidades significativas de IGF-I radiomarcado en el nervio trigémino de dos ratas que recibieron IGF-I por vía intranasal. La porción del nervio más cercana a la cavidad nasal mostró las concentraciones más altas (103-461 nM), mostrando las otras partes del nervio más cercanas al punto de salida del nervio de la protuberancia ventral concentraciones significativas, pero menores, de IGF-I (29-186 nM).

Los resultados de los estudios realizados según los ejemplos 1-3 se reúnen en la Tabla 4 a continuación. Estos resultados muestran las concentraciones de IGF-I en diversos tejidos del SNC.

Conclusiones

Estos resultados indican el transporte directo del IGF-I a lo largo de la ruta neural trigeminal.

TABLA 4 Concentración de radiomarcaje (nM) en diferentes regiones cerebrales y sangre después de la administración intranasal de ^{125}I-IGF-I

Región cerebral	Concentración (nM)
Membrana dural dorsal	85,9 \pm 23,84^{d}
Membrana dural ventral	91,9 \pm 23,51^{d}
Bulbo olfatorio	5,0 \pm 0,96^{a}
Núcleo olfatorio anterior	2,8 \pm 1,0^{b}
Córtex frontal	1,6 \pm 0,44^{c}
Formación hipocámpica	0,53 \pm 0,15^{c}
Caudado-putamen	0,09 \pm 0,09^{c}
Diencéfalo	0,54 \pm 0,22^{d}
Cerebro medio	0,51 \pm 0,18^{c}
Protuberancia	0,52 \pm 0,20^{a}
Nervio trigémino distal (V1, V2)	169,1 \pm 61,09^{e}

TABLA 4 (continuación)

Región cerebral	Concentración (nM)
Nervio trigémino proximal (V1, V2)	151,71 \pm 23,0^{e}
Nervio trigémino (V3)	99,58 \pm 32,76^{e}
Membrana dural del nervio trigémino	4.136,25^{f}
Cerebelo	0,52 \pm 0,22^{a}
Médula	1,2 \pm 0,48^{a}
Médula espinal cervical	2,97 \pm 1,22^{a}
Médula espinal torácica	0,37 \pm 0,17^{a}
Médula espinal lumbar	0,13 \pm 0,06^{b}
Membrana dural de la médula espinal	9,44 \pm 3,11^{b}
Los valores se reseñan como media \pm error típico; membrana dural trigeminal: media de dos medidas.
^{a} n= 7; ^{b} n= 6; ^{c} n= 5; ^{d} n= 3; ^{f} n= 2.

Ejemplo 4 Efectos biológicos del IGF-1 en el SNC después de administración intranasal Introducción

Se monitorizaron los efectos biológicos después de administración intranasal para demostrar que esta ruta consigue niveles biológicamente relevantes de IGF-I en el SNC.

Materiales y métodos

Se administró IGF-I generalmente como se describe en los ejemplos 1-3 anteriores, y a dosis de 7,4 nmol y 74 nmol. Después de sacrificar las ratas, se retiraron tejidos del SNC, se fijaron y se analizaron mediante métodos inmunohistoquímicos. La inmunohistoquímica se realizó mediante métodos conocidos en la técnica. Se incubaron las secciones de tejido relevantes con proteínas reconocedoras de anticuerpo que tienen restos tirosina fosforilados, seguido de tinción con DAB. Se perfundieron, congelaron y extrajeron otros tejidos del SNC para realizar electroforesis en gel y una transferencia Western, de nuevo mediante métodos conocidos en la técnica.

Resultados y discusión

A ambas dosis, la administración de IGF-I aumentó la fosforilación de proteína tirosina en el SNC y aumentó la fosforilación de receptor de IGF-I en el SNC.

La administración de IGF-I aumentó la fosforilación de proteína tirosina en el bulbo olfatorio, el cerebelo y la médula espinal cervical superior. En el bulbo olfatorio, la fosforilación era claramente evidente en la capa glomerular y en los cuerpos celulares mitrales. En el cerebelo, la fosforilación era claramente evidente en la capa molecular y en la capa de células de Purkinje. En la médula espinal, la fosforilación era claramente evidente en el asta dorsal superficial/núcleo V medular. La administración de IGF-I dio como resultado la fosforilación de la subunidad \beta del receptor de IGF-I y de la proteína p^{130cas}.

La observación de estos efectos biológicamente relevantes de IGF-I en el SNC indica que la administración nasal suministra cantidades terapéuticamente eficaces de este agente neurológico al SNC.

Ejemplo 5 Administración intranasal de NGF al sistema nervioso central (cerebro y médula espinal) Introducción

Administrar factor de crecimiento nervioso (NGF) por vía intranasal es un medio eficaz para suministrar este agente neurotrófico al cerebro y la médula espinal de un animal.

Material y métodos

Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho de 200-310 g con uretano intraperitoneal (1,1 g/kg), se dispusieron en posición supina y después se les administraron aproximadamente 0,4 ó 4 nmol de NGF de ratón marcado con ^{125}I durante un periodo de 30 minutos, esencialmente como se describió anteriormente por Frey et al. [1997, Drug Delivery 4: 87-92]. Se administró el ^{125}I-NGF en forma de gotas nasales, 50 \mul por orificio nasal. La perfusión vascular con solución salina fisiológica y fijador aldehído se inició poco después de la terminación de la administración de ^{125}I-NGF. Se analizó en tejidos de cerebro, médula espinal y periféricos seleccionados la captación de NGF mediante recuento gamma.

Resultados

Se observó la rápida aparición de radiomarcaje en el cerebro y la médula espinal. La concentración de ^{125}I-NGF fue mayor en la región cervical de la médula espinal que en la región torácica, y mayor en la región torácica que en las regiones lumbar o sacra (Tabla 4). La concentración encontrada en la médula espinal era dependiente de la dosis.

TABLA 5 Concentración de ^{125}I-NGF (pM) en la médula espinal después de administración olfatoria

	R411	R412	R416
Dosis (nmol)	0,413	3,78	4,497
Médula espinal
Cervical	17	700	610
Torácica	15	370	350
Lumbar	11	210	110
Sacra	11	170	120

Se encontraron altas concentraciones de ^{125}I-NGF en la membrana dural que rodea cada uno de los siguientes: los bulbos olfatorios, las regiones dorsal y ventral del cerebro, el nervio trigémino y la médula espinal (Tablas 5 y 6). Los nódulos linfáticos cervicales profundos contenían muy altas concentraciones de ^{125}I-NGF, así como la arteria carótida primitiva.

El nervio trigémino mismo contenía también altas concentraciones de ^{125}I-NGF (Tabla 6).

Conclusiones

Los resultados demuestran que la administración intranasal es un método eficaz de suministro de NGF al cerebro, al nervio trigémino y a la médula espinal. Aunque los estudios anteriores habían mostrado claramente suministro al bulbo olfatorio y a otras regiones del cerebro, esta es la primera demostración de suministro no invasivo de NGF a la médula espinal. Esto es importante, ya que el NGF es incapaz de cruzar la barrera hematoencefálica, y por tanto no se ha suministrado anteriormente de forma no invasiva a la médula espinal.

Después de la administración intranasal, se muestra que ^{125}I-NGF está en el nervio trigémino y en la membrana dural que rodea al nervio trigémino, así como en los nódulos linfáticos cervicales profundos. Esto sugiere que el NGF administrado por vía intranasal se mueve desde la cavidad nasal a través de la mucosa nasal a los vasos linfáticos durales que viajan a lo largo del nervio trigémino y después a los vasos linfáticos que rodean la médula espinal. Por tanto, el suministro a la médula espinal puede ocurrir a lo largo de la ruta neural trigeminal. La observación de radiomarcaje en la carótida primitiva y el círculo de Willis sugiere que puede ocurrir cierto transporte también por rutas hemangiolinfáticas.

1

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Ejemplo 6 Respuesta a la dosis para la administración intranasal de NGF al cerebro Introducción

Se administraron por vía intranasal varias dosis diferentes de NGF para determinar el efecto de la dosis sobre los niveles de NGF conseguidos en el cerebro.

Materiales y métodos

Estos experimentos se realizaron generalmente como se describe en el ejemplo 4. La dosis de NGF marcado estaba en el intervalo de 2,4 a 38 nmol.

Resultados

Se ilustran los niveles de NGF en diversos tejidos cerebrales a dosis entre 2,4 y 38 nmol en las Figuras 1-5.

Discusión

Se encontró una relación lineal entre las concentraciones de NGF y las dosis administradas mediante administración nasal en las siguientes regiones cerebrales: bulbo olfatorio y su membrana dural (Figura 1 y Figura 2), epitelio olfatorio (Figura 3), médula espinal cervical (Figura 4) y nódulos linfáticos cervicales profundos (Figura 5), con el intervalo de dosis de 2,4-38 nmol. Además, la concentración de NGF en el bulbo olfatorio se encontró que se correlacionaba bien con los niveles de NGF tanto en el epitelio olfatorio como en la membrana dural de bulbo olfatorio. La relación lineal de dosis-concentración observada en este estudio no significa necesariamente que el proceso saturable mediado por receptor no esté implicado en el transporte de NGF. La dosis de NGF ensayada puede no ser suficientemente alta para saturar los receptores de NGF en el cerebro.

Ejemplo 7 Administración intranasal de FGF al sistema nervioso central (cerebro y médula espinal) Introducción

Administrar factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) por vía intranasal es un medio eficaz para suministrar este agente neurotrófico al cerebro y a la médula espinal de un animal.

Materiales y métodos

Se obtuvo FGF básico (bFGF) mediante métodos descritos anteriormente en la presente memoria. Se administró ^{125}I-bFGF por vía intranasal a ratas generalmente como se describe en los ejemplos anteriores para IGF y NGF. Después del sacrificio, se procesó el cerebro de rata para determinar la cantidad de FGF en diferentes secciones del cerebro, tanto contando el FGF marcado como mediante análisis de fósforo empleando un analizador de fósforo Packard Cyclone. Se realizó el análisis en una sección sagital a través de 1 mm lateral del cerebro. Además, se separaron ciertas porciones del SNC y se determinó la concentración de FGF en estas porciones separa-
das.

Resultados

El análisis indicó que se suministraron niveles sustanciales de bFGF al bulbo olfatorio, cerebelo y córtex frontal. El análisis indicó también poco bFGF en el tracto olfatorio y la zona ventral del cerebro.

Las concentraciones de FGF observadas en porciones separadas del SNC fueron: 1.200 pM en el bulbo olfatorio, 1.600 pM en la médula espinal cervical superior. Además, se observaron aproximadamente 200 a aproximadamente 700 pM de bFGF en otras regiones del cerebro. Se observaron concentraciones de bFGF de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 6.000 pM en el nervio trigémino.

Conclusiones

Los resultados demuestran que la administración intranasal es un método eficaz de suministrar FGF al cerebro, al nervio trigémino y a la médula espinal. Las concentraciones suministradas están en exceso de las que se creen necesarias para la actividad biológica del FGF (10-100 pM). La alta concentración de FGF en el nervio trigémino sugiere que este agente se suministra mediante transporte a lo largo de una ruta nerviosa trigeminal.

Debe observarse que, como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a una composición que contiene "un compuesto" incluye una mezcla de dos o más compuestos. Debe observarse también que el término "o" se emplea generalmente en su sentido que incluye "y/o" a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. La invención se ha descrito con referencia a diversas realizaciones y técnicas específicas y preferidas.

Claims (27)

1. Uso de un agente neurotrófico o variante biológicamente activa del mismo en la fabricación de un medicamento para suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo al sistema nervioso central de un mamífero mediante una cavidad nasal, comprendiendo dicho medicamento una dosis unitaria de 0,1 nmol a 1.000 nmol de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo, en el que la administración de dicho medicamento a dicha cavidad nasal de dicho mamífero proporciona el transporte de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo al sistema nervioso central de dicho mamífero en una cantidad eficaz para proporcionar un efecto protector o terapéutico a una célula del sistema nervioso central, estando seleccionado dicho agente neurotrófico del grupo constituido por un factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), un factor de crecimiento nervioso (NGF) y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y teniendo dicha variante biológicamente activa del mismo al menos un 70% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de dicho agente neurotrófico, y en el que dicha variante biológicamente activa de IGF es una variante biológicamente activa de factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I).

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la administración de dicho medicamento a dicha cavidad nasal da como resultado una cantidad terapéuticamente eficaz de 10^{-11} M a aproximadamente 10^{-9} M de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo en una porción del sistema nervioso central.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la administración de dicho medicamento a dicha cavidad nasal proporciona el transporte de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo a vasos linfáticos asociados al sistema nervioso central.

4. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la administración de dicho medicamento a dicha cavidad nasal proporciona el transporte de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo a un bulbo olfatorio, una formación hipocámpica, un córtex frontal, un cerebro medio, un tronco cerebral, una médula espinal o una combinación de los mismos.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende un líquido, un polvo, un pulverizador, un gel, un ungüento, una infusión o una combinación de los mismos.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende una sustancia que tiene afinidad por un sitio receptor en una neurona.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, una micela lipófila, un liposoma o una combinación de los mismos.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que la micela lipófila o liposoma comprende un gangliósido, una fosfatidilcolina, una fosfatidilserina, lipofectina, DOTAP o una combinación de los mismos.

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende un polímero de liberación controlada.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que el polímero comprende poli(etileno-co-acetato de vinilo).

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha administración comprende aplicar el medicamento al tercio superior de la cavidad nasal.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que dicha administración comprende aplicar el medicamento a una zona olfatoria en el tercio superior de la cavidad nasal.

13. Uso según la reivindicación 11, en el que dicha administración comprende aplicar el medicamento al techo de una nariz.

14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho mamífero es un ser humano.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que dicho medicamento comprende aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 1.000 nmol de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que dicho medicamento comprende aproximadamente 1 nmol a aproximadamente 300 nmol de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo.

17. Uso según la reivindicación 15, en el que dicho medicamento comprende aproximadamente 300 nmol a aproximadamente 700 nmol de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo.

18. Uso según la reivindicación 15, en el que dicho medicamento comprende aproximadamente 700 nmol a aproximadamente 1.000 nmol de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo.

19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho factor de crecimiento similar a la insulina es factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I).

20. Uso según la reivindicación 19, en el que dicho IGF-I es IGF-I humano, y dicha variante biológicamente activa del mismo tiene al menos un 70% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de IGF-I humano.

21. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho FGF es FGF básico (FGF-2).

22. Uso según la reivindicación 21, en el que dicho FGF-2 es FGF-2 humano, y dicha variante biológicamente activa del mismo tiene al menos un 70% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica del FGF-2 humano.

23. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho NGF es NGF humano, y dicha variante biológicamente activa del mismo tiene al menos un 70% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de NGF humano.

24. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 19-23, en el que dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo se produce recombinantemente.

25. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la administración de dicho medicamento a dicha cavidad nasal proporciona el transporte de dicho agente neurotrófico o dicha variante del mismo al sistema nervioso central del mamífero en una cantidad eficaz para tratar una afección neurológica, un trastorno del sistema nervioso central, un trastorno psiquiátrico o una combinación de los mismos.

26. Uso según la reivindicación 25, en el que la afección o trastorno comprende un trastorno neurodegenerativo, un trastorno afectivo, daño nervioso por un trastorno cerebrovascular, una infección del SNC o una combinación de los mismos.

27. Uso según la reivindicación 25, en el que la afección o trastorno comprende enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, demencia de cuerpos de Lewy, esclerosis múltiple, ataxia cerebelar, parálisis supranuclear progresiva, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos afectivos, trastornos de ansiedad, esquizofrenia, apoplejía en el cerebro, apoplejía en la médula espinal, meningitis, infección por VIH del sistema nervioso central, un tumor cerebral, un tumor de la médula espinal, una enfermedad priónica, anosmia, lesión cerebral, lesión de la médula espinal o una combinación de los mismos.