CN110913872B - 治疗溶酶体贮积疾病及病症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于治疗或预防溶酶体疾病或病症的组合物和方法，该治疗或预防涉及增加受试者的金属硫蛋白多肽或多核苷酸的水平、表达或活性。

Description

治疗溶酶体贮积疾病及病症的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请主张2017年1月17日提交的美国临时申请62/447,341和2017年11月6日期缴的美国临时申请62/582,247的优先权和权利，该临时申请的公开内容通过引用而整体并入本文。

背景技术

伴有中枢神经系统(CNS)损伤的大多数溶酶体贮积病症(LSD)缺少有效且治愈性的治疗，且患者最终死于他们的毁灭性疾病。疾病发作往往出现在很早的婴儿期，且如果不是晚期，一般以轻微的表现为特征，该表现导致对明显症状的诊断。LSD的特征也在于快速早期疾病进展，尤其是早发性变异。由于这些原因，已经在症状发生前LSD儿童中取得一定程度的成功的治疗途径，包括例如用于克拉伯病(Krabbe disease)的造血细胞移植(HCT)或用于异染性脑白质营养不良(MLD)的造血干细胞(HSC)基因疗法(HSC GT)，对于大多数LSD患者并未见受益，其相关受益几乎为用于症状发生前情况下或早期症状情况下所专有。这些基于HSC的途径在缓解迅速进展的LSD脑病中失败的关键原因之一是，与原发性神经系统疾病的迅速进展相比，所移植的造血细胞后代替换常驻型CNA组织巨噬细胞/组织细胞和小神经胶质细胞的步伐缓慢。事实上，尽管已经明确地证明在HCT后通过源自供体的细胞进行的对脏器官巨噬细胞的迅速重建，但被期望出现的是供体细胞对脑实质的更为受限且更缓慢的浸润。此外，不同细胞类型的吸收效率和与酶缺陷相关的内在病理机制没有完全为酶替换所克服，且交叉矫正可能对在移植患者体内观察到的残留且长期进展的疾病负有责任。重要的是，在大多数LSD中，溶酶体酶缺陷触发一连串事件，最终导致神经炎症、氧化应激途径的激活和后续的神经退行性变。这些机制关键性地影响对治疗的应答，也是综合方案的关键治疗靶点。据此，患有溶酶体贮积病症的患者需要新的治疗组合物和方法。

发明内容

如下所述，本文公开用于通过增加受试者的金属硫蛋白多肽或多核苷酸的水平、表达或活性而治疗或预防溶酶体贮积疾病或病症(例如，神经元蜡样脂褐质沉积症)的组合物和方法。在一些实施方案中，该方法涉及将患者的内源性小神经胶质细胞替换为源自供体或工程化的细胞，该细胞能通过不同机理对疾病患者有所贡献，其中该机理为诸如蛋白质输送或局部炎症的调节以及氧化应激等。

因此，一方面，本文公开治疗受试者的溶酶体贮积疾病或病症的组合物方法，该方法涉及相对于参考值增加所述受试者的金属硫蛋白多肽或多核苷酸的水平、表达或活性。

在本文描绘的任何方法的各种实施方案中，伴有CNS损伤的溶酶体贮积病症是神经元蜡样脂褐质沉积症、球状细胞性脑白质营养不良、GM1神经节苷脂症、青少年氨基己糖酯酶A缺乏症、异染性脑白质营养不良、粘多糖症障碍、多发性硫酸脂酶缺乏症、Tay-Sachs/GM2神经节苷脂症。

在本文描绘的任何方法的各种实施方案中，该受试者是通过检测所述受试者的样品中金属硫蛋白(MT)多核苷酸或多肽的水平相对于参考值的增加而预先选择的。

在本文描绘的任何方法的各种实施方案中，该金属硫蛋白是金属硫蛋白-1A(MT1A)、金属硫蛋白-1B(MT1B)、金属硫蛋白-1E(MT1E)、金属硫蛋白-1F(MT1F)、金属硫蛋白-lG(MT1G)、金属硫蛋白-1H(MT1H)、金属硫蛋白-1I假基因(MT1Ip或MTE)、金属硫蛋白-1L(LT1L或MT1R)、金属硫蛋白-lM(MT1M或MT1K)、金属硫蛋白-1X(MT1X)、金属硫蛋白-2(MT2)、金属硫蛋白-2A(MT2A)、金属硫蛋白-3(Mt3)、和金属硫蛋白-4(MT4)中的一种或多种。

在本文描绘的任何方法的各种实施方案中，该方法涉及将一种或多种MT给药至该受试者。

在本文描绘的任何方法的各种实施方案中，该方法涉及使用造血干细胞(HSC)在受试者的脑内和CNS外的组织内生成编码一种或多种MT的持续混合造血嵌合体。在本文描绘的任何方法的各种实施方案中，该方法涉及治疗患有溶酶体贮积病症或处于增高的发展出溶酶体贮积病症风险下的受试者，包括通过给药作为CD34⁺、CD38^-中的一种或多种的造血干细胞(HSC)进行治疗，其中HSC经静脉给药(IV)；或通过脑室内(ICV)注射与去髓性预处理联合进行治疗。在本文描绘的任何方法的各种实施方案中，使用表达一种或多种治疗性多肽或多核苷酸的载体转换单离的HSC，其中HSC是CD34⁺、CD38^-中的一种或多种。在各种实施方案中，使用整合型载体即慢病毒载体将HSC工程化以表达一种或多种金属硫蛋白+/-感兴趣的溶酶体酶(在靶标疾病中有缺陷)。在本文描绘的任何方法的各种实施方案中，该方法涉及通过预处理方案将受试者的的内源性髓细胞和小神经胶质细胞和/或它们的祖细胞去髓，并且通过HSC植入来重建受试者的的小神经角质细胞。在本文描绘的任何方法的各种实施方案中，HSC与去髓性预处理(ablative conditioning)联合给药。在各种实施方案中，去髓性预处理包含将细胞毒性剂给药至受试者。在各种实施方案中，烷基化剂是白消安(busulfan)。在各种实施方案中，去髓性预处理在给药HSC之前执行。

从具体具体例和权利要求书可明了本发明的其它特征和优点。

定义

除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有本发明所属领域技术人员所一般理解的意义。下述参考文献对技术人员提供本发明中使用的多个术语的一般性定义：Singleton等人所著《微生物学和分子生物学词典(第二版)》(Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994))；《剑桥科技词典》(The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988))；Rieger等人编撰的《遗传性术语表(第五版)》(The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger etal.(eds.),Springer Verlag(1991))；以及Hale和Marham所著《哈珀·柯林斯生物学词典》(Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)).如本文中所用，除非明确排除，否则下述术语具有归于其下方的意义。

“剂”意为任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子、或肽、或其片段。

“缓解”意为减少、阻抑、衰减、缩减、迟滞或稳定化疾病的发展或进展。

如本文中所用，术语“抗体”指的是特异性地与抗原结合的免疫球蛋白分子。术语“抗体片段”指代是完整抗体的一个部分，且指的是完整抗体的抗原决定可变区。

“变更”或“改变”意为改变增加或降低。变更可小至1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％，或大至40％、50％、60％，或甚至大至70％、75％、80％、90％、或100％。

“生物样品”意为源自有机体的任何组织、细胞、体液或其它材料。

“捕捉剂”意为特异性地结合核酸分子或多肽以选择或单离该核酸分子或多肽的试剂。

如本文中所用，术语“测定”、“评估”、“分析”、“测量”和“检测”指的是定量测定和定性测定两者，且就其本身而言，术语“测定”在本文中与“分析”、“测量”等可互换使用。若试图进行定量测定，则使用短语“测定被分析物等的量”。若试图进行定性和/或定量测定，则使用短语“测定被分析物的水平”或“检测”被分析物。

“检测”指的是证实待检测的被分析物的存在、不存在或量。

“可检测的标记”意为一种组合物，当链接至感兴趣的分子时，该组合物使得后者可经由光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。例如，有用的标记包括放射性同位素、磁性微珠、金属微珠、胶体离子、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，一般用于ELISA)、生物素、地高辛(digoxigenin)或半抗原。

“疾病”意为损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病況或病症。

“有效量”意为相对于未治疗患者缓解疾病症状所需的化合物的量。用来实践本发明的用于治疗性处理疾病的活性化合物的有效量可变，取决于给药模式以及受试者的年龄、体重和一般健康情况。基本上，主治医生或兽医将决定适宜的量和给药方案。这一量被称为“有效”量。

“片段”意为蛋白质或核酸的一个部分，其大致上与参考蛋白质或核酸一致。在一些实施方案中，该部分保留本文所述的参考蛋白质或核酸的生物学活性的至少50％、75％或80％，或更优选90％、95％或甚至99％。

术语“单离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指的是材料没有不同程度的在其天然状态下发现的正常伴生组分。“单离”表示与原始来源或周围物质分隔的程度。“纯化”表示高于“单离”的分隔程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质最够不含其它材料，使得任何杂质均不在材料上影响该蛋白质的生物学性质或不造成其它负面后果。换言之，如果本发明的核酸或肽基本上在通过重组DNA技术生产时不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者当化学合成时不含化学前体或其它化学品，则该核酸或肽是纯化的。典型使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高校液相色谱来测定纯度和均质性。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中给出实质上的一条谱带。对于可进行修饰如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同的修饰可给出不同的单离的蛋白，它们可独立纯化。

“单离的多肽”意为已经与其天然伴随组分单离的本发明的多肽。典型地，以重量计，当多肽的至少60％不含其天然关联的蛋白质和天然出现的有机分子时，则该多肽是单离的。优选该制剂含有至少75重量％、更优选至少90重量％、最优选99重量％的本发明的多肽。可通过例如从天然来源提取、编码多肽的重组核酸的表达、或化学合成蛋白质来获得本发明的单离的多肽。可通过任何适宜的方法例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量纯度。

如本文中所用，“溶酶体贮积病症(SD)”指的是由导致底物(例如，硫酯、硫酸乙酰肝素、糖脂质、神经酰胺)在溶酶体内蓄积的不正常代谢所造成的一组疾病中的任一种。例如，溶酶体贮积病症(LSD)由溶酶体功能障碍造成，该溶酶体功能障碍一般为脂质、糖蛋白(含糖的蛋白质)或所谓粘多糖的代谢所需酶的缺陷的结果。

“标记物”意为任何具有与疾病、病症或病況相关变更的临床指示物、蛋白、代谢物或多核苷酸。

“小神经胶质细胞”意为中枢神经系统的免疫细胞。

如本文中所用，“神经退行性疾病”指的是以包括神经元死亡在内的神经元结构和/或功能的进行性丧失为特征的疾病。

“加快增殖”意为细胞在体内或体外的分裂增加。

如本文中所用，术语“预防(prevent)”、“防止(preventing)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等指的是降低受试者的发展出病症或病況的概率，其中该受试者不具有病症或病況但处于发展出病症或病況的风险下或易于发展出病症或病況。

术语“受试者”或“患者”指的是作为治疗、观察或实验的目标的动物。仅作为实例，受试者包括但不限于，哺乳动物，包括但不限于人类和非人哺乳动物，诸如非人灵长类、鼠、牛、马、犬、羊或猫科动物。

“降低”意为至少10％、25％、50％、75％或100％的负向改变。

“参考”意为比较的标准或对照条件。

“基本相同”意为多肽或核酸分子展现与参考氨基酸序列(例如，任何一种本文所述的氨基酸序列)或核酸序列(例如，任何一种本文所述的核酸序列)的至少50％一致性。优选的，此序列在氨基酸水平或核酸水平上与用于比较的序列的一致性为至少60％、更优选80％或85％、且更优选90％、95％、96％、97％、98％、或99％或更高。

通常使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心的遗传学计算机公司(Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705)的序列分析软件包BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列一致性。该软件通过设定多种替换、删除、及/或其它修饰的同源性程度来匹配一致或相似的序列。保守替换典型包括下述各组的组内替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在例示性的测定一致性程度的途径中，可使用BLAST程序，其中介于e^-3与e^-100之间的可能性得分指示密切相关的序列。

可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子无须与内源性核酸序列100％一致，但典型将会展现大致的一致性。具有与内源性序列“基本一致性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意为在互补多核苷酸序列(如，本文中揭示的基因)或其部分在多种严格条件下配对以形成双链分子。(见，例如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。

举例而言，严格的盐浓度一般为少于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选少于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，且更优选少于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格度杂交可在有机溶剂如甲酰胺不存在下获得，而高严格度杂交可在至少约35％甲酰胺且更优选至少约50％甲酰胺的存在下活儿。严格的温度条件一般将包括至少约30℃，更优选至少约37℃，且最优选至少约42℃的温度。可变的附加因素，如杂交时间、洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及包含或不饱和载体DNA，是该领域技术人员所周知的。通过按需要组合这些多种条件来实施各种水平的严格度。在优选的具体例中，杂交将出现在30℃的750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中。在更优选的具体例中，杂交将出现在37℃的500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中。在最优选的具体例中，杂交将出现在42℃的250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中。对这些条件的有用改变对于该领域技术人员是显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格度也将改变。可通过盐浓度和温度来界定洗涤严格度条件。如上，可通过降低盐浓度或增加温度来增加洗涤严格度。举例而言，洗涤步骤的严格的盐浓度优选为少于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，且最优选少于约15mMNaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件一般将包括至少约25℃，更优选至少约42℃，且甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的具体例中，洗涤步骤将出现在25℃的30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。在更优选的具体例中，洗涤步骤将出现在42℃的15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。在更优选的具体例中，洗涤步骤将出现在68℃的15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。对这些条件的额外改变对于该领域技术人员是显而易见的。杂交技术是该领域技术人员所周知的，且揭示在例如Benton andDavis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA72:3961,1975)；Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,WileyInterscience,New York,2001)；Berger and Kimmel(Guide to Molecular CloningTechniques,1987,Academic Press,New York)；以及Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中。

“特异性结合”意为化合物(例如，肽)识别并结合分子(例如，多肽多肽)，但基本上不识别并结合样品如生物学样品中的其它分子。

如本文中所用，“治疗”等指的是减轻或缓解与其相关的病症和/或症状。应知晓，尽管未排除，但治疗病況或症状并不需要完全消除与该病況或症状相关的病況、症状或症候。

除非明确指出或从语境中明显可见，否则本文中使用的术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如，处于均值的2标准偏差内。“约”可理解为处于所指出值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从语境中明确排除，否则本文中提供的所有数值均以术语“约”修饰。

本文中提供的范围理解为该范围内所有值的略写。例如，1至50的范围理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成的组的任意数字、数字组合或子范围。

本文中提供的任何化合物、组合物或方法可与本文中提供的一种或多种任何其它组合物和方法组合。

本文中，除非语境中明确排除，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”包括复数形式。因此，举例而言，提及“生物标记物”包括提及超过一种生物标记物。

除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“或”理解为包含的。

本文中使用的术语“包括”意为短语“包括但不限于”，且可与该短语互换地使用。

如本文中所用，术语“包含”、“含有”、“具有”等可具有美国专利法中规定的属于它们的意义，且可意为“包括”等；“主要由...组成”等具有美国专利法中规定的属于它们的意义，且该术语是开放性的，允许超过其所引述者的存在，只要其所引述的基本或新颖特征没有被超过其所引述者的存在改变即可，但不包括先前技术实施方案。

附图说明

图1A、图1B、图1C和图1D显示用于以MT作为LSD治疗剂的临床前测试的疾病模型选择。

图1A显示来自GLD、MLD、NPC和NCL患者(如图中所注明)的尸检脑样品的MT免疫反应性的代表性照片。对于脑白质营养不良，显示灰质和白质(GM和WM)；而对于NPC和NCL，仅显示GM。MT免疫反应性主要与皮质和白质中的星形胶质细胞相关。仅在NCL脑样品(*)中，神经元显示MT免疫反应性；而MT阳性组织细胞(#)仅见于MLD中。40X放大。

图1B是提供伴有神经损伤的LSD的脑中Lrp2 mRNA的相对丰度与年龄相仿的正常供体(ND)样品相比的图。均值±SEM。单因素方差分析与Bonferroni测后检验，**＝P值<0.01。GLD n＝2，NPC n＝3，MLD n＝3，NCL n＝4，ND＝12。

图1C是西方墨点法，显示巨蛋白/Lrp2蛋白在来自4例LSD脑(GLD n＝1,NPC n＝1,MLD n＝1,NCL n＝2)和3例ND的蛋白质提取物上的免疫反应性。评估α-肌动蛋白免疫反应性作为蛋白质负载的对照。

图1D是显示LSD小鼠模型中MT1 mRNA表达水平的图。在下列LSD小鼠模型中测量mMT1水平：GLD(n＝6，40日龄)，MLD(n＝4，10月龄)，Sandhoff(SD n＝4，3.5月龄)，INCL(n＝4，200日龄)，MPSI(n＝4，10月龄)，MPSII(n＝3，10月龄)，MPSIII(n＝4，40日龄)，多发性硫酸酯酶缺陷(MSD n＝5，2至3周龄)，与20个不同年龄的WT小鼠比较。单因素方差分析，Dunnett校正，**＝P值<0.01,*＝P值<0.05。

图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图2G和图2H显示MT在GLD和INCL动物模型中的表型效果。

图2A是显示天然小鼠以及MT-转基因Galc-/-和Ppt1-/-小鼠体内的MT脑表达的图。将MTtg(n＝8)、GLD(n＝8)、MT-GLD(n＝8)、INCL(n＝5)和MT-INCL(n＝5)小鼠体内的MT-1表达水平(MT-1mRNA丰度)计算为WT水平的倍数。均值与SEM。单因素方差分析与Bonferroni测后检验：**＝P值<0.01，*＝P值<0.05。在两个天然动物疾病模型中，MT表达均相较于野生型水平有所增长，这是由于反应性疾病机制；当令与MT转基因种系杂交的小鼠罹患疾病时，MT表达进一步增加。

图2B显示PND36染色星形胶质细胞(GFAP-红)、金属硫蛋白(MT-绿)和DAPI的MT-GLD小鼠的脑桥区的代表性共焦图像，证实星形胶质细胞中表达的MT特异性。20X放大(左图)和40X放大(右图)。

图2C显示PND36染色小神经胶质细胞(IBA-红)、金属硫蛋白(MT-绿)和DAPI的GLD小鼠和MT-GLD小鼠的脑桥区的代表性共焦图像，显示在两个动物模型中极少数MT阳性细胞与小神经胶质细胞信号共局域化，而在MT-GLD样品中存在更强的MT染色。20X放大。

图2D和图2E说明下述实验：该实验中，将MT1转基因(过表达)小鼠与Galc-/-小鼠或Ppt1-/-小鼠杂交，后两者分别是溶酶体贮积疾病球形细胞样脑白质病(或克拉伯病)和1型神经元样脂褐质沉积症的动物模型。图2D提供MT-GLD小鼠和GLD小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。通过对数秩(Mantel-Cox)测试分析数据；P值<0.0001。图2E提供MT-INCL小鼠和INCL小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。通过对数秩(Mantel-Cox)测试分析数据；P值<0.0001。生成天然小鼠和MT转基因Galc-/-小鼠(图2D)和Ppt1-/-小鼠(图2E)的生存曲线，该曲线显示患病的转基因动物(过表达MT)相对于患病的非转基因小鼠的生存优势。

图2F是显示MT-INCL小鼠和INCL小鼠的疾病严重程度评分(DSS)。INCL，n＝10；以及，MT-INCL，n＝10。双因素方差分析重复测量，之后进行Bonferroni校正：*P值<0.05，***P值<0.001。长达250天生存期内，天然小鼠和MT转基因Ppt1-/-小鼠的平均疾病评分。疾病评分对运动机能、肌肉强度和癫痫的发生负有责任。

图2G是说明对图2D的生存数据和图2A中呈现的MT水平(表达为WT水平的倍数)校正的图，包括GLD数据集和MT-GLD数据集。该图描绘以相同动物体内的MT表达水平插值的天然出现的疾病模型的最大生存，证实与生存增益相关的最小MT水平。这里也显示在GLD小鼠和MT-GLD小鼠体内检测的MT水平范围。

图2H是说明对图2E的生存数据和图2A中呈现的MT水平(表达为WT水平的倍数)校正的图，包括INCL数据集和MT-INCL数据集。该图描绘以相同动物体内的MT表达水平插值的天然出现的疾病模型的最大生存，证实与生存增益相关的最小MT水平。这里也显示在INCL小鼠和MT-INCL小鼠体内检测的MT水平范围。

图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F和图3G显示MT-GLD小鼠和MT-INCL小鼠体内的抗炎基因、抗凋亡基因和抗氧化应激基因的转调。

图3A提供描述四个测试组中上调和下调的差异性表达基因的分级聚类。如图中所示，过表达以红色阴影可视化，而低表达以蓝色阴影可视化。使用来自下列全部在PND36下分析的小鼠的小脑提取物执行转录组阵列：3例WT、3例MTtg、3例MT-GLD和3例GLD。

图3B、图3C和图3D是显示LSD和MT-LSD脑样品中Ifi44(图3B)、Hpgd(图3C)、和Casp4(图3D)表达变异的图。图3B、图3C、图3D的左图均显示所注明的对中的倍数表达改变，从转录组分析数据计算；MT-GLD与GLD对比，Ifi44的倍数改变为-2,5528，P值<0.001；MT-GLD与GLD对比，Hpgd的倍数改变为-2,24130，P值<0.001；MT-GLD与GLD对比，Casp4的倍数改变为-1,75215，P值<0.01。图3B、图3C和图3D的中图和右图，Ifi44(图3B)、Hpgd(图3C)、和Casp4(图3D)显示通过在MTtg小鼠、GLD小鼠和MT-GLD小鼠(中图)以及在MT-Tg小鼠、INCL小鼠和MT-INCL小鼠(右图)上进行qPCR而计算的相对mRNA丰度；每组n＝4小鼠；均值与SEM；通过单因素方差分析与Bonferroni测后检验进行分析，*P值<0.05，**P值<0.01，***P值<0.001。与患病的天然对照组相比，患病的转基因小鼠体内的Casp4表达下降。

图3E显示在WT小鼠、GLD小鼠和MT-GLD小鼠的脑切片中进行硝基酪氨酸(Nitro)染色的代表性照片。其它区域使用相同的表达模式进行分析。全部动物均在PND36下分析。放大倍数为40X。

图3F是显示在PND36下对GLD(n＝3)和MT-GLD(n＝3)的CNS(所分析的小脑、胼胝体脑干)中的硝基酪氨酸免疫阳性区域进行定量的图，每个动物取3个切片，每个切片取2个片段，表达为WT(n＝3)的倍数。数据通过未配对t测试分析，并进行MT-GLD与GLD的比较，***P值<0.001。均值与SEM。与患病的天然对照组相比，患病的转基因小鼠体内的硝基酪氨酸表达下降。

图3G包括曲线图和直方图，显示通过将荧光染料H2DCFDA与从小鼠脑部(WT n＝5，GLD n＝5，且MT-GLD n＝5)单离的骨髓细胞一起孵育并以流式细胞术进行分析而测量的细胞内活性氧(ROS)。图3G(左图)显示表示为总活骨髓细胞内DCFDA阳性细胞的百分比的结果。均值与SEM。(G右图)代表性的直方图，不包括阳性对照(Co+，加入H2O2的WT细胞)。与患病的天然对照组相比，患病的转基因小鼠体内的DCDFA表达下降。

图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G和图4H显示，在MT-GLD模型和MT-INCL模型中，Purkinje细胞丧失均得以修复。

图4A、图4B、图4C、图4D和图4E是显示MT在Galc-/-小鼠或Ppt1-/-小鼠体内的神经保护作用的代表性图像和图表。显示了来自野生型小鼠、天然小鼠、以及MT-转基因Galc-/-小鼠(图4A、图4B)和Ppt1-/-小鼠(图4C)的小脑切片。Purkinje细胞可通过阳性钙结合蛋白(CALB)染色(A)以及通过它们在结晶紫下的形态特征(C)检测。将Purkinje细胞定量，并且显示，其在疾病模型中显着减少，但在患病的MT转基因小鼠体内并未显着减少。

图4A显示在WT小鼠、GLD小鼠和MT-GLD小鼠的小脑切片中进行钙结合蛋白染色的代表性照片。全部动物均在PND36下分析。

图4B是显示在PND36下对WT小鼠(n＝3)、GLD小鼠(n＝3)和MT-GLD小鼠(n＝3)体内的钙结合蛋白阳性细胞的定量的图，表达为100μm内的细胞数(每个动物取3个切片，每个切片取2个片段)。均值与SEM。数据通过单因素方差分析与Bonferroni校正进行分析；***P值<0.001。

图4C显示在PND36下在WT小鼠、GLD小鼠和MT-GLD小鼠的小脑中进行小清蛋白染色的代表性照片。细胞核以Topro III染色。

图4D是显示在PND36下对WT小鼠(n＝3)、GLD小鼠(n＝3)和MT-GLD小鼠(n＝3)体内的小清蛋白阳性细胞的定量的图，表达为100μm内的细胞数(每个动物取3个切片，每个切片取2个片段)。均值与SEM。数据通过单因素方差分析与Bonferroni校正进行分析；****P值<0.0001。

图4E显示在WT小鼠、INCL小鼠和MT-INCL小鼠的小脑中进行Nissl染色以检测Purkinje细胞的代表性照片。全部动物均在200天的中间疾病阶段分析。

图4F是显示在PND200下对WT小鼠(n＝5)、INCL小鼠(n＝5)和MT-INCL小鼠(n＝5)体内的钙结合蛋白计数的图，表达为100μm内的细胞数(每个动物取3个切片，每个切片取2个片段)。均值与SEM。数据通过单因素方差分析与Bonferroni校正进行分析；****P值<0.001。

图4G是显示对WT(n＝3)、GLD(n＝3)和MT-GLD(n＝3)的脑桥区(但在其它脑部区域如小脑和胼胝体中检测到相同的表达模式)中凝集素阳性区域的定量的图(每个动物取3个切片，每个切片取2个片段)。数据表达为与WT水平的比率。均值与SEM。数据通过单因素方差分析与Bonferroni校正进行分析。

图4H是显示在PND200下对WT(n＝5)、INCL(n＝5)和MT-INCL(n＝5)的不同脑区域(皮质、丘脑、海马体)中的自发荧光阳性区域定量的图(每个动物取3个切片，每个切片取2个片段)。数据表达为与WT的比率，细胞核以DAPI染色。均值与SEM。数据通过单因素方差分析与Bonferroni校正进行分析。

图5A、图5B、图5C、图5D、图5E、图5F、图5G、图5H、图5I、图5J和图5K显示，MT在GLD和INCL中诱导抗炎M2样小神经胶质细胞表型。

图5A显示在WT小鼠、GLD小鼠和MT-GLD小鼠的脑桥区中进行GFAP染色的代表性照片。全部动物均在PND36下分析。20X放大。

图5B是显示在PND36下对WT(n＝3)、GLD(n＝3)和MT-GLD(n＝3)的脑桥区中的GFAP免疫阳性区域定量的图(每个动物取3个切片，每个切片取2个片段)。对于INCL模型，该分析使用WT(n＝3)、INCL(n＝5)和MT-INCL(n＝5)在PND200下(每个动物及每个区域取3个切片，每个切片取2个片段，来自丘脑、皮质和海马体)执行。对于每个模型，数据表示为与WT的比率，并通过未配对t测试机芯分析。均值与SEM。

图5C显示在WT小鼠、GLD小鼠和MT-GLD小鼠的脑桥区中进行IBA染色的代表性照片。全部动物均在PND36下分析。20X放大。

图5D是显示在PND36下对WT(n＝3)、GLD(n＝3)和MT-GLD(n＝3)的脑桥区中的IBA免疫阳性区域定量的图(每个动物取3个切片，每个切片取2个片段)。对于INCL模型，该分析使用WT(n＝3)、INCL(n＝5)和MT-INCL(n＝5)在PND200下(每个动物及每个区域取3个切片，每个切片取2个片段，来自丘脑、皮质和海马体)执行。对于每个模型，数据表示为与WT的比率，并通过未配对t测试机芯分析。均值与SEM。

图5E、图5F、图5G、图5H和图5I是显示转基因MT过表达对于Galc-/-小鼠或Ppt1-/-小鼠体内的小神经胶质细胞表型的作用的图。将小神经胶质细胞从野生型动物、患病的天然动物和患病的MT转基因动物体内分选出来，并测试所列基因的表达。患病的天然动物具有普遍的促炎小胶质神经细胞表型(IL1β和TNFα表达增加)，而该表型在患病的MT转基因动物体内减少。在患病的MT转基因动物体内也观察到了与神经保护型小神经胶质细胞表型(CD206、ARG1、YM1)相关的标记物表达的增加。这些图显示通过在PND36下从WT小鼠(n＝6)、MTtg小鼠(n＝3)、GLD小鼠(n＝5)和MT-GLD小鼠(n＝5)脑部分选而单离以及在PND200下从NCL小鼠(n＝5)和MT-INCL小鼠(n＝5)单离的总骨髓集落的髓样CD206(图5E)、Arginase1(图5F)、YM1(图5G)、IL1β(图5H)、TNFα(图WT5I)mRNA的相对丰度。数据表达为WT水平的倍数，通过单因素方差分析与Bonferroni校正进行分析；****P值<0.001。均值与SEM。

图5J是显示对WT(n＝3)、GLD(n＝3)和MT-GLD(n＝3)的脑桥区中的CD206免疫阳性区域定量的图(每个动物取3个切片，每个切片取2个片段)。数据表达为与WT的比率，且通过未配对t测试分析，并进行MT-GLD与GLD的比较，**P值0.0085。

图5K显示MTtg小鼠、GLD小鼠和MT-GLD小鼠的脑桥区的代表性照片，显示IBA信号与CD206的共局域化。40X放大。

图6A、图6B、图6C、图6D、图6E、图6F和图6G显示，通过AAV-PHP.B载体进行的MT输送减轻了GLD表型。

图6A是显示两个独立实验(两次平行实验)中，以编码1个(AAV-MT)和4个(AAV-4MT)MT-1拷贝的AAV-PHP.B(AAV)转导的HEK293T中MT1的相对丰度的图，报告为UT样品的倍数。单因素方差分析与Bonferroni校正；*P值<0.05，***P值<0.001。均值与SEM。

图6B是，与作为对照的注射PBS的小鼠(n＝5)相比，静脉(IV)注射AAV-4MT(IVAAV)的GLD小鼠(n＝7)的Kaplan-Meier生存曲线，两组之间显示显着差异。通过对数秩(Mantel-Cox)测试分析数据；P值0.0059。

图6C是显示MTtg过表达转基因小鼠(n＝8)、注射AAV-4MT载体(IV AAV)的GLD小鼠(n＝7)、作为对照的注射PBS的GLD小鼠(n＝5)的脑内的MT-1的相对mRNA丰度。均值与SEM。

图6D是说明对图6B的生存数据和在相同小鼠体内测量的MT水平校正的图，包括GLD数据集和AAV-GLD数据集。该图描绘以相同动物体内的MT表达水平插值的天然出现的疾病模型的最大生存，证实与生存增益相关的最小MT水平。这里也显示在GLD小鼠和AAV-GLD小鼠体内检测的MT水平范围。

图6E、图6F和图6G包括下述图表，该图表显示IV注射AAV-4MT或PBS的GLD小鼠脑内的Ifi44(图6E)、Hpgd(图6F)、和Casp4(图6G)的相对mRNA丰度，报告为WT样品的倍数。使用未配对t测试，*P值<0.05。均值与SEM。

具体实施方式

本发明提出可用于治疗和预防溶酶体疾病和病症(例如，神经元蜡样脂褐质沉积症)的组合物和方法。多种具体例中，该方法涉及增加该受试者的的金属硫蛋白多肽或多核苷酸的水平、表达或活性。在一些实施方案中，该方法涉及将小神经胶质细胞去髓和/或重建。

本发明至少部分地基于本文中所述的若干发现。已经发现，金属硫蛋白多肽水平的增加在患有溶酶体疾病或病症的受试者的具有治疗性益处。

溶酶体贮积病症(LSD)是一大类由特异性溶酶体酶的活性缺陷造成的遗传性代谢病。大概50％的LSD患者存在中枢神经系统(CNS)表现，该表现代表了患者的未被满足的医疗需求。本文中公开探索金属硫蛋白(MT)的治疗性潜力的组合物和方法，金属硫蛋白是新近被确认的一族蛋白质，在两种具有CNS损伤的两种LSD的鼠模型中，扮演所报告的神经保护角色。

尽管被归类并研究了超过40年，作为临床表现的原因的病理机制和可能减轻它们的通常致命结果的治疗途径两方面的大量知识仍然缺乏。目前使用的疗法包括来自健康的相容供体的造血细胞移植和酶替换，但对于大多数LSD来说，它们在治疗疾病相关的神经症状方面无效，这是由于它们既不能有效地以中枢神经系统为靶点也不能以及时的方式干预神经退行性变(Escolar et al,2005)。使用工程化的自体造血细胞进行的基因疗法是新兴的潜力策略，该疗法同时具备移植的子代细胞移动至接纳体脑部的能力以及通过相同的组织浸润细胞达成超生理水平的酶表达的可能性。已经证实一些LSD具有积极的临床结果(Sessa M et al,2016)。

金属硫蛋白(MT)已经被描述为神经保护分子和用于急慢性脑病的可能的治疗工具，但到目前为止，它们尚未显现治疗神经性LSD的潜力。MT是一族结合有金属的非酶蛋白质，已知其在患病的脑中发挥抗氧化剂及神经保护功能，其中，通过受体Lrp2/巨蛋白，MT被从星形胶质细胞释放出来且被星形胶质细胞自身和神经元吸收(Chung et al,2008)。已经显示，高于生理水平的MT的全身性或局部给药与针对急性脑损伤的保护性作用相关联，但是，最近多个研究小组已经报导了MT过表达在慢性不如帕金森症(Ebadi et al,2005)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Tokuda et al,2014)和阿尔兹海默症(Manso et al,2016)中的有益角色。近年来，我们确定了在患有LSD的患者和小鼠的中枢神经系统中被高表达的金属硫蛋白家族的成员，该观察结果暗示了MT在这些疾病的神经损害的发病机制中扮演的推定角色(Cesani et al,2014)。基于我们和其他小组的数据，金属硫蛋白是新兴的具有极大潜力的神经功能病況治疗剂。

为了完全开发这一潜力，在减轻LSD的神经损害中探究MT的治疗性角色。为了评估持续高水平的MT在LSD本经上的作用，将在全部组织中多表达MT-1的转基因鼠(种系B6.Cg-Tg(Mt1)174Bri/J,The Jackson Laboratory)与球形细胞样脑白质病的天然小鼠模型(GLD，也称Twitcher小鼠)(Suzuki,1995)交叉繁殖，GLD是由β-半乳糖脑苷脂酶(GALC)的活性缺陷造成的典型的神经性溶酶体贮积疾病，其特征在于迅速的、进行性的脱髓鞘和神经退行性变。为了获得MT在病脑中发挥的可能的保护性特征，特异性地分析了交叉繁殖的动物的中枢神经系统病理学。尽管单独使用保护剂并未预期治愈严重的LSD如GLD，但仍显示，MT发挥有益作用并导致生存率增加。此外，为了评估MT介导的在特异性神经疾病中的作用，将相同的MT过表达策略用于婴儿神经元蜡样脂褐病(INCL)小鼠模型(Gupta et al,2001)，这是由于神经元是MT介导的神经保护的最具靶向性的细胞类型，并且证实了加入MT的一致的有益效果。与所述MT功能一致，它们的效果也普遍与抗炎机制、抗氧化机制和抗凋亡机制相关。

溶酶体贮积疾病(LSD)

溶酶体贮积病症(LSD)包含超过40种以溶酶体功能中断为特征的疾病。这些病況中的大多数以无休止的神经退行性变为特征(Platt FM,Nature 2014；510(7503))。溶酶体功能障碍导致未完全降解的底物的蓄积，造成细胞的机械损害和/或细胞自动调节的改变，并最终导致细胞凋亡(Futerman AH et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 2004；5(7))。此外，复杂细胞信号传导机制的扰乱使得结构和生化出现对LSD中组织损害负有责任的二次改变，诸如炎症。大概50％的LSD存在中枢神经系统(CNS)表现，该表现代表了患者的未被满足的医疗需求。

目前可用于这些LSD的疗法包含来自健康的相同供体的造血细胞移植、酶替换疗法、和底物减少策略。由于这些方法不能有效地以CNS为靶点、以及时的方式干预神经损害或以复杂的LSD脑发病机制为靶点，其在治疗LSD神经性症状中通常无效或仅部分有效(Musolino PL et al.,Neuropediatrics 2014；45(3))。在早期临床测试的情境中，创新的治疗策略已经或目前正在被测试。这些新颖的方法针对将酶有效地输送至LSD CNS，且包含指向脑部的酶替换策略(即，ClinicalTrials.gov#NCT02055118)、引导脑实质内/鞘内基因转移的体内基因疗法(即，ClinicalTrials.gov#NCT01801709和NCT02725580)、或例如基于造血干细胞的间接体内基因疗法(即，ClinicalTrials.gov#NCT01560182)。有趣的是，在通过后一策略治疗的处于症状发生前的患者体内观察到了不错的结果(Biffi A.,Hum MolGenet 2016；25(R1)；Sessa M.et al.,Lancet2016；388(10043))。但是，尽管存在这些不错的早期发现，但大多数伴有CNS损伤的LSD患者缺乏治愈性治疗。

溶酶体贮积疾病包括而不限于，神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、GM1和GM2神经节苷脂贮积病、α-甘露糖苷贮积症、球形细胞样脑白质病(GLD),神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、异染性脑白质营养不良(MLD)、粘多糖症病症(MPS)、多发性硫酸酯酶缺陷(MSD)、和尼曼匹克症(Niemann-Pick Disease)。大约50％的LSD具有CNS的损伤，如在上文所列实例的情形中。例示性SD及其相关缺陷蛋白的非限制性列举提供在表1中。

表1.溶酶体贮积病症(LSD)及其相关缺陷蛋白

一方面，本文公开一些与HSC移植方案特别相关的LSD的信息，如本发明的一些方面所述。

神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)

神经元蜡样褐质沉积症是一类遗传性贮积病，其导致进行性的神经退行性变。一些变种诸如晚婴型NCL(LINCL)是由溶酶体酶的缺陷造成的。LINCL由导致TPP-I的缺陷的CLN2基因中的突变造成，其中TPP-I是一种主要责任为降解膜蛋白的溶酶体酶。神经元对于这一贮积材料的溶酶体蓄积尤其敏感，且患有LINCL的个体在脑的所有部位均具有广泛的、进行性的神经退行性变，导致植物人状态并在8至12岁的年龄死亡。

异染性脑白质营养不良(MLD)

异染性脑白质营养不良(MLD)是一种由芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因中的突变造成的脱髓鞘LSD，其伴有未降解的底物在神经系统中的进行性蓄积以及继发性神经炎症和退行性变的LSD的原型实例。MLD的基因传递是常染色体隐性遗传，且据估计，其整体发病率为1:40,000至1:100,000。

由严重且无休止的运动和认知功能损伤组成的临床表现以及疾病进展在早发临床变异中更为严重，导致一般在生命的第一个十年内死亡。MLD患者的表型与他们所携带的ARSA突变之间的关联已经得到证明。采用慢病毒载体进行自体HSC转导的HSC基因疗法以及暴露于全身性白消安预处理，已经显示在预防或终止罹患最严重的MLD变种并在症状发生前进行治疗的儿童的疾病表现中有效。

球形细胞样脑白质病(GLD)

球形细胞样脑白质病(GLD)，也称克拉伯病(Krabbe disease)，是一种由溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶(GALC)缺陷造成的常染色体隐性遗传LSD，GALC催化半乳糖基神经酰胺(GalCer)的分解代谢，而GalCer是髓鞘的重要构件。100,000个新生儿中大约出现1例GLD。该疾病典型出现于婴儿期，并迅速致死，但也存在迟发形式。该毁灭性的神经退行性病症的病因是由GALC缺陷造成的鞘糖脂分解代谢的变更：所导致的未完全代谢的GalCer的蓄积造成进行性白质疾病，而该白质疾病影响CNS和周围神经系统(PNS)。半乳糖苷鞘氨醇(或神经胺醇)也是GALC的底物，且被认为在发病机制中扮演关键角色。GLD患儿可在症状发生前且在不到4个月大时通过来自健康的相容供体的HCT进行治疗，该治疗延缓疾病发作并减弱疾病表现²⁰。HSC基因疗法也被证实在GLD临床前模型中潜在地有效²¹。

粘多糖贮积症(MPS)

粘多糖贮积症(MPS)是一组LSD，由打破葡糖氨基葡聚糖所需的溶酶体酶的缺席或故障造成。

基于症状的严重性，MPS I分为三个子类型。三种类型全部由α-L-艾杜糖醛酸酶的缺席或水平不足造成.MPS I H(也称Hurler综合征或α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷),是最严重的MPS I子类型；而MPS I S,也称Scheie综合征,是最轻微形式的MPS I。MPS I H-S，也称Hurler-Scheie综合征，其严重程度仅次于Hurler综合征。MPS II，也称Hunter综合征或艾杜糖醛酸硫酸酯酶缺陷,由艾杜糖醛酸硫酸酯酶的缺乏造成。MPS III,也称Sanfilippo综合征,其标志为严重的神经症状.存在四种截然不同类型的Sanfilippo综合征，各自由完全打破乙酰肝素硫酸酯糖链所需的不同的酶的变更造成。粘多糖病Ⅲ型A是最严重的MPS III病症，且由乙酰肝素N-硫酸酯酶的缺失或变更造成。患有粘多糖病Ⅲ型A的儿童具有罹患MPS III病症者中最短的生存期。粘多糖病Ⅲ型B由α-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶的缺失或缺陷造成。粘多糖病Ⅲ型C是乙酰辅酶Aα-氨基葡萄糖苷乙酰转移酶的缺失或变更所导致。粘多糖病Ⅲ型D由N-乙酰基氨基葡萄糖6-硫酸酯酶的缺失或缺陷造成。

MPS IV，也称Morquio综合征，是打破硫酸角质素糖链所需的N-乙酰基氨基半乳糖6-磷酸酯酶(A型)或β-半乳糖苷酶(B型)的缺失或缺陷所导致。MPS VI，也称Maroteaux-Lamy综合征，具备与Hurler综合征中所见者相同的多种体征，且由N-乙酰基氨基半乳糖4-硫酸酯酶的缺陷造成。MPS VII，也称Sly综合征，是最不常见的粘多糖贮积症之一，由β-葡萄糖醛酸酶的缺陷造成。一些MPS患者显示了从来自健康的相容供体的HCT受益，而对于一些MPS，HSC GT策略是优选²²。

LSD中的神经退行性表现

神经退行性疾病的特征为，神经元结构和/或功能的进行性丧失和/或神经元细胞死亡。炎症在几种神经退行性疾病中也扮演角色。在不同种类的神经退行性疾病中，运动机能和感觉神经元的进行性丧失以及将感官信息传达给外部对象的思维能力受到影响。通过评估受试者的的神经退行性疾病的一种或多种症状，专业医护人员可将受试者专断为患有神经退行性疾病。受试者的神经退行性疾病的非限制性症状包括，难以抬起脚和脚趾的前部；臂、腿、足或踝的虚弱；手的虚弱或动作笨拙；言语不清；吞咽困难；肌肉痉挛；臂、肩和舌的颤搐；咀嚼困难；呼吸困难；肌肉麻痹；视力的部分或完全丧失；重影；身体部分的刺痛或疼痛；随着头部移动而出现的触电感；震颤；步态不稳；疲劳；头晕；记忆力丧失；迷失方向；曲解空间关系；读写困难；难以集中注意力和思考；难以做出判断和决定；难以计划和执行熟悉的任务；抑郁；焦虑；社交退缩；情绪波动；易怒；攻击性；睡眠习惯改变；神志恍惚；痴呆；自主行动能力丧失；姿态和平衡力受损；肌肉僵硬；运动迟缓；眼部移动缓慢或不正常；不由自主地抽搐或扭动(舞蹈病)；不由自主地持续的肌肉收缩(肌张力障碍)；缺乏柔韧性；缺乏冲动控制；和饮食偏好的改变。专业医护人员也可部分地基于受试者的神经退行性疾病家族病史而作出诊断。当受试者情况呈现给卫生保健设施(如，诊所或医院)时，专业医护人员可将患者诊断为患有神经退行性疾病。在一些情况下，当受试者被辅助保健设施接纳时，专业医护人员可将该受试者诊断为患有神经退行性疾病。典型地，医师在一种或多种症状呈现之后诊断受试者的神经退行性疾病。

金属硫蛋白

金属硫蛋白(MT)是一族结合有金属的非酶蛋白质，已知其在几种不同的病理条件下在患病的脑中发挥抗氧化剂和神经保护功能(Ebadi MH et al.,Brain Res Mol BrainRes 2005；134(1)；Tokuda E.et al.,Hum Mol Genet 2014；23(5)；Manso Y.et al.,JAlzheimers Dis 2016；51(1))。通过受体Lrp2/巨蛋白，MT被从星形胶质细胞中释放出来并被星形胶质细胞本身和神经元吸收(Chung,RS.et al.,J Neurochem 2008；104(1))。近年来，有报导显示，MT家族的成员在罹患LSD的患者和小鼠的CNS中被高度表达，这一观察结果暗示了MT在LSD神经退行性变过程中的推定角色(Cesani M.et al.,Ann Neurol 2014；75(1):127-137)。在机制上已经证明，LSD中的MT表达是对与由溶酶体功能障碍造成的自噬作用抑制相关的氧化和炎症过程的应答(Cesani M.et al.,Ann Neurol2014；75(1)；BairdSK.et al.,Biochem J 2006；394(Pt 1))。MT的上调可代表一种内生机制，以抵消LSD相关炎症和氧化应激，并最终发挥一定程度的神经保护作用。(Filippon L.et al.Mol GenetMetab 2011；103(2))。基于这些设想和数据，评估了MT的输送是否能发挥疗效并减轻LSD中的神经损害。生成并分析两个MT转基因疾病模型(神经元蜡样脂褐质贮积症(NCL)，也称为Batten症；和球形细胞样脑白质病(GLD)，也称为Krabbe症)，其特征为在包括CNS在内的所有身体组织内存在MT的持续高表达。尽管并未预期单独使用保护剂治愈如这里研究的严重的先天性代谢缺陷，但MT在患病的小鼠表型上发挥了有益作用。这一有益效果，也在当通过给药编码MT的AAV-PHP.B载体而将MT转录物输送至突变LSD小鼠时实现(Deverman BE.etal.,Nat Biotechnol 2016；34(2))，并且普遍与通过MT在LSD CNS中发挥的抗炎、抗氧化和抗凋亡作用相关。

因此，一方面，本文中公开的组合物和方法，如该数据所支持，表明内源性输送的MT将会通过调整疾病相关的神经损害机制而在严重影响CNS的LSD中发挥治疗作用。

治疗方法

本发明提供一种治疗受试者的溶酶体贮积疾病或病症的方法，该方法涉及增加所述受试者的金属硫蛋白多肽或多核苷酸的水平、表达或活性。金属硫蛋白(MT)是一族耐热的小(～6-7kDa)蛋白，其含有25％至30％的半胱氨酸残基，在从酵母到哺乳动物的广泛物种范围内在进化上高度保守。MT通过糖皮质激素、氧化应激和多种重金属诸如铜、镉、汞和锌得以上调(Andrews(2000)Biochem.Pharmacol.59,95-104)。同工型范围从MT-1到MT-4，且在氨基酸组成上略有不同。MT结合金属并保护生物免于该金属的毒性，如在水生物种诸如来自污染水域的鱼类、节肢动物和软体动物中最先得到证明。除了结合重金属之外，MT也被认为作为抗氧化剂而发挥作用，但机制尚未确定。因此，已经发现，MT保护免于由氧化应激、依托泊苷(etoposide)、顺铂、阿霉素(doxorubicin)和X射线辐射诱发的细胞凋亡/坏死(Cai et al.(2004)Toxicol.Lett.146,217-226；Chimienti et al.(2001)Free RadicalsBiol.Med.31,1179-1 190；Wang et al.(2001)J.Pharmacol.Exp.Ther.298,461-468)。

本文所述的MT转录物和蛋白质可选自，例如，金属硫蛋白-1A(MT1A)、金属硫蛋白-1B(MT1B)、金属硫蛋白-1E(MT1E)、金属硫蛋白-1F(MT1F)、金属硫蛋白-lG(MT1G)、金属硫蛋白-1H(MT1H)、金属硫蛋白-1I假基因(MT1Ip或MTE)、金属硫蛋白-1L(LT1L或MT1R)、金属硫蛋白-lM(MT1M或MT1K)、金属硫蛋白-1X(MT1X)、金属硫蛋白-2(MT2)、金属硫蛋白-2A(MT2A)、金属硫蛋白-3(Mt3)、或金属硫蛋白-4(MT4)。

该家族主要成员的NCBI蛋白质保藏号为：NP_005937(MT1A)；NP_005938(MT1B)；NP_783316(MT1E)；NP_005940(MT1F)；NP_005941(MT1G)；NP_005942(MT1H)；NP_789846(MT1M)；NP_005943(MT1X)；NP_005944(MT2)；NP_005945(MT3)；和NP_116324(MT4)。MT1A、MT1E、MT2A和MTE-MT1IP的其它NCBI保藏号分别包括：NM_005946、NM_075617、NM_005953和NR_0303669。

本发明也提供治疗疾病和/或病症或其症状的方法，该方法包含将治疗有效量的包含本文所述HSC的医药组合物给药至受试者(例如，哺乳动物，诸如人类)。因此，一个实施方案是治疗苦于或易患疾病或病症或其症状的受试者的方法。该方法包括对该哺乳动物给药治疗量的本文所述细胞的步骤，给药量足以在使得该疾病或病症被治疗的条件下治疗该疾病或病症或其症状。

本文的方法包括对该受试者(包括被证实需要此治疗的受试者)给药有效量的本文所述的细胞或本文所述的组合物以产生此效果。证实受试者需要此治疗可为专业医护人员对受试者的判断，且可以是主观的(例如，观点)或客观的(例如，通过测试或诊断方法可测)。

被移植细胞的外源移植提供了多肽或其它治疗剂的表达或活性。例如，溶酶体酶中的缺陷或功能丧失导致溶酶体贮积病症。表达该治疗性蛋白(例如，酶)的或经内源移植的或经由重组方法移植的造血细胞植入小神经胶质细胞内并分化为小神经角质细胞，从而弥补该酶的缺陷。此外，所移植的细胞可用作治疗性多肽(例如，一种或多种金属硫蛋白多肽)的运载体。

在某些实施方案中，通过将现有小神经胶质细胞和/或其祖细胞去髓(例如，使用烷基化剂)而增强外源移植物。

本文的方法包括对该受试者(包括被证实需要此治疗的受试者)给药有效量的本文所述的化合物或本文所述的组合物以产生此效果。证实受试者需要此治疗可为专业医护人员对受试者的判断，且可以是主观的(例如，观点)或客观的(例如，通过测试或诊断方法可测)。此治疗将被适当地给予苦于、患有、易患疾病、病症或其症状或处于该疾病、病症或其症状风险下的受试者，尤其是人类。可通过由诊断性测试做出的客观决定或受试者或保健提供者的观点(例如，基因测试、酶或蛋白标记物、标记物(如本文中所定义)、家族病史等)做出那些受试者“处于风险下”的决定。

抗体

如本文中报导，特异性地结合标记物(例如，小神经胶质细胞或其前体的标记物)的抗体可用于本发明的包括治疗方法在内的方法中。在特别的实施方案中，本发明提供将小神经胶质细胞去髓的方法，涉及令小神经胶质细胞与具有捕获分子的纳米颗粒接触，其中该捕获分子特异性地结合小神经角质细胞的标记物并含有细胞毒性剂(例如，烷基化剂)。

抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部位。抗体典型是免疫球蛋白分子的四聚体。四聚体可以是天然出现的，或是从单链抗体或抗体片段重构的。如本文中所用，术语“抗体”不仅意为完整的抗体分子，而且意为抗体分子的保留免疫原结合能力的片段。此类片段在该领域中也是周知的，且规律地用于体内外。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、线性抗体、scFv抗体、单链抗体，诸如骆驼抗体(Riechmann,1999,Journal ofImmunological Methods231:25-38)，由VL结构域或VH结构域构成，其显现对于靶点的足够亲和性；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明的抗体可存在各种形式，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab')2，以及单链抗体(scFv)、人源化抗体、和人抗体(《使用抗体：实验室手册》(Harlow etal.,1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY)；《抗体：实验室手册》(Harlow et al.,1989,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,New York)；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。例如，缺乏完整抗体的Fc片段的F(ab')2片段和Fab片段被更快地从循环中清除，且可具有比完整抗体更差的非特异性组织结合(Wahl et al.,J.Nucl.Med.24:316325(1983)。因此，本发明的抗体包含而不限于，完整的天然抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab’、单链V区片段(scFv)；融合多肽；以及非传统抗体。

非传统抗体包括但不限于，纳米抗体、线性抗体(Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062,1995)、单结构域抗体、单链抗体、和具有多价的抗体(例如，双体、三体、四体和五体)。纳米抗体是天然出现的重链抗体的最小片段，它们进化为在轻链缺席下具有完全功能。纳米抗体具有传统抗体的亲和性和特异性，但它们的大小仅是单链Fv片段的一半。这一独特结构联合它们的极度稳定性和与人抗体框架的高度同源性导致的后果是，纳米抗体可结合传统抗体无法接近的治疗靶点。具有多价的重组抗体片段提供对癌细胞的高结合活性和独特的靶向特异性。由于大小为～60-100kDa的小分子提供更快的血液清除和迅速的组织吸收，这些多嵌合scFvs(例如，双体、四体)提供相对于亲本抗体改善的特性。见，Power等人(Generation of recombinant multimeric antibody fragments for tumordiagnosis and therapy.Methods Mol Biol,207,335-50,2003)；和Wu et al.(Anti-carcinoembryonic antigen(CEA)diabody for rapid tumor targeting andimaging.Tumor Targeting,4,47-58,1999)。

各种用于制作和使用非传统抗体的技术已经有所描述。使用亮氨酸拉链产生的双特异性抗体由Kostelny等人描述(J.Immunol.148(5):1547-1553,1992)。双体技术由Hollinger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993)描述。使用单链Fv(sFv)二聚物制作双特异性抗体片段的另一策略由Gruber等人描述(J.Immunol.152:5368,1994)。三特异性抗体由Tutt等人(J.Immunol.147:60,1991)描述。单链Fv多肽抗体包括共价结合的VH::VL杂二聚体，其可从包括编码VH和VL序列的核酸表达，该序列或直接接合或通过编码肽的链接基接合，如Huston等人所述(Proc.Nat.Acad.Sci.USA85:5879-5883,1988)描述。也见美国专利5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公布20050196754和20050196754。

多种实施方案中，该抗体是单克隆抗体。或者，该抗体是多克隆抗体。多克隆抗体的制备和使用也是技术人员已知的。本发明也涵盖杂交抗体，其中，一对重链和轻链从第一抗体获得，而另一对重链和轻链从不同的第二抗体获得。此类杂交物也可使用人源化重链和轻链形成。此类抗体一般称为“嵌合”抗体。

通常，完整抗体被称为含有“Fc”区和“Fab”区。Fc区被牵涉入补体激活中，而不被牵涉入抗原结合中。该Fc’区所来自的抗体已经被酶促裂解，或已经被产生为没有该区，标注为“F(ab’)2”片段，保留完整抗体的两个抗原结合位点。同样，该Fc区所来自的抗体已经被酶促裂解，或已经被产生为没有该区，标注为“Fab’”片段，保留完整抗体的一个抗原结合位点。Fab片段由共价键结的抗体轻链和抗体重链的一部分组成，表示为“Fd”。Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(单一Fd片段可能与多达10个不同的轻链关联而不改变抗体特异性)。单离的Fd片段保留特异性地结合至免疫原表位的能力。

制备抗体的方法对于免疫科学领域技术人员是周知的。抗体可通过该领域中已知的任何方法使用可溶性多肽、或其免疫原抗体作为免疫原而制备。一种获得抗体的方法是，使用免疫原将合适的宿主动物免疫化，随后进行多克隆或单克隆抗体生产的标准过程。免疫原将促进该免疫原在细胞表面上的呈递。对合适的宿主的免疫化可通过多种途径完成。可编码多肽或其免疫原片段的核酸序列提供至宿主，其中该核酸序列处于被宿主免疫细胞吸收的输送运载体内。该细胞随后表达该多肽，从而在宿主体内产生免疫原应答。或者，可将编码人类多肽或其免疫原片段的核酸序列在体外表达在细胞内，之后单离该多肽并将该多肽给药至适合的宿主，在该宿主体内出现抗体。

或者，若需要，抗体可以源自噬菌体抗体库。噬菌体能感染细菌并在该细菌内繁殖，当与人类抗体基因联合时，是具体可被工程化以展示人类抗体蛋白。噬菌体展示是借以将该噬菌体作成“展示”位于其表面上的人类抗体蛋白的过程。将来自人类抗体基因库的基因插入噬菌体集落中。每一噬菌体携带用于不同抗体的基因，并因此在其表面上展示不同的抗体。

随后，可从该宿主纯化通过该领域任何方法制作的抗体。抗体纯化方法可包括盐沉淀(例如，使用硫酸铵)、离子交换色谱(例如，在阳离子或阴离子交换柱上，优选在中性pH下运行并使用离子强度逐渐增加的不连续梯度进行洗脱)、凝胶渗透色谱(包括凝胶渗透HPLC)、和在亲和树脂诸如蛋白A、蛋白G、羟磷灰石、和抗免疫球蛋白上进行的色谱。

抗体可便利地从被工程化以表达该抗体的杂交瘤细胞中生产。制作杂交瘤的方法是该领域周知的。可在适合的培养基中培养杂交瘤细胞，且用过的培养基可用作抗体来源。然后，可从生产感兴趣的抗体的杂交瘤中获得编码该抗体的多核苷酸，随后可从这些DNA序列合成性地或重组性地生产该抗体。对于大量抗体的生成，获得腹水通常更为便利。产生腹水的方法通常包含将杂交瘤细胞注射至免疫上天然的组织亲和性或免疫耐受性哺乳动物尤其是鼠的体内。通过事先给药适合的组合物(例如，姥鲛烷(Pristane))，引导该哺乳动物产生腹水。

通过本发明的方法生产的单克隆抗体(Mab)可通过该领域中已知的方法进行“人源化”。“人源化的”抗体是其中该序列的至少一部分已经被从其原始形式改变为令其更像人类免疫球蛋白的抗体。当生成非人动物(如，鼠科动物)抗体时，用以将抗体人源化的技术尤其有用。人源化鼠抗体的方法的实例提供于美国专利4,816,567、5,530,101、5,225,539、5,585,089、5,693,762和5,859,205中。

造血细胞移植(HCT)

最近，临床前和临床证据表明，通过促成脑内髓细胞的周转，造血干细胞和祖细胞(HSPC)和/或其后代可用作将治疗分子进行跨血脑屏障输送的运载体。但是，在移植后重建的该细胞的分化和功能特征仍有待确定，尤其是真实的小神经胶质细胞在移植后是否将会通过供体细胞后代得以重建仍有待评估。最近三十年中，造血细胞移植(HCT)和基于造血干细胞(HSC)的基因疗法已经应用到罹患影响神经系统的非血液学和非肿瘤学疾病诸如溶酶体贮积疾病(LSD)和神经退行性疾病的患者，并取得一定受益。这些早期的临床证据和临床前支持数据一起暗示，造血干细胞和祖细胞(HSPC)和/或它们的后代可用作将治疗分子进行跨血脑屏障(BBB)输送的运载体。事实上，HSPC和/或它们的后代将促成髓细胞集落在脑内的周转，该集落可能包括小神经角质细胞，其在这些病症进展中的决定性角色和病症结果已经得以广泛描述。重要的是，已经证实，源自移植物的细胞一旦被整合至患病的组织，就优先影响局部环境，即，通过在被移植小鼠或患者的脑内释放治疗分子而产生影响。这一概念在通过HSG基因疗法治疗的罹患脱髓鞘LSD异染性脑白质营养不良的患者体内得到证明。在治疗后很长时间内，测量被治疗儿童的脑脊液中的芳基硫酸酯酶A的正常或超正常活性，该酶的表达由通过被整合到患者HSC及其后代内的慢病毒(LV)诱发且该酶在该患者体内是有缺陷的。注意，该酶本身不能有效地跨越BBB。这些与在症状发生前阶段被治疗的患者的标志性临床受益有关的发现，正式地证实了该患者脑部被终止了基因更正的HSPC后代细胞。

近年来，金属硫蛋白家族的成员被确定为在患有LSD的患者和小鼠的中枢神经系统中被高表达，该观察结果暗示了MT在这些疾病的神经损害的发病机制中扮演的推定角色(Cesani et al,2014)。如本文所公开，金属硫蛋白是新兴的具有极大潜力的神经功能病況治疗剂。

重组多肽表达

为了表达本发明的多肽，可将通过本文所述的或该领域中已知的任何方法获得的DNA分子通过该领域中周知的技术插入适宜的表达载体中。例如，可通过涉及使用合成DNA链接基的限制酶链接或通过钝端连接将双链DNA克隆到适当的载体中。一般使用DNA连接酶来链接该DNA分子，且可通过使用碱性磷酸酯酶处理而避免不希望的接合。

因此，本发明包括载体(如，重组质粒)，该载体包括如本文中所述的核酸分子(如，基因或编码基因的重组核酸分子)。术语“重组载体”包括已经被变更、修饰或工程化的载体(如，质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、或其它纯化的核酸载体)，从而使得该重组载体含有比该重组载体所来自的原生或天然核酸分子中所包括的核酸序列更大、更小或不同的核酸序列。例如，重组载体可包括编码多肽的核苷酸序列或其片段，其可操作地链接至调控序列，例如启动子序列、终止子序列等，如本文所述。允许其内部包括的基因或核酸表达的重组载体称为“表达载体”。

在一些本文所述的本发明分子中，一个或多个具有编码本发明的一种或多种多肽的核苷酸序列的DNA分子被可操作地链接至一个或多个调控序列，其能将所希望的DNA分子整合到原核宿主细胞内。例如，可通过引入一种或多种允许进行含有该表达载体的宿主细胞选择的标记物，选择已经被所引入的DNA稳定转化的细胞。可选择的标记物基因可直接链接至待表达的核酸序列，或可通过共转染被引入相同的细胞内。对于本文所述蛋白质的最优合成，可能需要额外元素。使用何种额外元素对于该领域技术人员是显而易见的。

选择特定质粒或病毒载体的重要性因素包括但不限于，含有该载体的接纳者细胞被识别以及从不含该载体的接纳者细胞中被选出的容易性；在特定宿主中所希望的载体拷贝数；以及是否希望能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”。

一旦载体被构建为包括用于表达的DNA分子，则可通过一种或多种该领域中已知的适当方法将其引入适宜的宿主细胞内，该方法包括但不限于，例如，转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。

引入一种或多种载体后，宿主细胞一般在选择性培养基中生长，该培养基选择用于含载体细胞的生长。可通过包括西方墨点法分析、免疫印迹、和免疫荧光在呢的免疫分析来检测重组蛋白的表达。可通过该领域中已知的或本文所述的任意方法完成重组蛋白的纯化，例如，涉及提取、沉淀、色谱和电泳的任何传统过程。可用于纯化蛋白的其它纯化过程包括使用结合靶点蛋白的单克隆抗体进行的亲和色谱。通常，令含有重组蛋白的粗制剂穿行通过其上固定有适合的单克隆抗体的柱。蛋白一般经由特异性抗体结合至该柱，而杂质则穿行通过。洗涤该柱后，例如通过改变pH或离子强度将蛋白质从凝胶中洗脱。

评估疗效的方法

在一种方法中，通过测量例如被治疗器官的生物学功能(如，神经元功能)来评估疗效。此类方法在该领域中是标准方法，且在例如《医学生理学(第十版)》(Textbook ofMedical Physiology,Tenth edition,(Guyton et al.,W.B.Saunders Co.,2000))中有所描述。特别地，本发明的方法将组织或器官的生物学功能增加至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％，或甚至增加多达300％、400％或500％。该组织优选为神经组织，且该器官优选为脑。

在另一种方法中，通过测量被治疗组织或器官中细胞数相对于相应对照组织或器官(例如，不接受治疗的组织或器官)的增加来评估本发明方法的疗效。优选的，组织或器官内的细胞数相对于相应的组装或器官增加至少5％、10％、20％、40％、60％、80％、100％、150％或200％。分析细胞增殖的方法是该领域技术人员已知的，且在例如Bonifacino等人所著《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Cell Biology Loose-leaf,JohnWiley and Sons,Inc.,San Francisco,Calif.)中有所描述例如，用于细胞增殖的分析可涉及在细胞复制过程中对DNA合成的测量。在一个实施方案中，使用标记的DNA前体诸如[³H]-胸腺嘧啶或5-溴-2^*-脱氧尿嘧啶[BrdU]检测DNA合成，该DNA前体被加至细胞(或动物)内，并随后检测这些前体在该细胞循环的S期过程中被并入基因组DNA中的合并(Ruefli-Brasse et al.,Science 302(5650):1581-4,2003；Gu et al.,Science 302(5644):445-9,2003)。

试剂盒

本发明提供用于通过增加受试者的一种或多种金属硫蛋白多肽的水平、表达或活性而治疗或预防溶酶体贮积疾病或病症(例如，神经元蜡样脂褐质沉积症)的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒包括一种组合物，该组合物含有表达一种或多种金属硫蛋白多肽的单离的造血干细胞。在另一实施方案中，该试剂盒包括用于内源性小神经胶质细胞的去髓性预处理的纳米颗粒。

在一些实施方案中，该试剂盒包含含有治疗性或预防性细胞组合物的无菌容器；此类容器可为盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、包、或其它该领域中已知的适合的容器形式。此类容器可由塑料、剥离、层压纸、金属箔或其它适用于容纳药物的材料制作。

若需要，本发明的剂可与将该剂给药至患有神经疾病或中枢神经系统病症或处于发展出该疾病或病症风险下的受试者的使用说明书一起提供。使用说明书通常将包括关于使用该组合物治疗或预防疾病或病症的信息。在其它实施方案中，使用说明书包括下列的至少一种：对治疗剂的说明；治疗或预防神经疾病或其症状的给药方案和方式；预防措施；警告信息；指示；禁忌说明；过量信息；副作用；动物药理；临床研究；和/或参考文献。该说明书可直接印在容器(当存在时)上，或作为用于该容器的标签，或作为独立的页、册、卡或折叠式印刷品提供在给容器内或与该容器一起提供。

除非明确指定，否则本发明的实践采用传统的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，这些技术处于该领域技术人员的知识范围内。此类技术在文献中完整地诠释，如，《分子克隆：实验室手册(第二版)》(MolecularCloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,1989)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis,(Gait,1984)；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture,(Freshney,1987)；《酶学方法》(Methods in Enzymology)《实验免疫学手册》(Handbook ofExperimental Immunology,(Weir,1996)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells,(Miller and Calos,1987)；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology,(Ausubel,1987)；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,1994))；《免疫学现代方法》(CurrentProtocols in Immunology,(Coligan,1991))。这些技术可用来生产本发明的多核苷酸和多肽，且因此可在作成并实践本发明中考虑这些技术。尤其可用于特定具体例的技术将在下文中讨论。

提出下述实施例以向该领域技术人员提供对于如何制作并使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完全公开和说明，但并不试图限制发明人所认定的发明范畴。

实施例

实施例1：用于以金属硫蛋白作为LSD治疗剂的临床前测试的疾病模型选择

基于先前的发现(Cesani M.et al.,Ann Neurol 2014；75(1))，伴有白质损伤和灰质损伤的LSD可被视为用于测试MT的优良备选，其中MT作为可能的神经保护剂用于伴有CNS损伤的LSD。为了确定我们的策略的相关目标疾病，检查了来自LSD患者的人脑样品。评估了来自患有四种不同LSD的患者的样品，两种以原发性白质损伤为特征，一种名为MLD，由芳基硫酸酯酶A基因(OMIM#250100)的突变造成，另一种名为GLD，由半乳糖脑苷脂酶基因(OMIM#245200)的突变造成；而另两种以灰质损伤为特征，名为C型NPC(OMIM#257220)和NCL。MT免疫反应性在全部所测试的LSD脑中均得到确认(图1A)。MT信号主要在包括MLD和GLD在内的全部LSD脑样品的灰质中被检测到。在每个所测试的样品中，星形胶质细胞均起到初代MT过表达细胞的作用。在MLD样品中，MT信号也在组织细胞性细胞中得到确认。有趣的是，MT免疫反应性仅在NCL脑样品的神经元中得到确认。不欲受缚于理论，这表明了这一特异性疾病中持续再吸收的可能机制。随后使用相同样品测量Lrp2的表达，Lrp2是已知将通过神经元对MT吸收产生应答的MT受体，并测量它们的神经保护活性。RNA和蛋白分析均表明，来自两种伴随灰质损伤的LSD的样品中的Lrp2上调(图1B和图1C)，尤其在INCL脑中。在从患INCl小鼠(以棕榈酰蛋白硫酯酶1(PPT1)为特征)提取的脑组织中也测量到了高MT转录物水平(图1D)。基于这些发现，我们因此选择INCL作为潜在价值疾病平台来测试MT在LSD中的神经保护角色，特别地，我们采用了INCL动物模型。此外，为了理解MT是否能在其它LSD中也产生类似的受益或主要影响白质，基于免疫反应性人类数据和鼠类MT转录物水平，选择进一步的实验GLD(由于半乳糖脑苷脂酶——GALC缺陷)，其中MT显示随着疾病进展且当进行治疗性处置时有所变更(Cesani M.et al.,Ann Neurol 2014；75(1))。

实施例2：金属硫蛋白在GLD和INCL动物模型中的表型效果

利用荷有MT-1基因多拷贝(Palmiter RD.et al.,Mol Cell Biol1993；13(9))并在脑部及周围组织中均表达高MT-1转录物水平(Comes G.et al.,Int J Mol Sci 2017；18(2)；数据未显示)的过度表达MT-1的转基因小鼠(MTtg)，来评估外源性MT输送至INCL和GLD鼠的CNS是否能对其疾病表型产生积极影响。令MTtg小鼠与GLD和INCL杂合动物交叉繁殖以产生GLD和INCL纯合缺陷小鼠(分别为MT-GLD和MT-INCL)，该缺陷小鼠在其组织内具有组成性的高MT-1水平。在这些小鼠的脑内均测量到高水平的MT-1表达(图2A)。有趣的是，在两种设定中，MT-1表达水平是MT转基因背景和该疾病设定本身两者贡献的结果。在脑中优先具有所述表达谱的种系中，疾病转基因脑中的MT信号大多与星形胶质细胞共局域化(Vela JMet al.,Brain Res1997；767(2))(图2B)，且仅一部分小神经胶质细胞显示了MT免疫染色(图2C)。有趣的是，在所检查的两种模型中，MT过表达决定了治疗性受益。事实上，MT-GLD转基因小鼠显示了比非转基因的患GLD对照物显着增加的生存期(大约10％，MT-GLD的中值生存期为40.5天，而GLD为37.5)，而对照物具有非常短的预期寿命和极严重的表型(图2D)。同样，MT-INCL小鼠显示了比非转基因的患INCL小鼠显着增加的生存期(图2E)(大约5％，MT-INCL的中值生存期为248天，而INCL为235.5天)，以及其表型的减轻(图2F)，如通过疾病特异性严重程度评分所确定。为了确认两种所测试动物模型脑中与生存期增加相关的MT转录物水平的最小增加，将在LSD小鼠和MT-LSD小鼠中采集的MT表达水平相对于生存期数据作图(图2G和图2H)。这些数据的分析显示，等于或大于野生型MT表达水平的10至20倍的MT水平，与MT-INCL小鼠和MT-GLD小鼠相对于对应的INCL动物和GLD动物的生存期增加有关(图2G和图2H)。由于两种疾病模型在其原始背景中均以与疾病相关的脑内高MT表达为特征，这一受益阈值解释为将MT表达水平在GLD和INCL的基础疾病水平上分别增加1.5至2倍。2G和图2H)。

实施例3：MT-GLD小鼠和MT-INCL小鼠体内的抗炎基因、抗凋亡基因和抗氧化应激基因的转调

为了确认有MT过表达调制的复杂神经退行性LSD过程的方面，对来自野生型(WT)小鼠、MTtg小鼠、GLD小鼠MT-GLD小鼠(每组n＝3)的脑提取物进行全转录组分析。通过将截留倍数改变设定为2、仅考虑具有相关RefSeq ID的基因、并生成以确认条件内表达谱为目标的分级聚类，生成一系列差异性表达的基因。这一分布反应了四个在MT-GLD中具有主要差异的测试组相对于彼此的差异性基因表达。确认，很多基因在MT-GLD小鼠中比GLD组有所下调(图3A)。极少基因在MTtg样品中比WT中过表达，且这些基因大多为Affymetrix平台中所包括的非编码转录物。在MT-GLD模型中相对于GLD下调的基因证实了与神经递质受体活性、离子通道活性(电压门控的钾通道和钙通道)、运输通道等相关的功能，表明了MT动作调节脑网络稳定性的可能的新机制。在转录组阵列中，免疫途径和细胞凋亡途径涉及的其它基因在MT-GLD小鼠中相对于GLD小鼠显着下调(图3B、图3C、图3D)。这些基因通过qPCR验证(图3B、图3C、图3D)。它们包含Ifi44(干扰素诱导的蛋白44)，一种在诱导神经胶质细胞炎症、DNA损伤和退行性变中扮演角色的蛋白编码基因(Pachiappan A.et al.,Toxicon2005；46(8))；HPGD，羟前列腺素脱氢酶类，是包括炎症和氧化应激在内的若干生物学过程的潜在中介物(Nakao R.et al.,Chronobiol Int 2015；32(4))；Casp4，已知作为凋亡级联的一部分(该基因过去称为Casp11)(Villani GR et al.,J Neurosci Res 2007；85(3))；Ndst4、IL33、Dgkk等，它们一直为炎性和氧化应激途径所牵涉，但不包括在验证系列中(表2)。在疾病中期的MT-INCl小鼠体内测试这同一组基因(图3B、图3C、图3D)，且这组基因显示类似的相对于INCL样品的下调。

表2.基因在MT-GLD脑与GLD脑中差异性表达的比较

为了进一步描绘MT在所公开的模型中缓和氧化应激的能力，通过免疫荧光测量了MT-GLD小鼠和对照小鼠脑内的硝基酪氨酸，硝基酪氨酸是细胞损伤、炎症及氮氧化物产生的标记物(图3E和图3F)(Hidalgo J.et al.,Exp Biol Med(Maywood)2006；231(9))。与天然GLD动物相比，MT-GLD脑的多个区域(小脑、胼胝体、脑干)内的硝基酪氨酸信号显着且普遍下降(图3E和图3F)。当进行DCFDA(DCFDA 6-羧基-2′,7′-二氯二氢荧光素二醋酸酯)染色时，MT-GLD脑细胞也显示了ROS下降的趋势(图3G)。

实施例4：在MT-GLD小鼠和MT-INCL小鼠中，Purkinje细胞丧失均得以修复

已知Purkinje细胞丧失是GLD的严重和复杂表型的原因，已知该现象与细胞凋亡严格关联(Lin DS et alGene 2015；571(1))。已经证实，在GLD小鼠体内，Purkinje细胞从疾病的早期症状期至有明显症状期进行性地丧失。重要的是，在MT-GLD小鼠的脑内观察到了对Purkinje细胞丧失的阻止(图4A和图4B)。通过对从疾病晚期获得的GLD和MT-GLD小脑切片的钙结合蛋白小清蛋白信号的定性和定量测量，证明了这一补救(图4C和图4D)。

深刻的小脑病理也存在于INCL小鼠体内(Macauley SL.et al.,Exp Neurol2009；217(1))，与人类的疾病肇因一致，伴有代表早期神经元丧失的退行性Purkinje细胞体和树突分支。在已经处于中间疾病期(200天)的MT-INCL小鼠脑内，也观察到了对Purkinje细胞和退行性变的阻止，暗示了MT对于这一神经元室的特异性作用(图4E和图4F)。

实施例5：金属硫蛋白过表达不对原发性疾病缺陷造成冲击

这里显示，MT过表达调制所分析的两种LSD模型的继发性疾病方面。但对于两种模型，原发性疾病机制以由于造成疾病的溶酶体水解酶缺陷导致的存储材料的蓄积为代表。尽管我们不预期这一现象发生，但我们仍评估了MT是否会对未降解的底物的存储产生影响。如预期，在MT-GLD动物的所分析的全部脑区域中，MT并不显着影响细胞内的半乳糖脂存储(图4G)。还是在MT-INCL模型中，在所分析的实验组中，我们没有通过流式细胞术和免疫荧光分析观察到自体荧光存储材料蓄积的任何改变(图4H)。

实施例6：金属硫蛋白在GLD和INCL中诱导抗炎M2样小神经胶质细胞表型

之后，描绘了MT是否能在GLD小鼠和INCL小鼠内对神经炎症产生影响。在疾病中期(MT-INCL and INCL)和疾病(PND36、MT-GLD和GLD)晚期进行分析的MT-LSD小鼠和原生LSD动物中，星形胶质细胞和小神经胶质细胞标记物的免疫荧光显露了相似水平的星形胶质细胞增生和小神经胶质细胞增生(图5A、图5B、图5C、图5D)，表明尽管MT大多由星形胶质细胞产生，但MT可能不能对这些细胞的表型产生影响。为了在我们的模型中进一步描绘神经炎症，将骨髓细胞/小神经胶质细胞集落从MT-GLD小鼠脑部和对照小鼠脑部单离出来，并对这些样品中一些周知的小神经角质细胞激活标记物的mRNA水平进行定量。有趣的是，在MT-GLD细胞和MT-INCL细胞中，检测到了相对于对照GLD样品和INCL样品显着增加的抗炎标记物Arginase1、CD206和YM1(也称为M2骨髓细胞标记物)表达(图5E、图5F、图5G)。此外，在MT-LSD样品中，观察到了相对于原生LSD对照下降的促炎细胞因子IL1β和TNFα，这两种细胞因子(也称为M1骨髓细胞标记物)由被激活的小神经胶质细胞产生(图5H和图5I)。在来自MTtg小鼠的样品中，这些分子的表达水平反而与WT对照物类似，表明在疾病情境中普遍存在该效应。在通过免疫荧光分析的MT-GLD脑部切片上，也证实了CD206受体的表达，CD206受体是一种与M2表型相关的C型凝集素碳水化合物结合蛋白(Perego C.et al.,JNeuroinflammation 2011；8:174)(图5J和图5K)。与原生GLD动物相比，MT-GLD小鼠脑髓细胞中的CD206阳性信号面积增加。

总之，这些数据表明，MT诱导小神经胶质细胞朝着M2样抗炎状态偏移，并因此建立可抗衡疾病进展的神经保护环境。

实施例7：通过AAV载体进行的金属硫蛋白输送减轻了GLD表型

如本文所公开的，MT-LSD转基因小鼠体内的MT-1的持续过表达数据表明，MT可用作治疗LSD的神经保护剂。因此，通过对GLD小鼠注射由AAV-PHP.B产生的表达MT-1的腺相关病毒(AAV)载体，执行概念实验的简单证明，其中AAV-PHP.B是最近研发的能在成年小鼠体内实现高效全身性CNS基因输送的粘粒(Deverman BE et al.,Nat Biotechnol 2016；34(2):204-9)。比较了携带HEK-293细胞中一种或四种MT-1cDNA拷贝的AAV载体，且如预期，后一种载体造成更高的MT-1表达水平(图6A)。因此，我们选择AAV-4MT载体进行体内研究。对2日龄(PND2)GLD小鼠全身性注射2x10¹⁰ vg的AAV-4MT载体，随后监控，直至末期。有趣的是，与注射PBS的GLD小鼠相比，AAV治疗的小鼠的生存期显着增加(图6B)，与在MT-GLD转基因动物中观察到的一致。在这一生存期的增加的同时，注射AAV的动物脑内的MT-1定量也高于对照物(图6C)。还是在这一情况下，对于在尝试确定MT外源性输送的治疗性目标水平的注射PBS和AAV的小鼠，将其体内的MT表达水平对生存期作图(图6D)。有趣的是，与生存期增益相关的最小倍数增加是相对于基础GLD相关MT转录物水平的3.3倍，处于与在MT-LSD模型中所观察到的一致的范围内。重要的是，在AAV治疗的小鼠体内，生存期增益与炎症、氧化应激和凋亡基因的下调相关，如在MT-GLD小鼠体内所观察到的(图6E、图6F、图6G)，不受缚于理论，这证明了MT在万元AAV介导输送时也影响相同的途径调整。

先前，MT被确认并表征为脑病的生物标记物，其在疾病进展进程中剧烈改变其表达且对多种LSD的治疗产生应答(Cesani M.et al.,Ann Neurol 2014；75(1):127-137)。由于当给药抗炎药物时，MT在星形胶质细胞内的表达增加，因此MT在病脑内发挥保护性作用。MT显示在急性脑损伤中具有神经保护能力(West AK et al.,Neurotoxicology 2008；29(3))，其最近在慢性脑损伤中也显示神经保护能力，例如在帕金森症中(Ebadi MH et al.,Brain Res Mol Brain Res 2005；134(1))、在肌萎缩性脊髓侧索硬化症中(Tokuda E.etal.,Hum Mol Genet 2014；23(5))、以及在阿尔兹海默症中(Manso Y.et al.,JAlzheimers Dis 2016；51(1))。基于这些例证，探究了利用MT在以严重的神经损伤为特征的LSD中发挥神经保护作用的可能性。

MT在病脑中发挥抗氧化、抗炎及抗凋亡功能已经有所描述，但对于MT激活途径以及它们在这一腔室中的作用机制所知甚少(Ito Y.et al.,Curr Pharm Biotechnol 2013；14(4))。实验证据支持下述假设：当受到促炎性和促氧化硅刺激时从病脑内的星形胶质细胞合成的MT，可通过受体Lrp2/巨蛋白被神经元吸收并随后发挥它们的减毒活性(ChungRSet al.,J Biol Chem 2008；283(22))，这一现象大多见于神经元损害的情境中。有趣的是，在人脑LSD样品和鼠LSD脑样品中，尤其在伴有神经元损伤的疾病如NCL中，确认了不仅MT的水平增加，Lrp2的水平也增加。因此，在用来评估MT在LSD脑中的有益效果(若存在)以及体内MT-Lrp2轴的角色的尝试中，令MTtg过表达小鼠与INCL小鼠模型交叉繁殖。有趣的是，在MTtg疾病模型中，MT的持续表达减轻了INCL表型。MT-INCL小鼠表型的改善和生存期的增加支持最初的假设以及MT(和Lrp2)在这一疾病设定中的角色。重要的是，在生存期也得到改善的极严重GLD动物模型中，也观察到了MT的相似的有益效果。在以造成疾病的原发性溶酶体酶缺陷为靶向的任何治疗性介入均缺席下，这些完全基于MT加入的结果出乎意料地积极正面。注意，除了天然出现的与原发性疾病相关的过表达外，MT表达水平的相对少量增加足以在两种所测动物模型中决定有益效果和生存增益。

重要的是，生存期增益伴随有与在MT-LSD脑内观察到的一致的转录/表达改变。这些改变以至少在检查位点的神经炎症、小神经胶质细胞的激活和氧化应激以及神经元保护的调制为代表。在两种模型中，在极大地从退行性变和凋亡中挽回的Purkinje细胞上观察到了深远且特异性的效果。多个体外研究已经显示，MT可在神经元和小脑颗粒神经元细胞培养系统中均发挥神经保护作用，意为可归因于所有神经元细胞类型(Ambjorn M.et al.,J Neurochem 2008；104(1))。在Purkinje细胞层中和整体表型减轻中的神经元保护机制可能涉及多种周知的MT作用机制。

MT的最显着效果之一是减少氧化应激及相关途径，如在抗肌萎缩蛋白病的小鼠模型中所示(Di Foggia V.et al.,J Exp Med 2014；211(13))。氧化应激应答和炎症涉及的不同途径的失调作为自体吞噬作用阻断的结果而出现在LSD中，也是被广泛接受的(Settembre C.et al.,Nat Rev Mol Cell Biol 2013；14(5))。最后，MT显示保护免于氧化应激诱导的溶酶体去稳定化(Baird SK.et al.,Biochem J 2006；394(Pt 1))。基于这些证据和本文公开的数据，MT将会响应由溶酶体失能造成的氧化应激和炎症而被过表达。因此，MT在LSD模型中发挥的治疗性作用将会由它们调制这些事件的能力介导。事实上，在我们的模型中执行的测量表明，MT可下调并减轻与溶酶体失能相关的氧化应激，对于被损害的Purkinje层具有潜在的益处。

此外，尽管宏观测量未能成功演示MT在疾病模型中星形细胞增多和小神经胶质细胞增多上的效果，仔细观察，在两种MT-LSD模型中均观潮到了撷取M2样标记物(Arginase1和CD206表达增加)并下调IL1β和TNFα表达的小神经胶质细胞表型中的改变。替代性激活的M2样小神经胶质细胞标记物相对于经典的M1样促炎标记物的这一增加表明，当MT在LSDD设定中被过表达时，出现了小神经胶质细胞表型的再调整、以及它们远离炎症且倾向于神经保护的功能的可能性。新兴的数据支持M1/M2范式在神经退行性疾病中的相关性，在GLD设定中尤其明显(Nicaise AM et al.,J Neurosci Res 2016；94(11))。在MTtg-LSD脑中，MT对于M1/M2平衡的可能影响也进一步由下述证据证实：来自MT-GLD小鼠的小神经胶质细胞中的氧化应激下降，该细胞被赋予M2特征，这一现象在文献中得到广泛描述(Rojo AI.etal.,Antioxid Redox Signal 2014；21(12)).注意，这里首次报告了小神经胶质细胞参与到介导MT驱动的神经保护中。

另一个将会与诠释本文所公开的尤其在INCL模型中的发现相关的方面是，最近在不同的NCL小鼠模型中生物金属失调的证据。事实上，生物金属稳态异动在包括INCL在内的三种不同的NCL动物模型中得以确认，其显示生物金属锌、铜、锰、铁和钴的显着蓄积。在每一模型中，生物金属蓄积的模式领先于显着的神经退行性变，且大致类似于每一模型中已知的疾病相对严重程度。同样地假设，MT在潜在地与星形胶质细胞内铜稳态失衡的正常化相关的ALS疾病进程中扮演保护性角色，促进运动神经元的生存(Tokuda E.et al.,HumMol Genet2014；23(5))。类似的疾病机制可能在LSD情况下出现，但尚未对其进行探究。

整体上，这些数据可表明，内源性输送的MT将会通过调整疾病相关的神经损害机制而在严重影响CNS的LSD中发挥治疗作用。但是，若当转基因时MT被持续地以非常高的水平表达，则所采用的模型的人工特性可能不允许准确预测我们的发现的临床转化率。因此，通过执行对旨在评估将MT输送至LSD小鼠以及预期地输送至LSD患者的可行性和治疗相关性的概念研究的简单证明，我们解除了这一限制。近年来的研究显示，当将新研发的AAV-PHP.B粘粒经血管内给药至成年小鼠时，该粘粒介导高效的广泛CNS基因转移。因此，如本文所公开的，AAV-PHP.B载体被生成为含有一个MT拷贝或通过三个不同的2A肽链接的四个MT拷贝，并且验证了具有四个拷贝的表达系统在驱动MT表达在RNA层面和蛋白质层面的增加中具有更高效能。当被注射至GLD动物体内时，这一AAV-4MT载体再次产生并验证了在MTtg-GLD小鼠中观察到的发现。事实上，AAV介导的MT-1cDNA输送及其在患病GLD脑中的表达，发挥与由转基因造成的持续表达类似的效果，伴随显着改善的生存期、对炎症和氧化应激的调制、以及在GLD中枢神经系统中发挥的抗凋亡作用。这些发现因此验证了下述概念：MT将会进一步作为LSD的治疗剂而被探究。

总之，迄今为止描述的神经保护特征对于利用MT作为LSD的新颖治疗剂和/或靶标是有前途的。MT补充疗法被设想为任何可作为临床上解释为神经保护性策略而获得的形式，其可最终与其它针对酶活性重建为目标的方法联合。

使用下述方法和材料获得上文所述的结果。

人体研究

从巴尔的摩马里兰大学发育障碍脑部及组织库(NICHD Brain and Tissue Bankfor Developmental Disorders at University of Maryland,Baltimore)获得尸检后急速冷冻且福尔马林固定的来自患有LSD的患者的脑样品(球形细胞样脑白质病(GLD)，n＝2；异染性脑白质营养不良(MLD)，n＝2；NCL，n＝2；尼曼匹克症(NPC)，n＝2)和来自4岁的同性别对照者的脑样品。对于每个样品，死亡与组织采样之间的时间差小于24小时。如我们的先前研究中所述，执行RNA提取(Cesani et al.,2014)。对于免疫组化分析，采用1:1000稀释度的MT克隆体E9(Dako)。对于Lrp2 mRNA定量，使用Taqman分析Hs00189741_m1。使用1:1000稀释度的一级兔抗体α-Lrp2(来自Abcam)执行西方墨点法(见，例如，Cesani et al.,2014)。

小鼠研究

所有过程均得到圣拉斐尔蒙特塔博尔基金会的动物保护和使用委员会(AnimalCare and Use Committees of the Fondazione San Raffaele del Monte Tabor(IACUC573))和达纳法伯癌症研究所动物委员会(The Dana Farber Cancer InstituteCommittee on Animals(IACUC 15-024和15-042))批准。在下列LSD小鼠模型中测量鼠类MT1水平：GLD(n＝6，40日龄)，MLD(n＝4，10月龄)，Sandhoff(SD n＝4，3.5月龄)，婴儿INCL(n＝4，200日龄)，粘多糖病I型(MPS I，n＝4，10月龄)，MPS II(n＝3，10月龄)，MPS III(n＝4，40日龄)，多发性硫酸酯酶缺陷(MSD，n＝5，2至3周龄)，与20个不同年龄的野生型(WT)小鼠比较。

从杰克逊实验室(Jackson Laboratory)购买隐性携带鼠类MT-1的转基因小鼠(种系B6.Cg-Tg(Mt1)174Bri/J，物料编号002210)将MT-1小鼠维持在C57BL/6J背景上。令杂合GLD小鼠与半合MT-1杂交。随后，从第二代开始，获得携带MT-1的受到GLD病理学影响的双转基因小鼠(纯合缺陷突变小鼠)。将相同的策略应用至INCL小鼠模型。根据出现的症状，使用认可的疾病严重程度评分(在Peviani et al.,Hematopoietic cell transplantationcan mitigate neuronal pathology in a mouse model of infantile neuronal ceroidlipofuscinosis,submitted中全面描述)，对INCL小鼠的疾病进展评分。

免疫荧光和IHC研究。在深度麻醉下牺牲36日龄的GLD小鼠、MT-GLD小鼠和年龄匹配的WT小鼠、200日龄的INCL小鼠、MT-INCL小鼠和年龄匹配的WT小鼠，并灌注磷酸盐缓冲盐水(PBS)。单离脑部并将其在4％多聚甲醛中固定15小时，在PBS中的10-30％蔗糖梯度下评估48小时，随后包埋在OCT化合物中进行快速冷冻。16-微米恒冷箱切片在4℃使用下述一级抗体温育过夜：鼠单克隆抗金属硫蛋白(DAKO)1:100、兔抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(MCA1909；Serotec Ltd)1:500、兔抗Iba1(Wako)1:100、鼠单克隆抗硝基酪氨酸(Abcam)1:500、大鼠抗小鼠CD206(AbD Serotec)1:200、兔抗钙结合蛋白(Swant)1:700、兔抗小清蛋白(Swant)1:700；随后使用下述二级抗体在室温下温育1小时30分钟：山羊抗小鼠AlexaFluor488 1:1000、兔抗山羊Alexa Fluor488 1:1000、山羊抗兔AlexaFluor546 1:1000、山羊抗鼠AlexaFluor546 1:1000(分子探针公司(Molecular Probes))。使用ZeissAxioskop2显微镜和3-激光共聚焦显微镜(Radiance 2100；BioRad TCS SP2)将样品可视化，使用每一通道的基于阴性染色对照物定义的恒定设定，循序采集来自单个光学切面的信号。遵循先前描述的用于染色和计数的方法处理恒冷箱切片，用于凝集素组化分析(Visigali et al.,Neurobiol Dis 2009；34(1):51-62；Neri et al.,Stem Cells 2011；29(10):1559-1571)。使用DAB(3,3'-二氨基联苯胺)和甲酚紫执行免疫组化分析，如先前所述(Peviani et al.,Neurobiol Dis 2014；62:218-32)。对于计算机辅助图像分析，使用ImageJ软件将共聚焦图像上的信号阳性面积的扩张(总信号阳性面积)定量。对于适宜的比较，将待进行细胞定量比较的切片染色并同步采集图像。

小神经胶质细胞集落的分选。处理灌注后的脑部，如先前所述(Capotondo etal.,Intra-cerebral ventricular delivery of hematopoietic stem and progenitorcells allows efficiently generating microglia-like cells in myeloablatedrecipients)。

DCFDA分析。从作为荧光探针H2DCFDA氧化的结果的荧光的变化中确定细胞内反应活性氧(ROS)的水平。简单地说，通过Perdoll选择法单离的鬼祟细胞用无FBS的DMEM洗涤一次，并在37℃在荧光探针H2DCFDA的50μM溶液中温育1h。该细胞随后以无FBS的培养基洗涤两次，并以流式细胞仪在FITC通道(LSR Fortessa)中分析对应于细胞内ROS的荧光。

RNA提取。使用RNeasy plus微处理试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从分选的小神经胶质细胞提取RNA，使用RNeasy脂质组织迷你试剂盒提取用于全转录组分析的来自小脑的RNA(200μg)并以DNase I(Qiagen)处理。对下述基因实施定量PCR：MT1 Mm00496660_g1、IL1βMm00434228_m1、TNFαMm00443258_m1、Ifi44 Mm00505670_m1、精氨酸酶Mm00477592_m1、CD206 Mm01329362_m1、YM1Mm00657889_mH、Hpgd Mm00515121_m1、Casp4 Mm00432304_m1。

全转录组分析。从36日龄GLD小鼠(n＝3)、相同年龄的MT-GLD小鼠(n＝3)、年龄匹配的WT小鼠(n＝3)和MTtg过表达小鼠(n＝3)的小脑中提取总RNA。首先使用AgilentBioanalyzer 2100(安捷伦技术公司(Agilent Technologies,Palo Alto,CA))评估总RNA的品质。从150ng的总RNA开始合成生物素标记的dCNA靶标。使用WT Plus试剂盒(昂飞公司(Affymetrix,Santa Clara,CA))执行双链cDNA及相关cRNA的合成。使用相同试剂盒合成正义链cDNA，随后将其片段化并标记。执行DNA微阵列杂交和图像采集、处理以及生物信息学分析。使用杂交、洗涤和染色试剂盒执行杂交，该试剂盒含有用于靶标稀释的混合物：最终浓度为7％的DMSO，以及预混合的生物素标记的对照物oligo B2和bioB、bioC、bioD和cre对照物(Affymetrix cat#900299)，其最终浓度分别为50pM、1.5pM、5pM、25pM和100pM。将靶标在杂交缓冲液中稀释到25ng/μl的浓度，在99℃变性5分钟，随后在45℃温育5分钟并离心。随后，将单一小鼠转基因组阵列1.0与每一生物素标记的正义靶标杂交。

在电转烤箱中在45℃下执行杂交16小时。遵循FS450_0002标准协议，使用AffymetrixFluidics Station 450中的杂交、洗涤和染色试剂盒洗涤暗盒并染色，包括下述步骤：(1)(洗涤)10次循环，每次循环中与洗涤缓冲液A在30℃混合2次；(2)(洗涤)6次循环，每次循环中与洗涤缓冲液B在50℃混合15次；(3)在35℃在SAPE溶液中将探针阵列染色5min；(4)(洗涤)10次循环，每次循环中与洗涤缓冲液A在30℃混合4次；(5)在35℃在抗体溶液中将探针阵列染色5min；(6)在35℃在SAPE溶液中将探针阵列染色5min；(7)(最终洗涤)15次循环，每次循环中与洗涤缓冲液A混合4次；(8)以阵列保持缓冲液填充该探针阵列。

图像撷取、处理和生物信息学分析。使用Affymetrix 扫描仪30007G，使用缺省参数扫描GeneChip阵列。使用Affymetrix Command Console软件(AGCC)采集图像并生成.DAT文件和.CEL文件，这些文件用于后续使用适宜软件进行的分析中。

采用编码MT-1的AAV-PHP.B进行的临床前研究

克隆通过2A肽分隔的编码一个MT-1拷贝或四个MT-1拷贝的匣，以替换AAV-CBA.GFP-Wpre质粒中的GFP。通过以转移质粒、Fd6辅助质粒和在Sena-Esteves实验室中生成的质粒对HEK-293细胞进行瞬态三重转染而产生AAV-PHP.B载体，其携带AAV2 rep以及最近揭示的AAV-PHP.B cap基因13。通过下述纯化载体：碘克沙醇梯度离心，之后使用7K MWCOZeba旋转脱盐柱(赛摩科技(Thermo Scientific))进行与磷酸盐缓冲盐水(PBS)的缓冲液交换，最后，使用100K Amicon Ultra-15离心过滤器(Merck Millipore,Cork,Ireland)浓缩。通过使用引物和用于BGH聚腺苷化信号的qPCR确定滴度。经由颞浅静脉对2日龄(PND2)GLD小鼠注射AAV载体，若先前所述(Capotondo et al,2017,submitted)。对照小鼠接受PBS。

其它实施方案

从前述说明书可知，可对本文所述的发明作出变更和修改以令其适应各种用途和条件。此类实施方案也处于所附权利要求书的范畴内。

本文中，对任何变量定义中一系列元件的描述包括该变量作为任何单一元件或作为所列元件的组合(或亚组合)的定义。对本文中实施方案的描述包括该实施方案作为任何单一输送法南或作为与任何其它实施方案或其部分的组合。

本申请可能部分地与美国专利申请62/408,693相关，其公开内容通过引用而整体并入本文。

本说明书中提及的全部专利、出版物及保藏号通过引用并入本文，其并入程度与各独立的转录、出版物和保藏号具体地且独立地指明以待通过引用并入的程度相同。

Claims (7)

1.一种药物组合物在制备治疗受试者的溶酶体贮积疾病或病症的药物的用途，其中，所述药物组合物包含编码金属硫蛋白多肽或多核苷酸的载体，以及其中，所述药物组合物相对于参考值增加所述受试者的金属硫蛋白多肽或多核苷酸的水平、表达或活性。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述溶酶体贮积病症是神经元蜡样脂褐质沉积症、球状细胞性脑白质营养不良、GM1神经节苷脂症、青少年氨基己糖酯酶A缺乏症、异染性脑白质营养不良、粘多糖症障碍、多发性硫酸脂酶缺乏症、Tay-Sachs/GM2神经节苷脂症。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述受试者是通过检测所述受试者的样品中金属硫蛋白(MT)多核苷酸或多肽的水平相对于参考值的增加而预先选择的。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述金属硫蛋白是金属硫蛋白-1A(MT1A)、金属硫蛋白-1B(MT1B)、金属硫蛋白-1E(MT1E)、金属硫蛋白-1F(MT1F)、金属硫蛋白-lG(MT1G)、金属硫蛋白-1H(MT1H)、金属硫蛋白-1I假基因(MT1Ip或MTE)、金属硫蛋白-1L(LT1L或MT1R)、金属硫蛋白-lM(MT1M或MT1K)、金属硫蛋白-1X(MT1X)、金属硫蛋白-2(MT2)、金属硫蛋白-2A(MT2A)、金属硫蛋白-3(Mt3)、和金属硫蛋白-4(MT4)中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述载体是慢病毒载体。

6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述载体是AAV载体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中，所述药物组合物还包含含有所述载体的造血干细胞(HSC)。