ES2227844T3 - Formulacion de ngf microencapsulada de liberacion lenta. - Google Patents
Formulacion de ngf microencapsulada de liberacion lenta.Info
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Abstract
Se proporcionan composiciones de microencapsulación de NGF que tienen características de liberación controlada preferiblemente con estabilidad aumentada para el componente NGF, particularmente el NGF recombinado humano (rhNGF) que se utiliza para estimular el crecimiento, reparación, supervivencia, diferenciación, maduración o la función de las células nerviosas. Se proporcionan también procedimientos de fabricación y utilización de dichas composiciones.
Description
Formulación de NGF microencapsulada de liberación
lenta.
Esta invención está relacionada con formulaciones
de factor de crecimiento nervioso ("NGF") y con su utilización
para la inducción de crecimiento celular nervioso, diferenciación,
supervivencia, reparación, maduración o funcionamiento in
vitro, in vivo o ex vivo. Más particularmente,
esta invención está relacionada con composiciones de
microencapsulación que tienen características de liberación
controlada, preferiblemente con estabilidad incrementada, para el
componente NGF, particularmente el NGF humano recombinante
("rhNGF"). Se proporcionan procedimientos para la preparación y
utilización de las citadas composiciones.
El factor de crecimiento nervioso (NGF) es un
factor neurotrófico necesario para el crecimiento y la
supervivencia de las neuronas simpáticas y sensoriales, durante el
desarrollo y en animales maduros (Thoenen et al., Physiol.
Rev. 60:1284-1335 (1980)). El
Pro-NGF y el NGF puede ser encontrado como un
complejo 75 que puede contener iones de zinc (Journal of Molecular
Biology, 239(3); 385-400 (1994) y J.
Histochem. Cytochem. 35(5):579-583 (1987)).
Entre las indicaciones clínicas para el NGF humano recombinante se
incluyen la neuropatía sensorial periférica y la enfermedad de
Alzheimer. Por ejemplo, se ha demostrado que la administración
generalizada de NGF reduce la neuropatía inducida por la
administración de cisplatino y taxol en ratones (Apfel, et
al., Ann. Neurol. 28:87-90 (1991); Apfel et
al., Ann. Neurol. 31:76-80 (1992)). En ensayos
clínicos recientes, se ha administrado el NGF a humanos para mejorar
la función sensorial en neuropatías de tipo diabético (Petty et
al., Ann. Neurol. 36:244-246 (1994)). Si bien
resulta no tóxico y eficaz, se ha informado acerca de que la
administración de NGF en formulaciones líquidas parenterales está
asociada con hiperalgesia en el punto de aplicación de la inyección
y, en particular, con mialgesia en los ensayos clínicos
actuales.
La administración intracerebroventricular (ICV)
de rhNGF puede prevenir la degeneración de las neuronas
colinérgicas prosencefálicas basales en ratas y en monos que
presentan lesiones fimbria-fornex (Koliatsos et
al., Exp. Neurol. 112:161-73 (1991); Koliatsos
et al., Ann. Neurol. 30: 831-40 (1991));
Tuszynsli et al., Ann. Neurol. 30:626-36
(1991)). Los estudios han demostrado que la administración ICV de
rhNGF puede reforzar la actividad de la acetilcolinatransferasa y
mejorar la memoria espacial en ratas de edad avanzada (Williams,
Neurobiol. Aging 12. 39-46 (1991); Fisher et
al., J. Neurosci. 11(7):1889-1906
(1991)). El suministro ICV de rhNGF a través de la barrera
hematoencefálica se ha conseguido mediante jeringa, reservorio
Ommaya® o bomba Alzet. Para el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer, se ha considerado la utilización de bombas de infusión
implantables con catéteres para suministrar el rhNGF de forma
directa y continua al ventrículo del cerebro. No obstante, se ha
observado que el rhNGF se degrada a través de la desamidación y la
formación de isoaspartato, en algunas bombas implantables a 37ºC
(condición fisiológica), tal y como se determina por medio de
RP-HPLC. La estabilidad del NGF, particularmente en
líquidos, se ve complicada, más allá de las rutas de degradación
químicas y físicas, como resultado de la estructura dímera del NGF.
La estabilidad proteínica puede verse complicada adicionalmente
cuando la proteína recombinante es una mezcla de variaciones de NGF
sujetas a C terminales. Si bien el NGF existe habitualmente en
forma de dímero (la estructura cristalina del NGF murino muestra 3
pares antiparalelos de hebras b, las cuales forman una superficie
plana, a través de la cual dimerizan los monómeros (McDonald, et
al., Nature 354:411-414(1991); la
constante de disociación dímera es \leq 10^{-13}M (Bothwell
et al., J. Biol. Chem., 252:8532-8536
(1977); Timm et al., Biochem. 33: 4667-4676
(1994); se ha observado un orden de acumulación de NGF más elevado.
El documento WO 96/40072A trata acerca de la liberación controlada
biocompatible con composiciones poliméricas que presentan
partículas de hormona de crecimiento humano estabilizadas con
cationes metálicos.
Por consiguiente, existe la necesidad de disponer
de formulaciones que contengan NGF, las cuales mantengan la
estabilidad y la actividad del NGF, a la vez que proporcionen
medios para el tratamiento de una diversidad de dolencias,
resultando eficaces para la administración terapéutica a mamíferos,
en particular a sujetos humanos, y en particular para la
administración intracerebral. Las ventajas de la presente invención
satisfacen estas necesidades, al igual que otras.
La presente invención está basada en el hallazgo
de condiciones de formulación y procedimientos para la liberación
sostenida controlada del NGF, con velocidades de liberación
iniciales bajas y estabilidad reforzada del NGF durante el período
de liberación. Se proporciona una formulación de liberación
sostenida controlada de NGF, la cual proporciona una baja velocidad
de liberación inicial y conserva una estabilidad reforzada de NGF,
para inducir, de forma eficaz, el crecimiento celular nervioso, la
supervivencia, la diferenciación, la maduración, la reparación o el
funcionamiento in vitro, in vivo o ex vivo. Se
proporciona una formulación de liberación controlada que contiene
microesferas poliméricas que contienen NGF o sus formas creadas
mediante ingeniería genética, especialmente el NGF humano,
preferiblemente la forma 118, la cual demuestra una pérdida muy
pequeña de actividad o de acumulación durante el período de
liberación. En realizaciones preferidas, las formulaciones contienen
NGF complejado con Zn. En diversas realizaciones, las
formulaciones, que presentan características de liberación
sostenida controlada, presentan estabilidad reforzada a la
agitación, a la congelación, a la descongelación, a la luz y al
almacenamiento.
Se describen sistemas poliméricos de liberación
controlada en los cuales el NGF conserva una actividad biológica
útil y es liberado a lo largo de un período prolongado de tiempo,
de al menos un día, más habitualmente de una a dos semanas, después
de la administración. En la realización preferida, las microesferas
poliméricas de NGF son preparadas utilizando temperaturas muy frías
para congelar las mezclas polímero-NGF en forma de
microesferas poliméricas con una conservación muy elevada de la
actividad biológica y material. El NGF es primero complejado
preferiblemente en solución con un metal y, opcionalmente, mezclado
con un poliol estabilizante (y con una carga creciente de NGF), tal
como la trehalosa o el manitol y secado, preferiblemente secado por
congelación mediante rociado. El polvo seco es mezclado con un
polímero, preferiblemente una poli(lactida) o un copolímero,
disuelto en un disolvente, tal como acetato de etilo o cloruro de
metileno. La mezcla polímero/NGF es atomizada en el interior de un
recipiente que contiene un material congelado no disolvente, tal
como etanol, revestido con un gas licuado, tal como nitrógeno, a
una temperatura situada por debajo del punto de congelación de la
solución o suspensión de agente activo/polímero. Las partículas
atomizadas congelan en forma de microesferas cuando entran en
contacto con el gas licuado frío, después se hunden en la capa de
no disolvente congelada. El material no disolvente congelado es
después descongelado. El disolvente en las microesferas también se
descongela y es extraído lentamente hacia el no disolvente, dando
como resultado microesferas endurecidas que contienen NGF.
Se proporcionan realizaciones en las cuales la
liberación sostenida de NGF biológicamente activo procedente de las
microesferas, in vitro, ex vivo o in vivo, se
extiende a lo largo de un período de una semana a tres meses. El
perfil de liberación puede ser obtenido por medio de inclusión de
modificadores de la degradación de polímeros, agentes formadores de
poros, relaciones polímero-copolímero, y
estabilizadores de NGF, particularmente zinc.
Se proporciona también un procedimiento para la
preparación de microesferas de liberación controlada que contienen
NGF o sus formas obtenidas por medio de ingeniería genética,
preferiblemente complejados con metal, preferiblemente con zinc,
con muy pequeñas pérdidas de actividad o de material durante el
proceso de formación. Se proporciona un procedimiento para la
preparación de microesferas formadas a partir de un amplia banda de
polímeros que contienen NGF activo liberable de forma controlada, y
las microesferas producidas a través de tal
procedimiento.
procedimiento.
En el presente documento se proporciona una
formulación de NGF con consistencia reforzada para una aplicación
mejorada a la neurona o mamífero. Se proporciona una formulación de
NGF estable para ser utilizada en el tratamiento de un mamífero,
preferiblemente un humano, que precise un tratamiento de NGF con
vistas a proporcionar una cantidad eficaz de NGF. Los dispositivos
microencapsulados resultan también de utilidad en procedimientos de
cultivo celular, por ejemplo, con cultivos de neuronas primarias o
líneas celulares neuronales. Este y otros aspectos resultarán
evidentes para los expertos en la materia, a la vista de la
presente memoria y dibujos.
La Figura 1 representa un esquema que muestra una
realización para la producción de microesferas de NGF. La Figura 2
muestra una pantalla de preformulación de estabilidad de las
formulaciones de proteína secadas por congelación mediante rociado
(Proteína seca 1).
La Figura 3 muestra pantallas de preformulación
de estabilidad adicionales de formulaciones de proteínas secadas
por congelación mediante rociado (Proteínas secas II).
La Figura 4 muestra el transcurso del tiempo de
liberación de rhNGF procedente de microesferas de PLGA que
contienen diferentes cantidades de carbonato de zinc: 0 (círculos
abiertos), 3 (círculos cerrados) o 6 (cuadrados cerrados)
peso/peso. Las microesferas fueron incubadas a pH 7,0 y a 37ºC. El
tampón de liberación fue eliminado completamente y rellenado en
cada uno de los momentos puntuales. Las formulaciones que contienen
zinc proporcionan una liberación continuada de rhNGF durante 2 a 3
semanas, después del tercer día.
La Figura 5 muestra el transcurso del tiempo de
liberación de rhNGF procedente de microesferas de PGLA que
contienen diferentes cantidades de tensioactivo: 0 (círculos
abiertos), 0,01% de PF68 (círculos cerrados) ó 0,11% de PEG
(cuadrados cerrados) peso/peso. Las microesferas fueron incubadas a
pH 7,0 y 37ºC. El tampón de liberación fue extraído completamente y
rellenado en cada uno de los momentos puntuales. El tensioactivo en
la formulación de proteínas no afecta a la velocidad de liberación
de rhNGF.
La Figura 6 muestra la estabilidad del rhNGF
liberado a partir de una realización de microesferas de PLGA, en la
que el zinc fue añadido después del secado del NGF.
La Figura 7 muestra la estabilidad de las
formulaciones de NGF (118/118 rhNGF) que contienen zinc, medida
según el monómero presente (por medio de SEC) retenido después de
cuatro horas.
La Figura 8 muestra la concentración proteínica
de formulaciones de NGF que contienen zinc, después de
transcurridas cuatro semanas (concentración de proteína medida por
medio de absorbancia UV).
La Figura 9 muestra la liberación in vivo
de rhNGF a partir de microesferas de PLGA preparadas con (círculos
cerrados) y sin (cuadrados abiertos) acetato de zinc añadido a la
formulación de proteínas (preformulada con zinc). La totalidad de
microesferas se prepararon utilizando 12 KD, PLGA 50:50 no
bloqueado, y un 10% (peso/peso) de carga de proteína. El
modificador de la liberación era carbonato de zinc al 6%, el tampón
de liberación para "NGP PLGA" era acetato, pH 5,5, y para
"Zn-NGF-PLrGA" era PBS, pH
7,2.
La Figura 10 muestra el efecto de la
preformulación de Zn sobre la estabilidad de liberación de rhNGF, a
partir de microesferas de PGLA.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que el NGF formulado con un metal, tal como zinc,
en forma microencapsulada biopolimérica, presenta una marcada baja
velocidad de liberación inicial, si bien permite una liberación
sostenida controlada durante un período de tiempo superior a un día
y, habitualmente, al menos durante una a dos semanas. Además, la
formulación en solución acuosa del NGF con un metal que se une al
NGF, tal como zinc, con anterioridad a la encapsulación con
biopolímero, incrementaba de modo sorprendente la estabilidad del
NGF liberado desde estos dispositivos microencapsulados. Por
consiguiente, en una realización preferida, el NGF es formulado con
el metal en solución con anterioridad al secado o mezclado con
polímeros de microencapsulación o modificadores de liberación. Si
bien tan solo unas pocas proteínas han sido formuladas con un modo
de liberación controlado, la liberación controlada a la velocidad
deseada y durante un período de tiempo deseado resulta difícil de
alcanzar. Por ejemplo, se ha informado acerca de que el rhGH puede
formar un complejo con zinc y puede ser estabilizado complejando la
proteína con acetato de zinc durante el proceso de fabricación de
las microesferas y durante la subsiguiente liberación in
vivo (Johnson et al., Nature Medicine
2:795-799 (1966)). No obstante, las condiciones
utilizadas para encapsular un fármaco no tienen que dar como
resultado la degradación del fármaco que tiene que ser suministrado
ni el fármaco tiene que reaccionar con la matriz polimérica, con
vistas a inactivar o unir el fármaco. Para una situación clínica,
el medio de suministro debe tener una efectividad de coste de
producción, deber resultar estable al almacenamiento y administrable
utilizando una metodología estándar. Estas necesidades han sido
cumplidas por la presente invención.
El término "poliol", tal y como se utiliza
en el presente documento, denota un hidrocarburo que incluye al
menos dos hidroxilos unidos a átomos de carbono. Los polioles
pueden incluir otros grupos funcionales. Los polioles tienen,
preferiblemente, un peso molecular situado por debajo de
aproximadamente 70.000 kD. Entre los ejemplos de polioles que
resultan de utilidad para la práctica de la presente invención se
incluyen alcoholes de azúcar, tales como el manitol y la trehalosa
y poliéteres tales como el polietilenglicol. Ver el documento de
patente USA nº. 5.589.167, concedida el 31 de diciembre de 1996, el
cual se incorpora al presente documento a título de referencia. El
NGF puede ser estabilizado frente a la desnaturalización cuando es
tratado con un disolvente orgánico, mediante el mezclado del
polipéptido con un poliol, preferiblemente con un alcohol de azúcar
y, más preferiblemente, con trehalosa, manitol o sacarosa y, muy
preferiblemente, con trehalosa.
El término "poliéter", tal y como se utiliza
en el presente documento, denota un hidrocarburo que contiene al
menos tres enlaces éter. Los poliéteres pueden incluir otros grupos
funcionales. Entre los poliéteres que resultan de utilidad para la
práctica de la invención se incluye el polietilenglicol (PEG).
El término "polipéptido seco", tal y como se
utiliza en el presente documento, denota un polipéptido que ha sido
sometido a un procedimiento de secado, tal como liofilización, de
tal forma que al menos el 50% de la humedad ha sido eliminada.
El término "encapsulación", tal y como se
utiliza en el presente documento, denota un procedimiento para la
formulación de un agente terapéutico, tal como un polipéptido en
una composición (dispositivo microesfera), que resulta de utilidad
para la liberación controlada del agente terapéutico. Entre los
agentes de materiales de encapsulación que resultan de utilidad en
la presente invención se incluyen polímeros o copolímeros de ácidos
lácticos y glicólicos, o mezclas de los citados polímeros y/o
copolímeros, identificados habitualmente como
"polilactidas".
El término "mezclado", tal y como se utiliza
en el presente documento, denota la adición de un excipiente a un
polipéptido de interés, tal como el mezclado de reactivos secos o
el mezclado de un reactivo seco con un reactivo en solución o en
suspensión, o el mezclado de formulaciones acuosas de reactivos.
El término "excipiente", tal y como se
utiliza en el presente documento, denota un agente no terapéutico
añadido a una composición farmacéutica para proporcionar una
consistencia deseada o un efecto estabilizante.
El término "disolvente orgánico", tal y como
se utiliza en el presente documento, pretende significar cualquier
disolvente líquido que tenga como base el carbono. Entre los
ejemplos de disolventes se incluyen cloruro de metileno, acetato de
etilo, dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, dimetilformamida y
etanol. Tal y como se utiliza en el presente documento, los
términos "alcoholes" y "disolventes alcohólicos"
adquieren significado en el sentido de la terminología
habitualmente utilizada para los alcoholes, preferiblemente para los
alcoholes con entre 1 y 10 átomos de carbono, más preferiblemente
metanol, etanol, iso-propanol,
n-propanol, o terc-butanol, al igual
que glicerol, propilenglicol, etilenglicol, hexilenglicol,
polipropilenglicol y polietilenglicol y, muy preferiblemente,
etanol o isopropanol. Los citados alcoholes son disolventes los
cuales, cuando son añadidos a una solución acuosa, incrementan la
hidrofobicidad de la solución mediante la disminución de la
polaridad de la misma.
El "tratamiento" de un polipéptido con un
disolvente orgánico, tal y como se utiliza en el presente
documento, se refiere al mezclado de un polipéptido seco con un
disolvente orgánico o a la preparación de una emulsión de un
polipéptido en una formulación acuosa con un disolvente orgánico,
creando una interfase entre un polipéptido en una formulación
acuosa con un disolvente orgánico o extrayendo un polipéptido de
una formulación acuosa con un disolvente orgánico.
El término "microesfera" se utiliza para
identificar esferas sólidas formadas por polímeros que tienen el
NGF completamente dispersado, al igual que micropartículas y
microcápsulas, salvo que se indique lo contrario. Se hace especial
referencia a las micropartículas cuando se describen polímeros de
forma irregular o partículas polímero-fármaco. Las
microcápsulas son dispositivos poliméricos de forma esférica que
tienen un núcleo no polimérico o un núcleo de un polímero distinto
a la cubierta exterior.
La liberación "sostenida" o
"prolongada" de NGF puede ser continua o discontinua, lineal o
no lineal. Esto puede ser logrado utilizando uno o más tipos de
composiciones poliméricas, cargas de fármacos, selecciones de
excipientes o reforzadores de degradación u otras modificaciones,
administradas en solitario, en combinación o secuencialmente, para
producir el efecto deseado.
El término "NGF" se refiere al factor de
crecimiento nervioso en cualquier tipo de especie, incluyendo la
murina, bovina, ovina, porcina, equina, aviar y, preferiblemente,
la humana, en secuencia de origen natural o en una forma variante
modificada genéticamente y a partir de cualquier fuente, ya sea de
origen natural, sintética o producida recombinantemente.
Preferiblemente, el NGF se producido recombinantemente. En un
procedimiento preferido, el NGF es clonado y su DNA expresado, por
ejemplo, en células de mamíferos, en células bacterianas.
Para la utilización en humanos resulta preferida
la secuencia de origen natural, el NGF maduro, más preferiblemente
una secuencia de 120 aminoácidos e, incluso más preferiblemente, en
forma de una secuencia de 118 aminoácidos. Las secuencias de
aminoácidos preferidas para el
pre-pro-NGF humano y el NGF maduro
humano son proporcionadas por medio de la patente USA 5.288.622, la
cual es incorporada específicamente al presente documento a título
de referencia. La forma de 120 aminoácidos, sin modificaciones
post-translacionales adicionales, resulta una forma
preferida en la forma homodímera (a saber, 120/120). Incluso más
preferida resulta la forma 118, sin modificaciones
post-translacionales adicionales, particularmente
como un homodímero (a saber, 118/118). La estructura primaria de un
NGF de mamífero (NGF de ratón) fue primeramente elucidad por
Angeletti y Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Aci. USA 68:
2417(1971). La estructura primaria de su precursor,
pre-pro-NGF, ha sido deducida a
partir de la secuencia de nucleótido del ratón NGF cDNA (Scott
et al, Nature 302:538 (1983); Ulrrich et al., Nature
303:821 (1983)). El gen del NGF humano homólogo (hNGF) ha sido
también identificado (Ullrich, Symp. on Quan. Biol. ColdSpring
Harbor 48:435 (1983); patente USA 5.288.622, concedida el 22 de
febrero de 1994, la cual es incorporada al presente documento a
título de referencia). Su grado de homología con el NGF de ratón es
de aproximadamente el 90% y el 87%, sobre los niveles de secuencia
de nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente. El NGF pueden
encontrarse glicosilado o no glicosilado.
En otras realizaciones, las formulaciones de
microesferas de la presente invención incluyen NGF quimérico y
neurotrofinas pantópricas, tales como las que se relacionan en la
patente USA 5.488.099, concedida el 30 de enero de 1996. En Urfer
et al., EMBOJ 13(24):5896-909 (1994) y
en WO 95/33829, publicada el 14 de diciembre de 1995 (incorporada
al presente documento a título de referencia) en los cuales el NGF
ha sido modificado para unirse a uno o más receptores o contiene
una actividad de unión a receptores que no se encuentra normalmente
presente en un grado significativo en el NGF de origen natural.
Resultan particularmente interesantes las quimeras que tienen un
esqueleto de aminoácido NGF, pero modificado para su unión a
receptores distintos a trKA, tales como trKB o trKC. Estas formas
de NGF tienen una secuencia de aminoácidos homóloga (habitualmente
superior al 80%, preferiblemente superior al 90%, más
preferiblemente superior al 95% y, muy preferiblemente superior al
97%) en relación con la secuencia de aminoácidos de NGF, con
sustituciones que confieren otras especificidades de neurotrofina.
En la realización preferida, los dominios están sustituidos por
restos NGF; es decir, un determinado número de aminoácidos es
abandonado de la secuencia de NGF y un número idéntico o similar de
aminoácidos son sustituidos, confiriéndole una especificidad
adicional. Por ejemplo, se obtiene un NGF pantóprico con una
sustitución D16A, la cual le confiere especificidad (actividad de
unión a trKB) al BDNF, al tiempo que conserva la actividad de unión
a trKA. Resultan preferidas aquellas en las cuales las
sustituciones en aminoácidos han sido efectuadas en NGF con un
aminoácido procedente de una posición correspondiente en
NT-3, el cual es el responsable de la unión con el
receptor trKC para NT-3. Los citados mutantes NGF
presentan actividad de unión a receptores trKC similar a
NT-3, si bien conservan la conformación NGF, la
farmacocinética y el comportamiento de purificación (Urfer et
al., Biochemistry 36 (16): 4775-4781 (1997)).
Por ejemplo, se incluyen las sustituciones en la región
pre-variable 1 (V18E + V20L + G23T) y en la región
variable (Y79Q + T81K + H84Q + F86Y + K88R), lo cual permite la
actividad de unión a trKC. Las sustituciones en la región
pre-variable 1 pueden ser efectuadas tan solo con
simples sustituciones de aminoácidos en la región variable 4: por
ejemplo, V18E + V20L + G23T y pueden ser efectuadas una o más de
Y79Q, T81K, H84Q, F86Y o K88R. Estos mutantes NGF pueden ser también
preparados mediante ingeniería genética para carecer de actividad
de unión a trKA, por ejemplo, eliminando o modificando los
aminoácidos 1 a 9 N-terminales del NGF. La especie
de 109 aminoácidos (10-118)hNGF, resultante
de la pérdida de los primeros 9 restos de la terminación N y al
menos dos restos procedentes de la terminación C de NGF humano
recombinante purificado, es 300 veces menos eficaz a la hora de
desplazar el [^{125}]NGF de ratón desde el receptor trKA
humano, en comparación con el (1-118)hNGF
(Shih et al., J. Biol. Chem. 269 (44):
27679-86 (1994)). Los citados mutantes NGF
preparados mediante ingeniería genética, que se unen a trKC pero no
a trKA, resultan particularmente preferidos para ser utilizados en
la invención que se describe en el presente documento.
El aislamiento de un NGF humano recombinante
conlleva la separación de la proteína de una diversidad de
contaminantes celulares huésped. Cada uno de estos pasos conlleva
tampones especiales que permiten el que tenga lugar una separación
suficiente. El último o penúltimo paso de procesado para el NGF
resulta complicado debido a la presencia de varias variaciones de
NGF que co-purifican utilizando medios de
cromatografía convencionales. Cuando en el procedimiento de
purificación y recuperación se incluye un paso de replegamiento,
entre las variaciones se incluyen las formas mal plegadas de NGF.
Las variantes pueden también incluir aquellas que difieren
químicamente del NGF, tales como las formas carbamiladas, amidadas,
desamidadas, o rotas proteolíticamente. En el caso del NGF, estas
especies comprenden principalmente formas diméricas -homodímeros,
por ejemplo, 120/120 o 117/117, cuando se desea 118/118 o
heterodímeras, por ejemplo 120/118, 117/118- o variaciones
modificadas químicamente- isoaspartato,
mono-oxidado, variaciones de glicosilación, formas
truncadas N-terminal y C-terminal y
dímeros de las mismas (Schmeizer et al., (J. Neurochem.
59:1675-1683 (1992)); Canova-Davis
et al., In Peptides: chemistry, Structure and Biology, Escom
Science Publishers, Leiden. The Netherlands, pp (1993) (Proceedings
of the Thirteenth American Peptide Symposium, Edmonton, Alberta,
Canada, June 20-25, 1993)). Las formulaciones
preferidas son 118/118 NGF sustancialmente puros y homogéneos, sin
estas modificaciones.
A través del término "sustancialmente puro"
se quiere dar a entender un grado de pureza de NGF total a proteína
total en el que existe al menos el 70% de neorotrofina, más
preferiblemente al menos el 80%, e incluso más preferiblemente
incrementando hasta al menos el 90, 95 o 99%. Un grado de pureza
particularmente preferido es de al menos el 95%. Por el término
"esencialmente pura" se quiere dar a entender que la
composición tiene un grado de pureza de al menos el 90% o más, para
la neurotrofina deseada.
A través del término "sustancialmente exenta de
variaciones de NGF" se quiere dar a entender una composición en
la cual el porcentaje de especie NGF deseada, en relación con el
NGF total (incluyendo las especies menos deseables) es de al menos
el 70% de especies deseadas de NGF, más preferiblemente de al menos
el 80% e incluso más preferiblemente incrementando hasta un 90, 93,
95 o 99%. A través del término "esencialmente exenta" se
quiere dar a entender que la composición contiene al menos el 90% o
más del NGF deseado. Un nivel particularmente preferido es de al
menos el 95% de neurotrofina deseada, por ejemplo, la especie
118/118 rhNGH intacta, correctamente plegada. Las formas o especies
no deseables pueden ser formas microprocesadas o variaciones
químicas, por ejemplo, variaciones de carga, que resultan del
procedimiento de purificación y fermentación o, preferiblemente, la
totalidad de las indicadas anteriormente, tal y como se ha descrito
en el presente documento. Por ejemplo, cuando el NGF es plegado
in vitro después de síntesis en bacterias, las
"especies" o "variaciones" de NGF pueden incluir formas
mal plegadas o parcialmente plegadas.
A través del término "mal plegada", se
quiere dar a entender una variación del NGF que difiere del NGF
parenteral en el emparejamiento de sus restos cisteína o por los
restos cisteína particulares que están libres o bloqueados. Las
variaciones mal plegadas pueden también tener el mismo
emparejamiento de cisteína que el NGF parenteral, pero poseer una
conformación tridimensional diferente, como consecuencia del mal
plegamiento.
El término variación "química" quiere dar a
entender una variación que difiere químicamente del NGF parenteral
deseable, por ejemplo, mediante carbamilación, amidación o rotura
proteolítica.
El NGF, preferiblemente el estabilizado por
metal, tal y como se describe en el presente documento, es
formulado para liberación sostenida, preferiblemente mediante
encapsulación, preferiblemente con un polímero biodegradable, como
una microesfera. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de
liberación sostenida se incluyen las matrices semipermeables de
polímeros hidrófobos sólidos que contienen NGF, las cuales están en
forma de artículos formateados, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación
sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles, (por ejemplo,
poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), tal como
se describe por parte de Langer et al., J. Biomed. Mater.
Res. 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech.,
12:98-105 (1982) o poli(vinilalcohol)],
polilactidas (patente USA nº 3.773.919; EP 58.481), copolímeros de
ácido L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (Sidman et
al., Byopolimers, 22:547-556 [1983]); acetato de
viniletileno no degradable (Langer et al., supra),
copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales
como Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de
copolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y
ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(EP 133.988). Si bien polímeros tales como acetato de viniletileno
y ácido láctico-ácido glicólico permiten la libración de moléculas
durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan
polipéptidos durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los
polipéptidos encapsulados permanecen en organismo durante un largo
período de tiempo, los mismos pueden desnaturalizarse o acumularse
como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando como
resultado la pérdida de actividad biológica y posibles
modificaciones en la inmunogenicidad. Tal y como se ha determinado
en el presente documento, la preformulación de NGF con un metal
conserva remarcadamente la integridad del NGF durante la liberación
sostenida.
Entre los modos de liberación sostenida
alternativos para los cuales el NGF o el complejo
NGF-metal proporciona una ventaja se incluye el NGF
estabilizado por metal atrapado por liposomas. Los liposomas que
contienen polipéptidos se preparan mediante procedimientos que
resultan conocidos per se, DE 3.218.121; Epstein et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692
(1985): Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP
88.046; EP 143.949; EP 142.641; Solicitud de patente japonesa
83-118008; Pat. USA 4.485.045 y Pat. USA nº.
4.544.545; y EP 102.324. Por regla general, los liposomas son de
tipo unilamelar pequeño (entre aproximadamente 200 y 800
Angstroms), en el cual el contenido en lípidos es superior a
aproximadamente el 30% en moles de colesterol, siendo ajustada la
proporción seleccionada para la terapia óptima de análogos de
ligando. En la patente USA nº 5.013.556 se describen liposomas con
tiempo de circulación reforzado.
Las composiciones del presente documento,
incluyendo las formas liofilizadas, son preparadas en general
formulando los componentes utilizando técnicas de formulación
farmacéutica generalmente disponibles, conocidas per se. De
forma similar, se utilizan procedimientos de liofilización y equipos
habituales y bien conocidos en el estado de la técnica.
El polímero biodegradable de la presente
invención tiene baja solubilidad en agua o resulta insoluble en
agua e incluye poliésteres alifáticos, por ejemplo, homopolímeros o
copolímeros sintetizados a partir de uno o más tipos de ácidos
\alpha-hidroxicarboxílicos (por ejemplo, ácido
glicólico, ácido láctico, ácido 2-hidroxibutírico,
ácido valínico, ácido leucico, etc); ácidos hidroxidicarboxílicos
(por ejemplo, ácido málico, etc.); ácidos hidroxitricarboxílicos
(por ejemplo, ácido cítrico, etc) o sus mezclas; ésteres
poli-\alpha-cianoacrílicos, por
ejemplo, poli(\alpha-cianoacrilato de
metilo), poli(\alpha-cianoacrilato de
etilo), poli(\alpha-cianoacrilato de
butilo); etc y polímeros aminoácidos, por ejemplo,
poli(\gamma-bencil-L-glutamato)
etc, o sus mezclas. El modo de polimerización para estos polímeros
biodegradables puede ser cualquier técnica de polimerización
aleatoria, en bloque o mediante injerto.
Los polímeros biodegradables preferidos son
poliésteres alifáticos, por ejemplo, homopolímeros o copolímeros
sintetizados a partir de uno o más tipos de ácidos
\alpha-hidroxicarboxílicos (por ejemplo, ácido
glicólico, ácido láctico, ácido 2-hidroxibutírico,
etc); ácidos hidroxidicarboxílicos (por ejemplo, ácido málico) y
ácidos hidroxitricarboxílicos (por ejemplo, ácido cítrico, etc) o
sus mezclas, etc.
De entre los poliésteres alifáticos mencionados
anteriormente, resultan preferidos los homopolímeros y copolímeros
sintetizados a partir de uno o más tipos de ácidos
\alpha-hidroxicarboxílicos, a la vista de la
biodegradabilidad y la biocompatibilidad. Los poliésteres
alifáticos particularmente preferidos son copolímeros sintetizados
a partir de uno o más tipos de ácidos
\alpha-hidroxicarboxílicos. Además, estos
copolímeros pueden ser utilizados como mezclas.
Cuando los ácidos
\alpha-hidroxicarboxílicos son compuestos
quirales, pueden adoptar cualquiera de las combinaciones D-, L- y
D-,L-. Resulta preferible el que la relación de configuración D-/L-
(% en moles) esté comprendida entre aproximadamente 75/25 y
aproximadamente 25/75. El más preferido es un ácido
hidroxicarboxílico en el que la relación de configuración D-/L- (%
en moles) esté comprendida en la banda comprendida entre
aproximadamente 60/40 y aproximadamente 30/70.
Un polímero de ácido láctico (de ahora en
adelante identificado a veces como "ácido poliláctico"),
constituye un ejemplo de polímero del ácido
\alpha-hidroxicarboxílico mencionado
anteriormente. El copolímero de ácido
\alpha-hidroxicarboxílico incluye copolímeros de
ácido glicólico con otros ácidos
\alpha-hidroxicarboxílicos, tales como ácido
láctico y ácido 2-hidroxibutírico. Los copolímeros
de ácido \alpha-hidroxicarboxílico preferidos son
el copolímero ácido láctico-ácido glicólico y el copolímero ácido
2-hidroxibutírico-ácido glicólico. El copolímero
ácido láctico-ácido glicólico resulta un copolímero de ácido
\alpha-hidroxicarboxílico particularmente
preferido.
El ácido poliláctico puede tener o bien la
configuración D o la configuración L, o una mezcla de las mismas,
resultando preferida una relación (% moles) de configuración D-/L-
de aproximadamente entre 75/25 y aproximadamente 20/80. Resulta más
preferido un ácido poliláctico en el que la relación entre
configuración D-/L- (% en moles) está comprendida en la banda que va
de aproximadamente 60/40 y aproximadamente 25/75. Un ácido
poliláctico en el que la relación entre la configuración D-/L- esté
comprendida en la banda que va desde entre aproximadamente 55/45 y
aproximadamente 25/75 resulta muy preferido.
El ácido poliláctico tiene preferiblemente un
peso molecular promedio en peso, tal como se define más adelante,
de entre aproximadamente 1.500 y aproximadamente 10.000. Un ácido
poliláctico que tiene un peso molecular promedio en peso
comprendido entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 8.000
resulta más preferido. Resulta particularmente preferido un ácido
poliláctico que tenga un peso molecular promedio en peso
comprendido entre aproximadamente 3.000 y aproximadamente 6.000. La
dispersidad (peso molecular promedio en peso/peso molecular
promedio en número) del ácido poliláctico está preferiblemente
comprendida en la banda que oscila entre aproximadamente 1,2 y
aproximadamente 4,0 y, más preferiblemente, en la banda que oscila
entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente 3,5.
El ácido poliláctico puede ser producido a través
de los procedimientos del estado de la técnica descritos en el
documento EP-172636 (por ejemplo, por medio de
policondensación deshidratante en ausencia de un catalizador o
mediante policondensación deshidratante en presencia de un
catalizador ácido sólido inorgánico). El ácido poliláctico
preferido se produce mediante policondensación deshidratante en
ausencia de un catalizador.
La relación composicional (ácido láctico/ácido
glicólico, % moles) en el copolímero ácido láctico/ácido glicólico
está comprendida entre aproximadamente 100/0 (homopolímero) y
aproximadamente 40/60, preferiblemente entre aproximadamente 90/10
y aproximadamente 45/55, más preferiblemente entre aproximadamente
75/25 y 50/50, y muy preferiblemente, entre aproximadamente 60/40 y
40/60. El peso molecular promedio en peso del copolímero ácido
láctico/ácido glicólico está preferiblemente comprendido entre
aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000 y más
preferiblemente entre aproximadamente 4.000 y aproximadamente
15.000. La dispersidad (peso molecular promedio en peso/peso
molecular promedio en número) del copolímero ácido láctico/ácido
glicólico está preferiblemente comprendida entre aproximadamente
1,2 y aproximadamente 4,0 y, más preferiblemente, entre
aproximadamente 1,5 y aproximadamente 3,5. En la presente
invención, en una mezcla de cualquier relación, pueden utilizarse
dos tipos de copolímeros de ácido láctico/ácido glicólico, los
cuales difieren en la relación composicional y en el peso molecular
promedio en peso. El ejemplo típico lo constituye una mezcla de
copolímero ácido láctico/ácido glicólico en la que la relación
composicional de ácido láctico/ácido glicólico (% en moles) es de
aproximadamente 75/25 y el peso molecular promedio en peso es de
aproximadamente 6.000. Otro ejemplo lo constituye el copolímero
ácido láctico/ácido glicólico en el que la relación composicional
de ácido láctico a ácido glicólico (% en moles) es de
aproximadamente 50/50 y el peso molecular promedio en peso de
aproximadamente 4.000. La relación en peso preferida de la mezcla
está comprendida entre aproximadamente 27/75 y aproximadamente
75/25.
Los copolímeros ácido láctico/ácido glicólico
pueden ser obtenidos a través de procedimientos conocidos descritos
en el documento EP-172636 (por ejemplo,
policondensación deshidratante en ausencia de un catalizador o
policondensación deshidratante en presencia de un catalizador ácido
sólido inorgánico). El copolímero preferido es uno obtenido
mediante policondensación deshidratante en ausencia de un
catalizador.
La relación composicional del copolímero ácido
2-hidroxibutírico-ácido glicólico está comprendida
entre aproximadamente 10 y aproximadamente 75, % en moles de ácido
glicólico y el resto de % en moles de ácido
2-hidroxibutírico, más preferiblemente entre
aproximadamente 20 y aproximadamente 75% en moles de ácido
glicólico y más preferiblemente entre aproximadamente 30 y
aproximadamente 70% de % en moles de ácido glicólico. El peso
molecular promedio en peso del copolímero ácido
2-hidroxibutírico-ácido glicólico está
preferiblemente comprendido entre aproximadamente 2.000 y
aproximadamente 30.000 y, más preferiblemente, entre
aproximadamente 3.000 y aproximadamente 20.000. El peso molecular
promedio en peso que resulta particularmente preferido de copolímero
es el comprendido entre aproximadamente 4.000 y aproximadamente
15.000. La dispersidad (peso molecular promedio en peso/peso
molecular promedio en número) del copolímero ácido
2-hidroxibutírico-ácido glicólico está
preferiblemente comprendida entre aproximadamente 1,2 y
aproximadamente 4,0 y, más preferiblemente, entre aproximadamente
1,5 y aproximadamente 3,5.
Los copolímeros de ácido
2-hidroxibutírico-ácido glicólico pueden ser
obtenidos a través de procedimientos conocidos en el documento
EP-172636 (por ejemplo, mediante policondensación
deshidratante en ausencia de un catalizador o de policondensación
deshidratante en presencia de un catalizador ácido sólido
inorgánico). El copolímero preferido es uno producido mediante
policondensación deshidratante en ausencia de un catalizador.
Los copolímeros de ácido glicólico (por ejemplo,
el copolímero ácido láctico-ácido glicólico, el copolímero ácido
2-hidroxibutírico-ácido glicólico, etc) pueden ser
utilizados en combinación con un ácido poliláctico, pudiendo la
relación de copolímero de ácido glicólico/ácido láctico estar
comprendida (% en peso) entre aproximadamente 10/90 y
aproximadamente 90/10. La relación preferida está preferiblemente
comprendida entre aproximadamente 20/80 y aproximadamente 80/20,
estando la relación muy preferida comprendida entre aproximadamente
30/70 y aproximadamente 70/30.
Los términos "peso molecular promedio en
peso" y "peso molecular promedio en número", tal y como se
utilizan en la presente memoria significan el peso molecular
promedio en peso equivalente a estireno y el peso molecular promedio
en numero de una muestra, tal y como se determina por medio de
cromatografía de permeación en gel (GPC), utilizando 9 estándares
de poliestireno, que tienen un peso molecular promedio en peso de
120.000, 52.000, 22.000, 9.200, 5.050, 2.950, 1.050, 580 y 162.
Estas determinaciones pueden ser efectuadas utilizando una columna
de GPC KF804L x 2 (Showa Denko K.K.), un Monitor R1
L-3300 (Hitachi, Ltd.) y cloroformo como fase
móvil.
En la presente invención, los polímeros
biodegradables sintetizados por medio de la reacción de
policondensación deshidratante en ausencia de un catalizador
presentan grupos carboxilo libres en las terminaciones. Los citados
polímeros biodegradables que presentan grupos carboxilo libres en
las terminaciones caracterizan una correlación elevada entre el
peso molecular promedio en número, determinado a través de ensayo
titrimétrico de grupo terminal y el peso molecular promedio en
número determinado a través de ensayo GPC, utilizando poliestirenos
estándares de pesos moleculares conocidos, tal y como se ha
descrito previamente.
El peso molecular promedio en número puede ser
determinado del siguiente modo, por medio del procedimiento de
ensayo de grupo terminal. Se disuelven entre aproximadamente 1 y 3
gramos del polímero biodegradable en una mezcla de disolventes
formada por acetona (25 ml) y metanol (5 ml) y los grupos carboxilo
en la solución son valorados rápidamente con solución alcohólica de
hidróxido potásico 0,05N, utilizando fenolftaleina como indicador,
en condiciones de agitación a temperatura ambiente (aproximadamente
entre 0 y 30ºC). El peso molecular promedio en número es calculado
a través de la siguiente ecuación: peso molecular promedio en
número por ensayo de grupo terminal= 20.000 (A/B), en donde A es el
peso de la masa (g) de polímero biodegradable y B es la cantidad
(ml) de solución alcohólica de KOH añadida hasta que se alcanza el
punto final.
En el caso de un polímero biodegradable que tenga
grupos carboxilo libres en el terminal, sintetizado a partir de uno
o más tipos de ácidos \alpha-hidroxi mediante
policondensación deshidratante en ausencia de un catalizador, se
encuentra una elevada correlación entre el peso molecular promedio
en número, determinado a través de ensayo GPC, y el peso molecular
promedio en peso, determinado a través del ensayo de grupo
terminal. Como contraste, en el caso de un polímero biodegradable
obtenido a partir del dímero cíclico de un ácido
\alpha-hidroxi a través del procedimiento de
polimerización por apertura de anillo, utilizando un catalizador y
sin tener esencialmente grupos carboxilo libres en la terminación,
el peso molecular promedio en número encontrado por medio del
ensayo de grupo terminal es considerablemente más elevado que el
peso molecular promedio en número encontrado por medio de GPC. Como
consecuencia de esta diferencia, un polímero biodegradable que
tenga grupos carboxilo libres en la terminación puede ser
diferenciado rápidamente de un polímero biodegradable que no tenga
grupos carboxilo libres en la terminación.
Si bien el peso molecular promedio en número
encontrado a través del ensayo de grupo terminal es un valor
absoluto, el peso molecular promedio en número encontrado a través
del ensayo con GPC es un valor relativo que depende de muchas
variables, tales como las condiciones y procedimientos analíticos
(por ejemplo, de los tipos de fase móvil y de columna, del estándar
de referencia, de la elección de la amplitud de corte, de la
selección de la línea de base, etc) y, por lo tanto, resulta
difícil de generalizar. No obstante, existe una generalización
entre el peso molecular promedio en número encontrado y el ensayo a
través de grupo terminal y el peso molecular promedio en número
encontrado a través de ensayo con GPC, cuando el valor obtenido a
partir del ensayo de grupo terminal está dentro de la banda situada
entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2,0 veces el valor
encontrado a través del ensayo con GPC. La banda preferida está
comprendida entre aproximadamente 0,8 y aproximadamente 1,5 veces.
El hecho de que el peso molecular promedio en número encontrado a
través del ensayo del grupo final sea "considerablemente más
elevado" que el peso molecular promedio en número encontrado a
través de GPC significa que en valor encontrado a través del ensayo
de grupo final es aproximadamente más del doble del valor
encontrado a través de ensayo GPC.
En la presente invención, los polímeros
preferidos son aquellos que muestran una elevada correlación entre
el peso molecular promedio en número encontrado a través del ensayo
de grupo terminal y el peso molecular promedio en número encontrado
por medio del ensayo GPC.
Las sales metálicas que pueden ser utilizadas
para convertir un polímero biodegradable en su sal metálica no
quedan particularmente limitadas, siempre y cuando no ejerzan una
influencia no deseada o perjudicial in vivo. Entre las sales
metálicas se incluye una sal formada por un metal monovalente, tal
como los metales alcalinos (por ejemplo, sodio, potasio, etc.) o
metales alcalinotérreos (por ejemplo, calcio, magnesio, etc) o
metales polivalentes, tales como zinc (II), hierro (II, III), cobre
(II), estaño (II, IV) y aluminio (II, III), con un ácido inorgánico
o un ácido orgánico.
El metal es, preferiblemente, un metal
polivalente y, más preferiblemente, un metal alcalinotérreo y zinc.
El calcio y el zinc resultan metales particularmente
preferidos.
Entre los ácidos inorgánicos que pueden ser
utilizados en la formación de la sal metálica se incluyen el haluro
de hidrógeno (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico,
ácido yodhídrico, ácido fluorhídrico), ácido sulfúrico, ácido
nítrico, ácido tiociánico, etc.
Entre los ácidos orgánicos que pueden ser
utilizados en la formación de sales metálicas se incluyen ácidos
carboxílicos alifáticos y ácidos aromáticos. Los ácidos
carboxílicos aromáticos preferidos son los ácidos carboxílicos
alifáticos C_{1-9}, por ejemplo, los ácidos
monocarboxílicos alifáticos, los ácidos dicarboxílicos alifáticos y
los ácidos tricarboxílicos alifáticos. Los ácidos carboxílicos
alifáticos pueden ser saturados o insaturados.
Entre los ácidos monocarboxílicos alifáticos se
incluyen los ácidos monocarboxílicos alifáticos saturados
C_{1-9} (por ejemplo, ácido carbónico, ácido
acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido
caproico, ácido enentoico, ácido caprílico, ácido pelargónico,
ácido cáprico, etc) y ácidos monocarboxílicos alifáticos
insaturados C_{2-9} (por ejemplo, ácido acrílico,
ácido propiólico, ácido metacrílico, ácido crotónico, ácido
isocrotónico, etc.).
Entre los ácidos dicarboxílicos alifáticos se
incluyen ácidos dicarboxílicos alifáticos saturados
C_{2-9} (por ejemplo, ácido malónico, ácido
succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido pimélico, etc) y
ácidos dicarboxílicos alifáticos insaturados
C_{2-9} (por ejemplo, ácido maleico, ácido
fumárico, ácido citracónico, ácido mesacónico, etc).
Entre los ácidos tricarboxílicos alifáticos se
incluyen ácidos tricarboxílicos alifáticos saturados
C_{2-9} (por ejemplo, ácido tricarvalílico, ácido
1,2,3-butanotricarboxílico, etc).
Los ácidos carboxílicos alifáticos mencionados
anteriormente pueden tener, adicionalmente, 1 ó 2 grupos hidroxilo.
Constituyen ejemplos ilustrativos, el ácido glicólico, el ácido
láctico, el ácido glicérico, el ácido tartrónico, el ácido málico,
el ácido tartárico, el ácido cítrico, etc.
Los ácidos monocarboxílicos alifáticos son los
ácidos carboxílicos preferidos. Los ácidos monocarboxílicos
alifáticos C_{2-9} más preferidos son los ácidos
carboxílicos alifáticos. Resultan particularmente preferidos los
ácidos monocarboxílicos alifáticos saturados
C_{2-3}. Entre los ácidos carboxílicos alifáticos
más preferidos se incluyen el ácido acético.
Entre los ácidos aromáticos que pueden ser
utilizados en la formación de sales metálicas se incluyen el ácido
benzoico, el ácido salicílico y el ácido fenolsulfónico.
La sal metálica del polímero biodegradable puede
ser también obtenida utilizando el acetilacetonato o el óxido de
los metales polivalentes mencionados anteriormente. Los donantes
metálicos preferidos de este tipo son el acetilacetonato de zinc y
el óxido de zinc.
Las sales metálicas que pueden ser utilizadas
para convertir un polímero biodegradable en su sal metálica son
preferiblemente las sales formadas por un metal polivalente con un
ácido orgánico o inorgánico (de ahora en adelante identificada como
una sal de metal polivalente).
Entre las sales de metal polivalente que pueden
ser utilizadas se incluyen sales de zinc con un ácido inorgánico,
por ejemplo, haluros de zinc (por ejemplo, cloruro de zinc, bromuro
de zinc, yoduro de zinc, fluoruro de zinc), sulfato de zinc,
nitrato de zinc, tiocianato de zinc, etc.; sales de zinc con un
ácido orgánico, por ejemplo, sales de zinc de ácido carboxílico
alifático (por ejemplo, carbonato de zinc, acetato de zinc,
glicolato de zinc, lactato de zinc, tartrato de zinc, etc), sales
de zinc aromáticas (por ejemplo, benzoato de zinc, salicilato de
zinc, fenolsulfonato de zinc, etc.); sales de calcio con un ácido
inorgánico, por ejemplo, haluro de calcio (por ejemplo, cloruro de
calcio, bromuro de calcio, yoduro de calcio, fluoruro de calcio,
etc), sulfato de calcio, nitrato de calcio, tiocianato de calcio,
etc.; sales de calcio con un ácido orgánico, por ejemplo, sales de
calcio de ácido carboxílico alifático (por ejemplo, carbonato de
calcio, acetato de calcio, propionato de calcio, oxalato de calcio,
tartrato de calcio, lactato de calcio, citrato de calcio, gluconato
de calcio, etc) y sales de calcio aromáticas (por ejemplo, benzoato
de calcio, salicilato de calcio, etc). Las sales preferidas son el
acetato de zinc, el carbonato de zinc, el acetato de calcio y el
carbonato de calcio. Entre las sales metálicas polivalentes se
incluyen el acetato de zinc y el acetato de calcio.
En caso necesario, con vistas a obtener un
complejo homogéneo de NGF/metal, los metales relacionados con el
polipéptido bioactivo a partir de la purificación pueden ser
extraídos del polipéptido mediante procedimientos conocidos y
sustituidos por metales solubilizantes de elección.
En la presente invención, resulta preferible que
los aditivos diferentes a las sales metálicas poliméricas
biodegradables en la preparación de liberación sostenida no formen
una sal metálica.
La sal metálica de polímero biodegradable en la
presente invención puede ser obtenida mediante la emulsificación y
dispersión de una solución acuosa o de una forma sólida de una sal
metálica en una solución de disolvente orgánico de un polímero
biodegradable para preparar una emulsión agua/aceite (w/o) o
aceite/agua (o/w) o una solución orgánica o una suspensión de un
polímero biodegradable que contiene una sal metálica. Las
sustancias resultantes son lavadas y secadas o sometidas a un
procedimiento de secado en agua, un procedimiento de separación de
fase, un procedimiento de secado por rociado, o a un procedimiento
similar con lavado y secado. La sal metálica que no participa en la
formación de una sal con el polímero biodegradable en este
procedimiento es preferiblemente eliminada.
El disolvente orgánico mencionado anteriormente
tiene, preferiblemente, un punto de ebullición que no supera los
120ºC. Entre los citados disolventes orgánicos se incluyen
hidrocarburos halogenados (por ejemplo, diclorometano, cloroformo,
tetracloruro de carbono, etc), alcoholes (por ejemplo, etanol,
metanol, etc), acetonitrilo y similares. Estos disolventes pueden
ser también utilizados en forma de mezcla. Los disolventes
orgánicos preferidos son el diclorometano y el acetonitrilo. El
diclorometano constituye un disolvente particularmente
preferido.
El contenido metálico de la sal metálica de
polímero biodegradable está preferiblemente comprendido entre
aproximadamente el 0,01 y aproximadamente el 10% (peso/peso), más
preferiblemente entre aproximadamente el 0,05 y aproximadamente el
7% (peso/peso) y, muy preferiblemente, entre aproximadamente el 0,1
y aproximadamente el 5% (peso/peso). El contenido metálico de la sal
de polímero biodegradable puede ser determinado por medio de
espectrometría de absorción.
Los procedimientos para la producción de una sal
metálica de polímero biodegradable (por ejemplo, el procedimiento
de secado en agua, procedimiento de separación de fase y el
procedimiento de secado por rociación) se describen más
adelante.
Para producir una sal metálica de polímero
biodegradable a través de un procedimiento de secado en agua (un
procedimiento agua/aceite/agua o w/o/w), el polímero biodegradable
es primeramente disuelto en un disolvente orgánico para preparar
una solución de disolvente orgánico (de ahora en adelante
identificada algunas veces como la fase aceite). La concentración
de polímero biodegradable en esta solución de disolvente orgánico
es seleccionada adecuadamente según el peso molecular del polímero
y el tipo de disolvente orgánico utilizado. Por ejemplo, la
concentración de polímero biodegradable en el disolvente orgánico
puede estar comprendida entre aproximadamente el 0,01 y
aproximadamente el 90% (peso/peso), preferiblemente entre
aproximadamente el 0,1 y aproximadamente el 80% (peso/peso) y, más
preferiblemente, entre aproximadamente el 1 y aproximadamente el
70% (peso/peso). Para la fase acuosa interna, se utiliza una
solución acuosa de sal metálica. La concentración de sal metálica
puede estar comprendida entre aproximadamente el 10 y
aproximadamente el 90% (peso/volumen) y preferiblemente entre
aproximadamente el 20 y aproximadamente el 80% (peso/volumen). No
obstante, la concentración de sal metálica depende de la
solubilidad de la sal metálica en agua. La solución acuosa de sal
metálica mencionada anteriormente es dispersada y emulsionada en la
solución de disolvente orgánico del polímero biodegradable, con
vistas a proporcionar una emulsión w/o. La relación en volumen de
la solución acuosa de las sales metálicas en la solución de
disolvente orgánico del polímero biodegradable está comprendida
entre aproximadamente 1:1.000 y aproximadamente 1:1, preferiblemente
entre aproximadamente 1:100 y aproximadamente 1:2, y muy
preferiblemente entre aproximadamente 1:50 y aproximadamente 1:3.
La emulsificación puede ser obtenida a través de procedimientos
convencionales de emulsificación, tales como por medio de
utilización de un mezclador de turbina, un homogeneizador o
similares.
La emulsión w/o obtenida de esta manera es
después añadida a una fase acuosa (la fase acuosa externa) para
proporcionar una emulsión w/o/w. Seguidamente, el disolvente de la
fase aceite es eliminado por evaporación para proporcionar la sal
metálica de polímero biodegradable deseada. El volumen de la fase
acuosa externa puede ser seleccionado a partir de la banda de, por
ejemplo, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10.000 veces el
volumen de la fase aceite. La banda preferida es la comprendida
entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5.000 veces, y la banda
más preferida la comprendida entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 2.000 veces. La evaporación del disolvente puede ser
obtenida a través de procedimientos utilizados habitualmente,
incluyendo el procedimiento en el cual el disolvente es evaporado
en condiciones de presión normales o reducidas, al tiempo de llevar
a cabo agitación utilizando un agitador con hélice o un agitador
magnético, etc, y el procedimiento según el cual el disolvente es
evaporado mientras el grado de vacío de mantiene ajustado
utilizando un evaporador rotatorio y similares.
A la fase acuosa externa se le puede adicionar un
emulsionante. El emulsionante puede ser cualquier sustancia que sea
capaz de proporcionar emulsiones w/o/w que resulten estables. Entre
los ejemplos de los citados emulsionantes se incluyen tensioactivos
aniónicos, tensioactivos no aniónicos, derivados de
polioxietileno-aceite de ricino,
polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, carboximetilcelulosa,
lecitina, gelatina, ácido hialurónico y similares. El emulsionante
preferido es alcohol polivinílico. Para su utilización en la fase
acuosa externa, pueden también utilizarse múltiples emulsionantes en
combinación, La concentración de emulsionante, en base a la fase
acuosa externa, puede ser seleccionada en la banda comprendida
entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 20% (peso/peso). La
banda preferida oscila entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente
10% (peso/peso) y la banda todavía más preferida es la comprendida
entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5% (peso/peso).
Una sal metálica, similar o diferente a una sal
metálica contenida en la fase acuosa interna puede ser añadida a la
fase acuosa externa. En tales casos, se añade preferiblemente una
sal metálica de ácido graso, en una cantidad tal que la
concentración de sal metálica en la fase acuosa externa está
comprendida entre aproximadamente el 0,01 y 20% (peso/peso) o, más
preferiblemente, entre aproximadamente el 0,1 y 10% peso/peso).
Mediante la selección cuidadosa de la concentración de la sal
metálica en la fase acuosa externa, puede ser evitada la
transferencia de la sal metálica utilizada en la fase acuosa interna
desde el polímero biodegradable hacia la fase acuosa externa.
La sal metálica de polímero biodegradable
producida de esta manera es recuperada por medio de centrifugación
con agua destilada varias veces para eliminar el emulsionante y
otros depósitos procedentes de la superficie de la sal, después
re-dispersada en agua destilada y liofilizada.
Para producir una sal metálica de un polímero
biodegradable a través de un procedimiento de secado en agua
(procedimiento aceite/agua), se prepara primeramente una solución
del polímero biodegradable en un disolvente orgánico, tal como en
el procedimiento (A). Seguidamente, se añade la sal metálica, y se
dispersa o disuelve en la solución de disolvente orgánico del
polímero biodegradable. La relación de sal metálica a polímero
biodegradable (en peso) está comprendida entre aproximadamente 5:1
y aproximadamente 1:100, preferiblemente entre aproximadamente 2:1
y aproximadamente 1:50 y, más preferiblemente, entre
aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10. La solución de
disolvente orgánico obtenida de esta manera es derramada después en
una fase acuosa y se prepara una emulsión o/w mediante la
utilización de un mezclador de turbina o similar. Seguidamente, se
evapora el disolvente de la fase aceite, tal como en el
procedimiento (A), para proporcionar la sal metálica de polímero
biodegradable. El volumen de la fase acuosa se basa en el volumen de
la fase aceite o, preferiblemente, entre aproximadamente 2 y
aproximadamente 5.000 veces. La banda más preferida es la
comprendida entre aproximadamente 5 y aproximadamente 2.000
veces.
Tal y como ocurre en el procedimiento (A), puede
añadirse un emulsionante en la fase acuosa.
A la fase acuosa se le puede añadir una sal
metálica, que resulte similar o diferente a la sal metálica que es
añadida y dispersada o disuelta en la fase aceite.
La sal metálica de polímero biodegradable
obtenida de esta manera es separada, lavada y liofilizada tal como
en el Ejemplo (A).
Para producir una sal metálica de polímero
biodegradable a través de un procedimiento de separación de fase
(procedimiento de coacervación), se le añade a la emulsión un
agente coacervante, de forma gradual, tal y como se utiliza en el
procedimiento (A) o la solución de disolvente orgánico de polímero
biodegradable que contiene la sal metálica, tal y como se utiliza en
el procedimiento (B), en condiciones de agitación para precipitar y
solidificar la sal metálica de polímero biodegradable. La cantidad
de agente coacervante utilizada está basada en el volumen de la
emulsión w/o de la sal metálica de polímero biodegradable. El
volumen utilizado está comprendido entre aproximadamente 0,01 y
aproximadamente 1.000 veces el volumen de la emulsión w/o o la
solución orgánica de polímero biodegradable, preferiblemente entre
0,05 y aproximadamente 500 veces y, más preferiblemente, entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 200 veces.
El agente coacervante puede ser una sustancia que
pertenezca a cualquiera de las categorías de polímeros, aceites
minerales o aceites vegetales, los cuales son miscibles con el
disolvente orgánico utilizado para disolver el polímero
biodegradable, pero en la cual el polímero biodegradable no es
apreciablemente soluble. Los ejemplos típicos son el aceite de
silicona, el aceite de sésamo, el aceite de soja, el aceite de
maíz, el aceite de semilla de algodón, el aceite de coco, el aceite
de linaza, el aceite mineral, n-hexano, y similares.
Los agentes coacervantes pueden ser utilizados en forma de
combinación de dos o más tipos.
La sal de polímero biodegradable obtenida de esta
forma es recuperada por medio de filtración y lavada repetidamente
con heptano o similar para eliminar el agente coacervante. La sal
es lavada después tal como en el procedimiento (A) y
liofilizada.
En la producción de una sal metálica de polímero
biodegradable mediante el procedimiento de secado en agua o el
procedimiento de coacervación, puede añadirse un antifloculante
para evitar la aglomeración de las partículas. Entre los agentes
antifloculantes que pueden ser utilizados se incluye un polisacárido
soluble en agua, tal como metanol, lactosa, glucosa, y almidones
(por ejemplo, almidón de maíz), ácido hialurónico y su sal de metal
alcalino, glicina, una proteína tal como fibrina, colágeno y una
sal inorgánica tal como cloruro sódico, hidrógenofosfato sódico y
similares.
Para producir una sal metálica de polímero
biodegradable a través de un procedimiento de secado por rociado, o
bien una emulsión agua/aceite preparada a partir de una solución
acuosa de una sal metálica y una solución de disolvente orgánico
del polímero biodegradable o una solución de disolvente orgánico o
una suspensión de polímero biodegradable que contiene la sal
metálica es aplicada mediante rociado a través de una boquilla a
una cámara de rociado de un secador por rociado, con vistas a
volatilizar el disolvente orgánico en forma de finas gotitas en un
período de tiempo muy corto y se obtiene una sal metálica fina de
un polímero biodegradable. Constituyen ejemplos de la boquilla
mencionada anteriormente una boquilla de fluido binario, una
boquilla de presión y una boquilla de disco rotatorio. Con vistas a
evitar la acumulación de sal metálica de polímero biodegradable con
la emulsión w/o o la solución de disolvente orgánico o la
suspensión de polímero biodegradable que contiene la sal metálica,
puede ser también aplicada por rociamiento, a través de otra
boquilla, una solución acuosa del antifloculante mencionado
anteriormente. La sal de polímero biodegradable obtenida de esta
manera es lavada tal como en el procedimiento (A) y, en caso
necesario, sometida de nuevo a eliminación de agua y disolvente
orgánico en condiciones de calentamiento y presión reducida.
La preparación de liberación sostenida de la
presente invención puede ser obtenida mediante la dispersión de NGF
en un disolvente orgánico que contiene la sal metálica de polímero
biodegradable y el sometimiento de la dispersión resultante a
formulación. El procedimiento de fabricación de la presente
invención puede ser utilizado con el procedimiento (A) descrito
anteriormente en el procedimiento de secado en agua (procedimiento
w/o/w), en el procedimiento de secado en agua (B) (procedimiento
o/w), en el procedimiento de separación de fase (C) (procedimiento
de coacervación), procedimiento de secado por rociado (D) o
cualquiera de las modificaciones de los mismos. El disolvente
orgánico en la solución de disolvente orgánico es preferiblemente
un disolvente con un punto de ebullición no superior a los 120ºC.
Entre los citados disolventes orgánicos se incluyen hidrocarburos
halogenados (por ejemplo, diclorometano, cloroformo, tetracloruro
de carbono, etc), alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol,
1,4-butanodiol, 1,5-pentanodiol,
etc) y acetonitrilo, entre otros. Cualquiera de los disolventes
orgánicos puede ser utilizado conjuntamente en forma de mezcla.
Cuando tiene que utilizarse un único disolvente orgánico, resultan
particularmente preferidos el diclorometano o el acetonitrilo.
Cuando tiene que utilizarse una mezcla de disolventes orgánicos,
resulta preferida una combinación de hidrocarburos halogenados (por
ejemplo, diclorometano) con acetonitrilo o un alcohol (por ejemplo,
metanol, etanol, etc). Resulta particularmente preferida en muchos
casos una combinación de diclorometano con acetonitrilo. La
relación (en volumen) de hidrocarburo halogenado, ya sea
acetonitrilo o alcohol, está comprendida entre aproximadamente 40:1
y aproximadamente 1:1, y preferiblemente entre aproximadamente 20:1
y aproximadamente 1:1.
El procedimiento de fabricación para la
preparación de liberación sostenida se describe ahora utilizando
microesferas como ejemplo.
Para producir una preparación de microesferas de
liberación controlada o sostenida utilizando el procedimiento de
secado en agua (procedimiento w/o/w), se prepara primeramente una
solución de disolvente orgánico de la sal metálica de polímero
biodegradable de la misma forma que en el procedimiento (A) descrito
anteriormente. La concentración de sal metálica de polímero
biodegradable en la solución de disolvente orgánico depende del
tipo y del peso molecular de la sal metálica del polímero
biodegradable y del tipo de disolvente orgánico. Por ejemplo, la
relación de sal metálica de polímero biodegradable a disolvente
orgánico puede estar comprendida entre aproximadamente el 0,01 y
aproximadamente el 80% (peso/peso) y está preferiblemente
comprendida entre aproximadamente el 0,1 y aproximadamente el 70%
(peso/peso) y, muy preferiblemente, entre aproximadamente el 1 y
aproximadamente el 60% (peso/peso). Para la fase acuosa interna, se
utiliza una solución acuosa de NGF. La concentración de NGF en
solución acuosa puede estar comprendida, por ejemplo, entre
aproximadamente el 0,1% (peso/volumen) y aproximadamente el 500%
(peso/volumen), preferiblemente entre aproximadamente el 1%
(peso/volumen) y aproximadamente el 400% (peso/volumen) y, más
preferiblemente, entre aproximadamente el 10% (peso/volumen) y
aproximadamente el 300% (peso/volumen). A esta solución acuosa se
le puede añadir un agente de ajuste de pH (por ejemplo, ácido
acético, ácido clorhídrico, hidróxido sódico, etc), estabilizadores
(por ejemplo, sueroalbúmina, gelatina, etc) y/o conservantes (por
ejemplo, ésteres del ácido p-hidroxibenzoico, etc).
La solución acuosa obtenida de esta forma es dispersada en la
solución de disolvente orgánico de sal metálica de polímero
biodegradable para proporcionar una emulsión w/o.
La relación (volumen/volumen) de solución acuosa
de NGF (forma dímera) a solución de disolvente orgánico de sal
metálica de polímero biodegradable está preferiblemente comprendida
entre aproximadamente 1:1.000 y aproximadamente 1:1,
preferiblemente entre aproximadamente 1:100 aproximadamente 1:5 y,
más preferiblemente, entre aproximadamente 1:50 y aproximadamente
1:5, resultando incluso más preferible entre aproximadamente 1:50 y
aproximadamente 1.10 y, muy preferiblemente, entre aproximadamente
1:50 y aproximadamente 1:20. Los intervalos comprendidos entre 1:4
y 1:50; entre 1:6 y 1:20 y entre 1:8 y 1:14 constituyen
realizaciones de utilidad, siendo particularmente preferido el
intervalo comprendido entre 1:50 y 1:20. determinadas realizaciones
que resultan de utilidad son 1:10, 1:15, 1:20 y 1:25. La emulsión
w/o obtenida de esta manera es después derramada en una fase acuosa
(fase acuosa externa) para proporcionar una emulsión w/o/w y el
disolvente en la fase aceite es evaporado para proporcionar
microesferas. A la fase acuosa externa se le puede añadir un
emulsionante. El emulsionante puede ser cualquier sustancia que
resulte generalmente capaz de proporcionar una emulsión w/o/w
estable. Específicamente, pueden utilizarse tensioactivos
aniónicos, tensioactivos no iónicos, derivados
polioxietileno-aceite de ricino,
polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, carboximetilcelulosa,
lecitina, gelatina, ácido hialurónico, etc. El emulsionante
preferido es alcohol polivinílico. Dos o más tipos de emulsionantes
pueden ser utilizados en combinación. La concentración de
emulsionante en base a la fase acuosa externa es elegida entre el
intervalo que oscila entre aproximadamente el 0,001% (peso/peso) y
aproximadamente el 20% (peso/peso), preferiblemente entre
aproximadamente el 0,01% (peso/peso) y aproximadamente el 10%
(peso/peso) y, más preferiblemente, entre aproximadamente el 0,05%
(peso/peso) y aproximadamente el 5% (peso/peso). Una sal metálica,
ya sea la misma sal que se añadió a la fase acuosa interna o una
sal diferente, puede ser añadida a la fase acuosa externa. En este
procedimiento, se añade preferiblemente una sal de ácido graso, a
los efectos de que la concentración de sal metálica de la fase
acuosa externa esté comprendida entre aproximadamente el 0,01 y
aproximadamente el 20% (peso/peso) y preferiblemente entre
aproximadamente el 0,1 y aproximadamente el 10% (peso/peso).
Modificando la concentración de la sal metálica de la fase acuosa
externa puede evitarse la migración la sal metálica utilizada en la
fase acuosa interna, desde el polímero biodegradable hacia la fase
acuosa externa.
Las microesferas obtenidas de este modo son
recuperadas por medio de centrifugación o de filtración, lavadas
repetidamente con agua destilada para eliminar el emulsionante y
otros depósitos de la superficie celular, redispersadas después en
agua destilada o similar y liofilizadas. Seguidamente, en caso
necesario, el agua residual y el disolvente orgánico en las
microesferas son nuevamente eliminados mediante calentamiento en
condiciones de presión reducida. Las microesferas son calentadas a
una temperatura situada no por debajo de la temperatura de
transición vítrea del polímero biodegradable y no tan alta como
para provocar la acumulación de las microesferas. La temperatura de
calentamiento es preferiblemente seleccionada dentro del intervalo
comprendido entre la temperatura de transición vítrea del polímero
biodegradable y aproximadamente 30ºC más elevada que la temperatura
de transición vítrea del polímero biodegradable. En el presente
documento, la temperatura de transición vítrea se define como la
temperatura de transición vítrea intermedia determinada utilizando
un calorímetro de exploración diferencial durante el calentamiento,
a una velocidad de entre 10 y 20ºC por minuto.
Para obtener una preparación de microesferas de
liberación controlada o sostenida utilizando el procedimiento de
secado en agua (procedimiento o/w), se prepara primeramente una
solución en disolvente orgánico de la sal metálica de polímero
biodegradable de la misma manera que en el procedimiento (A). La
concentración de sal metálica de polímero biodegradable en el
disolvente orgánico puede ser similar a la descrita en el
procedimiento (i). A la solución de disolvente orgánico de la sal
metálica de polímero biodegradable obtenida de este modo, se le
añade y disuelve o dispersa NGF para preparar una solución o
suspensión de disolvente orgánico que contiene la sal metálica de
polímero biodegradable y NGF. La relación en peso de NGF a sal
metálica de polímero biodegradable puede estar, por ejemplo,
comprendida entre aproximadamente 1:1.000 y aproximadamente 1:1;
preferiblemente entre aproximadamente 1:200 y aproximadamente 1:5
y, más preferiblemente, entre aproximadamente 1:100 y
aproximadamente 1:5, siendo más preferible la comprendida en el
intervalo que oscila entre aproximadamente 1:50 y aproximadamente
1:5, a pesar de que todavía resulta más preferible la comprendida
entre aproximadamente 1:50 y aproximadamente 1.10 y muy preferible
la comprendida entre aproximadamente 1:50 y aproximadamente 1:20.
Los intervalos comprendidos entre 1:4 y 1:50; 1:6 y 1:20 y 1:8 y
1:14 resultan realizaciones de utilidad, siendo particularmente
preferida la comprendida entre 1:50 y 1:20. Diversas realizaciones
que resultan de utilidad son 1:10; 1:15; 1:20 y 1:25.
Esta solución en disolvente orgánico que contiene
la sal metálica de polímero biodegradable y NGF es derramada en una
fase acuosa para preparar una emulsión aceite/agua. El disolvente
en la fase aceite es después eliminado por evaporación para
proporcionar microesferas.
Las microesferas obtenidas de esta manera son
recuperadas, lavadas y liofilizadas tal como en el procedimiento
(i). Seguidamente, las microesferas pueden ser calentadas en
condiciones de presión reducida para eliminar el agua residual y el
disolvente orgánico, tal como en el procedimiento (i).
Para obtener una preparación de microesferas de
liberación controlada o sostenida, utilizando el procedimiento de
separación de fase, se añade gradualmente un agente coacervante a
la misma emulsión w/o utilizada en el procedimiento (i) o la misma
solución de disolvente orgánico de sal metálica de polímero
biodegradable y NGF que se utilizó en el procedimiento (ii), en
condiciones de agitación como las del procedimiento (C), para
proporcionar microesferas precipitadas y solidificadas. Las
microesferas obtenidas de este modo son recuperadas y lavadas para
eliminar el agente conservante y el NGF libre, tal como en el
procedimiento (C). Seguidamente, en caso necesario, el agua
residual y el disolvente orgánico dentro de las microesferas son
eliminados por calentamiento en condiciones de presión reducida, de
la misma forma que en el procedimiento (i).
En la producción de microesferas a través del
procedimiento de secado en agua o del procedimiento de separación
de fase, puede añadirse un agente antifloculante, con vistas a
evitar la aglomeración de partículas como en el Procedimiento
(C).
Para obtener la preparación de microesferas de
liberación controlada o sostenida, utilizando el procedimiento de
secado en agua, la misma emulsión w/o que se utilizó en el
procedimiento (i) o la misma solución de disolvente orgánico que
contiene la sal metálica de polímero biodegradable y NGF, tal como
se utiliza en el procedimiento (ii), es rociada a través de una
boquilla de la misma forma que en el procedimiento (D) para
proporcionar microesferas. En caso necesario, las microesferas
obtenidas de esta forma son calentadas en condiciones de presión
reducida para eliminar el agua residual y el disolvente orgánico,
tal y como ocurre en el procedimiento (i).
En una realización preferida, el NGF es formulado
en solución acuosa con un metal (en forma de sal) que se une al
NGF, tal como zinc en forma de acetato de zinc o de carbonato de
zinc, con anterioridad a la nueva formulación con otros
modificadores de liberación, biopolímeros degradables que forman las
microesferas y similares. El tampón de solución acuosa de
metal-NGF es lo suficientemente no ácido como para
permitir que el metal se una al NGF. Preferiblemente, el pH está
comprendido entre 6,5 y 8,5, más preferiblemente entre 7 y 8 e,
incluso más preferiblemente, entre 7,2 y 7,6. Dado que el metal que
se une a NGF proporciona un medio para estabilizar el NGF liberado,
a la vez que reduce las velocidades de liberación iniciales desde
la microesfera, la adición de un poliol estabilizante, tal como
trehalosa, a la solución acuosa NGF-metal, con
anterioridad al secado por congelación resulta opcional.
El polvo de NGF-zinc secado por
congelación es procesado en forma de microesfera de liberación
controlada, tal y como se describe en el presente documento,
preferiblemente tal y como se discute en el Ejemplo 1. Dado que el
metal se añadió a la solución acuosa de NGF, la adición de un metal
como modificador de la liberación al polvo seco, con anterioridad o
mezclado con un polímero biodegradable, es opcional. No obstante,
cuando se encuentra presente, el modificador de liberación es
preferiblemente una sal de ión metálico en la cual el metal se une
al NGF, tal como un metal alcalino, un metal alcalinotérreo o un
metal polivalente, tal y como se describe en el presente documento,
más preferiblemente el modificador de liberación es zinc y el
modificador de liberación representa entre el 1 y el 10% en peso,
más preferiblemente entre el 3 y el 6% en peso.
Las sales metálicas que pueden ser utilizadas
para formulación acuosa con NGF son aquellas que se unen al NGF y
lo estabilizan, una vez liberado desde las microesferas. La sal no
resulta particularmente limitada, en tanto en cuanto la misma no
ejerza influencias perjudiciales o no deseadas in vivo. La
sal metálica incluye una sal formada por un metal monovalente, tal
como metales alcalinos (por ejemplo, sodio, potasio, etc) o metales
alcalinotérreos (por ejemplo, calcio, magnesio, etc) o un metal
polivalente, tal como zinc (II), hierro (II, III), cobre (II),
estaño (II, IV) y aluminio (II, III), con un ácido inorgánico o un
ácido orgánico. Los metal son, preferiblemente, metales
polivalentes y, más preferiblemente, metales alcalinotérreos y zinc.
El calcio y el zinc resultan metales particularmente preferidos.
Entre los ácidos inorgánicos que pueden ser utilizados en la
formación de sal metálica se incluyen haluros de hidrógeno (por
ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico,
ácido fluorhídrico), ácido sulfúrico y similares. Entre los ácidos
orgánicos que pueden ser utilizados en la formación de la sal
metálica se incluyen ácidos alifáticos carboxílicos y ácidos
aromáticos. Entre los ácidos carboxílicos alifáticos preferidos se
encuentran los ácidos carboxílicos alifáticos
C_{1-9}, por ejemplo, ácidos monocarboxílicos
alifáticos, ácidos dicarboxílicos alifáticos y ácidos
tricarboxílicos alifáticos. Los ácidos carboxílicos alifáticos
pueden ser saturados o insaturados. Los ácidos monocarboxílicos
alifáticos incluyen ácidos monocarboxílicos alifáticos saturados
C_{1-9} (por ejemplo, ácido carbónico, ácido
acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido
caproico, ácido enantoico, ácido caprílico, ácido pelargónico,
ácido cáprico, etc.) y ácidos monocarboxílicos alifáticos
insaturados C_{2-9} (por ejemplo, ácido acrílico,
ácido propiólico, ácido metacrílico, ácido crotónico, ácido
isocrotónico, etc). Entre los ácidos dicarboxílicos alifáticos se
incluyen ácidos dicarboxílicos alifáticos saturados
C_{2-9} (por ejemplo, ácido malónico, ácido
succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido pimélico, etc),
ácidos dicarboxílicos alifáticos insaturados
C_{2-9} (por ejemplo, ácido maleico, ácido
fumárico, ácido citracónico, ácido mesacónico, etc.). Entre los
ácidos tricarboxílicos alifáticos se incluyen ácidos tricarboxílicos
alifáticos saturados C_{2-9} (por ejemplo, ácido
tricarvalílico, ácido 1,2,3-butanotricarboxílico,
etc). Adicionalmente, los ácidos carboxílicos alifáticos
mencionados anteriormente pueden tener 1 ó 2 grupos hidroxilo.
Constituyen ejemplos ilustrativos el ácido glicólico, el ácido
láctico, el ácido glicérico, el ácido tartrónico, el ácido málico,
el ácido tartárico, el ácido cítrico y similares. Los ácidos
carboxílicos alifáticos preferidos son los ácidos monocarboxílicos
alifáticos. Los ácidos carboxílicos alifáticos más preferidos son
los ácidos monocarboxílicos alifáticos C_{2-9}.
Resultan particularmente preferidos los ácidos monocarboxílicos
alifáticos saturados C_{2-3}. El ácido acético
constituye el ácido carboxílico alifático más preferido. Entre los
ácidos aromáticos que pueden ser utilizados en la formación de
sales metálicas se incluyen el ácido benzoico, el ácido salicílico y
el ácido fenolsulfónico. Las sales metálicas para formulación en
solución con NGF son preferiblemente las sales formadas por un
metal polivalente con un ácido orgánico o inorgánico (identificadas
de ahora en adelante como sales de metales polivalentes).
Entre las sales de metales polivalentes que
pueden ser utilizadas se incluyen sales de zinc con un ácido
inorgánico, por ejemplo, haluros de zinc (por ejemplo, cloruro de
zinc, bromuro de zinc, yoduro de zinc, fluoruro de zinc), sulfato
de zinc, nitrato de zinc, tiocianato de zinc, etc.; sales de zinc
con un ácido orgánico, por ejemplo sales de zinc de ácidos
carboxílicos alifáticos (por ejemplo, carbonato de zinc, acetato de
zinc, glicolato de zinc, lactato de zinc, tartrato de zinc, etc),
sales aromáticas de zinc (por ejemplo, benzoato de zinc, salicilato
de zinc, fenolsulfonato de zinc, etc); sales de calcio con un ácido
inorgánico, por ejemplo, haluro de calcio (por ejemplo, cloruro de
calcio, bromuro de calcio, yoduro de calcio, fluoruro de calcio,
etc), sulfato de calcio, nitrato de calcio, tiocianato de calcio,
etc; sales de calcio con un ácido orgánico, por ejemplo, sales de
calcio con ácidos carboxílicos alifáticos (por ejemplo, carbonato
de calcio, acetato de calcio, propionato de calcio, oxalato de
calcio, tartrato de calcio, lactato de calcio, citrato de calcio,
gluconato de calcio, etc) y sales de calcio aromáticas (por ejemplo,
benzoato de calcio, salicilato de calcio, etc). Las sales
preferidas son acetato de zinc, carbonato de zinc, acetato de
calcio y carbonato de calcio. Entre las sales de metálicas
polivalentes más preferidas se incluyen el acetato de zinc y el
acetato de calcio.
La relación molar de NGF a metal es aquella que
permite estabilizar el NGF que se libera desde las microesferas,
sin provocar daños o efectos secundarios en un paciente o cultivo
celular al cual le son administradas las microesferas de NGF. La
relación molar en solución de NGF a ión metálico puede oscilar entre
1 a 4 y 1 a 50 ó, más preferiblemente, entre 1 a 6 y 1 a 20, e
incluso más preferiblemente entre 1 a 8 y 1 a 14.
En caso necesario, con vistas a formar un
complejo homogéneo NGF/metal, cualquiera de los metales que se
encuentran en el NGF desde la purificación puede ser eliminado del
polipéptido a través de procedimientos conocidos y sustituido por
el metal estabilizante de elección.
Opcionalmente presente en el NGF y la mezcla de
sal metálica se encuentra un excipiente que resulta de utilidad
para, o bien estabilizar al NGF frente a la desnaturalización
provocada por el disolvente orgánico utilizado en el procedimiento
de microencapsulación y/o para maximizar la concentración de NGF.
Habitualmente, el excipiente será un poliol de un peso molecular
inferior a aproximadamente 70.000 kD. Entre los ejemplos de
polioles que pueden ser utilizados se incluyen la trehalosa, el
manitol, y el polietilenglicol. Habitualmente, la relación en peso
de tetrahosa a polipéptido estará comprendida entre 100:1 y 1:100,
preferiblemente entre 1:1 y 1:10, más preferiblemente entre 1:3 y
1:4. Las relaciones de masa habituales de manitol a polipéptido
estarán comprendida entre 100:1 y 1:100, preferiblemente entre 1:1
y 1:10, más preferiblemente entre 1:1 y 1:2. Habitualmente, la
relación de masa de PEG a polipéptido estará comprendida entre
100:1 y 1:100, preferiblemente entre 1:1 y 1:10. Las relaciones
óptimas son seleccionadas en base a una concentración de excipiente
que permita la máxima solubilidad del polipéptido con la mínima
desnaturalización del mismo.
En la presente invención resulta preferible que
la eficacia del atrapamiento de NGF en un polímero biodegradable
sea igual al 50%. Más preferiblemente, que sea igual o mayor al 80%
y, muy preferiblemente, igual o mayor al 90%.
La concentración de NGF bioactivo presente en la
preparación de liberación sostenida en la presente invención puede
oscilar entre el 0,001 y el 50% en peso de microesfera, resultando
preferido entre aproximadamente el 0,01 y aproximadamente el 30%
(peso/peso), más preferido entre el 2 y el 20 por ciento e incluso
más preferido entre el 5 y el 15%. Resulta habitual una carga de
aproximadamente el 10% (peso/peso). La carga de NGF está limitada
por la solubilidad del NGF en agua y por el volumen de NGF acuoso
que puede ser añadido al polímero en disolvente orgánico. Volúmenes
superiores a 0,5 mL de NGF por gramo de polímero dan lugar
habitualmente a una gran explosividad inicial del fármaco desde las
microesferas. Para evitar estas dificultades, puede utilizarse una
formulación de fármaco sólida en lugar de la solución de fármaco
acuosa. Así pues, para producir microesferas resultan preferidos
los procedimientos
sólido-en-aceite-en-agua
con cargas de fármaco elevadas (superiores al 10%), con
explosividades iniciales entre bajas y moderadas. La formulación de
fármaco sólida utilizada para la microencapsulación tiene que ser
estable en disolventes orgánicos y tener un tamaño pequeño
(1-5 \mum) en relación con las microesferas
finales deseadas (10-100 \mum), con vistas a
permitir una carga elevada y una baja explosividad de fármaco. Para
formulaciones proteínicas, uno de los procedimientos para obtener
sólidos secos pequeños es el secado por rociado. Mummemthaler et
al., (Pharm. Res.
11(1):12-20(1994) describen
formulaciones de rhGH de secado por rociado. Dado que la rhGH
resulta fácilmente desnaturalizada por medio de interacciones en
superficie, tales como interfases aire-líquido, el
secado por rociado de la rhGH tiene que ser llevado a cabo con
tensioactivos en la formulación de rhGH. Sorprendentemente, tal y
como se describe en el presente documento, se averiguó que la
presencia de un metal resultaba capaz de estabilizar al NGF durante
el secado por congelación, sin necesidad de tensioactivos.
La formulación de liberación sostenida puede ser
administrada en forma de microesfera o bajo diversas formas de
dosificación, tales como preparaciones no orales (por ejemplo,
preparaciones permanentes o inyectables - intramuscular, subcutánea
o visceral; preparación nasal, rectal o
uterina-transmucosal), o preparaciones orales (por
ejemplo, cápsulas tales como cápsulas duras y cápsulas blandas,
preparaciones sólidas, tales como gránulos y polvo, preparaciones
líquidas, tales como una suspensión).
La preparación de liberación sostenida preferida
es a través de inyección. Para preparar una inyección utilizando
las microesferas obtenidas anteriormente, las microesferas pueden
ser formuladas con una solución viscosa fisiológicamente aceptable,
un dispersante (por ejemplo, un tensioactivo tal como Tween 80,
HCO-60; polisacáridos tales como
carboximetilcelulosa, alginato sódico, hialuronato sódico, sulfato
de protamina; polietilenglicol 400, etc), un conservante (por
ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, etc), un agente
isotonificante (por ejemplo cloruro sódico, manitol, sorbitol,
glucosa dextrano, etc) y un anestésico local (por ejemplo,
hidrocloruro de xilocaina, clorobutamol, etc), para proporcionar
una suspensión acuosa, o dispersada con aceite vegetal (por
ejemplo, aceite de sésamo, aceite de maíz, etc), o una mezcla de
los mismos con un fosfolípido (por ejemplo, lecitina) o
triglicéridos de ácido graso de cadena media (por ejemplo, Migriol
812), para proporcionar una suspensión aceitosa.
Cuando la preparación de liberación sostenida es
microesferas, las microesferas son preferiblemente partículas
finas. El tamaño de las microesferas para una suspensión inyectable
puede ser seleccionado a partir de la banda que esté de acuerdo con
los requerimientos para el grado de dispersión y paso a través de la
aguja utilizada para la inyección. Por ejemplo, el tamaño de
partícula de la microcápsula puede estar situado dentro de la banda
que oscila entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 300 \mum,
preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 150
\mum, más preferiblemente entre aproximadamente 2 y
aproximadamente 100 \mum y, muy preferiblemente, entre
aproximadamente 20 y 90 micras.
Entre los procedimientos de preparación de
microesferas como preparaciones estériles se incluyen, sin que ello
suponga ninguna limitación, el procedimiento en el cual el
procedimiento completo de producción es estéril, el procedimiento
en el cual se utilizan rayos gamma como esterilizante y el
procedimiento en el cual se añade un antiséptico durante el
procedimiento de fabricación.
La preparación de liberación sostenida puede ser
utilizada de forma segura en mamíferos (por ejemplo, humanos,
bovinos, cerdos, perros, gatos, ratones, conejos, etc.) con baja
toxicidad. Entre los "pacientes", a los efectos de la presente
invención, se incluyen tanto los humanos como otros mamíferos. Así
pues, los procedimientos son aplicables tanto para terapia humana
como en terapia veterinaria.
La preparación de liberación sostenida de la
invención resulta de utilidad para evitar o tratar el daño
neuronal. El factor de crecimiento nervioso tiene efectos
prominentes sobre las neuronas sensoriales y simpáticas del sistema
nervioso periférico. El NGF actúa, a través de receptores
específicos de la superficie celular, sobre las neuronas de
respuesta para apoyar la supervivencia neuronal, favorecer el
sobrecrecimiento de las neuritas y reforzar la diferenciación
neuroquímica. Las acciones del NGF van acompañadas de alteraciones
en las membranas neuronales en el estado de fosforilación de las
proteínas neuronales y en abundancia de determinados mRNA y
proteínas que juegan probablemente un papel el en funcionamiento y
en la diferenciación neuronales. (Connolly et al., J. Cell.
Biol. 90:176-180 (1981); Skaper and Varon, Brain
Res. 197:379-389 (1980); yu, et al., J. Biol.
Chem. 255:10481-10492 (1980); Halequoa and Patrick,
Cell 22:571-581 (1980); Tiercy and Shooter, J. Cell.
Biol. 103:2367-2378 (1986). Las neuronas
colinérgicas del prosencéfalo responden también a NGF y pueden
requerir NGF para apoyo trófico (Hefti, J. Neurosci. 6:2155 (1986).
Ciertamente, la distribución y la ontogénesis de NGF y su receptor
en el sistema nervioso central (CNS) sugieren que el NGF actúa como
un factor neurotrófico procedente de objetivo para neuronas
colinérgicas del prosencéfalo (Korsching, TINS, pp.
570-573 (Nov/Dec 1986)).
Por consiguiente, se considera que las
formulaciones de NGF de la invención resultan útiles para favorecer
el desarrollo, el mantenimiento o la regeneración de neuronas in
vivo, incluyendo las neuronas centrales (cerebro y médula
espinal), las periféricas, las simpáticas, las parasimpáticas, las
sensoriales y las entéricas) y las motorneuronas. Las formulaciones
de NGF de la invención son utilizadas en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de una diversidad de enfermedades y
trastornos neurológicos. En una realización preferida, las
formulaciones de la presente invención se utilizan en la
preparación de un medicamento para tratar los trastornos neurales.
Entre los ejemplos específicos de trastornos neurales se incluyen,
sin que ello suponga ninguna limitación, la enfermedad de
Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la Corea de Hungtington, el
ictus, ALS, las neuropatías periféricas y otras dolencias
caracterizadas por necrosis o por la pérdida de neuronas, ya sean
centrales, periféricas o motorneuronas, además de tratar los nervios
dañados como consecuencia de traumatismos, quemaduras, disfunción
renal, lesiones, y los efectos tóxicos de los productos de
quimioterapia utilizados para el tratamiento del cáncer y el AIDS.
Por ejemplo, las neuropatías periféricas asociadas con determinadas
dolencias, tales como las neuropatías asociadas con la diabetes, el
AIDS, o la quimioterapia, pueden ser tratadas utilizando las
formulaciones de la presente invención. Resultan también de
utilidad como un componente de medios de cultivo utilizados en el
cultivo de células nerviosas in vitro o ex vivo.
En diversas realizaciones de la invención, las
formulaciones de NGF utilizadas en la preparación de un medicamento
para el tratamiento de sistemas nervioso que han resultado sido
dañados por traumatismos, cirugía, ictus, isquemia, infección,
enfermedad metabólica, deficiencia nutricional, malignidad, o
agentes tóxicos para favorecer la supervivencia o el crecimiento de
neuronas o de cualquier dolencia que se considere tratable con NGF.
Por ejemplo, la formulación de NGF de la invención puede ser
utilizada para favorecer la supervivencia o el crecimiento de
motorneuronas que han sido dañadas por traumatismo o cirugía.
Asimismo, las formulaciones de NGF de la invención pueden ser
utilizadas en la preparación de un medicamento para tratar
trastornos motorneuronales, tales como la esclerosis lateral
amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), parálisis de Bell y
diversas dolencias que conllevan atrofia o parálisis muscular
espinosa. Las formulaciones de NGF de la invención pueden ser
utilizadas en la preparación de un medicamento para el tratamiento
de trastornos degenerativos humanos, tales como la enfermedad de
Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la epilepsia, la esclerosis
múltiple, la Corea de Huntington, el síndrome de Down, la sordera
nerviosa y la enfermedad de Meniere. Las formulaciones de NGF de la
invención pueden ser utilizadas como reforzadores cognitivos, para
reforzar el aprendizaje en el caso de demencias o traumatismos. La
enfermedad de Alzheimer, la cual ha sido identificada por parte de
los National Institutes of Aging como representando bastante más
del 50% de las demencias en personas de edad, es también la cuarta
o quita causa de conduce a la muerte en personas americanas que
tienen más de 65 años de edad. Cuatro millones de americanos, el
40% de los americanos que tienen más de 85 años de edad (el
segmento de población que más crece entre la población USA), tienen
la enfermedad de Alzheimer. El veinticinco por ciento de la
totalidad de pacientes con enfermedad de Parkinson, padecen también
demencia similar a la enfermedad de Alzheimer. En aproximadamente
el 15% de los pacientes con demencia, la enfermedad de Alzheimer y
la demencia multi-infarto coexisten. La tercera
causa más común de demencia, después de la enfermedad de Alzheimer
y la demencia vascular, son los daños cognitivos debidos a
enfermedades cerebrales orgánicas relacionadas directamente con el
alcoholismo, lo cual ocurre en aproximadamente el 10% de los
alcohólicos. No obstante, la anormalidad más consistente para la
enfermedad de Alzheimer, al igual que para la demencia vascular y
las dificultades cognitivas debidas a enfermedades cerebrales
orgánicas relacionadas con el alcoholismo, es la degeneración del
sistema colinérgico que surge del prosencéfalo basal (BF) hacia el
codex y el hipocampo (Bigl et al., en Brain Cholinergic
Systems, M. Steriade and D. Biesold, eds. Oxford University Press,
Oxford, pp. 364-386 (1990). Existen un determinado
número de otros neurotransmisores afectados por la enfermedad de
Alzheimer (Davies Med. Res. Rev. 3:221 (1983)). No obstante, las
dificultades cognitivas, relacionadas por ejemplo con degeneración
del sistema neurotransmisor colinérgico, no están limitadas a
individuos que sufren demencia. Esto ha sido también observado en,
por lo demás, personas de edad adulta y en ratas. Los estudios que
comparan el grado de dificultades de aprendizaje con el grado de
flujo sanguíneo cerebral cortical en ratas de edad avanzada
muestran una buena correlación, Berman et al., Neurobiol.
Aging 9:691 (1988)). En alcoholismo crónico, la enfermedad cerebral
orgánica, como la enfermedad de Alzheimer y el envejecimiento
normal, se caracteriza también por reducciones difusas en el flujo
sanguíneo cerebral cortical en aquellas regiones del cerebro en las
que surgen las neuronas colinérgicas (prosencéfalo basal) y en las
cuales ellas se proyectan (cortex cerebral) (Lofti et al.,
Cerebrovasc and Brain Metab. Rev. 1:2 (1989)). Tales demencias
pueden ser tratadas mediante la administración de las formulaciones
de NGF de la
invención.
invención.
Además, las formulaciones de NGF de la invención
se utilizan preferiblemente en la preparación de un medicamento
para tratar neuropatías y, especialmente, la neuropatía periférica.
La "neuropatía periférica" se refiere a un trastorno que
afecta al sistema nervioso periférico, manifestado muy habitualmente
como una o una combinación de disfunciones motoras, sensoriales,
sensorimotoras o disfunciones neurales autónomas. La amplia
variedad de morfologías mostradas por parte de las neuropatías
periféricas puede, cada una de ellas, ser atribuida especialmente a
un numero de factores igualmente amplio. Por ejemplo, las
neuropatías periféricas pueden ser adquiridas genéticamente, pueden
ser el resultado de una enfermedad generalizada o pueden ser
provocadas por un agente tóxico. Entre los ejemplos se incluyen,
sin que ello suponga ninguna limitación, la neuropatía periférica
diabética, la neuropatía sensorimotora distal, la neuropatía
asociada con AIDS, o las neuropatías autónomas, tales como la
motilidad reducida del tracto gastrointestinal o la atonía de la
vejiga urinaria. Entre los ejemplos de neuropatías asociadas con
enfermedades generalizadas se incluyen el síndrome
post-polio; entre los ejemplos de neuropatías
hereditarias se incluye la enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth, la enfermedad
de Refsum, la betalipoproteinimia, la enfermedad de Tangier, la
enfermedad de Krabbe, la leucodistrofia metacromática, la enfermedad
de Fabry y el síndrome de Dejerine-Sottas; y entre
los ejemplos de neuropatías provocadas por un agente tóxico se
incluyen las provocadas por un tratamiento con un agente de
quimioterapia, tal como la vincristina, el cisplatino, el
metotrexato o la
3'-azido-3'-desoxitimidina.
Se le administra a un paciente una dosis
terapéuticamente eficaz de formulación de NGF. Por la expresión
"dosis terapéuticamente eficaz" se quiere dar a entender, en
el presente documento, una dosis que produce los efectos para los
cuales es administrada o la cantidad que proporciona efectos
terapéuticos es un régimen de administración particular. La dosis
de la preparación de liberación sostenida es la que se requiere
para alcanzar una concentración eficaz de NGF in vivo, para
la dolencia que se esté tratando en particular, a pesar de que la
dosis varíe en función del tipo de variante de NGF, la duración
deseada de la liberación, la enfermedad objetivo, la especie animal
objeto de tratamiento y otros factores, tales como el estado del
paciente. La dosis exacta estará en función del trastorno que tenga
que ser objeto de tratamiento y podrá ser averiguada por parte de
un experto en la materia utilizando técnicas conocidas.
Actualmente, el rhNGF ha sido administrado de forma subcutánea a
pacientes que padecen neuropatías periféricas o relacionadas con
diabetes o AIDS, encontrándose los ensayos en Fase III en curso.
Las cantidades de dosis semanales utilizadas en estos estudios
clínicos proporcionan un buen punto de partida para que el médico
determine las dosis de administración de NGF microencapsulado de la
invención. En general, las formulaciones de NGF de la presente
invención son administradas a razón de entre aproximadamente 0,01
\mug de NGF/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg por
día, preferiblemente entre 0,02 y 10 mg/kg, más preferiblemente
entre 0,03 y 500 ug/kg y, muy preferiblemente, entre 0,5 ug/kg y
100 ug/kg. En algunas realizaciones se dan dosis de entre 0,03 y
1,0 \mug/kg, más preferiblemente de entre 0,1 y 0,3 \mug/kg.
Además, tal y como resulta conocido en el estado de la técnica,
pueden resultar necesarios ajustes debido a la edad, al igual que
imputables al peso corporal, al estado de salud en general, al sexo,
al régimen alimenticio, al tiempo de administración, a
interacciones con fármacos y a la gravedad de la enfermedad, y
podrán ser averiguadas de acuerdo con la rutina experimental
llevada a cabo por parte de los expertos en la materia.
Habitualmente, el doctor administrará las formulaciones de NGF de la
invención hasta que se alcanza una dosis que repara, mantiene y, de
forma óptima, reestablece, la función de la neurona. El avance en
esta terapia es monitorizado fácilmente por medio de ensayos
convencionales.
Los resultados de los ensayos clínicos en Fase II
indican que los pacientes que padecen la enfermedad de neuropatía
periférica requieren tres dosis por semana de rhNGF, a razón de o
bien 0,3 ó 0,1 \mug/kg. Esto significa que tan solo se necesitan
21 ó 7 \mug por dosis de rhNGF para un paciente promedio de un
peso corporal de 70 kg. La actual formulación líquida de rhNGF es
de 2 mg/mL en acetato sódico 10 mM, pH 5,5; NaCl 142 mM. Esta
información de dosificación proporciona un punto de partida para la
dosificación con el dispositivo de microesferas de NGF.
Cuando la preparación de liberación sostenida es
una formulación de acción prolongada a una semana, la dosis de NGF
puede ser elegida entre la banda comprendida entre 0,0001 y
aproximadamente 10 mg/kg por peso corporal por adulto. La dosis
preferida puede ser seleccionada de forma adecuada a partir de la
banda comprendida entre aproximadamente 0,0005 y aproximadamente 1
mg/kg de peso corporal. La frecuencia de administración preferida
de la preparación de liberación sostenida puede ser elegida
adecuadamente desde una vez por semana y una vez cada dos semanas,
en función del tipo de polipéptido NGF, de la forma de dosis, de la
duración de la liberación, de la enfermedad objetivo, de la especie
animal en cuestión y de otros factores.
Las composiciones del presente documento son
preparadas conteniendo cantidades de microesferas de NGF para
generar concentraciones de NGF, en forma resuspendida, comprendidas
entre 0,07 y 20 mg/ml, preferiblemente entre 0,08 y 15 mg/ml, más
preferiblemente entre 0,09 y 10 mg/ml y, muy preferiblemente, entre
0,1 y 2 mg/ml. En una realización preferida, la concentración de NGF
es de 0,1 mg/ml. En otra realización preferida, la concentración de
NGF es de 2,0 mg/ml. Para la utilización de estas composiciones en
la administración a pacientes humanos que sufren de neuropatías
periféricas, por ejemplo, estas composiciones pueden contener entre
aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 2 mg/ml de NGF,
correspondiente a la velocidad de dosificación contemplada
actualmente para el citado tratamiento. El NGF es bien tolerado y
pueden administrarse dosis más elevadas si resulta necesario, tal
como se determina por parte del doctor.
La preparación de liberación sostenida es
preferiblemente almacenada seca a temperatura ambiente o en
condiciones de frío. Más preferiblemente, la preparación de
liberación sostenida es almacenada en condiciones de frío.
"Temperatura ambiente" significa entre 15 y 25ºC y "frío"
significa una temperatura situada por debajo de los 15ºC.
Las composiciones terapéuticas de NGF se colocan,
por regla general, en el interior de un recipiente que tiene un
puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución
intravenosa que tiene un tapón perforable mediante una aguja
hipodérmica para inyección.
En otra realización de la invención, se
proporciona un equipo para la administración de NGF, el cual
incluye un vial o receptáculo que contiene un dispositivo de
liberación sostenida de la invención que contiene una cantidad
farmacéuticamente eficaz de factor de crecimiento nervioso,
preferiblemente complejado con un metal, más preferiblemente con
zinc. Se proporciona, opcionalmente, una solución estéril, viscosa,
fisiológicamente aceptable, para resuspender las microesferas. Por
ejemplo, resulta conveniente un volumen de 1,5 ml cuando se
utilizan dosis de 0,3 \mug/kg ó de 0,1 \mug/kg.
El NGF es combinado, opcionalmente con o es
administrado concertadamente con otros factores neurotrópicos,
entre los que se incluyen NT-4/5,
NT-3. y/o BDNF y se utiliza con otras terapias
convencionales para trastornos nerviosos.
Una cantidad eficaz de las microesferas que
contienen NGF es administrada a un paciente por medio de inyección
subcutánea, intramuscular, intraperitoneal e intradérmica, por
medio de administración a las membranas de la mucosa (tales como
intranasal o por medio de un supositorio) o mediante suministro
in situ, para proporcionar la dosis deseada de NGF basada en
parámetros conocidos para el tratamiento con NGF de las diversas
dolencias médicas. Por consiguiente, la administración de las
formulaciones de la presente invención puede ser efectuada de una
diversidad de modos, incluyendo, sin que ello suponga ninguna
limitación, la administración oral, subcutánea, intravenosa,
intracerebral, intranasal, transdérmica, intraperitoneal,
intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraventricular,
intratecal o intraocular. Las formulaciones pueden ser
administradas de forma continua mediante infusión en el interior del
reservorio de fluidos del CNS, si bien resulta aceptable le
inyección embolada, utilizando técnicas bien conocidas por parte
del experto en la materia, tales como bombas, reservorios, o
implantes. Resulta particularmente preferida la administración
intracerebroventricular (ICV) de la rhNGF mediante jeringa,
reservorio Ommaya®, bomba Alzet o similar. En algunos casos, por
ejemplo, en el tratamiento de heridas, las formulaciones pueden ser
aplicadas directamente como una solución o aerosol. Las
microesferas pueden ser también comprimidas en forma de pellet del
tamaño deseado para implante.
Cuando se trata de un inyectable, las
microesferas son tamizadas, preferiblemente a un tamaño comprendido
entre 20 y 90 micras. La masa de microesferas tamizada es colocada
en viales en una cantidad adecuada para resuspensión e inyección.
La suspensión de las microesferas se lleva a cabo con una solución
estéril con la viscosidad adecuada, para facilitar la inyección,
mientras se mantiene un nivel igualado de partículas para evitar el
asentamiento durante el mezclado de resuspensión, la retirada de
dosis y la inyección. La viscosidad adecuada es aquella que resulta
similar a la de una solución de dextrano-70 al 5%.
Para inyección subcutánea, las microesferas pueden ser
resuspendidas en dextrano-70 al 5% en solución
salina (NaCl 9%), con Tween 20 al 0,01 opcional.
Por regla general, las formulaciones de la
presente invención pueden contener otros componentes en cantidades
que no desvirtúan la preparación de formas estables y en cantidades
adecuadas para la administración eficaz y segura. Por ejemplo, los
expertos en la materia conocerán la existencia de otros excipientes
farmacéuticamente aceptables, los cuales pueden formar parte de las
presentes composiciones. Entre los mismos se incluyen, por ejemplo,
diversos agentes de carga, agentes tamponantes adicionales, agentes
quelantes, antioxidantes, codisolventes, y similares; entre cuyos
ejemplos específicos se incluyen sales de trihidroximetilamina
("Tampón tris"), y EDTA disódico. Opcionalmente, las
formulaciones de NGF pueden contener soportes farmacéuticamente
aceptables, un conservante, un tampón o tampones, un excipiente o
múltiples excipientes, tales como polietilenglicol (PEG), además de
trehalosa o de manitol, o de un tensioactivo no iónico, tal como el
tensioactivo Tween®, o estabilizantes (Remington's
Pharmaceutical Sciences). Los soportes, estabilizantes o
excipientes son no tóxicos para los receptores a las dosis y
concentraciones utilizadas y no reducirán significativamente la
estabilidad del NGF en las formulaciones, tal y como se describe en
el presente documento. Entre los citados compuestos se incluyen
antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo
peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas,
tales como la sueroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros
hidrófilos, tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales
como histidina, metionina, glicina, glutamina, asparagina, arginina
o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos entre
los cuales se incluye la glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol
o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o
tensioactivos no iónicos entre los cuales se incluye el polisorbato
20 u 80 (Tween), etc, poloxámeros, tales como el poloxámero 184 o
188, polioles Pruronic® y otros polímeros en bloque,
etileno/polipropileno, tales como PEG, etc. No obstante, tal y como
se indica en el presente documento, los tensioactivos no mejoraban,
por regla general, la liberación de NGF a partir de las
microesferas o la estabilidad de NGF a 37ºC. Cuando se encuentra
opcionalmente presente, un tensioactivo farmacéuticamente aceptable
es preferiblemente Tween 20 o ácido plurónico (F68). Las cantidades
utilizadas están habitualmente comprendidas entre aproximadamente
el 0,001% (peso/peso) y aproximadamente el 30% (peso/volumen), más
preferiblemente entre el 0,005 y el 0,02%. Una concentración
preferida para el tensioactivo es 0,01%. Entre los tampones se
incluyen carbonato, acetato, fosfato, Tris, citrato, succinato o
tampones histadina. Cuando se encuentra presente, el tampón, de
forma muy ventajosa, está comprendido en la banda de entre
aproximadamente 2 mM y aproximadamente 100 mM. Habitualmente, los
dispositivos microesfera secas no requieran la presencia de
tampones. Opcionalmente, si la formulación contiene una sal
farmacéuticamente aceptable, la sal es preferiblemente cloruro
sódico y, preferiblemente, en concentraciones fisiológicas.
Dado que las formulaciones se proporcionan
habitualmente en forma seca, habitualmente no se necesita un
conservante. No obstante, cuando se utiliza una resuspensión de
microesferas a lo largo de un período de tiempo prolongado, tal
como con una bomba, los conservantes pueden resultar de utilidad.
Opcionalmente, las formulaciones resuspendidas de la invención
pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. En
algunas realizaciones, la concentración de conservante oscila entre
el 0,1 y el 2,0%, habitualmente volumen/volumen. Entre los
conservantes adecuados se incluyen aquellos que resultan conocidos
en el campo de la tecnología farmacéutica. El alcohol bencílico,
fenol, m-cresol, metilparabeno, cloruro de
benzalconio, cloruro de bencetonio y proprilparabeno son los
conservantes preferidos. Los conservantes más preferidos son fenol
0,2-0,4% (peso/volumen) y alcohol bencílico
10,7-1,5% (peso/volumen). Si bien el tipo de
conservante y la banda de concentración no resultan críticas, se ha
informado acerca de que el alcohol bencílico refuerza la estabilidad
del NGF en solución. Una concentración de alcohol bencílico
particularmente preferida es la comprendida entre el 0,7 y el 1,2%
(peso/volumen), más preferiblemente entre el 0,8 y el 1,0%, con una
concentración particularmente preferida del 0,9%.
Las microesferas de NGF de liberación controlada,
sostenida, proporcionan diversas ventajas en relación con la
inyección embolada de NGF, particularmente en lo que se refiere al
tratamiento de la neuropatía periférica. En particular, esta
formulación reduciría en número de inyecciones desde 3 por semana a
una o dos por mes. Además, la baja explosividad y la lenta
liberación diaria (a saber, una baja liberación inicial) dará como
resultado niveles de Cmax más bajos y, por consiguiente, reducirá
efectos secundarios tales como la irritación local o la
hiperalgesia. Además, el desarrollo de otras indicaciones, tales
como el daño a los nervios (por ejemplo, fracturas óseas o
espinales) se beneficiarían del suministro local de NGF a través de
microesferas. Se ha observado que el factor de crecimiento nervioso
refuerza la supervivencia de las neuronas e incrementa el
sobrecrecimiento de las neuritas, los cuales resultan efectos
beneficiosos en el tratamiento de neuropatías periféricas y
encuentran utilidad en el tratamiento de trastornos cerebrales,
tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.
Si bien una forma de NGF administrada de forma generalizada no
penetrará en la barrera hematoencefálica y pueden resultar
necesarias inyecciones diarias de NGF para tratar la neuropatía
periférica, el suministro localizado o el suministro dirigido a
objetivo de NGF que utiliza las formulaciones de microesferas de la
invención puede permitir un tratamiento mucho más eficaz de estos
trastornos. El suministro localizado de NG a neuronas cerebrales o
cerebrales puede ser alcanzado con las microesferas biodegradables
de la invención las cuales liberan continuamente NGF en el punto de
acción deseado. Las realizaciones que utilizan microesferas de poli
(ácido láctico-glicólico) (PLGA) resultan seguras y
se localizarán efectivamente o quedarán restringidas al punto de
inyección, en el espacio subcutáneo o en el cerebro, permitiendo de
esta forma el que un aporte local continuo de NGF sea suministrado
a las neuronas.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a título de
ejemplo y no suponen ninguna limitación. La descripción de la
totalidad de las citas que aparecen en la memoria son expresamente
incorporadas al presente documento a título de referencia.
En el desarrollo de una formulación de larga
duración para NGF humano recombinante, se investigó la utilización
de una matriz polimérica biodegradable para la liberación sostenida
de NGF. El polímero utilizado para esta aplicación era un
copolímero de ácido láctico y glicólico, identificado como poli
(ácido láctico/glicólico) o PLGA. Para incorporar el NGF a este
polímero, el PLGA tiene que ser disuelto en un disolvente
inmiscible en agua. El cloruro de metileno ha sido un disolvente
habitualmente utilizado para la disolución de PLGA, el cual
proporciona tanto inmiscibilidad en agua como solubilidad al PLGA.
No obstante, resulta preferido el acetato de etilo. Por regla
general, para la producción de microesferas de PLGA, el NGF fue
mezclado en solución tamponada, acuosa, con estabilizantes poliol
opcionalmente presentes y/o un tensioactivo y se secó por
congelación. Al polvo de NGF liofilizado se le añadió,
opcionalmente, un modificador de la liberación, tal como carbonato
de zinc. El polvo de NGF fue después añadido a una solución de
acetato de etilo que contenía PLGA. En estudios iniciales, el
polipéptido fue añadido en forma de polvo liofilizado molido. Una
vez finalizada la adición de polipéptido, la solución de acetato de
etilo fue brevemente homogeneizada. En un procedimiento, la solución
fue añadida a una baño de emulsificación, lo cual daba como
resultado la extracción de cloruro de metileno con la formación
concomitante de microesferas de PLGA que contenían el NGF. En un
procedimiento preferido, la solución es atomizada y las gotitas
atomizadas congeladas. El acetato de etilo es extraído de las
microesferas y las microesferas son secadas para eliminar las trazas
de disolvente de extracción. Para dimensionar las microesferas
puede utilizarse el tamizado. El polipéptido liberado desde estas
microesferas fue después estudiado para determinar la integridad
del NG liberado desde las microesferas. La valoración del NGF
liberado fue llevada a cabo a través de cromatografía de exclusión
por tamaño analítica (SEC-HPLC), al igual que a
través de otras técnicas.
Se produjo factor de crecimiento nervioso humano
(NGF) recombinante en células de ovario de cobayo chino y se
purificó por medio de cromatografía de intercambio iónico (IEC) y
cromatografía de fase inversa (RP-HPLC), tal y como
se ha descrito anteriormente (Schmelzer et al. (J. Neurochem.
59:1675-1683 (1992)). Para la
RP-HPLC se utilizaron acetonitrilo de grado HPLC y
TFA. Los restantes productos químicos eran de grado USP. Los viales
de 2 cc, de vidrio claro, estériles, de tipo I, fueron adquiridos
en Wheaton y utilizados con tapones de caucho butílico, revestidos
con Teflon, siliconados.
Análisis UV. La concentración de rhNGF fue
determinada mediante escaneado desde 240 a 360 nm, utilizando un
espectrofotómetro HP 8452A UV-Vis. Como referencia
para tapar el instrumento se utilizó tampón en formulación y la
concentración de proteína en mg/mL fue calculada a partir de
(A278-320)/1,5, en la que 1,5 es el coeficiente de
extinción del rhNGF en mL/(mg.cm).
El BCA (ensayo bicinconínico) utilizando
estándares rhNGF se llevó a cabo para determinar la concentración
de proteína NGF en el NGF liberado de las microesferas in
vitro.
Cromatografía de exclusión por tamaño. Se
utilizó HPLC de exclusión por tamaño para detectar y cuantificar la
formación acumulada en las formulaciones de rhNGF. utilizando esta
técnica, el rhNGF es eluido en forma de dímero (pico principal) con
un tiempo de retención de 8,6 minutos. La aparición de un saliente
destacado sobre el pico principal del dímero indica la presencia de
acumulación de peso molecular más elevado. La HPLC por exclusión de
tamaño ("SEC-HPLC") fue llevada a cabo
utilizando una Bomba Perkin Elmer Series 410 Bio LC con un Detector
UV Espectrofotométrico Perkin Elmer LC90 y una columna Tosohas TSK
2000 SWXL, 5 \mum (7,8 x 300 mm). Esta columna SEC fue utilizada a
razón de 0,5 ml/min, utilizando una fase móvil de fosfato potásico
0,2M, cloruro potásico 0,45 M, a pH 7,0. Para SEC, la detección UV
se efectuó a 280 nm; para RP-HPLC e IEC, a 214
nm.
ELISA. Este ensayo tiene una banda de
entre 0,39 y 6,25 ng/mL. Cada una de las muestras de rhNGF fue
diluida en diluyente de ensayo a dos concentraciones objetivo de 5
y de 2,5 ng/mL, y cada una de las diluciones fue ensayada por
triplicado. La concentración de proteína en mg/mL fue normalizada a
una referencia interna estándar a -70ºC, la cual fue sometida para
el mismo ensayo.
Ensayo de radiorreceptor (RRA). Este
ensayo mide la capacidad del rhNGF no marcado para competir con el
1251-rhNGF para la unión del receptor sobre las
células PC-12. Este ensayo tiene una banda de entre
3-80 ng/mL. Cada una de las muestras de rhNGF fue
diluida en diluyente de ensayo en dos concentraciones objetivo de
25 y 12,5 ng/mL y cada una de las diluciones fue analizada por
duplicado. La concentración de proteína en mg/mL fue normalizada con
una referencia interna estándar a -70ºC, la cual fue sometida para
el mismo ensayo.
Bioensayo de supervivenvia de células
PC-12. Este ensayo determina la capacidad del
rhNGF para unirse a sus receptores y generar señales intracelulares
que dan como resultado la supervivenvia de las células
PC-12 en condiciones de cultivo exentas de suero y
tiene una banda de entre 0,24 y 0,30 ng/mL. La concentración de
proteína activa en mg/mL fue normalizada a una referencia interna
estándar a -70ºC, la cual fue sometida para el mismo ensayo.
Ensayo de sobrecrecimiento de neuritas. La
actividad biológica del NGF fue determinada utilizando el ensayo de
PC12 desarrollado por Greene (Un bioensayo cuantitativo para la
actividad de factor de crecimiento nervioso que utiliza una línea
celular de feo-cromocitoma clonal. Brain Res. 133:
350-353 (1977)) y modificado tal y como se describe
por parte de Schmelzer et al., (J. Neurochme. 59:
1675-1683 (1992)).
SDS-PAGE. Se diluyeron
muestras en tampón de muestra SDS de tricina Novex e incubaron por
espacio de 1 hora a 50ºC. Se llevó a cabo un
SDS-PAGE no reducida sobre geles de tricina Novex
que contienen acrilamida al 10%, seguido de teñido con Azul
Coomassie. Los pesos moleculares fueron estimados utilizando
marcadores de bajo peso molecular Bio-Rad.
utilizando SDS-PAGE no reducida, el monómero se
encuentra en 13,5 kDa y la banda dímera a aproximadamente 26kD.
La estabilidad de NGF a 37ºC fue valorada en
parte por la extensión de acumulación de NGF. La constante de
equilibrio entre dímero/monómero para NGF murino es más pequeña que
10-13 M a pH 4-7 (Bothwell et
al., J. Biol. Chem. 252: 8532-8536 (1977); Timm
et al., Biochem. 33: 4667-4676 (1994); Moore
et al., Neurobiol. 5: 369-381 (1975); Timm
et al., Prot. Sci. 1: 236-244 (1992)). Por
consiguiente, el NGF, ensayado primeramente como dímero en una SEC
a pH neutro. Una pequeña cantidad de NGF acumulada puede ser
identificada como tetrámero basado en pesos moleculares estándar.
Un saliente destacado sobre este pico indica una acumulación más
grande.
La liberación in vitro de NGF procedente
de las microesferas fue medida mediante incubación en tampón de
liberación; acetato de sodio 10 mM, NaCl 136 mM; polisorbato 20
0,02%, azida sódica 0,02%, pH 5,5. El período de "liberación
inicial" fue definido como una hora.
Se observó que la proteína NGF presentaba la
estabilidad más elevada a pH 5,5 y fue formulada por consiguiente
en histidina 5 mM, pH 5,5 (De Young et al., Biophys. J. 66:
A401 (1194)). Diversos excipientes fueron añadidos a este tampón de
formulación y, seguidamente, las formulaciones fueron tratadas con
acetato de etilo, tal como se ha descrito anteriormente (Cleland,
J.L. & Jones, A.J.S. Pharm Res. 13: 1464-1475
(1996)). La formulación más estable de las formulaciones
comprobadas fue secada por congelación mediante rociado, por medio
del bombeado de la solución a través de una boquilla ultrasónica en
nitrógeno líquido y liofilizado de las gotitas congeladas. Ver la
Figura 1.
El polvo de proteína final fue homogeneizado en
una solución de lactida/glicolido PLGA (0,2 dL/g de viscosidad, que
tienen grupos hidrófilos terminales, Boehringer Ingelheim RG 502H)
en acetato de etilo. El efecto del zinc sobre la liberación de
rhNGF fue analizado a través de la adición de diferentes cantidades
de carbonato de zinc sólido (partículas de < 5 \mum) a la
solución de disolvente de polímero orgánico. La suspensión fue
bombeada a través de una boquilla ultrasónica hacia un recipiente
que contenía nitrógeno líquido y etanol congelado (Johnson et
al., Nature Medecine, 2:795-799 1996)). Después
de calentar a -70ºC, el etanol extrajo el acetato de etilo
procedente de las microesferas durante un período de
2-3 días. Las microesferas fueron después filtradas
para eliminar el etanol y secadas.
El análisis de las microesferas fue llevado a
cabo in vitro mediante incubación en acetato de sodio 10 mM,
cloruro sódico 136 mM, pH 5,5 ó HEPES 10 mM, cloruro sódico 100 mM,
pH 7,4 con 0,02% de polisorbato 20 y 0,02% de azida sódica en ambos
tampones. Se llevaron a cabo estudios de liberación, tal y como se
ha descrito anteriormente (Cleland et al., Pharm. Res. 13:
1464-1475 (1996)). La carga de rhNGF en las
microesferas de PLGA fue determinada mediante disolución en NaOH 1N
y la capacidad de absorción a 284 nm (E= 1,545
(mg/mL)^{-1}cm^{-1}).
Para asegurar la liberación de rhNGF natural
intacto, se escaneó la capacidad de la trehalosa, la sacarosa, el
manitol, el polietilenglicol (PEG, 3350 Da) y plurónico F68 (PF68)
para estabilizar al rhNGF en acetato de etilo. Los resultados de
las pruebas de estabilidad se presentan en las Figuras 2 y 3. La
formulación más estable consistía en 5 mg/mL de rhNGF y 5 mg/mL de
trehalosa. Esta formulación fue utilizada con o sin tensioactivo,
el cual puede resultar necesario para evitar la acumulación de
rhNGF durante la incubación en condiciones fisiológicas. Las
microesferas de PLGA fueron obtenidas con formulaciones estables de
rhNGF y diferentes cantidades de carbonato de zinc, tal y como se
muestra en la Tabla 1.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}[t]{145mm} a. microesferas preparadas con el
mismo procedimiento. Los tensioactivos fueron añadidos a la
formulación de proteína líquida con anterioridad al secado por
congelación mediante rociado. El carbonato de zinc (Zn) fue añadido
como sólido a la solución de polímero.\end{minipage} \cr b.
Liberación inicial de rhNGF procedente de microesferas de
PLGA.\cr}
La adición de carbonato de zinc sólido reducía en
gran medida la liberación inicial (1 hora de incubación) desde las
microesferas. Este resultado puede ser provocado por la unión de
rhNGF al zinc (un punto de unión a zinc por monómero) para formar
un acumulado no covalente reversible (Holland et al., J. Mol.
Biol. 239: 385-400 (1994)). Se informó acerca de
resultados similares para la utilización de carbonato de zinc para
modular la liberación de otra proteína de unión a zinc, la hormona
de crecimiento humana. Las formulaciones de PLGA rhNGF que
contenían zinc tenían también una velocidad de liberación global más
lenta, tal y como se muestra en la Figura 4. Estas microesferas
liberaban la totalidad del rhNGF encapsulado en 14 días, mientras
que las microesferas con zinc liberaban la mayor parte el rhNGF en
7 días. La velocidad de liberación no resultaba afectada por la
adición de tensioactivo a la formulación de proteína (Figura
5).
Otra importante consideración era la estabilidad
del rhNGF durante la liberación desde las microesferas a 37ºC. El
rhNGF liberado inicialmente desde las microesferas se acumulaba
ligeramente (94% de dímero natural) y la adición de tensioactivo a
la formulación de proteína no incrementaba de forma significativa
la cantidad de dímero natural (ver la Figura 6). La capacidad que
tiene el rhNGF de unirse a su receptor también resultaba reducida.
Se observó una reducción adicional en la fracción de dímero natural
liberada de las microesferas, tras la incubación por espacio de
entre 7 y 10 días a 37ºC, sugiriendo que el rhNGF no era estable en
estas condiciones, incluso en un tampón de liberación a pH bajo (pH
5,5).
Las formulaciones de microesferas en este ejemplo
proporcionaron una liberación continua del rhNGF a lo largo de un
período de entre 7 y 14 días. La velocidad de liberación estaba
modulada por la adición de zinc sólido a la fase polímero. El zinc
y el rhNGF pueden formar un complejo estable que se disocia
lentamente desde las microesferas de PLGA. Si bien la formulación
de trehalosa, con o sin tensioactivo, parecía proporcionar buena
estabilidad en estudios de cribado, la misma no se traducía en la
liberación de rhNGF natural a lo largo de la liberación. Si bien
estos resultados indican una liberación controlada de NGF en
microesferas, las mejoras en la formulación para mantener la
estabilidad del NGF para asegurar la liberación del dímero natural
a lo largo de la liberación se proporcionan en el presente
documento.
Debido a la particularidad de que los estudios de
liberación in vitro en el Ejemplo 1 indicaron que el rhNGF
encapsulado se degradaba a través de acumulación (a 37ºC, el rhNG
liberado desde las microesferas estaba constituido por el 85% de
dímero natural acumulado, después de un período de incubación de 10
días, tal y como se determinó a través de SEC), se utilizó una nueva
preformulación. En esta nueva preformulación, se complejo un ión
metálico con el rhNGF con anterioridad al mezclado con el polímero
biodegradable. De forma sorprendente, se observó una mejora
significativa en la estabilidad (integridad) del NGF liberado desde
las microesferas.
El acetato de zinc fue añadido a una solución de
rhNGF formulada en NaHCO_{3} 4 mM, a pH 7,4. El incremento en la
concentración de acetato de zinc reducía la cantidad de formación
de acumulado, tal y como se determinó a través de SEC (Figura 7).
La Figura 7 muestra la integridad en forma de porcentaje de monómero
de las soluciones de NGF que contenían zinc, antes y después del
secado por congelación que precede a la encapsulación. Las
soluciones de rhNGF que contienen zinc que habían sido incubadas
como líquidos a 5 y 37ºC, eran opacas al cabo de 4 semanas de
almacenamiento. Por el contrario, bajo las mismas condiciones de
almacenamiento, las muestras liofilizadas formaron un precipitado
después de la reconstitución. Para determinar la cantidad mínima de
zinc necesaria para la formación de complejo rhNGF, el precipitado
de las muestras de rhNGF liofilizadas con diversas relaciones
molares de proteína en relación con zinc fue eliminado por
centrifugación y se determinó la concentración de proteína (sin
complejación con zinc) que permanecía en el sobrenadante, mediante
UV. Tal y como se muestra en la Figura 8, más del 80% del rhNGF
liofilizado se complejaba con el acetato de zinc, a las relaciones
molares comprendidas entre 1:6 y 1:8 (rhNGF: acetato de zinc) a
5ºC. Así pues, la cantidad de NGF complejado con zinc y remanente
en la solución, antes y después del secado por congelación que
precede a la encapsulación, constituye otra indicación de la
integridad, tal y como se muestra en la Figura 8). Tal y como puede
ser observado después de transcurridas cuatro semanas a 37ºC, el
ión metálico añadido a la solución de NGF con anterioridad a la
encapsulación contribuye a mantener la integridad del dímero NGF.
Estas averiguaciones confirman que la preformulación en solución
acuosa de NGF con un ión metálico que se une al NGF, con
anterioridad al secado de la solución y al mezclado de la misma con
modificadores adicionales de liberación o con biopolímeros,
proporciona un medio para mejorar y asegurar la estabilidad del
rhNGF encapsulado durante el procedimiento de fabricación de
microesferas y durante la liberación subsiguiente in vitro.
Así pues, el presente ejemplo muestra que el rhNGF puede ser
estabilizado mediante complejación de la proteína con acetato de
zinc en solución, con anterioridad a la encapsulación.
Esta preformulación fue caracterizada
adicionalmente. El rhNGF purificado obtenido en células CHO fue
formulada en forma líquida a razón de 5,5 mg/ml en bicarbonato
sódico 4 mM, pH 7,4. A la solución de rhNGF se le añadió acetato de
zinc, a una relación molar de 1:10 (rhNGF:acetato de zinc). A lo
largo de todos los ejemplos, por un mol de rhNGF se quiere dar a
entender un mol de forma dímera activa. La solución de rhGF que
contenía zinc fue liofilizada por rociado en nitrógeno líquido y
liofilizada para producir rhNGF sólido para microencapsulación.
Esta proteína sólida (10% peso/peso) fue después homogeneizada con
PLGA (RG502H, 50:50, no bloqueado, 12 Kda), el cual fue disuelto en
acetato de etilo para formar una suspensión. Se añadió también
carbonato de zinc (6% peso/peso) a la solución de polímero y se
homogeneizó antes de la adición del rhNGF sólido. Una vez
finalizada la homogeneización, la suspensión de
polímero-proteína fue liofilizada por rociado en
nitrógeno líquido y etanol frío, para producir microesferas de
rhNGF/PLGA.
Se llevaron a cabo estudios de liberación in
vitro utilizando un dispositivo de ultrafiltración centrífugo.
Al reservorio extraíble del dispositivo se le añadieron 10 mg de
microesferas y se mezclaron con 300 FL de tampón de liberación
(solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4). El dispositivo fue
incubado a 37EC. Una vez liberada, la proteína fue muestreada por
medio de centrifugación y el dispositivo rellenado con tampón de
liberación. La concentración proteínica de rhNGF fue determinada
utilizando medición con ácido bicinconínico (BCA). Para determinar
la integridad (porcentaje no acumulado) del sólido reconstituido y
la liberación de rhNGF, se utilizó cromatografía de exclusión de
tamaño natural (SEC).
El efecto del zinc sobre la estabilización del
rhNGF fue investigado mediante la comparación del perfil de
liberación y la integridad del rhNGF liberado con las microesferas
preparadas sin la adición de acetato de zinc en la formulación de
proteína (tampón histidina 5 mM, Ph 5,0), tal y como se describe en
el Ejemplos 1. En este ejemplo en particular, se eligió una
relación molar preferida de 1:10 (rhNGF:acetato de zinc), la cual
se observó reducía de forma significativa la acumulación de la
proteína en esta relación mínima, cuando la suspensión se
almacenaba a 37ºC. La adición de acetato de zinc a la formulación de
proteína no afectaba significativamente al perfil de liberación
global in vitro, tal y como se muestra en la Figura 9. Ambas
formulaciones de rhNGF/PLGA, con o sin acetato de zinc en la fase
proteínica, presentaban una baja explosividad inicial de
aproximadamente el 1%. Las microesferas preparadas a partir de ambas
formulaciones liberaron la totalidad del rhNGF encapsulado en un
período de 14 días.
Se estudió también el efecto del acetato de zinc
sobre la estabilidad del rhNGF durante la liberación a partir de
las microesferas a 37ºC. Tal y como se presenta en la Figura 10, la
proteína liberada de la formulación rhNGA/PLGA que contenía acetato
de zinc, presentaba el 93% de dímero natural después de la
incubación a 37ºC por espacio de 10 días, mientras que la
formulación sin acetato de zinc liberaba la proteína con el 85% de
dímero natural. De hecho, el rhNGF liberado inicialmente desde la
formulación de PLGA sin acetato de zinc resultaba ligeramente
acumulado (94% de dímero natural).
Los resultados en este Ejemplo indican que la
adición de acetato de zinc a la formulación de proteína reducía en
gran manera la acumulación del rhNGF y, por lo tanto, estabilizaba
la proteína durante la encapsulación y la subsiguiente liberación
desde las microesferas. La estabilización puede ser originada por la
complejación del rhNGF con el zinc para formar acumulados estables.
Si bien se añadió también zinc sólido (6% carbonato de zinc
peso/peso) en la fase de polímero durante la encapsulación, para
reducir la explosividad inicial del rhNGF encapsulado, esto no
contribuía a estabilizar la proteína. Además, el complejo Zn:rhNGF
se forma tan solo a ph elevado (pH de 7,4) y se disocia a pH bajo
(pH de 5,5). A 37ºC, el rhNGF en la formulación de bicarbonato (pH
7,4) que contenía acetato de zinc, resultaba tan estable como la
proteína en la formulación líquida de control sin acetato de zinc
(histidina 5 mM, pH 5,5), tal y como se muestra en la Figura 10.
Estudios previos (datos no mostrados) mostraron que el rhNGF no era
estable a pH 7,4, sin zinc. Esto sugiere que el rhNGF puede ser
estabilizado mediante la formación de un complejo de zinc (ión
metálico), en ausencia del cual el rhNGF puede ser rápidamente
degradado al citado elevado pH, Por consiguiente, tal y como se
muestra en el presente documento, el rhNGF formulado en bicarbonato
sódico 4 mM a pH de 7,4 con la adición de acetato de zinc, mejoraba
la estabilidad de la proteína durante la microencapsulación y
liberación a 37ºC (temperatura fisiológica. El rhNGF en esta
formulación era estabilizada mediante la formación de un complejo de
zinc.
Habitualmente, la solución
NGF-metal es secada por congelación mediante
rociado, preferiblemente por medio de atomización de la solución en
nitrógeno líquido, ubicación de las gotitas congeladas a una
temperatura situada por debajo o igual a aproximadamente 70ºC,
seguido de eliminación del nitrógeno y de liofilización de las
gotitas o cristales congelados, hasta lograr obtener un polvo de sal
metálica-NGF, de tamaño de partícula muy fino,
inferior a aproximadamente 5 micras. El polvo
NGF-zinc es procesado en forma de microesfera de
liberación controlada, tal y como se muestra en el presente
documento, preferiblemente tal y como se describe en el Ejemplo 1.
La cantidad de NGF cargada en el interior de las microesferas es
habitualmente del 10% (peso/peso).
Para un inyectable, las microesferas son
tamizadas, preferiblemente a un tamaño comprendido entre 20 y 90
micras. Las microesferas tamizadas, en masa, son introducidas en
viales en una cantidad que resulte adecuada para resuspensión e
inyección. Para inyección subcutánea, las microesferas son
resuspendidas en solución salina de dextrano-70 al
5% (9% e NaCl) con un 0,01% de Tween 20 opcional. De modo
alternativo, las microesferas de rhGF/zinc/PLGA son resuspendidas e
inyectadas en el interior de un reservorio Ommaya (o similar)
implantado en el cerebro para la liberación continua del rhNGF
durante un período de 3-4 semanas.
Claims (31)
1. Procedimiento para la preparación de un
dispositivo de microesferas para la liberación sostenida controlada
de NGF, que tiene una característica de acumulación de NGF
reducida, que comprende el mezclado de NGF en solución con una sal
metálica estabilizadora de NGF de un metal que se une al NGF, en el
cual la relación molar de NGF respecto al metal es de 1 a 4, a 1 a
50 y la microencapsulación de la mezcla NGF-metal,
para formar una microesfera que contiene el NGF y el metal capaz de
la liberación sostenida controlada del NGF.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual la relación molar de NGF respecto al metal en la solución es
de 1 a 6, a 1 a 20.
3. Procedimiento de la reivindicación 2, en el
cual la relación molar de NGF respecto al metal en la solución es
de 1 a 8, a 1 a 14.
4. Procedimiento de la reivindicación 2, en el
cual el metal es un metal alcalino, un metal alcalinotérreo o un
metal polivalente.
5. Procedimiento de la reivindicación 4, en el
cual el metal es sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro II,
hierro III, cobre II, estaño II, estaño IV, aluminio II, aluminio
III o zinc.
6. Procedimiento de la reivindicación 4, en el
cual el metal es zinc.
7. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual el metal es una forma de sal del ácido carboxílico
alifático.
8. Procedimiento de la reivindicación 7, en el
cual la sal es una sal carbonato o acetato.
9. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual la sal metálica es cloruro de zinc, bromuro de zinc, yoduro de
zinc, fluoruro de zinc, sulfato de zinc, nitrato de zinc,
tiocianato de zinc, carbonato de zinc, acetato de zinc, glicolato
de zinc, lactato de zinc, tartrato de zinc, benzoato de zinc,
salicilato de zinc, fenolsulfonato de zinc, cloruro de calcio,
bromuro de calcio, yoduro de calcio, fluroruro de calcio, sulfato
de calcio, nitrato de calcio, tiocianato de calcio, carbonato de
calcio, acetato de calcio, propionato de calcio, oxalato de calcio,
tartrato de calcio, lactato de calcio, citrato de calcio, gluconato
de calcio, benzoato de calcio o salicilato de calcio.
10. Procedimiento de la reivindicación 9, en el
cual la sal metálica es acetato de zinc, carbonato de zinc, acetato
de calcio o carbonato de calcio.
11. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual el NGF es NGF 118 humano.
12. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual el NGF se secreta a partir de células de ovario de cobayo
chino.
13. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual la mezcla tiene un pH comprendido entre 6 y 8.
14. Procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente el mezclado con un estabilizador poliol
que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 70.000
kD.
15. Procedimiento de la reivindicación 14, en el
cual el poliol es un alcohol de azúcar.
16. Procedimiento de la reivindicación 15, en el
cual el azúcar es trehalosa, manitol o sacarosa.
17. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual la microencapsulación comprende el mezclado de un polímero
biodegradable con la mezcla NGF-metal y la
formulación de la mezcla en microesferas poliméricas.
18. Procedimiento de la reivindicación 17, que
comprende adicionalmente el secado de la solución de
NGF-metal con anterioridad al mezclado con el
polímero biodegradable.
19. Procedimiento de la reivindicación 17, que
comprende el mezclado de un modificador de liberación en la mezcla
seca de metal-NGF o la mezcla de polímero
biodegradable-NGF.
20. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual la microencapsulación comprende el secado de la solución
metal-NGF, la dispersión de un polímero
biodegradable en un disolvente orgánico, el mezclado de la mezcla de
NGF seca con la mezcla de disolvente orgánico polimérico
biodegradable, el rociado de la mezcla de polímero
biodegradable-NGF para formar gotitas, la
eliminación del disolvente orgánico de las gotitas para formar
microesferas que contienen NGF.
21. Procedimiento de la reivindicación 20, el
cual comprende adicionalmente el mezclado de un modificador de
liberación con la mezcla de metal-NGF seca.
22. Procedimiento de la reivindicación 20, en el
cual el disolvente orgánico es acetato de etilo o cloruro de
metileno.
23. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual las microesferas tienen entre 1 y 1.000 micras.
24. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
cual el NGF representa entre el 5 y el 20% en peso de la
microesfera.
25. Procedimiento de la reivindicación, en el
cual el polímero biodegradable es una polilactida o una
poli(lactida-coglicolido).
26. Procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente la compresión de las microesferas para
formar un pellet.
27. Utilización de NGF para la fabricación de un
medicamento en microesferas poliméricas biocompatibles, para la
administración terapéutica de una cantidad eficaz de NGF mediante
liberación, durante un periodo de tiempo superior a un día,
teniendo la microesfera polimérica biocompatible un diámetro
inferior a 300 micras, que contiene entre el 0,1 y el 50% de NGF en
peso y un metal complejado con el NGF.
28. Utilización de la reivindicación 27, en el
cual el metal es zinc, calcio o magnesio.
29. Utilización de la reivindicación 27, en el
cual el paciente padece una neuropatía periférica.
30. Dispositivo de microesferas poliméricas que
tiene un diámetro inferior a 1.000 micras, para la liberación
controlada sostenida de NGF, que comprende una microesfera
polimérica biocompatible que contiene entre el 0,1 y el 50% en peso
de NGF complejado con un metal estabilizador de NGF, que se une al
NGF, siendo dicho dispositivo capaz de liberar NGF durante un
periodo de tiempo superior a un día.
31. Procedimiento para incrementar la estabilidad
de NGF en una composición microencapsulada que contiene NGF como
principio activo, comprendiendo la incorporación de un metal
estabilizador de NGF y de unión en una solución acuosa de NGF, con
anterioridad al secado de la solución para microencapsulación.
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