KR20170054465A

KR20170054465A - 신경 질환의 치료에 적절한 hgf 제제

Info

Publication number: KR20170054465A
Application number: KR1020177009589A
Authority: KR
Inventors: 가즈히로 후쿠타; 하야오 이노우에
Original assignee: 크링글파마 가부시키가이샤
Priority date: 2014-09-10
Filing date: 2015-08-27
Publication date: 2017-05-17
Also published as: JP2018044000A; EP3192524B1; ES2907125T3; US10213485B2; WO2016039163A1; PT3192524T; JPWO2016039163A1; CA2958342A1; US20190117732A1; DK3192524T3; CN106714823A; EP3192524A1; CA2958342C; EP3192524A4; US10702582B2; US20170333527A1; JP6281992B2; KR101950916B1

Abstract

본 발명은, 중추신경 질환 치료를 위해 수강 내 투여 또는 뇌실 내 투여, 또는 척수 실질 내 투여 또는 뇌실질 내 투여에 사용할 수 있는, 중추신경에 대한 안전성이 높고, 또한 안정성이 우수한 주사액 등의 HGF 제제(製劑)를 제공한다. 본 발명의 HGF 제제는, 간세포 증식 인자(HGF) 단백질을 유효 성분으로 하고, 또한 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 HGF 제제이다.

Description

신경 질환의 치료에 적절한 HGF 제제{HGF PREPARATION SUITABLE FOR TREATMENT OF NERVOUS DISEASES}

본 발명은, 간세포 증식 인자(Hepatocyte Growth Factor, 이하, 본 명세서 중에서는 「HGF」로 약칭하는 경우가 있음) 단백질을 함유하는 제제(製劑)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은, HGF 단백질을 함유하는 동결건조 제제, 주사액 등의 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한, HGF 단백질을 함유하고, 중추신경 질환의 치료에 바람직한 동결건조 제제, 주사액 등의 제제에 관한 것이다.

HGF는, 성숙 간세포에 대한 증식 촉진 활성을 가지는 생리 활성 단백질로서 발견되었다(예를 들면, 비특허 문헌 1 참조). 그 후의 연구에 의하여, HGF 단백질은 간세포뿐만 아니라, 많은 표피계 세포, 혈관 내피 세포 등에 작용하여, 조직이나 장기의 상해의 수복·재생에 관여하는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 2 참조). HGF 단백질은, 생물 공학적 방법에 의해 재조합 단백질로서 양산이 가능하며(예를 들면, 비특허 문헌 3 참조), 재조합 HGF 단백질은, 간염 및 간경변뿐만 아니라, 신장 질환, 창상(創傷) 등에 대한 치료약으로서의 적용이 기대되고 있다(비특허 문헌 2 참조).

한편, 최근의 녹아웃/녹인 마우스의 방법을 포함하는 유전자의 발현 및 기능적 해석에서의 다수의 연구에 의해, HGF 단백질은 신경 세포의 생존이나 신경 돌기의 신장(伸長)을 촉진하는 작용도 가지고 있으며, 신경 영양 인자로서도 중요한 인자인 점도 밝혀져 있다(비특허 문헌 4, 및 5 참조).

HGF 단백질은 해마 뉴런, 도파민 작동성 뉴런, 소뇌 과립 세포, 감각 뉴런, 및 운동 뉴런 등의 신경 세포에 대하여 신경 영양 인자 활성을 나타낸다(비특허 문헌 6 참조). 특히 HGF 단백질은, 운동 뉴런에 대하여 강력한 생존 촉진 작용을 나타내고(비특허 문헌 7 참조), 그 활성은, 운동 뉴런에 대하여 가장 강력한 생존 촉진 작용을 가지는 것으로 알려진 글리아(glia) 세포주 유래 신경 영양 인자(GDNF)의 활성에도 필적(匹敵)한다.

이와 같은 신경 영양 활성에 기초하여, HGF 단백질은 근위축성 측색 경화증(ALS) 및 척수 손상을 비롯하여 각종 신경 질환에 대한 치료약으로서 사용할 수 있는 것으로 보고되어 있다(특허 문헌 1∼3, 비특허 문헌 5, 8, 및 9 참조).

단백질 의약품은, 일반적으로는 정맥 내, 또는 피하 또는 근육 내에 주사된다. 그러나, 이들 투여 경로로 투여된 단백질은, 뇌 조직과 혈관의 사이에 존재하는 뇌혈액 관문(bldde brain barrier)의 존재에 의해 중추신경 조직으로의 이행이 극히 곤란한 것으로 알려져 있다. 이에, HGF 단백질을 중추신경 질환의 치료에 사용하기 위해서는, 일반적인 장기 질환의 치료를 위해 행해지는 정맥 내 주사, 피하 또는 근육 내 주사와 같은 투여 경로가 아닌, 중추신경 조직에 직접적으로 HGF 단백질을 송달하기 위하여, 수강(medullary cavity) 내 투여 또는 뇌실 내 투여가 유효한 것으로 여겨진다(비특허 문헌 8 및 9 참조). 수강 내 투여 및 뇌실 내 투여는, 뇌종양에 대한 항암제 치료에 있어서도 사용되는 투여 경로이다. 또한, 중추신경 질환의 치료의 목적으로는, HGF 단백질을 뇌실질 내 또는 척수 실질 내에 직접 투여하는 것도 고려할 수 있다.

HGF 단백질의 의약품화에 있어서는, 안정화된 HGF 단백질 제제의 개발이 필요하다. HGF 단백질 제제로서는, HGF 단백질(TCF-II라고도 칭함)에 알부민, 인간 혈청, 젤라틴, 소르비톨, 만니톨, 및 크실리톨 등을 안정화제로서 함유시킨 수용액 제제가 특허 문헌 4에 개시되어 있다(특허 문헌 4 참조). 그러나, 상기 HGF 수용액 제제는 보존 중에 HGF 단백질이 응집, 백탁, 겔화가 진행하는 결점이 있고, 또한 HGF 단백질의 중합체(HGF 중합체)가 형성되는 등 물리화학적 안정성이 낮고, 생물 활성이 저하되는 문제가 있다.

이와 같은 중합체 형성을 억제하기 위하여, 예를 들면, 특허 문헌 5에는, HGF에 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민, 프롤인, 글루타민산, 아스파라긴산 등을 안정화제로서 함유시킨 동결건조 HGF 제제가 개시되어 있다(특허 문헌 5 참조). 또한, 특허 문헌 6에는, HGF에 글리신, 알라닌, 소르비톨, 만니톨, 및 덱스트란 황산 등을 안정화제로서 함유시킨 동결건조 HGF 제제가 개시되어 있다(특허 문헌 6 참조). 또한, 특허 문헌 7에는, HGF에 정제 백당(白糖) 및 알라닌 등을 첨가한 동결건조 HGF 제제가 개시되어 있다(특허 문헌 7 참조).

이와 같은 제제로부터 조제되는 주사액은, 일반적인 장기 질환의 치료를 위해 행해지는 정맥 내 주사, 피하 또는 근육내 주사에 있어서는 안전한 것으로 생각할 수 있지만, 예를 들면, 수강 내 투여 및 뇌실 내 투여에서는, 중추신경계에 직접 HGF 단백질을 투여하게 되어, 제제 중에 첨가하는 각종 성분을 포함하여, 제제 성분의 중추신경계에 대한 안전성을 충분히 확인할 필요가 있다. 종래 개시되어 있는 HGF 제제에 있어서, 수강 내 투여 또는 뇌실 내 투여, 또는 척수 실질 내 투여 또는 뇌실질 내 투여에 사용해도 안전한 것으로 확인된 제제는 알려져 있지 않다.

중추신경 질환 치료를 위해 수강 내 투여 또는 뇌실 내 투여, 또는 척수 실질 내 투여 또는 뇌실질 내 투여에 사용할 수 있는 안정성이 높은 HGF 제제가 요구되고 있다.

국제 공개 제2002/22162호(대응 US Pub. No. US 2003/0176347) 국제 공개 제2007/122976호(대응 US Patent No. US 8, 575, 099) 국제 공개 제2008/105507호(대응 US Patent No. US 8, 518, 880) 국제 공개 제90/10651호(대응 EP Patent No. EP 0462277) 국제 공개 제00/72873호(대응 EP Patent No. EP 1180368) 일본공개특허 평9-25241호 공보(대응 US Patent No. US 7, 173, 008) 국제 공개 제2008/102849호(대응 US Patent No. US 8, 461, 112)

T. Nakamura 등, Biochem. Biophys.Res. Commun., 제122권, p. 1450, 1984년 T. Nakamura 등, J. Gastroenterol. Hepatol., 제26권, Suppl. 1, p.188-202 (2011년) Jeong Soo Park 등, Protein Expr. Purif., 제70권, p.231-235 (2010년) Flavio Maina 등, Nat. Neurosci., 제2권, p.213-217(1999년) Funakoshi H 등, Current Signal Transduction Therapy 제6권, p 156-167 (2011년) Honda, S. 등, Brain Res. Mol. Brain Res. 제32권, p.197-210 (1995년) Allen Ebens 등, Neuron, 제17권, p 1157-1172 (1996년) Ishigaki A 등, J Neuropathol Exp Neurol., 제66권, p.1037-1044 (2007년) Kitamura K 등, PLoS One., 제6권: e27706 (2011년)

본 발명은, 중추신경 질환 치료를 위해 수강 내 투여 또는 뇌실 내 투여, 또는 척수 실질 내 투여 또는 뇌실질 내 투여에 사용할 수 있는, 중추신경에 대한 안전성이 높은 주사액 등의 HGF 제제를 제공하는 것을 과제로 한다. HGF 제제는, 통상, 실용적인 의약으로서 사용할 수 있도록 안정성도 우수한 필요가 있다. 본 발명은 또한, 안정성이 우수한 주사액, 동결건조 제제 등의 HGF 제제를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의(銳意) 연구를 거듭한 결과, HGF 단백질에 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 첨가함으로써, HGF 단백질의 중합체 생성이 억제되는 것을 발견하고, 이들 성분을 함유하는 HGF 용액은 안정적인 HGF 주사액으로서 사용할 수 있는 것과, 또한, 상기 HGF 용액을 동결건조함으로써 안정적인 HGF 동결건조 제제를 얻을 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 이들 성분을 함유하는 HGF 주사액은 중추신경계에 대한 독성이 극히 적어, 중추신경 등의 신경계에 대한 안전성이 높은 것을 발견하였다.

본 발명자들은, 이러한 지견에 기초하여 더욱 연구를 진행시켜 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명의 HGF 제제는, 의약품으로서 사용하는 점에서 충분한 안정성을 가지며, 예를 들면, 본 발명의 HGF 주사액은, ALS나 척수 손상 등의 각종 중추신경 질환의 치료를 위하여, 수강 내 또는 뇌실 내, 또는 척수 실질 내 또는 뇌실질 내에 안전하게 투여할 수 있다.

즉, 본 발명은, 이하의 HGF 제제를 제공한다.

(1) 간세포 증식 인자(HGF) 단백질을 유효 성분으로 하고, 또한 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 것을 특징으로 하는 HGF 제제.

(2) 동결건조 제제인 상기 (1)에 기재된 HGF 제제.

(3) 간세포 증식 인자(HGF) 단백질, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 수용액을 동결건조하여 얻어지는 동결건조 제제인 상기 (2)에 기재된 HGF 제제.

(4) 유당의 함유량이 HGF 1중량부에 대하여 0.1∼50 중량부인 상기 (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 HGF 제제.

(5) 수용액에서의 유당의 농도가 0.1∼100 mg/mL인 상기 (3)에 기재된 HGF 제제.

(6) 수용액에서의 글리신의 농도가 0.05∼50 mg/mL인 상기 (3)에 기재된 HGF 제제.

(7) 수용액에서의 HGF 단백질 농도가 0.05∼40 mg/mL인 상기 (3)에 기재된 HGF 제제.

(8) pH 완충제가 시트르산 또는 그의 수화물과, 시트르산의 염과의 조합인 상기(1)에 기재된 HGF 제제.

(9) 계면활성제가 폴리소르베이트인 상기 (1)에 기재된 HGF 제제.

(10) 주사액인 상기 (1)에 기재된 HGF 제제.

(11) 주사액이, 상기 (2)에 기재된 동결건조 제제를, 약학적으로 허용되는 용매에 용해하여 얻어지는 수용액인 상기 (10)에 기재된 HGF 제제.

(12) 중추신경 질환의 치료용인 상기 (1)에 기재된 HGF 제제.

(13) 중추신경 질환이, 근위축성 측색 경화증(ALS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea), 척수 소뇌 변성증, 척수 손상, 뇌경색, 뇌허혈, 및 다발성 경화증 중 어느 하나인 상기 (12)에 기재된 HGF 제제.

(14) 수강 내, 뇌실 내, 척수 실질 내 또는 뇌실질 내에 투여되는 것임을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 HGF 제제.

(15) 주사액 중의 유당의 농도가 0.1∼100 mg/mL인 상기 (10)에 기재된 HGF 제제.

(16) 주사액 중의 글리신의 농도가 0.05∼50 mg/mL인 상기 (10)에 기재된 HGF 제제.

(17) 주사액 중의 HGF 단백질 농도가 0.05∼40 mg/mL인 상기 (10)에 기재된 HGF 제제.

(18) HGF 단백질이 인간 유래의 HGF 단백질인 상기 (1)에 기재된 HGF 제제.

(19) HGF 단백질이, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질인 상기 (18)에 기재된 HGF 제제.

(20) HGF 단백질이, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 단백질로서, HGF로서의 생물 활성을 가지는 단백질인 상기 (1)에 기재된 HGF 제제.

또한, 본 발명은, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제에 의한 HGF 수용액 또는 HGF 동결건조 제제에서의 HGF의 안정화 방법, 더욱 상세하게는 HGF 단백질의 중합체의 생성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 상기 (1)에 기재된 HGF 제제를, 중추신경 질환을 앓고 있는 환자의 수강 내, 뇌실 내, 척수 실질 내 또는 뇌실질 내에 투여하여, 중추신경 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 HGF 제제는, 제제로서 안정적이며, 또한 중추신경에 대하여 안전하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 HGF 주사액은, 중추신경계에 대하여 안전성이 높고, ALS나 척수 손상 등의 각종 중추신경 질환의 치료를 위하여, 수강 내 또는 뇌실 내, 또는 척수 실질 내 또는 뇌실질 내에 투여할 수 있다.

본 발명의 HGF 제제는, HGF 단백질을 유효 성분으로 하고, 또한 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유한다.

본 발명의 HGF 제제는, HGF 단백질 이외에 유효 성분(약효 성분)을 포함할 수도 있지만, HGF 단백질 이외에 유효 성분을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 HGF 제제의 제형은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 동결건조 제제, 주사액 등의 비경구 투여의 제형 등이 바람직하다. 동결건조 제제는, 바람직하게는 주사용 동결건조 제제이다.

주사액이란, 그대로 생체에 주사할 수 있는 액상(液狀)의 조성물을 의미한다. 본 발명의 HGF 제제가 주사액인 경우, 간단하게 「HGF 주사액」으로 약기하는 경우가 있다.

또한, 동결건조 제제란, 그 성분이 동결건조체와 같은 고체의 상태로 제공되는 제제를 의미한다. 본 발명의 HGF 제제가 동결건조 제제인 경우, 간단하게 「HGF 동결건조 제제」로 약기하는 경우가 있다. 동결건조 제제는, 통상, 사용 시에는 적당한 용매(용해액)를 사용하여 용해하고, 그 용액을 그대로 주사액으로서, 또는 원하는 바에 따라 적당한 용매 등에 희석한 후, 주사액으로서 투여된다. 즉, 동결건조 제제에 임의의 용매를 첨가하여 용해한 것은, 주사액과 실질적으로 동등한 것이라고 할 수 있다.

본 발명의 HGF 제제는, HGF 단백질을 유효 성분으로 하고, 또한 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 동결건조 제제인 것이 바람직하다. 또한 HGF 단백질을 유효 성분으로 하고, 또한 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 HGF 주사액도, 본 발명의 HGF 제제의 바람직한 실시형태의 하나이다.

본 발명의 HGF 제제는, 중추신경계에 대한 안전성이 높은 것이다. 본 발명의 HGF 주사액 등의 HGF 제제는, 중추신경계에 대한 독성이 극히 낮기 때문에, 예를 들면, 수강 내 또는 뇌실 내, 또는 척수 실질 내 또는 뇌실질 내에 투여할 수 있는 것이며, 각종 중추신경 질환의 치료 등에 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에서의 HGF 단백질로서는 종의 한정은 특별히 없으며, 각종 동물 유래의 HGF 단백질(천연형 HGF 단백질 또는 유전자 공학 기술에 의해 제조한 재조합 단백질) 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들면, 본 발명의 HGF 제제를 적용하는 동물 유래의 HGF 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명에서 사용되는 HGF 단백질로서, 본 발명의 제제를 인간에 적용하는 경우에는 인간 유래의 HGF 단백질(이하, 인간 HGF 단백질이라고 하는 경우도 있음)이 바람직하게 사용된다. 더욱 바람직하게는, 재조합 인간 HGF 단백질이다. 본 발명의 HGF 제제를 인간 이외의 포유동물에 대하여 사용하는 경우에는, 이들 동물종 유래의 HGF를 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스, 토끼, 햄스터, 모르모트, 침팬지 등으로부터 유래하는 HGF 단백질이 사용 가능하다. 또한, 본 발명에 사용하는 HGF 단백질은 아미노산 5잔기가 결실되어 있는 딜리션(deletion) 타입(dHGF)이라도 된다.

인간 HGF 단백질은, 예를 들면, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA에 코딩되는 단백질 등이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 등이 바람직하다. 그 중에서도, 인간 HGF 단백질로서, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질이 바람직하고, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 더욱 바람직하다. 예를 들면, 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HGF 단백질은, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 131∼135 번째의 5개의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 5 아미노산 결손형 HGF 단백질(dHGF)이다. 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질은, 양자 모두 인간 체내에 천연으로 존재하는 HGF 단백질(천연형 HGF 단백질)로서, HGF로서의 마이토겐(mitogen) 활성, 모토겐(motogen) 활성 등을 가진다.

본 발명에 사용되는 HGF 단백질에는, 각종 동물 유래의 HGF 단백질(천연형 HGF 단백질)의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 단백질, 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 단백질, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 단백질로서, 또한 HGF로서의 생물 활성(마이토겐 활성, 및 모토겐 활성)을 가지는 단백질도 포함된다. 아미노산 서열에 대하여 「서열 동일성」이란, 단백질의 1차 구조를 비교한 경우의, 서열 간에 있어서 각각의 서열을 구성하는 아미노산 잔기의 일치성을 의미하고, 「% 이상」은 그 일치의 정도를 의미한다.

HGF 단백질이 상기 마이토겐 활성, 및 모토겐 활성을 가지는 것은, 예를 들면, J. Biol. Chem. 273, 22913-22920, 1998에 기재된 방법에 의해 확인할 수 있다. 상기 J. Biol. Chem. 273, 22913-22920, 1998에 따라 측정되는 마이토겐 활성, 및 모토겐 활성이, 천연형 HGF 단백질과 비교하여, 통상 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상인 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.

HGF 단백질과 상기 서열 동일성을 가지는 단백질로서는, 예를 들면, 서열 번호 5 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열로부터, 1개∼수개의 아미노산 잔기를 치환, 결실, 및/또는 삽입시킨 아미노산 서열, 또는 1개∼수개의 아미노산 잔기가 수식(修飾)된 아미노산 서열 등을 포함하는 단백질로서 HGF로서의 생물 활성을 가지는 단백질이 있다.

「수개」란, 통상 1∼8 개(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개)를 의미하며, 통상 8개, 바람직하게는 6개, 보다 바람직하게는 5개, 더욱 바람직하게는 3개, 특히 바람직하게는 2개이다. 삽입되는 아미노산 또는 치환되는 아미노산은, 천연 아미노산이 바람직하지만, 유전자에 의해 코딩되는 20 종류의 아미노산 이외의 비천연 아미노산이라도 된다. 비천연 아미노산은, 아미노기와 카르복실기를 가지는 한 어떠한 화합물이라도 되지만, 예를 들면 γ-아미노부티르산 등이 있다.

아미노산 잔기를 치환시킨다는 것은, 폴리펩티드 중의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이며, 바람직하게는 보존적 치환이다. 「보존적 치환」이란, 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변화시키지 않도록 1개∼수개의 아미노산 잔기를, 다른 화학적으로 유사한 아미노산 잔기에 의해 치환하는 것을 의미한다. 예를 들면, 어느 소수성(疏水性) 아미노산 잔기를 다른 소수성 아미노산 잔기에 의해 치환하는 경우, 어떤 극성(極性) 아미노산 잔기를 동일한 전하를 가지는 다른 극성 아미노산 잔기에 의해 치환하는 경우 등이 있다. 이와 같은 치환을 행할 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산은, 아미노산마다 해당 기술 분야에 있어서 공지되어 있다. 비극성(소수성)의 측쇄를 가지는 아미노산으로서는, 글리신, 알라닌, 바린, 이소류신, 류신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 메티오닌 등을 예로 들 수 있다. 극성의 측쇄를 가지는 아미노산 중에서 중성인 것으로서는, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 예로 들 수 있다. 양전하를 가지는(염기성) 아미노산으로서는, 아르기닌, 히스티딘, 리신 등을 예로 들 수 있다. 또한, 음전하를 가지는 (산성) 아미노산으로서는, 아스파라긴산, 글루타민산 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 제제에 포함되는 HGF 단백질은, 1종 만이라도 되고, 전술한 HGF 단백질 2종 이상이라도 된다.

본 발명의 제제에 사용되는 HGF 단백질은, 의약으로서 사용할 수 있는 정도로 정제된 것이면, 다양한 방법으로 조제된 것을 사용할 수 있다. HGF 단백질의 조제 방법으로서는, 다양한 방법이 알려져 있으며, 예를 들면, 래트, 소, 말, 양 등의 포유동물의 간장, 비장, 폐장, 골수, 뇌, 신장, 태반 등의 장기, 혈소판, 백혈구 등의 혈액 세포, 또는 혈장, 혈청 등으로부터 추출, 및 정제하여 얻을 수 있다.

HGF 단백질을 상기 생체 조직 등으로부터 추출 정제하는 방법으로서는, 예를 들면, 래트에 사염화탄소를 복강내 투여하고, 간염 상태로 한 래트의 간장을 적출하여 분쇄하고, S-세파로오스, 헤파린세파로오스 등에 의한 컬럼 크로마토그래피나 HPLC 등의 통상의 단백질 정제법에 의해 정제할 수 있다.

또한, HGF 단백질을 생산하는 초대 배양 세포나 주화(株化) 세포를 배양하고, 배양물(배양 상청액, 배양 세포 등)로부터 분리 정제하여 HGF 단백질을 얻을 수 있다. 또는 유전자 공학적 방법에 의해 HGF 단백질을 코딩하는 유전자(바람직하게는, 서열 번호 1 또는 2로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA)를 적절한 벡터에 내장하고, 이것을 적당한 숙주에 삽입하여 형질 전환하고, 이 형질 전환체의 배양물로부터 목적으로 하는 재조합 HGF 단백질을 얻을 수 있다(예를 들면, Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 1151-1158, 1991; J. Clin. Invest. 87: 1853-1857, 1991; Protein Expr. Purif. 70: 231-235, 2010 등 참조). 상기한 숙주 세포는 특별히 한정되지 않으며, 종래부터 유전자 공학적 방법에 사용되고 있는 각종 숙주 세포, 예를 들면, 대장균, 고초균(Bacillus subtilis), 효모, 사상균, 식물 또는 동물 세포 등을 사용할 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포로서 동물 세포를 사용하는 경우이면, 인간 HGF 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 내장한 발현 벡터에 의해 동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 마우스 C127 세포, 원숭이 COS 세포 등을 형질 전환하고, 그 배양 상청액을 분리하고, 상기한 컬럼 크로마토그래피 등에 의해 정제하여 HGF 단백질을 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 HGF 단백질은, HGF로서의 생물 활성을 가지는 한, 천연형 HGF 단백질의 아미노산 서열 중의 1 개또는 복수 개[예를 들면, 1개∼수개(「수개」는 상기와 동일한 의미이며, 예를 들면 1∼8 개, 바람직하게는 1∼6 개, 보다 바람직하게는 1∼5 개, 더욱 바람직하게는 1∼3 개, 특히 바람직하게는 1∼2 개; 이하 동일함)]의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열이라도 된다. 치환은, 바람직하게는 보존적 치환이다. 또한 마찬가지로, HGF 단백질에는, 당쇄(糖鎖)가 치환, 결실 또는 삽입되어 있어도 된다. 여기서, 아미노산 서열에 대하여, 「1 개 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 삽입」이란, 유전자 공학적 방법, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 주지의 기술적 방법에 의하여, 또는 천연에서 생길 수 있는 수(통상 1개∼수개)의 아미노산이, 결실, 치환 및/또는 삽입 등이 되어 있는 것을 의미한다. 당쇄가 치환, 결실 또는 삽입한 HGF 단백질이란, 예를 들면, 천연형 HGF 단백질에 부가되어 있는 당쇄를 효소 등으로 처리하여 당쇄를 결손시킨 HGF 단백질, 또한 천연형 HGF 단백질에 있어서, 당쇄가 부가되지 않도록 당쇄 부가 부위의 아미노산 서열에 변이가 행해진 것, 또는 천연의 당쇄 부가 부위와는 상이한 부위에 당쇄가 부가되도록 아미노산 서열에 변이가 행해진 것 등을 일컫는다.

본 발명의 HGF 제제에 사용되는 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제는, 각국의 약국방(예를 들면, 일본 약국방, 미국 약국방, 유럽 약국방 등) 수재품(收載品)을 바람직하게 사용할 수 있으며, 약국방에 수재되어 있지 않은 것을 사용하는 경우에는, 약학적으로 허용되는 것이 바람직하다. 「약학적으로 허용되는」이란, 통상 안전하며 독성이 낮고, 생물학적으로도, 그 외의 점에서도 문제없고, 또한 동물약 및 인간의 의약으로서 허용할 수 있는 제제의 조제에 유용한 것을 의미한다.

본 발명의 HGF 제제에 사용되는 유당은, 각국의 약국방(예를 들면, 일본 약국방, 미국 약국방, 유럽 약국방 등)에 수재되어 있는 유당을 바람직하게 사용할 수 있다. 유당의 첨가량은, HGF 단백질 1 중량부에 대하여, 약 0.1∼50 중량부가 바람직하고, 약 0.5∼10 중량부가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 1∼5 중량부(1∼2 중량부, 1∼3 중량부, 1∼4 중량부, 1∼5 중량부, 2∼3 중량부, 2∼4 중량부, 2∼5 중량부, 3∼4 중량부, 3∼5 중량부, 4∼5 중량부를 포함함)이다.

본 발명의 HGF 제제에 사용되는 글리신은, 각국의 약국방(예를 들면, 일본 약국방 등)에 수재되어 있는 글리신을 바람직하게 사용할 수 있다. 글리신의 첨가량은, HGF 단백질 1 중량부에 대하여, 약 0.01∼1 중량부가 바람직하고, 약 0.05∼1 중량부가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼0.5 중량부(0.1∼0.2 중량부, 0.1∼0.3 중량부, 0.1∼0.4 중량부, 0.1∼0.5 중량부, 0.2∼0.3 중량부, 0.2∼0.4 중량부, 0.2∼0.5 중량부, 0.3∼0.4 중량부, 0.3∼0.5 중량부, 0.4∼0.5 중량부를 포함함)이다.

본 발명의 HGF 제제에 사용되는 pH 완충제는, 물 등의 용매에 용해했을 때, 용액의 pH를 일정 범위로 유지하는 작용이 있는 완충액이 될 수 있는 약제를 일컬으며, 통상, 약산과 그의 염의 조합 등을 예로 들 수 있다. 바람직한 pH 완충제로서는, 용해했을 때, 예를 들면, 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 붕산 완충액이 될 수 있는, 예를 들면, 인산, 시트르산, 또는 붕산과 이들의 염과의 조합 등이 있고, 시트르산 완충액이 될 수 있는 시트르산과 그의 염과의 조합이 더욱 바람직하다. 이들 약산 및 이들의 염은 용매화물이라도 되며, 용매화물은, 예를 들면, 수화물이 바람직하다. pH 완충제를 용해한 용액은 완충액이 되어, HGF 수용액의 pH를 조정하고, HGF 단백질의 용해성 및 안정성을 유지하는 작용을 가진다. 본 발명에서의 HGF 수용액으로서는, 예를 들면, HGF 주사액, 후술하는 동결건조 제제를 제조할 때 조제되는 동결건조 전의 수용액, 상기 동결건조 제제를 용매에 재용해한 후의 수용액 등이 있다. pH 완충제는, 예를 들면, HGF 제제가 동결건조 제제이면, HGF 제제 재용해 후의 수용액의 pH가 약 4.5∼8.0이 되는 것이 바람직하다. 또한, HGF 주사액이면, 상기 주사액의 pH가 약 4.5∼8.0이 되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 본 발명에서의 pH 완충제는, HGF 주사액, HGF 동결건조 제제 등의 어느 HGF 제제에 있어서도, 시트르산 또는 그의 용매화물과, 시트르산염 또는 그의 용매화물과의 조합이 바람직하고, 시트르산 또는 그의 수화물과, 시트르산의 염과의 조합이 보다 바람직하고, 시트르산 수화물과 시트르산 나트륨(바람직하게는, 시트르산 삼나트륨 이수화물, 또는 시트르산 삼나트륨(무수)과의 조합이 더욱 바람직하다. 시트르산 완충액은, HGF 수용액 중의 HGF 단백질을 안정화시키는 작용이 우수하여, HGF 주사액, HGF 동결건조 제제를 조제하기 전의 HGF 수용액, 및 HGF 동결건조 제제 재용해 후의 수용액 중의 HGF의 단백질의 안정화에 기여할 수 있다. pH 완충제의 첨가량은, 예를 들면, HGF 주사액이면, 주사액 중의 농도로서, 바람직하게는 약 1∼100 mM, 더욱 바람직하게는 약 1∼20 mM의 범위로 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 동결건조 제제이면, 후술하는 동결건조 제제를 제조할 때의 동결건조 전의 수용액 중의 농도로서, 바람직하게는 약 1∼100 mM, 더욱 바람직하게는 약 1∼20 mM의 범위로 되도록 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 HGF 제제에 사용되는 계면활성제로서는, 예를 들면, 폴리소르베이트(예를 들면, 폴리소르베이트 20(폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트), 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레이트) 등), 플루로닉(등록상표) F-68(GIBCO사), 폴리에틸렌글리콜 등이 있으며, 2종 이상을 병용할 수도 있다. 계면활성제로서, 폴리소르베이트가 바람직하고, 폴리소르베이트 80이 특히 바람직하다. 용기의 재질인 유리나 수지 등에 HGF 단백질이 흡착하기 쉬우므로, 이와 같은 계면활성제를 첨가함으로써, HGF 제제의 제조 과정에 있어서, HGF 단백질의 용기로의 흡착을 방지할 수 있다. 또한, 계면활성제를 첨가함으로써, HGF 주사액, 및 HGF 제제 재용해 후의 HGF 수용액에 있어서 HGF 단백질의 용기로의 흡착을 방지할 수 있다. 계면활성제의 첨가량은, HGF 주사액이면, 주사액 중의 농도로서, 예를 들면, 약 0.001∼2.0 중량%의 범위인 것이 바람직하고, 약 0.005∼1.0 중량%의 범위가 더욱 바람직하다. 또한, 동결건조 제제이면, 계면활성제의 첨가량은, 예를 들면, 후술하는 동결건조 제제를 제조할 때의 동결건조 전의 수용액 중의 농도로서, 약 0.001∼2.0 중량%의 범위인 것이 바람직하고, 약 0.005∼1.0 중량%의 범위가 더욱 바람직하다.

본 발명의 HGF 제제에 사용되는 염화 나트륨은, HGF 단백질의 용해성을 유지하는 작용을 가진다. 즉, 염화 나트륨의 첨가에 의해 HGF 단백질의 용해도가 향상되고, 특히 염화 나트륨 약 150 mM 이상에서는 용해성이 향상된다. 또한, 염화 나트륨을 첨가함으로써, HGF 수용액의 삼투압을 체액의 삼투압에 근접시킬 수 있다. 염화 나트륨의 첨가량은 목적으로 하는 삼투압비에 따라 적절하게 조제하면 되지만, 생리 식염액을 기준(삼투압비 1)으로 하여, 의료용 또는 동물 약용 주사제의 삼투압비로서 허용되는 삼투압비 약 1∼3이 되는 양이 바람직하다. 예를 들면, HGF 주사액이면, 염화 나트륨 농도로서 약 150∼1000 mM이 바람직하고, 약 150∼300 mM이 더욱 바람직하다. 동결건조 제제이면, 예를 들면, 후술하는 동결건조 제제를 제조할 때의 HGF 수용액 중에서의 농도로서, 약 150∼1000 mM이 바람직하고, 약 150∼300 mM이 더욱 바람직하다.

본 발명의 HGF 제제의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 동결건조 제제이면, HGF 단백질, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 수용액을 동결건조함으로써 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 동결건조 제제는, 본 발명의 HGF 제제의 바람직한 실시형태의 하나이다. 동결건조 제제의 제조에 사용되는 상기 수용액은, HGF 단백질, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 포함하는 수용액이면 되고, 그 조제 방법은 특별히 한정되지 않는다. 상기 수용액은, 예를 들면, 정제된 HGF 단백질 용액(통상, pH 완충액, 염화 나트륨 및 계면활성제를 포함함)에 유당, 글리신 및 필요에 따라 약학적으로 허용되는 용매(예를 들면, 멸균수, 주사용 증류수, 정제수, 완충액, 생리 식염액 등)를 각각 첨가함으로써 제조할 수 있다. HGF 단백질은, 수용액 중에 바람직하게는 약 0.05∼40 mg/mL의 농도, 보다 바람직하게는 약 0.1∼40 mg/mL의 농도, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼20 mg/mL의 농도로 되도록 조제하는 것이 바람직하다. 유당은, 수용액 중에 약 0.1∼100 mg/mL가 바람직하고, 약 0.5∼50 mg/mL가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 1∼20 mg/mL로 되도록 첨가된다. 글리신은, 수용액 중에 바람직하게는 약 0.05∼50 mg/mL, 보다 바람직하게는 약 0.05∼20 mg/mL, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼10 mg/mL로 되도록 첨가된다. 이 HGF 수용액에는, 또한 필요에 따라, 용해 보조제, 산화 방지제, 무통화제 또는 등장화제 등의 첨가물을 첨가할 수도 있다. HGF 수용액은, 필터 등으로 여과하여 멸균하고, 바이알 또는 앰플에 주입하여 동결건조하는 것이 바람직하다. 필터는, 예를 들면, 포어 사이즈 약 0.22㎛ 이하의 멸균용 필터를 사용하는 것이 바람직하다. 멸균용 필터로서는, 예를 들면, 듀라포어(등록상표, 머크(Merck) 가부시키가이샤 제조) 또는 사토포어(sartopore) 2(등록상표, 사토리우스 가부시키가이샤 제조) 등이 바람직하게 들고 있다.

상기 수용액을 동결건조하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 통상의 동결건조 방법을 채용할 수 있다. 동결건조 방법으로서는, 예를 들면, 상압(常壓) 하에서 냉각 동결하는 동결 과정, 용질에 구속되지 않는 자유수(自由水)을 감압 하에서 승화 건조시키는 1차 건조 과정, 용질 고유의 흡착수나 결정수를 제거하는 2차 건조 과정의 3개의 공정에 의해 구성되는 건조 방법을 들 수 있다. 동결 과정의 냉각 온도는 약 -60℃∼-40℃가 바람직하고, 1차 건조 과정의 온도는 약 - 50℃∼0℃가 바람직하고, 또한 2차 건조 과정의 온도는 약 4℃∼40℃가 바람직하다. 진공 압력은 약 0.1∼1.5 Pa가 바람직하고, 특히 약 0.5∼1.2 Pa가 바람직하다. 동결건조 후의 건조고 내는 복압시킨다. 복압 방법로서는, 무균의 공기 또는 불활성 가스(예를 들면, 무균 질소 가스, 무균 헬륨 가스 등)를 고 내에 불어넣어 바람직하게는 약 70∼100 kPa, 더욱 바람직하게는 약 80∼95 kPa까지 1차 복압하고, 이어서, 대기압까지 복압(2차 복압)하는 방법이 바람직하다. 바이알의 타전(打栓)은, 1차 복압 후에 행하는 것이 바람직하고, 타전한 바이알은 2차 복압 후에 신속하게 캡으로 닫는 것이 바람직하다. 앰플의 경우에는, 건조 종료 후에 앰플 말단을 열(통상 가스 버너)로 용융 봉지(封止)하는 것이 바람직하다.

HGF 동결건조 제제는, 수분 함량이 약 2 중량% 이하인 것이 바람직하다.

본 발명의 HGF 동결건조 제제는, 보존 중에서의 HGF 단백질 중합체 형성이 억제되고, 안정성이 우수하다. 여기서 「단백질 중합체」란 복수의 단백질 단량체가, 예를 들면, 쇄상(鎖狀) 또는 망상(網狀)으로 결합하여 생성되는 물질을 일컫고, 본 발명에 있어서는 HGF 단백질의 2량체, 3량체 또는 4량체를 포함한다.

본 발명의 HGF 동결건조 제제는, 사용에 있어서는, 통상, 약학적으로 허용되는 용매에 용해시켜, 수용액의 형태로 사용된다. 「약학적으로 허용되는」이란, 상기와 동일한 의미이다. 약학적으로 허용되는 용매로서는, 예를 들면, 주사용 증류수, 생리 식염액, 각종 수액(예를 들면, 5% 포도당액, 링게르액 등) 또는 인공 골수액 등이 바람직하다. 용매는, 더욱 바람직하게는, 주사용 증류수 또는 생리 식염액이다. 바람직한 태양에 있어서는, 본 발명의 HGF 동결건조 제제는, HGF 단백질의 농도가 바람직하게는 약 0.05∼40 mg/mL, 보다 바람직하게는 약 0.1∼40 mg/mL, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼20 mg/mL로 되도록, 예를 들면, 주사용 증류수 등의 약학적으로 허용되는 용매에 용해하여, 주사액로서 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 HGF 동결건조 제제는, 상기한 약학적으로 허용되는 용매와 함께 키트로서 포장하여, 제조할 수도 있다.

본 발명의 HGF 주사액은, 바람직하게는 HGF 단백질, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 수용액이다. 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제, 및 그의 바람직한 태양 등은, 전술한 바와 같다.

본 발명의 HGF 주사액의 제조 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 전술한 HGF 동결건조 제제를 약학적으로 허용되는 용매에 용해하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용되는 용매로서는, 예를 들면, 주사용 증류수, 생리 식염액, 각종 수액(예를 들면, 5% 포도당액, 링게르액 등) 또는 인공 골수액 등이 바람직하다. 용매는, 더욱 바람직하게는, 주사용 증류수 또는 생리 식염액이다. 또한, 본 발명의 HGF 주사액은, 약 0.1∼40 mg/mL의 농도의 정제 HGF 단백질 수용액(통상, pH 완충액, 염화 나트륨 및 계면활성제를 포함함)에 유당, 글리신 및 필요에 따라 약학적으로 허용되는 용매(예를 들면, 멸균수, 주사용 증류수, 정제수, 완충액, 생리 식염액 등)를 첨가하여 조제할 수도 있다. 예를 들면, 상기 동결건조 제제의 제조에 사용되는 HGF 단백질, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 수용액을, HGF 주사액으로서 사용할 수도 있다.

본 발명의 HGF 주사액 중의 HGF 단백질 농도는, 바람직하게는 약 0.05∼40 mg/mL, 보다 바람직하게는 약 0.1∼40 mg/mL, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼20 mg/mL이다.

본 발명의 HGF 주사액 중의 유당의 농도는, 약 0.1∼100 mg/mL가 바람직하고, 약 0.5∼50 mg/mL의 범위가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 1∼20 mg/mL이다.

본 발명의 HGF 주사액 중의 글리신의 농도는, 약 0.05∼50 mg/mL가 바람직하고, 약 0.05∼20 mg/mL의 범위가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼10 mg/mL이다.

본 발명의 HGF 주사액의 pH는, 바람직하게는 약 4.5∼8.0이다.

본 발명의 HGF 주사액에는, 또한 필요에 따라, 용해 보조제, 산화 방지제, 무통화제 또는 등장화제 등의 첨가물을 첨가할 수도 있다.

본 발명의 HGF 주사액은, 통상 맑은 용액이다. 본 발명의 HGF 주사액은, 용액의 상태이면서도 보존 중의 HGF 중합체 형성이 억제되고, 안정성이 우수하다.

본 발명의 HGF 제제의 용도는 특별히 한정되지 않고, 중추신경 질환, 예를 들면, 근위축성 측색 경화증(ALS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤 무도병, 척수 소뇌 변성증, 척수 손상, 뇌경색, 뇌허혈, 다발성 경화증 등의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물로서 바람직하게 사용된다. 그 중에서도, 본 발명의 HGF 제제는, 중추신경 질환의 치료를 위해 바람직하게 사용되는 것이다.

본 발명의 HGF 주사액, HGF 동결건조 제제 등의 HGF 제제는, 예를 들면, 뇌실 내 또는 수강 내에 투여할 수 있는 것이다. 예를 들면, 본 발명의 HGF 주사액은, 뇌실 내 투여용 또는 수강 내 투여용의 제제로서 바람직하다. 본 발명의 HGF 주사액이 투여될 수 있는 수강이란, 척수 주위의 뇌척수액으로 충전된 공간이며, 상기 공간은, 지주막 및 경막의 2층의 막에 의해 둘러싸여 있다. 수강이란, 이들 주위 2층의 막 중에서 내측에 위치하는 지주막의 내부에 있는 공간이며, 수강 내 투여는, 즉 지주막하강 내 투여를 의미한다. 뇌와 척수의 주위는, 모두 뇌척수액으로 충전되어 있고, 뇌내부의 뇌실도 또한 뇌척수액으로 충전되어 있다. 뇌실과 뇌주위와 수강은 연결된 공간을 형성하고 있고, 뇌척수액은 이 공간을 순환하고 있다. 따라서, 뇌실 내 투여도 수강 내 투여도, 모두 뇌척수액 중에 약제를 투여하는 것이며, 통상, 실질적으로 뇌실 내 투여와 수강 내 투여는 동일한 투여 경로이다. 또한, 본 발명의 HGF 주사액 등의 HGF 제제는, 뇌실질 내 또는 척수 실질 내에 투여할 수도 있다. 뇌실 내 투여 또는 수강 내 투여, 또는 뇌실질 내 투여 또는 척수 실질 내 투여에 있어서는, 주사액을 볼러스(bolus) 투여할 수도 있고, 시린지(syringe) 펌프 등을 사용하여 지속 주입할 수도 있다.

그리고, 본 발명의 HGF 제제의 사용 용도는, 중추신경 질환의 치료로만 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 HGF 제제는, 의약으로서 충분한 안정성을 가지고 있고, 또한 안전성도 우수하므로, 중추신경 질환 이외의 질환의 치료에 사용할 수도 있다. 이 경우에, 투여 경로는, 정맥 내 주사, 피하 주사, 근육 내 주사, 국소 투여 등, 적용하는 질환의 치료에 적합한 투여 경로를 채용할 수 있다.

본 발명의 HGF 제제의 투여량은, 대상으로 하는 질환의 종류, 병상 등에 따라 적절하게 설정하면 된다. 예를 들면, HGF 주사액을 중추신경 질환의 치료를 위해 사용하는 경우이면, 성인 1 일당, HGF 단백질로서, 바람직하게는 약 0.01∼50 mg, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼10 mg을 투여하는 것이 바람직하다. 또한, HGF 주사액을 뇌실 내 투여 또는 수강 내 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 HGF 주사액 등의 HGF 제제는, 투여 시에, 약학적으로 허용되는 적절한 용매로 적절하게 희석하여 사용할 수도 있다. 약학적으로 허용되는 용매로서는, 예를 들면, 주사용 증류수, 생리 식염액, 각종 수액(예를 들면, 5% 포도당액, 링게르액 등) 또는 인공 골수액 등이며, 더욱 바람직하게는, 주사용 증류수 또는 생리 식염액을 예로 들 수 있다.

본 발명은, HGF 단백질을 유효 성분으로 하고, 또한 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 HGF 제제를 중추신경 질환의 환자에 투여하는 중추신경 질환의 치료 방법도 포함한다.

본 발명은, 중추신경 질환의 치료에 사용하기 위한, HGF 단백질을 유효 성분으로 하고, 또한 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는 HGF 제제도 포함한다.

HGF 제제는, 바람직하게는 동결건조 제제(HGF 동결건조 제제) 또는 주사액(HGF 주사액)이며, 더욱 바람직하게는 주사액이다.

HGF 제제, HGF 동결건조 제제, 및 HGF 주사액, 및 이들의 바람직한 태양 등은, 전술한 바와 같다. 중추신경 질환의 치료에 있어서, HGF 제제는, 바람직하게는 수강 내 또는 뇌실 내, 또는 척수 실질 내 또는 뇌실질 내에 투여된다.

본 발명은, HGF 단백질을 포함하는 수용액 중의 HGF 중합체(HGF 단백질의 중합체) 생성을 억제하는 방법으로서, 상기 수용액에 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 배합하는 것을 특징으로 하는, 수용액에서의 HGF 중합체 생성 억제 방법도 포함한다. 수용액에서의 HGF 단백질, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제, 및 이들의 바람직한 첨가량 등은, 전술한 HGF 주사액에서와 동일하다.

본 발명은, HGF 단백질을 포함하는 동결건조 제제 중의 HGF 중합체(HGF 단백질의 중합체)의 생성을 억제하는 방법으로서, 상기 동결건조 제제에, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 배합하는 것을 특징으로 하는, 동결건조 제제에서의 HGF 중합체 생성 억제 방법도 포함한다. HGF 단백질, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제, 및 이들의 바람직한 첨가량 등은, 전술한 HGF 동결건조 제제에서와 동일하다.

[실시예]

이하에서, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

이하, 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 재조합 인간 HGF 단백질(이하, 간단히 HGF라고만 표기함)에 각종 첨가물을 가하고, 안정성 및 안전성을 검토했다. 그리고, 이하의 실시예에 있어서 특별히 언급하지 않는 한, %는 질량%를 나타낸다. 사용한 HGF는, Biochem. Biophys.Res. Commun. 180: 1151-1158, 1991에 기재된 방법에 준하여 CHO 세포를 사용하여 제조하였다.

[실시예 1]

5 mM 시트르산 완충액(pH 6.0), 및 0.375 M 염화 나트륨, 0.005% 폴리소르베이트 80을 포함하는 HGF 용액에, 유당 및 글리신을 용해하고, 각각 하기 표 1에 나타낸 농도가 되도록 조제하였다.

[표 1]

얻어진 상기 용액을 바이알(φ23×43 mm)에 1 mL씩 무균적으로 분주했다. 바이알에 고무 마개를 반타전(半打栓)하고, 트레이에 정렬시키고, 동결건조기(트리오 마스터; 교와진공기술 가부시키가이샤 제조)에 넣고 -50℃에서 예비 동결한 후, 1차 건조(-50℃→-20℃/4시간, -20℃/24시간 이상, 0.01∼0.1 Torr) 및 2차 건조(-20℃→20∼30 ℃/8∼10시간, 20∼30 ℃/10시간 이상, 0.01∼0.1 Torr)를 거쳐 동결건조 제제를 얻었다. 동결건조 종료 후, 트리오 마스터고 내에 무균 질소를 불어넣어 복압(고내 압력: 88.0 kPa; 1차 복압)하고, 고무 마개를 전타전한 후 무균 질소로 트리오 마스터고 내를 대기압으로 되돌리고(2차 복압), 바이알을 인출한 후, 신속하게 바이알을 캡으로 닫았다. 이와 같이 하여, 본 발명의 HGF 동결건조 제제를 얻었다.

[실시예 2]

유당의 첨가 농도를 7.5 mg/mL로 한 점 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 HGF 동결건조 제제를 얻었다.

[실시예 3]

유당의 첨가 농도를 10 mg/mL로 한 점 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 HGF 동결건조 제제를 얻었다.

[실시예 4]

2 mM 시트르산 완충액(pH 6.0), 및 0.15 M 염화 나트륨, 0.002% 폴리소르베이트 80을 포함하는 HGF 용액에, 유당 및 글리신을 각각 하기 표 2에 나타낸 농도가 되도록 용해하고, HGF 주사액을 얻었다. 또한, 실시예 2에서 얻은 HGF 동결건조 제제를 주사용 증류수 2.5 mL로 용해하고, 표 2의 조성의 HGF 주사액을 얻을 수 있다.

[표 2]

실험예 1

10 mg/mL HGF, 10 mM 시트르산 완충액(pH 6.0), 0.3 M 염화 나트륨, 및 0.03% 폴리소르베이트 80을 기본 성분으로 하고, 이 기본 성분에 표 3의 각각의 첨가물을 가하여 처방 1∼3의 HGF 용액(2 mL)을 조제하고, 이것을 바이알 중에서 실시예 1과 동일하게 동결건조하여, 각각의 동결건조 제제를 제작하였다. 각각의 동결건조 제제를 강제 열화시키는 조건으로서 50℃에서 1주일 보존하고, 보존 전후의 중합체 함량을 측정하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

[표 3]

HGF 제제의 중합체 함량은, 각각의 동결건조 제제를 2 mL의 주사용 증류수로 용해하고, 얻어지는 HGF 용액을 하기 조건으로 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석하여 얻어지는 면적 백분율(%)(이하, 중합체 함량(%)이라고 함)로서 하기 식 1에 의해 구하였다.

식 1 중에서, A_M은 HGF 피크 면적, A_A는 중합체 피크 면적을 나타낸다.

(HPLC 조건)

컬럼: 겔 투과 컬럼(상품명: Superdex 200 10/300, GE 헬스케어사 제조)

이동상: 염화 나트륨 58.44 g, 시트르산 삼나트륨 이수화물 2.94 g, 및 폴리소르베이트 80 0.1 g을 정제수에 용해하고, 정제수로 1 L로 한 액을 A액으로 하였다. 염화 나트륨 58.44 g, 시트르산 일수화물 2.10 g, 및 폴리소르베이트 80 0.1 g을 정제수에 용해하고, 1 L로 한 액을 B액으로 하였다. A액에 B액을 가하여, pH 6.0으로 조정한 후, 0.45㎛의 필터(상품명: Millicup-HV, 공경(孔徑) 0.45㎛, 머크사 제조)로 여과하고, 사용 전에 탈기(脫氣)하였다. 실온에서 보존하고, 2주일 이내에 사용하였다.

컬럼 온도: 25℃

유속(流速): 0.5 mL/분

검액(檢液) 주입량: 25μL

검출 파장: 280 ㎚

[표 4]

기본 성분만으로 구성되는 처방 1의 HGF 용액으로부터 제작한 동결건조 제제에서는, 과혹 조건에서 보존하면 현저한 중합체의 생성이 인정되었다. 한편, 처방 2 및 3의 HGF 용액으로부터 제작한 동결건조 제제에서는 과혹 조건에서도 중합체의 생성이 억제되어 있고, 종래 알려져 있는 바와 같이, 정제 백당 또는 L-알라닌에는, HGF 동결건조 제제를 안정적으로 유지하는 효과가 인정되었다.

실험예 2

2.5 mg/mL HGF, 5 mM 시트르산 완충액(pH 6.0), 및 0.375 M 염화 나트륨, 0.005% 폴리소르베이트 80을 기본 성분으로 하고, 이 기본 성분에 표 5의 각각의 첨가물을 가하여 처방 4∼6의 HGF 용액(1 mL)을 조제하고, 이것을 바이알 중에서 실시예 1과 동일하게 동결건조하여, 각각의 동결건조 제제를 제작하였다. 각각의 동결건조 제제를 50℃에서 1주일 보존하고, 보존 전후의 중합체 함량을 실험예 1과 동일하게 측정하였다. 결과를 표 6에 나타내었다.

[표 5]

[표 6]

글리신 및 유당을 첨가한 처방 5의 HGF 동결건조 제제에서는, 중합체의 생성이 억제되어 있어, 제제의 안정성이 양호한 것을 알 수 있다.

실험예 3

글리신 및 유당을 첨가한 HGF 동결건조 제제의 안정성을 확인하기 위하여, 2.5 mg/mL HGF, 5 mM 시트르산 완충액(pH 6.0), 0.375 M 염화 나트륨, 및 0.005% 폴리소르베이트 80을 기본 성분으로 하고, 이 기본 성분에 표 7의 각각의 첨가물을 가하여 처방 4, 5, 7 및 8의 HGF 용액(1 mL)을 조제하고, 이것을 바이알 중에서 실시예 1과 동일하게 동결건조하여, 각각의 동결건조 제제를 제작하였다. 각각의 동결건조 제제를 25℃에서 1∼2 개월 또는 50℃에서 2주일 보존하고, 보존 전후의 중합체 함량을 실험예 1과 동일하게 측정하였다. 결과를 표 8에 나타낸다.

[표 7]

[표 8]

글리신과 유당을 첨가한 처방 5 및 7의 HGF 용액으로부터 제작한 동결건조 제제에서는, 실온의 25℃에서 2개월 보존한 후에도 중합체 함량은 근소한 증가로 억제되어 있었다. 또한, 처방 5 및 7의 HGF 용액으로부터 제작한 동결건조 제제에서는, 과혹 조건인 50℃, 2주일 보존 후에도 중합체 함량은 1%를 조금 초과할 정도에 지나지 않아, 중합체의 생성이 억제되어 있었다. 처방 5 및 7의 HGF 용액으로부터 제작한 동결건조 제제에서의 중합체 형성 억제 효과는, HGF 동결건조 제제의 안정화에 유효한 것으로 알려져 있는 정제 백당을 글리신와 함께 가한 처방 8과 거의 동등하였다.

실험예 4

실시예 2에서 얻은 HGF 동결건조 제제를 주사용 증류수 2.5 mL로 용해하여, 표 2의 조성의 HGF 주사액을 얻었다. 상기 주사액을 밀폐 용기 중에서 2주일, 40℃에서 보존하였다. 보존 전후의 HGF 주사액의 중합체 함량을 실험예 1과 동일하게 측정하였다. 또한, 보존 전후의 HGF 주사액의 HGF의 생물 활성을, 밍크 폐 유래 상피(上皮) 유사 세포인 Mv1Lu 세포(이화학 연구소, BRC ID: RCB0996)의 증식성을 지표(指標)로 평가했다.

보존 전 및 보존 후의 HGF 주사액 중의 중합체 함량은 각각 1.54% 및 2.67%이며, 40℃에서 2주일 보존한 동안의 중합체 함량의 증가는 1% 정도에 그쳤다. 또한, 40℃에서 2주일 보존한 후의 HGF 주사액 중의 HGF의 생물 활성은, 보존 전에 비해 89.4%(보존 전을 100%로 할 때의 상대 활성)로 높은 활성을 유지하고 있었다. 이와 같이, 본 발명의 HGF 주사액은, 40℃에서 2주일 보존하는 동안에도 거의 안정되었다.

시험예 1

래트 수강 내에 표 9의 HGF 용액 1, 2 또는 각종 용매(용매 A 또는 B) 또는 생리 식염액 45μL를 볼러스(bolus) 단회 투여하여, 중추신경계에 대한 안전성을 검토했다. 그리고, 래트의 골수액량은 약 200μL이며, 여기에 과잉의 양의 용액을 볼러스 단회 투여하는 것은 그 자체가 래트에게 이상(異常) 증상을 일으키기 때문에, 래트의 수강 내에 볼러스 단회 투여할 수 있는 최대 허용량을 45μL로 설정하였다.

래트를 펜트바르비탈 마 취하에, 경부(頸部)로부터 등부에 걸쳐서 전기 바리깡으로 전모(剪毛)하고, 소독용 에탄올 및 이소딘액 10%(상품명, 가부시키가이샤 메이지: 포피돈요오드 10% 용액)로 제모 부위를 닦아서 깨끗이 하고 또한 소독했다. 등부 피부를 절개하여, 제11 흉추로부터 제2 요추를 노출시킨 후, 제12/제13 흉추 사이의 인대를 절제하여, 경막을 노출시켰다. 노출 부위의 경막 및 지주막을 약간 절개하여 골수액의 유출을 확인한 후, 즉시 생리 식염액(가부시키가이샤 오오츠카 제약공장)을 충전시킨 폴리우레탄 카테터(catheter)(MRE025(OD: 0.25mm, 10cm)와 MRE010(OD: 0.65mm, 2.5cm)을 접속한 2단 카테터; Braintree, USA)의 선단(先端)을 절개부로부터 수강 내(두부(頭部) 측을 향하여)로 약 2.5 cm 삽입하였다. 의료용 아론 알파(상품명: 아론 알파 A 「산쿄」, 다이이치산쿄가부시키가이샤)를 사용하여 카테터를 주위 조직에 고정시키고, 또한 카테터의 말단을 열처리에 의해 폐색(閉塞)하고, 적절한 길이로 경부 피부로부터 노출시켰다. 창부(創部)는 봉합사(縫合絲)를 사용하여 봉합하였다. 래트가 마취로부터 각성할 때까지 는 보온 매트로 보온하고, 각성한 후, 사육 케이지로 돌려보냈다. 카테터 유치(留置)한 다음날, 래트의 각성 하에 있어서, 유치 카테터를 통하여 표 9의 HGF 용액 1, 2, 용매 A 또는 B 또는 생리 식염액 45μL를 단회 볼러스 투여하고, 이어서, 생리 식염액을 10μL 투여(카테터 내에 잔류하는 HGF 용액 또는 용매를 수강 내로 밀어넣기 위하여)했다. 그 후에 카테터를 열처리하여 폐색시키고 피하로 되돌리고, 래트 상태를 관찰했다.

[표 9]

래트 수강 내로의 볼러스 투여에 있어서, 생리 식염액의 투여에서는 래트는 아무런 이상을 나타내지 않았다. 한편, 종래 HGF 제제에 대한 안정화 효과가 알려져 있는 첨가물을 배합하여 조제한 용매 A의 수강 내 투여에서는, 일과성(一過性)이지만, 래트의 자발 운동 저하, 유연(流涎), 경련 등의 신경학적 이상 소견이 인정되었다. 이에 비해, 본 발명의 HGF 제제에 사용되는 첨가물을 배합하여 조제한 용매 B의 수강 내 투여에서는, 생리 식염액을 투여한 경우와 마찬가지로, 래트는 아무런 이상을 나타내지 않았다. 이 용매 B로 조제된 HGF 용액 1(실시예 4의 주사액과 동일하며, 본 발명의 HGF 주사액에 해당함)을 래트의 수강 내에 마찬가지로 투여해도, 래트는 아무런 이상을 나타내지 않았다. 본 발명의 HGF 주사액은, 중추신경계에 대하여 악영향을 미치지 않고, 매우 안전한 조성인 것이 확인되었다. 한편, 용매 B의 유당을 백당에 대신한 조성의 용매로 조제된 HGF 용액 2를 래트의 수강 내에 투여한 경우에는, 래트는 투여 후 20분 정도 동안, 울음소리나 사지 경직 등의 신경학적으로 이상인 증상을 나타낸다.

시험예 2

래트의 척수 손상 모델을 제작하고, 손상 직후부터 HGF 용액을 수강 내에 반복적으로 투여하였다(45 μL/shot, 3회/주, 4주일)(HGF 투여군; n=6). 이 때, HGF 용액으로서, 실시예 2의 동결건조 제제를 2.5 mL의 주사용 증류수로 재용해하여 얻어지는 표 2의 조성의 HGF 용액을 사용하였다. 또한, 대조군의 척수 손상 모델 래트(n=6)에는 HGF를 포함하지 않는 용매(2 mM 시트르산 완충액(pH 6.0), 0.15 M 염화 나트륨, 0.002% 폴리소르베이트 80, 0.16 mg/mL 글리신, 및 3 mg/mL 유당)를 동일하게 투여했다.

척수 손상 모델 래트의 제작은 다음과 같이 행하였다. 래트는, 먼저 케타민 및 자일라진 마취 하에 경부로부터 요부(腰部)에 걸쳐 전기 바리깡으로 전모하고, 70% 알코올 및 이소딘액 10%(상품명, 가부시키가이샤 메이지: 포피돈요오드 10% 용액)로 닦아서 깨끗하게 하였다. 등부 피부를 절개하여, 제6 흉추로부터 제5 요추 부근까지 노출시킨 후, 제9∼제10 흉추의 추궁(椎弓) 및 인대를 절제하여, 경막을 노출시켰다. 즉시 MASCIS Impactor(Rutgers university, USA)를 사용하여 10 g의 추를 25 mm의 높이로부터 제10 흉추 고위에 낙하시켜, 척수 손상을 제작하였다. 척수 손상 직후에 제1/제2 요추 사이의 인대를 절제하여, 경막을 노출시키고, 경막 및 지주막을 약간 절개하였다. 골수액의 누출을 확인하고, 즉시 폴리우레탄 카테터(MRE025(OD: 0.25mm, 10cm, Braintree, USA)와 MRE010(OD: 0.65 mm, 2.5 cm, Braintree, USA)를 접속한 2단 카테터)의 선단을 수강 내에 두부 측을 향해 삽입하여, 척수 손상 부근까지 진행했다. 카테터를 의료용 아론 알파(상품명: 아론 알파 A 「산쿄」, 다이이치산쿄 가부시키가이샤 제조)로 근층(筋層)에 고정하여 유치하고, 제1회째의 약액(HGF 용액 또는 용매) 투여를 행한 후, 카테터 말단을 적절한 길이로 경부 피부로부터 노출시키고, 창부를 봉합하였다. 동물은 마취로부터 각성할 때까지 보온 매트로 보온하고, 각성 후, 사육 케이지로 돌려보냈다. HGF 용액 또는 용매의 투여는 이후, 3회/주의 빈도로 4주일, 유치한 카테터를 통하여 행하였다. 각각의 회의 투여에서는, HGF 용액 또는 용매 45μL의 투여에 이어서, 생리 식염액을 10μL 투여(카테터 내에 잔류하는 HGF 용액 또는 용매를 수강 내로 밀어넣기 위하여)했다. 각각의 투여의 종료 후에는, 그 때마다 카테터 끝을 열처리하여 폐색시켰다.

BBB 스케일(21점 만점: 0점(완전 마비)∼21점(정상적인 후지(後肢) 운동)의 21 단계로 평가)(Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC: A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12: 1-21, 1995)을 사용하여 래트의 후지 운동 기능을 경시적(經時的)으로 평가하여, 척수 손상에 대한 HGF의 치료 효과를 검토했다. 척수 손상의 다음날에는, BBB 스코어는 모든 개체에서 0점이었지만, 척수 손상 4주일 후, HGF 투여군에서는 BBB 스코어의 평균은 10점 이상으로 회복하여, 용매 투여군(대조군)의 스코어(평균 10점 미만)보다 유의하게 높은 값을 나타낸다. HGF의 척수 손상에 대한 치료 효과가 확인되었다. 그리고, 4주일의 투여 기간에 걸쳐, 용매 투여군(대조군), 및 HGF 투여군 중 어느 것에 있어서도, 래트는 척수 손상 이외의 이상 증상을 나타내지 않았다. 또한, 척수 손상 4주일 후에 래트를 해부한 바, 래트의 척수에 있어서 척수 손상을 받은 부위 이외에 이상은 인정되지 않았다. 실시예 2의 동결건조 제제를 재용해하여 얻은 HGF 용액은 척수 손상의 치료에 있어서 안전하고 또한 유효한 것으로 확인되었다.

[산업상 이용가능성]

본 발명에 의하면, 의약으로서 유용한, 보존 안정성이 우수한 HGF 제제를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 HGF 주사액은, ALS, 척수 손상 등의 중추신경 질환의 치료를 위하여, 수강 내 또는 뇌실 내, 또는 척수 실질 내 또는 뇌실질 내에 투여할 수 있다. 따라서 본 발명은, 의료 분야 등에 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> KRINGLE PHARMA INC. <120> HGF preparation usable for treating a neurological disease <130> K12F5359 <150> JP 2014-184475 <151> 2014-09-10 <160> 6 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2187 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60 ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120 gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180 accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240 ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300 ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360 aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420 tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480 agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540 cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600 tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct 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Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly 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Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725 <210> 4 <211> 723 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg 165 170 175 Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg 180 185 190 Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr 195 200 205 Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly 210 215 220 Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe 225 230 235 240 Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg 245 250 255 Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His 260 265 270 Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met 275 280 285 Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln 290 295 300 Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro 305 310 315 320 Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 340 345 350 Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg 355 360 365 Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln 370 375 380 Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln 385 390 395 400 Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp 405 410 415 Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu 420 425 430 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr 435 440 445 Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys 450 455 460 Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile 465 470 475 480 Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr 485 490 495 Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His 500 505 510 Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg 515 520 525 Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly 530 535 540 Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu 545 550 555 560 Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu 565 570 575 Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile 580 585 590 Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser 595 600 605 Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu 610 615 620 Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His 625 630 635 640 His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala 645 650 655 Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu 660 665 670 Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro 675 680 685 Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val 690 695 700 Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val 705 710 715 720 Pro Gln Ser <210> 5 <211> 697 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys 1 5 10 15 Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys 20 25 30 Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly 35 40 45 Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln 50 55 60 Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu 65 70 75 80 Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn 85 90 95 Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr 100 105 110 Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu 115 120 125 His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn 130 135 140 Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr 145 150 155 160 Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser 165 170 175 Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met 180 185 190 Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr 195 200 205 Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe 210 215 220 Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr 245 250 255 Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr 260 265 270 Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr 275 280 285 Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His 290 295 300 Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu 305 310 315 320 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr 325 330 335 Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys 340 345 350 Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr 355 360 365 Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp 370 375 380 Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp 385 390 395 400 Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala 405 410 415 His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr 420 425 430 Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn 435 440 445 Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val 450 455 460 Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu 465 470 475 480 Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser 485 490 495 Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp 500 505 510 Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu 515 520 525 Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu 530 535 540 Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp 545 550 555 560 Asp Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro 565 570 575 Glu Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile 580 585 590 Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn 595 600 605 Glu Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser 610 615 620 Glu Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly 625 630 635 640 Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val 645 650 655 Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro 660 665 670 Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile 675 680 685 Ile Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 690 695 <210> 6 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys 1 5 10 15 Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys 20 25 30 Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly 35 40 45 Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln 50 55 60 Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu 65 70 75 80 Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn 85 90 95 Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr 100 105 110 Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu 115 120 125 His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 130 135 140 Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val 145 150 155 160 Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met 165 170 175 Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser 180 185 190 Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys 195 200 205 Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys 210 215 220 Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro 225 230 235 240 His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr 245 250 255 Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly 260 265 270 Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile 275 280 285 Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr 290 295 300 Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn 305 310 315 320 Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile 325 330 335 Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly 340 345 350 Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser 355 360 365 Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu 370 375 380 Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn 385 390 395 400 Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys 405 410 415 Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg 420 425 430 Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val 435 440 445 Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro 450 455 460 Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys 465 470 475 480 His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala 485 490 495 Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu 500 505 510 Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val 515 520 525 Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val 530 535 540 Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr 545 550 555 560 Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys 565 570 575 Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu 580 585 590 Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln 595 600 605 His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly 610 615 620 Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro 625 630 635 640 Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val 645 650 655 Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg 660 665 670 Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys 675 680 685 Val Pro Gln Ser 690 1

Claims

간세포 증식 인자(HGF) 단백질을 유효 성분으로 하고, 또한 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제, 및 계면활성제를 함유하는, HGF 제제(製劑).
제1항에 있어서,
동결건조 제제인, HGF 제제.
제2항에 있어서,
간세포 증식 인자(HGF) 단백질, 유당, 글리신, 염화 나트륨, pH 완충제 및 계면활성제를 함유하는 수용액을 동결건조하여 얻어지는 동결건조 제제인, HGF 제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
유당의 함유량이 HGF 1중량부에 대하여 0.1∼50 중량부인, HGF 제제.
제3항에 있어서,
수용액에서의 유당의 농도가 0.1∼100 mg/mL인, HGF 제제.
제3항에 있어서,
수용액에서의 글리신의 농도가 0.05∼50 mg/mL인, HGF 제제.
제3항에 있어서,
수용액에서의 HGF 단백질 농도가 0.05∼40 mg/mL인, HGF 제제.
제1항에 있어서,
pH 완충제가 시트르산 또는 그의 수화물과, 시트르산의 염과의 조합인, HGF 제제.
제1항에 있어서,
계면활성제가 폴리소르베이트인, HGF 제제.
제1항에 있어서,
주사액인, HGF 제제.
제10항에 있어서,
주사액이, 제2항에 기재된 동결건조 제제를, 약학적으로 허용되는 용매에 용해하여 얻어지는 수용액인, HGF 제제.
제1항에 있어서,
중추신경 질환의 치료용인, HGF 제제.
제12항에 있어서,
중추신경 질환이, 근위축성 측색 경화증(ALS), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea), 척수 소뇌 변성증, 척수 손상, 뇌경색, 뇌허혈 및 다발성 경화증 중 어느 하나인, HGF 제제.
제1항에 있어서,
수강(medullary cavity) 내, 뇌실 내, 척수 실질 내 또는 뇌실질 내에 투여되는 것인, HGF 제제.
제10항에 있어서,
주사액 중의 유당의 농도가 0.1∼100 mg/mL인, HGF 제제.
제10항에 있어서,
주사액 중의 글리신의 농도가 0.05∼50 mg/mL인, HGF 제제.
제10항에 있어서,
주사액 중의 HGF 단백질 농도가 0.05∼40 mg/mL인, HGF 제제.
제1항에 있어서,
HGF 단백질이 인간 유래의 HGF 단백질인, HGF 제제.
제18항에 있어서,
HGF 단백질이, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질인, HGF 제제.
제1항에 있어서,
HGF 단백질이, 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 단백질로서, HGF로서의 생물 활성을 가지는 단백질인, HGF 제제.