RU2283119C1

RU2283119C1 - Препарат аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, способ его получения, криоконсервации и использования для лечения травматической болезни центральной нервной системы

Info

Publication number: RU2283119C1
Application number: RU2005108721/15A
Authority: RU
Inventors: Андрей Степанович Брюховецкий (RU); Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ; Георгий Людомирович Менткевич (RU); Георгий Людомирович Менткевич; Деймури Мелитонович Мхеидзе (RU); Деймури Мелитонович Мхеидзе; Владимир Никитич Ярыгин (RU); Владимир Никитич Ярыгин; Андрей Юрьевич Зайцев (RU); Андрей Юрьевич Зайцев
Original assignee: Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2006-09-10
Also published as: AU2005329886A1; EP1863903A1; CA2601679A1; WO2006102933A8; WO2006102933A1; JP2008534529A; IL186228A0

Abstract

Изобретение относится к биофармакологии и медицине, в частности к области клеточной трансплантологии и неврологии, и может быть использовано для лечения травматической болезни центральной нервной системы. Препарат гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) представляет собой аутологичные ГСК, полученные из периферической крови пациента, обогащенной клетками, содержащими антиген CD34, в конечной концентрации (40÷100)·10⁶ клеток/мл. Обогащение крови проводят за счет специального дробного введения пациенту препарата гранулоцитколониестимулирующего фактора (Г-КСФ), например нейпогена в растворе глюкозы, по определенной схеме. Способ получения, криоконсервации препарата и способ лечения травматической болезни головного и спинного мозга с использованием заявленного препарата. Изобретение обеспечивает снижение тканевой несовместимости, отторжения трансплантатов, а также повышение эффективности и сокращение сроков лечения. 4 н. и 5 з.п., 1 ил., 2 табл.

Description

Изобретение относится к области клеточной трансплантологии и неврологии, а именно к созданию препарата гемопоэтических стволовых клеток, способу получения и криоконсервации препарата и использования его для лечения травматической болезни головного и спинного мозга.

Несмотря на значительное развитие методик лечения многих неврологических заболеваний успехи остаются достаточно скромными. Это касается нейродегенаративных заболеваний, постравматических состояний головного и спинного мозга, последствий нарушений мозгового кровообращения. Имеющиеся в арсенале лечебные мероприятия зачастую не в состоянии привести к восстановлению утраченных функций, инвалидизация больных остается на высоком уровне, а прогноз на активную жизнь - неблагоприятным. Поэтому поиск методик, способствующих стимуляции репаративных процессов нервной ткани, является крайне актуальным.

В последние годы для этих целей в лечении нервных болезней широко применялась трансплантация препаратов клеточных культур эмбриональной нервной ткани [например, патент РФ 2160112, 2000 г.]. Однако терапия препаратами, приготовленными из эмбриональной ткани, имеет очень серьезные проблемы тканевой совместимости, возможности отторжения трансплантатов, возникновения отсроченных иммунных конфликтов, а также морально-этические, юридические и религиозные ограничения.

Широкие перспективы, как нам представляется, может иметь применение для трансплантации аллогенных стволовых клеток, в том числе нервных, как в патенте РФ 2191388, 2002 г., а также гемопоэтических, которые использовали для пересадки в миокард в эксперименте (патент РФ 2237440, 2004 г.).

Наиболее близким аналогом нашему изобретению является разработка, описанная в патенте РФ 2216336 (2003 г.), где для лечения нервных болезней применяли препарат аутологичных гемотопоэтических стволовых клеток (ГСК), экспрессирующих антиген SV40. Однако в этой работе применяются стволовые клетки, изъятые у пациента при пункции костного мозга, что является травматичным для пациента и достаточно трудным для медперсонала.

В этой связи большой теоретический и практический интерес приобретает использование для целей лечения травматических поражений нервной системы гемопоэтических стволовых клеток (СК), полученных из периферической крови самого пациента. Эти клетки, обладающие значительной функциональной пластичностью, введенные в спинно-мозговой канал или желудочковую систему мозга, не вызывают существенных побочных реакций и позволяют повысить эффективность лечения, минимизировав травматичность для пациента, избежав проведение процедуры пункции костного мозга, и снизить все возможные осложнения. Локальная дифференцировка СК в мозговой ткани in situ, как правило, контролировалась "сигналами" микроокружения. Ограниченные клинические наблюдения также подтвердили отсутствие аномалий дифференцировки СК в трансплантате.

Технической задачей настоящего изобретения является создание препарата аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови (ГСКПК), способа получения и сохранения препарата, а также способа лечения травматического поражения центральной нервной системы, кроме того, технической задачей является устранение недостатков известной технологии (наиболее близкого аналога, описанного ранее), а также расширение арсенала средств помощи больным, страдающим различными формами травматической болезни головного и спинного мозга.

Технический результат достигается тем, что создан препарат гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации при поражении нервной системы, отличающийся тем, что представляет собой аутологичные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделенные из периферической крови пациента, обогащенной ГСК, содержащими антиген CD34, в конечной концентрации (40÷100)·10⁶ клеток/мл. Такой препарат получен за счет предварительного дробного введения пациенту препарата гранулоцитколониестимулирующего фактора (Г-КСФ), например нейпогена в растворе глюкозы. Дробное введение препарата Г-КСФ проводят в течение 4-х дней по схеме: первые три дня - через каждые 10-12 часов в дозе 2,5 мкг/кг, на 4-й день - удвоенную дозу препарата в том же режиме времени.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения препарата аутологичных гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации при поражений центральной нервной системы.

Технический результат достигается тем, что создан способ получения такого препарата для трансплантации, включающий предварительное дробное введение пациенту препарата Г-КСФ, забора периферической крови и сепарации ГСК периферической крови, обогащенных ГСК, содержащими антиген CD34, с последующей очисткой полученной взвеси клеток от эритроцитов и отмывкой в физиологическом растворе. Полученный препарат подвергают реинфузии или криоконсервации. Для осуществления способа дробное введение препарата Г-КСФ, например нейпогена, проводят в течение 4-х дней по схеме: первые три дня - через каждые 10-12 часов в дозе 2,5 мкг/кг, на 4-й день - удвоенную дозу препарата в том же режиме времени.

Способ получения препарата из периферической крови у больных с неврологическими заболеваниями осуществляют следующим образом:

С целью увеличения количества стволовых клеток в периферической крови пациент получает 8 инъекций препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), например нейпогена в растворе глюкозы, подкожно с интервалом в 10-12 часов в течение 4 дней. Г-КСФ представляет собой медицинский препарат, полученный путем генной инженерии, и является абсолютным аналогом человеческого фактора Г-КСФ. В первые три дня доза препарата составляет 2,5 мкг на кг, в последний день доза удваивается.

Сбор клеток для получения препарата осуществляют на 5 день от начала стимуляции Г-КСФ на сепараторе крови СОВЕ-спектра с использованием одноразовой системы для сепарации и стандартных растворов. Процент СД34⁺ клеток в клеточной суспензии, полученной в ходе цитафереза, определялют методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США).

Стволовые клетки и коммутированные клетки-предшественницы формируют в периферической крови так называемый пул стволовых клеток (ПСК). Общим для всех клеток данного пула является экспрессия на мембране клетки молекул антигена CD34+.

Установление субпопуляционного состава CD34+ клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии с помощью моноклональных антител.

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА

1. Цитофлуориметр лазерный проточный.

2. Программное обеспечение к прибору "Цитофлуориметр лазерный проточный".

3. Моноклональные антитела (МКА): к антигену CD34: НРСА-2а (8G12), изотип IgG1, меченные фикоэритрином (РЕ) или пиридининхлорофилом (PerCP) производства Becton Dickinson (США), к антигену CD45, изотип IgG1, метка флуоресцеин (FITC).

4. Изотипические контроли: иммуноглобулины мыши G1 изотипа с соответствующей меткой (РЕ, FITC, PerCP).

5. Азид натрия (NaN₃). Готовят маточный 2,5%-ный раствор азида натрия на физиологическом растворе. В питательные среды и забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР) добавляют азид натрия до конечной концентрации 0,25%.

6. Лизирующий раствор для очистки взвеси ПСК от эритроцитов. Пропись: NH₄Cl - 8,26 г, бикарбонат калия - 1 г, Na₄ ЭДТА - 0,37 г. Растворить в 100 мл дистиллированной воды.

7. Забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР).

8. Альбумин сывороточный бычий.

9. ЗФР с добавлением 0,1%-ного бычьего сывороточного альбумина (ЗФР-БСА) или среда 199.

Определение количества клеток-предшественниц проводили в прямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ).

Наиболее адекватным следует считать метод двойной метки, с одновременным окрашиванием клеточного субстрата моноклональными антителами к антигену CD34 -основному маркеру клеток пула ПСК и к молекуле CD45 - общелейкоцитарному антигену, определяющему все гемопоэтические клетки. Подобная методика позволяет сразу рассчитать количество CD34+ клеток на все гемопоэтические (CD45+ клетки) в материале. Для оценки уровней неспецифического связывания часть клеток окрашивают с помощью изотипического контроля. В качестве изотипического контроля стандартно применяют мышиные иммуноглобулины IgGl изотипа (IgGl), меченные красителями, аналогичными метке используемых моноклональных антител (РЕ, FITC, PerCP). Перед постановкой РИФ исследуемые клетки освобождают от примеси эритроцитов путем стандартной процедуры лизиса и последующей отмывки в ЗФР-БСА центрифугированием при 1000 g в течение 5-7 минут.

Методика лизиса эритроцитов:

1. Добавить 2 мл лизирующего раствора к 0,2-0,5 мл клеточного осадка, перемешать, инкубировать до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

2. Отмыть клетки 2 раза в среде 199 или в ЗФР-БСА с помощью центрифугирования (1000 g, 5-7 мин).

С выделенными клетками проводят прямую РИФ в 96-луночном планшете, при этом для определения количества ПСК в любом материале используют панель из 3 лунок:

- неокрашенные клетки

- клетки, окрашенные изотипическими контролями с меткой, соответствующей метке использованных МКА

- клетки, окрашенные одновременно МКА к антигенам CD34 и CD45.

Следует обратить особое внимание, что МКА к CD34 предпочтительнее использовать с фикоэритриновой (РЕ) или перидининхлорофиловой (PerCP) меткой. Данные флуорохромы имеют более высокий уровень специфического сигнала по сравнению с флуоресцеинизотиоционатом (FITC).

Для определения количества CD34+ клеток оптимальными являются антитела к антигену CD34 клона НРСА-2 (8G12), изотипа IgGl.

ПОСТАНОВКА РИФ

1. В лунки вносят клетки в количестве не менее 500000 на лунку.

2. Далее в каждую лунку вносят коктейль названных антител и аккуратно ресуспендируют пипеткой. Каждое МКА берут в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем МКА в лунке - 20 мкл.

3. Клетки инкубируют с антителами в течение 30 минут при +4°С.

4. По окончании инкубации клетки дважды отмывают от несвязавшихся антител путем центрифугирования в течение 5-7 минут при 1000 g.

5. Клетки переносят в специальные пластиковые пробирки для подсчета их количества на проточном цитометре.

6. Объем клеточной суспензии в каждой пробирке доводят до 200-500 мкл путем добавления к клеткам ЗФР-БСА.

CD34+ клетки в периферической крови представляют собой малую клеточную популяцию. В условиях предварительной стимуляции миграции гемопоэтических СК в периферическую кровь процент клеток, экспрессирующих CD34, составляет 1,0-3,0%. Конечная концентрация клеток CD34+ в препарате составляет (40-100)·10⁶ клеток на мл.

Аутологичный препарат ГСКПК, обогащенный клетками, содержащими антиген CD34, полученный от неврологического больного, не всегда может использоваться сразу после получения, режим использования препарата зависит от состояния организма пациента и ряда других объективных и субъективных обстоятельств.

В связи с этим возникла необходимость разработки способа консервации препарата в целях сохранения его свойств до момента непосредственного использования. Еще одним объектом настоящего изобретения стал способ криоконсервации полученного препарата, как наиболее приемлемый для решения поставленной задачи.

Традиционный метод криоконсервирования заключается в добавлении ДМСО к клеточной суспензии в финальной концентрации 10% и замораживании на 1 градус в минуту до -80°С или -120°С с использованием электронного программного замораживателя и хранением в жидком азоте или парах жидкого азота [Adrian P. Gee. "Bone marrow processing and purging: a practical guide", 1991; 332-337].

Технической задачей настоящего изобретения является повышение сроков хранения нового препарата.

Технический результат достигается тем, что способ криоконсервации аутологичного препарата ГСКПК, включающий перемешивание препарата в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО) с последующим замораживанием с помощью жидкого азота в градиенте температуры, отличается тем, что препарат замораживают в смеси ДМСО, взятым в начальной концентрации 10-12%, с полиглюкином, градиент температуры составляет 1,1° в минуту при охлаждении до -40°С, замораживание ведут до температуры (-165°)÷(-170°)С. Такой способ позволяет сохранять препарат неограниченно долгое время.

Способ осуществляют следующим образом:

Предлагаемая ниже оригинальная методика криоконсервирования в парах жидкого азота с использованием низких концентраций диметилсульфоксида в смеси полиглюкином позволяет сохранить препарат гемопоэтических клеток из периферической крови практически без потерь, в процессе всех этапов криоконсервирования.

Процедура криоконсервирования препарата включает следующие этапы:

- добавление криофилактика к клеточной суспензии

- замораживание клеток

В качестве криофилактика кроветворных клеток используют высокоочищенный диметилсульфоксид (ДМСО). К клеточному препарату добавляют при постоянном перемешивании равный объем смеси полиглюкина с ДМСО. Смешивание ДМСО с полиглюкином происходит по типу экзотермической реакции с выделением умеренного количества тепла. Начальная концентрация ДМСО в полиглюкине - 10-12%.

Для замораживания ампул с клеточной взвесью их помещают в подходящий контейнер, выполненный, например, из многослойной фанеры (общая толщина 10 мм) с плотно закрывающей крышкой и соответствующий размеру ампул. Затем контейнер с замораживаемым материалом переносят в пары жидкого азота при температуре (-165°)÷(-170°)С до замораживания. Скорость охлаждения материала составляет 1,1 градуса в минуту на начальном этапе охлаждения до -40°С, замораживают и хранят при температуре (-165°)÷(-170°)С. Через 1,5-2,0 часа от начала замораживания контейнер уже можно переносить в хранилище для длительного хранения, где он будет находиться до трансплантации. При этом методе криоконсервации свойства замораживаемого материала остаются неизменными в процессе неограниченно длительного хранения.

Преимущества замораживания в парах жидкого азота:

- большая безопасность хранения контейнеров

- значительно меньший расход жидкого азота

- большее удобство работы с контейнерами.

Полученный новый препарат аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови (ГСКПК) был использован для лечения пациентов-добровольцев. Другим объектом настоящего изобретения стал способ лечения больных с травмами головного и спинного мозга.

Ранее для лечения таких больных применяли медикаментозную терапию, а в последние годы и клеточную - эмбриональными стволовыми клетками (см., например, методы, описанные в патентах РФ №2152038 от 27.06.2000 и №2152039 от 27.06.2000). Однако, как уже указывалось, терапия препаратами, приготовленными из эмбриональной ткани, имеет очень серьезные проблемы тканевой совместимости, возможности отторжения трансплантатов, возникновения отсроченных иммунных конфликтов, а также морально-этические, юридические и религиозные ограничения.

Технической задачей настоящего изобретения является устранение этих недостатков, а также повышение эффективности и сокращение сроков лечения, а также ускорение проведения лечебных сеансов и снижение травматичности способа для пациента.

Технический результат достигается тем, что разработан способ лечения повреждения центральной нервной системы, включающий введение пациенту нового аутологичного клеточного препарата, полученного из собственной периферической крови больного, обогащенной стволовыми клетками, содержащими антиген CD34, клеточный препарат пациенту вводят в дозе из расчета 2,7 (0,005÷16,8)·10⁶ клеток, содержащих СD34, на 1 кг веса тела больного, препарат предварительно смешивают с носителем, приемлемым для интратекального или интравентрикулярного введения, в соотношении 1 мл клеточного препарата на 2,0-100,0 мл носителя. В способе используют также криоконсервированный по нашему способу и предварительно размороженный препарат. Размораживание ведут непосредственного перед введением, в водяной бане при t=37÷40°С, после разморозки препарат дважды промывают в физиологическом растворе, применяют препарат только в первые 6 часов после размораживания.

Эффективность предложенного способа лечения оценивалась у пациентов с последствиями травм головного и спинного мозга в сравнении с трансплантациями и трансфузиями эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), а также традиционным медикаментозным лечением.

С целью объективизации полученных клинических результатов использовали специализированные шкалы: ASIA (Scale American Spinal Injuri Association) - Шкала Американской ассоциации спинальных повреждений) и FIM (Scale Functional Independens - Шкала функциональной независимости (С.Grander, 1979, L.Cook, 1994)), а также данные магнитно-резонансной томографии, электронейромиографии, церебрального картирования энцефалографического исследования (ЭЭГ), комплексного уродинамического исследования, иммунохимического исследования крови и ликвора. Общее количество пациентов с травматической болезнью головного и спинного мозга, включенных в исследование, составило 312 человек, которые были разбиты на 3 группы: 1-я группа (основная): пациенты, получавшие лечение трансфузией препарата аутологичных ГСКПК (80 пациентов), 2-я группа (112 человек): пациенты, получавшие лечение трансфузией эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), 3-я группа контрольных лиц: (120 человек): пациенты, получавшие традиционную медикаментозную терапию, и пациенты, которым проводилась диагностическая люмбальная пункция с введением 1 мл 0,9%-ного физиологического раствора NaCl.

Распределение больных по полу и возрасту представлено в таблице 1. Диаграмма эффективности лечения травматической болезни центральной нервной системы (головного и спинного мозга) различными методами по клиническим группам представлена на фиг.1, где видно сравнение эффективности трансфузий нового препарата аутологичных ГСКПК при травматической болезни головного и спинного мозга с аналогичными трансплантациями и трансфузиями ЭСК. В сопроводительной таблице на этой фигуре приведено число пациентов с различной степенью эффективности лечения. Достоверно доказана наиболее высокая эффективность трансплантации и трансфузии нового препарата аутологичнных ГСКПК в отличие от группы, получавшей ЭСК, и контрольной группы.

Таблица 1
Возраст (лет)		Количество (К) больных
		1-я группа									2-я группа						3-я группа
		Мужчины (М)				Женщины (Ж)					М			Ж			М				Ж
		К		%		К			%		К	%		К		%	К		%		К		%
14-19		4		5.3		-			-		-	-		-		-	2		1.9		-		-
20-30		29		38.6		2			40		29	28.4		-		-	31		29.0		6		46.2
31-40		19		25.3		2			40		36	35.3		4		40	33		30.8		3		23.1
41-50		16		21.3		1			20		17	16.6		5		50	27		25.3		3		23.1
51-60		2		2.6		-			-		14	13.7		1		10	11		10.3		1		7.8
61-70		-		-		-			-		6	5.9		-		-	3		2.8		-		-
Итого		75		100		5			100		102	100		10		100	107		100		13		100
Таблица 2
№	Пациент Возраст		Уровень травмы		Время после травмы (годы		Статус до лечения ASIAFIM			Объем Операции*			Статус после лечения			Время после лечения (годы)		Чувствительность		Восстановление движений		Контроль тазовых органов
							***	**					ASIA		FIM
1	Г-на Р., 22		Т12		2.5		А	77		Трансфузия ГСКПК			С		106	1.5		L3		Поли.		Полн
2	С-в Г., 35		С6		4		В	95		Трансфузия ГСКПК			D		108	2		С6		Част.		Полн.
3	К-в Д., 24		С5		0.8		A	83		Трансфузия ГСКПК			С		102	1		С6		Част.		Част.
4	И-на Ж., 31		Т6		4		А	70		Трансфузия ГСКПЬ			с		70	0,6		Т12		Част		Част
5	А-в С., 46		Т8		10		В	76		Трансфузия ГСКПК			Д		108	0,5		Т12		Част.		Полн.
6	Я-та А., 36		Т11		5		А	57		Трансфузия ГСКПЬ			В		96	0,5		L2		Част.		Полн.
7	Щ-в С., 42		С6		10		А	64		Трансфузия ГСКПК			А		96	2		С7		Част		Полн
8	М-ва Б., 21		Т6		3,5		В	66		Трансфузия ГСКПК			С		122	1,5		Т7		Част		Полн.
9	С-в. Д, 24		С5		4		А	46		Трансфузия ГСКПК			В		98	2		С5		Нет		Полн.
10	Т-в С., 30		Т6		3		А	70		Трансфузия ГСКПК			В		106	0,6		Т6		Нет		Нет.
11	Т-х О., 23		Т2		4		А	62		Трансфузия ГСКПК			В		97	0,6		Т4		Нет		Подл.
12	К-ен, 40		С5		5		А	46		Трансфузия ГСКПК			А		66	0.8		С6		Част.		Част.
13	Л-ка М., 42		С5		2		А	36		Трансфузия ГСКПК			В		64	0.5		С5		Част.		Полн.
14	Ч-ва С, 14		Т12		2,5		А	86		Трансфузия ГСКПК			С		122	3		Т10		Част.		Част.

В таблице 2 представлены результаты ограниченного клинического применения трансплантаций и трансфузий нового препарата аутологичных ГСКПК при интратекальном введении у больных с повреждениями головного и спинного мозга. Показана весьма высокая эффективность применения нового препарата.

Преимущества получения и использования препарата аутологичных стволовых клеток крови.

1. Возможность получения препарата из периферической крови без применения общего наркоза и пункции костного мозга с минимальной травматизацией для пациента.

2. Возможность проведения многократных и повторных сеансов получения препарата.

3. Относительная быстрота получения.

4. Возможность сохранения препарата при определенных низких температурах и неограниченный срок хранения без потери свойств, что позволяет провести отсроченное введение препарата пациенту.

5. Неограниченные возможности для генной инженерии.

По новой методике было проведено 80 сеансов сбора крови для получения препарата аутологичных ГСКПК. Не было неуспешных сеансов или сеансов, прерванных в связи с осложнениями или плохой переносимостью процедуры. При средней скорости введения препарата 60 мл/мин с учетом веса больного длительность сеанса не превышала 3 часов, что свидетельствует об ускорении лечебной процедуры.

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами.

Пример 1

Больной Щ., 40 лет. Поступил в клинику с диагнозом: Отдаленные последствия тяжелой вертеброспинальной травмы. Последствия компрессионного перелома С6-С7 позвонков с повреждением спинного мозга в виде интрамедуллярной кисты на уровне С5-С6 с нижней спастической параплегией и парапарезом верхних конечностей, нарушением функции тазовых органов. Травма позвоночника и шейного отдела спинного мозга получена в 1994 году в автомобильной аварии. Длительное время лечился в специализированных учреждениях и реабилитационных центрах для спинальных больных. В клинической картине преобладают симптомы нижней спастической параплегии и глубокого парапареза верхних конечностей, нарушение функции тазовых органов в виде недержания мочи и кала. В течении 10 лет адаптировался к своему состоянию, самостоятельно себя обслуживал в пределах дома. После полного обследования в рамках протокола отраслевой программы "Новые клеточные технологии - медицине" было принято решение о проведении больному курса терапии новым препаратом аутологичных ГСКПК. После стимуляции миграции стволовых клеток в периферическую кровь в течение 4 дней, через периферические вены произведен сеанс сбора ГСК на сепараторе СОВЕ Спектра. Длительность сеанса 60 минут, скорость кровотока 60 мл/мин. За сеанс получен препарат в дозе из расчета 2,7 (0,005)·10⁶ клеток, содержащих антиген СД34, на 1 кг массы тела больного. Препарат был обработан смесью ДМСО с полиглюкином и криоконсервирован. Через 3 дня препарат разморозили и в объеме 1 мл, смешанный с 2 мл фармацевтически приемлемого носителя, интратекально вводили пациенту. Побочные эффекты не отмечены. В клинической картине в течение 7 дней после трансфузии отмечалась положительная динамика: появились движения в пальцах кисти правой и левой руки, восстановилась мелкая моторика (использует пальцы для самообслуживания, берет пальцами небольшие предметы), расширился объем движений в предплечьях, больше слева, появилось несколько "пятен" нормальной чувствительности на ногах, появились незначительные движения большого пальца правой стопы, стал управлять мышцами брюшного пресса. Через 1,5 месяца появились отводящие и приводящие движения обоих ног, смог двигать стопой вверх и вниз. Отмечены отчетливые улучшения электропроводимости в руках и ногах, больше слева, при контрольной электронейромиографии. Через 3 месяца восстановилась функция тазовых органов: стал контролировать дефекацию и восстановилось мочеиспускание, что подтверждено данными комплексного уродинамического исследования.

Пример 2

Больной Г., 22 лет, с клиническим диагнозом: последствия тяжелой позвоночно-спинномозговой травмы, перелома Th₁₂ позвонка. Нарушение функции тазовых органов.

Сопутствующие диагнозы: Очаговый атрофический гастрит. Хронический цистит. Хронический пиелонефрит. Мочекаменная болезнь. Состояние после эпицистостомии (2003 г.). Состояние после операции трансуретральной эндовезикальной механической цистолитотрипсии, цистолитотапаксии (2004 г.).

При поступлении предъявлял жалобы на отсутствие движений и чувствительности в нижних конечностях, нарушение мочеиспускания и дефекации.

История заболевания: в 2001 г. упал с высоты около 10 м. После травмы, со слов родственников, была длительная потеря сознания. Сразу был доставлен в больницу по месту жительства, где, придя в себя, больной обнаружил, что отсутствуют движения и чувствительность в ногах. На третий день пребывания в больнице была выполнена декомпрессионная ламинэктомия th₁₂, установлена титановая стабилизирующая система. Движения и чувствительность в ногах не появились. Неоднократно проходил обследование и лечение в различных лечебно-профилактических учреждениях, в том числе в Румынии и Германии без значительного эффекта. Поступил повторно в клинику для обследования и лечения в рамках отраслевой научно-исследовательской программы РАМН "Новые клеточные технологии - медицине".

Неврологический статус при поступлении: сознание ясное. Зрачки равные, средней величины. Фотореакция живая, D≥S. Несколько сглажена правая носогубная складка. Небольшая девиация языка вправо. Выраженная девиация язычка вправо. Глоточный рефлекс сохранен. Мышечный тонус в конечностях несколько снижен. Двигательных и чувствительных нарушений в верхних конечностях нет. Патологический симптом Россолимо с обеих сторон.

Брюшные рефлексы не вызываются. Нижняя спастическая параплегия. Рефлексы на ногах оживлены, больше справа. Клонические подергивания нижних конечностей при исследовании пассивных движений. Проводниковая анестезия всех видов чувствительности с дерматома Th₁₂ слева и L₁ справа. Симптомы Бабинского, Пуссепа, Гордона и Шеффера вызываются с обеих сторон. Нарушение функции тазовых органов по центральному типу. Менингеальных знаков нет. Отмечается в сравнении с прежней госпитализацией улучшение неврологического статуса - больной способен производить движения в тазобедренных суставах с помощью медиальной и латеральной групп мышц бедер.

МРТ грудо-поясничного отдела позвоночника к головного мозга, заключение: состояние после ламинэктомии Th₁₂, установка титанового фиксатора на уровне Th₁₁-Th₁₂. Отмечается клиновидная деформация тела Th₁₂; легкая клиновидная деформация тела Th₁₁. Отмечается неравномерное снижение высоты и изменение МР-сигиала межпозвонкового диска Th₁₁-Th₁₂ с небольшой (~0,2 см) его протрузией кзади. При исследовании поясничного отдела патологических изменений не выявлено. При исследовании головного мозга патологических сигналов в веществе мозга не получено. Имеются умеренное асимметричное расширение переднего рога левого бокового желудочка; легкое расширение конвекситальных субарахноидальных пространств в лобно-теменной области. Заключение: состояние после ламинэктомни Th₁₂; титановый фиксатор Th₁₁-Th₁₂; компрессионный перелом тела Th₁₂, признаков блока ликворопроводящей системы не выявлено.

Пациенту была проведена реинфузия препарата аутологичных ГСКПК в субарахноидальное пространство. Каждый раз вводилось в дозе из расчета 6,3·10⁶ клеток, содержащих антиген CD34, на 1 кг веса тела больного.

Таким образом, больной, перенесший тяжелую позвоночно-спинномозговую травму с нижней параплегией, поступал в клинику для продолженного лечения в рамках программы "Новые клеточные технологии - медицине", а также реабилитационного лечения. В ходе до обследования были установлены показания для введения аутологичных гемопоэтических стволовых клеток: отсутствие антител к нейроспецифическим белкам в сыворотке крови и в ликворе, отрицательный результат анализа на нейротропные вирусы в сыворотке крови и в ликворе, благополучный клинический анализ ликвора и нормальные показатели анализов крови. Параллельно больному активно проводились лечебная физкультура, занятия в тренажерном зале (в том числе на тредмиле), массаж, физиопроцедуры. Также больному проводилась симптоматическая консервативная терапия.

Катамнез через 1 год. Больной нарастил мышечную массу ног: объем голеней увеличился на 3 см, объем бедер до 2.5 см слева и 4 см справа, самостоятельно ходит с опорой на "ходунки", восстановилась половая функция, полностью стал контролировать дефекацию, но мочеиспускание осуществляет с использованием катетеризации, появилась мозаичная болевая чувствительность в ногах и ягодицах.

Таким образом, разработана новая система, включающая препарат; способ его получения, сохранения и использования для лечения травматической болезни центральной нервной системы, позволяющая весьма эффективно, с наименьшей травматичностью для пациента оказать помощь при травме головного и спинного мозга как в неотложных случаях, так и при лечении последствий таких травм.

Claims

1. Препарат аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для трансплантации при поражении нервной системы, отличающийся тем, что представляет собой аутологичные клетки, полученные из периферической крови пациента, обогащенной гемопоэтическими клетками, содержащими антиген CD34, в конечной концентрации (40÷100)×10⁶клеток/мл.

2. Препарат аутологичных ГСК по п.1, отличающийся тем, что получен за счет предварительного дробного введения пациенту препарата гранулоцитколониестимулирующего фактора (Г-КСФ).

3. Препарат аутологичных ГСК по п.2, отличающийся тем, что получен за счет предварительного дробного введения Г-КСФ нейпогена в растворе глюкозы, в течение 4-х дней по схеме: первые три дня - через каждые 10-12 ч в дозе 2,5 мкг/кг, на 4-й день - удвоенной дозы препарата в том же режиме времени.

4. Способ получения препарата, охарактеризованного в пп.1 и 2, включающий предварительное дробное введение пациенту препарата Г-КСФ, забора периферической крови и сепарации ГСК, содержащих антиген CD34, с последующей очисткой полученной взвеси клеток от эритроцитов и не менее чем 2-кратной отмывкой в физиологическом растворе.

5. Способ получения препарата по п.4, отличающийся тем, что при необходимости очищенную взвесь клеток подвергают криоконсервации.

6. Способ получения препарата по п.4, отличающийся тем, что в качестве препарата Г-КСФ берут нейпоген в растворе глюкозы, а дробное введение проводят в течение 4-х дней по схеме: первые три дня - через каждые 10-12 ч, в дозе 2,5 мкг/кг, на 4-й день - удвоенную дозу препарата в том же режиме времени.

7. Способ криоконсервации препарата, охарактеризованного в пп.1, 2 или 3, включающий перемешивание препарата в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО) с последующим замораживанием в градиенте температуры с помощью жидкого азота, отличающийся тем, что замораживание ведут до температуры (-165°)÷(-170°)С в смеси ДМСО с полиглюкином в начальной концентрации ДМСО 10-12%, градиент температуры составляет 1,1° в минуту на начальном этапе охлаждения до (-40°)С.

8. Способ лечения травматической болезни головного и спинного мозга, включающий введение пациенту клеточного препарата, отличающийся тем, что пациенту вводят препарат ГСК из периферической крови пациента, охарактеризованный в пп.1, 2 или 3, полученный по способу, охарактеризованному в пп.4 и 5, при этом клеточный препарат пациенту вводят в дозе из расчета 2,7 (0,005÷16,8)×10⁶ клеток, содержащих антиген CD34, на 1 кг веса тела больного, препарат предварительно смешивают с носителем, приемлемым для интратекального или интравентрикулярного введения, в соотношении 1 мл клеточного препарата на 2,0-100,0 мл носителя.

9. Способ лечения по п.8, отличающийся тем, что в случае использования криоконсервированного препарата его размораживают непосредственно перед введением, размораживание проводят на водяной бане при t=37÷40°С, затем препарат не менее 2-х раз промывают в физиологическом растворе, использование препарата ведут только в первые 6 ч после размораживания.