RU2757812C2

RU2757812C2 - Противоопухолевый таргетный клеточный продукт, способ его получения и его применение

Info

Publication number: RU2757812C2
Application number: RU2018147396A
Authority: RU
Inventors: Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ; Игорь Михайлович Абашин
Original assignee: Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ; Игорь Михайлович Абашин
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2021-10-21
Also published as: RU2018147396A; RU2018147396A3

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии и может быть использовано для противоопухолевой таргетной терапии и профилактики рака и других злокачественных новообразований. Биомедицинский клеточный продукт (БМКП) для лечения и профилактики рака и других злокачественных новообразований содержит аутологичные или иммуносовместимые аллогенные мононуклеарные клетки (МНК) мобилизованной периферической крови человека (компонент А), содержащие гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) с маркерами CD34+, CD45+ в количестве 1-2% клеток от общего числа МНК и мезенхимальные стромальные стволовые клетки (МССК) с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- в количестве 0,5-2% клеток от общего числа МНК, а также линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных нейральных стволовых клеток (НСК) с маркером CD133+ (компонент Б) и/или линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- (компонент В). Компоненты Б и В транскриптом-модифицированы путем их обработки пертурбагеном, приводящей к формированию секретома клеток этих компонентов, способного к блокированию внутриклеточного сигнального пути интегринов/фокальной адгезии у опухолевых и опухолевых стволовых клеток. БМКП также содержит вспомогательное вещество в виде стерильной трансфузионной среды при следующих концентрациях клеток на 1 мл вспомогательного вещества: компонент А (МНК) - 0,8×10⁶ - 4×10⁶ клеток; компонент Б (НСК) - 4×10³ - 3,3×10⁵ клеток; компонент В (МССК) - 0,5×10⁶ - 2×10⁶ клеток. Раскрыт также способ получения ex tempore БМКП и его применение для лечения и профилактики рака и других злокачественных новообразований. Группа изобретений обеспечивает БМКП, который сбалансирован по клеточному составу и имеет высокую противоопухолевую эффективность. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, более конкретно, к онкологии и медицинским биотехнологиям, а именно к противоопухолевому биомедицинскому клеточному продукту (БМКП) под торговым названием «ОнкоКомб», способу получения этого продукта и его применению. Этот БМКП может быть использован для противоопухолевой молекулярнонацеленной, так называемой таргетной (от англ. target - цель, мишень) терапии и профилактики рака (рака легких, рака груди и т.д.) и других злокачественных новообразований (ЗНО) человека (мультиформной глиобластомы, анапластической астроцитомы и т.д.).

Основным трендом большинства научных исследований в фармакологии и мировой онкологии начала XXI века стала разработка и создание противоопухолевых молекулярнонацеленных (таргетных) фармакологических препаратов. Так, согласно отчету Всемирной организации здравоохранения за 2013 год, разработка и создание современных таргетных противоопухолевых фармакологических препаратов в мировой онкологии позволило продлить общую продолжительность жизни населения в США и Евросоюзе на 25-30 лет (WHO, 2013).

В современной фармакологической индустрии создание противоопухолевых таргетных препаратов основано на глубоком изучении и молекулярном анализе канцерогенной трансформации путей внутриклеточной сигнальной трансдукции, называемых далее внутриклеточными сигнальными путями (ВКСП), в опухолевых клетках (ОК) при разных нозологиях ЗНО. Исследователи пытаются выявлять новые цели и мишени на ВКСП ОК. Эти мишени могут быть расположены как на мембране ОК или опухолевых стволовых клеток (ОСК) в виде акцепторных белков, так и во внутриклеточной структуре ВКСП, воздействие на которые позволит или блокировать, или активировать экспрессию конкретных генов ядра ОК. Фармакологическое воздействие на цели и мишени на ВКСП в ОК, позволяет активировать или блокировать определенные эффекторные функции этих клеток - апоптоз, пролиферацию, митоз, деление, инвазивность, метастазирование и т.д.

Разобраться в хитросплетениях показаний и обоснованности назначений современной таргетной лекарственной терапии при ЗНО очень непросто. Существует ряд методологических и экспериментальных подходов к выбору мишеней в ОК для фармацевтической таргетной терапии злокачественных опухолей (ЗО) у человека. Проиллюстрировать основные известные мишени в ОК можно на примере одной из самых фатальных опухолей, диагностируемых у человека - мультиформной глиобластомы (МГБ) головного мозга. В фундаментальном современном руководстве по нейроонкологии (Principles of Neuro-Oncology, edited by David Schiff, Brian Patrick O'Neill, 2005, New-York, USA) впервые были представлены основные принципы применения и практические подходы к лекарственной таргетной терапии опухолей мозга, исходя как из основных стандартных, так и новых представлений о генезе опухоли в свете последних открытий в области молекулярной генетики и исследований путей трансдукции сигнала, которой в основе своей управляется рост злокачественных глиом и МГБ. В связи с основными мишенями в современной лекарственной терапии опухолей сегодня рассматриваются: рецепторы факторов роста клеточной поверхности и направленное воздействие (таргетинг) на рецептор фактора роста, нейтрализация антител к EGFR (рецептору эпидермального фактора роста), фармакологические ингибиторы EGFR и ингибиторы рецептора фактора роста тромбоцитов, применение внутриклеточных компонентов вторичного мессенджера, воздействие на Ras ингибиторами фарнезилтранферазы, ингибиторы протеинкиназы С; препараты, напрямую воздействующие на ДНК или процесс ее репликации; алкилирующие вещества, ингибиторы клеточного цикла; фармакологическая терапия, воздействующая на контрольную точку G1/S клеточного цикла; генная терапия, направленная на укрепление барьера G1/S; протеиназы и интегрины как медиаторы инвазивности опухоли; эффекторные молекулы целенаправленного воздействия на протеинкиназы, интегрины, медиаторы ангиогенеза; способы повышения эффективности таргетинга препаратов в опухоль; доставка в опухоль большего количества препарата, повышающего проницаемость гематоэнцефалического барьера; химиотерапия, проводимая непосредственно в паренхиму головного мозга (интерстициальная терапия); лучшее распределение лекарственного вещества по мозгу (конвекционный подход), функциональный таргетинг лекарственного средства в ОК.

Расширение познаний в области молекулярной биологии злокачественных опухолей мозга позволило уже сегодня создать новые вещества, ориентированные на основные известные и новые мишени в ОК и ОСК. Высокоточное попадание молекул таргетных фармакологических средств в виде моноклональных антител (МКАТ) или микроРНК (мРНК) обеспечивает высокоточное поражение цели в виде акцепторных мембранных белков ВКСП на поверхности ОК, позволяет максимально эффективно управлять эффекторными функциями ОК и достигать выраженного клинического эффекта подавления неопластического процесса ЗНО. Большинство современных противоопухолевых фармакологических таргетных препаратов основано на конкретных молекулах МКАТ и белков, запатентованных и выведенных на рынок многими фармакологическими компаниями.

Молекулы МКАТ и белков, являющиеся действующим веществом в таргетных химиопрепаратах, избирательно действуют на неспецифические мишени в ОК (факторы роста, эффекторные молекулы, ингибиторы клеточного цикла) и на акцепторные онкоспецифические белки ВКСП только на мембране ОК. Для целенаправленного воздействия только на патологические онкоизмененные белки ВКСП и их блокирование мишенями фармацевтической таргетной терапии могут быть только онкоспецифические молекулы белков ВКСП ОК. Показано, что создание таргетных клеточных препаратов нового поколения в лечении онкологических болезней может значительно повысить эффективность и безопасность лечения, уменьшить количество осложнений от противоопухолевой лекарственной терапии и значительно улучшить качество жизни онкологических пациентов (Давыдов М.И., 2016).

Таргетные противоопухолевые фармакологические препараты нашли свое применение для преодоления лекарственной резистентности в терапии опухолей. Сегодня основной стратегией преодоления лекарственной резистентности к противоопухолевой терапии является фармакогеномный подход, ориентированный на создание новых таргетных препаратов на основе генетического исследования ОК (Моисеев А.А., 2014). Предложены системы таргетной доставки в ОК активной формы гена Р53, биомолекул Mir-34a и циклофилина В, новый класс ингибиторов тирозинкиназы - гефитиниб (Иресса), эрлотиниб (Тарцева) и лапатиниб (Тайверб), блокатор Ras-киназы типифарниб (Zarnestra). Активно обсуждается эффективность противоопухолевых вакцин в отношении EGFRvIII.

С молекулярно-биологических позиций современной онкологии канцерогенез рака и других ЗНО это генетическое заболевание ядра СК (Заридзе Д.Г., 2004). Неопластическая трансформация ядра СК начинается со специфической канцерогенной модификации ее генома, изменения транскриптома и формирования онкопротеома. В ядре и цитоплазме ОК появляются особые, онкоспецифические белки, но при этом клетка до определенного момента времени сохраняет свои ключевые функции и иммунофенотипический профиль. По мере накопления генетических нарушений такая клетка приобретает способность преодолевать критически значимые, контрольные точки клеточного цикла и начинает активно реплицироваться, сохраняя при этом свой иммуноцитохимический профиль и возможность порождать клетки различных типов, приобретая при этом потенции рекрутировать и программировать другие, нормальные стволовые и соматические клетки (Брюховецкий И.С. с соавт., 2015).

Продолжительное существование такой канцерогенно-измененной клетки в ситуации оптимального баланса общих и местных факторов микроокружения позволяет ей накопить необходимый количественный потенциал, что ведет к глубокому качественному нарушению внутритканевой иерархии и создает для потомства такой клетки особые условия существенно больших преференций. Системообразующие функции ОСК позволяют новообразованию в сжатые сроки сформировать собственную сосудистую, лимфатическую и нейральную сети, оптимизировать тканевой метаболизм и накопить потенциал для инвазии в прилежащие ткани и проникновению в удаленные органы. По мере своего существования ОСК приобретают способности противостоять всем существующим методам противоопухолевой терапии. Одновременно перестраиваются информационно-регуляторные паттерны ремоделируемой ткани, создавая для ОСК оптимальные условия, в которых они становятся практически неуязвимы для традиционных терапевтических воздействий. Это позволяет сделать закономерный вывод о том, что успех в лечении злокачественных опухолей лаже на теоретическом и методологическом уровне возможен только при сочетании инновационных терапевтических технологий, направленно инактивирующих функциональный потенциал ОСК, с методиками, нарушающими сложившиеся стереотипы опухолевой иерархии злокачественных новообразований.

К сожалению, большинство фармакологических таргетных препаратов практически не воздействуют на ОСК. Предложен ряд фармацевтических средств, поражающих отдельные мишени в ОСК, - Лапатиниб (Тикерб), Иматиниб (Гливек), Циклопамин, антитела к CD133, применение которых пока не привело к очевидным успехам. Возможно, что это связанно со спецификой ОСК и отсутствием в них статичных мишеней. Более того, все мишени в ОСК индивидуальны, динамичны и связанны с определенными этапами процесса канцерогенеза.

Несмотря на весь спектр клинических преимуществ и достоинств фармакологических таргетных противоопухолевых препаратов, их получение и производство очень дорогостоящие. Время создания одного фармакологического таргетного препарата занимает около 10-15 лет, а стоимость создания, разработки и выведения на рынок определенной молекулы таргетного клеточного препарата составляет около 10-12 млн. долларов США. Поэтому стоимость полного цикла лечения большинства злокачественных опухолей с использованием многокурсового введения современного таргетного препарата в течение года колеблется от сотни тысяч долларов США до 1-1,5 млн. долларов США. Например, стоимость таргетного препарата бевацизумаб (Авастин) на курс лечения составляет 5000- 6000 долларов США, а общий цикл лечения составляет 12 курсов в течение 12 месяцев с кратностью введения препарата 1 раз в месяц. Препарат показывает очень высокую эффективность в профилактике рецидивов у пациентов с различными типами рака, нарушая формирование опухолевой сосудистой сети, но абсолютно бесполезен при генерализации опухоли. Более одного года этот препарат использовать опасно, так как он блокирует рост сосудов не только в опухоли, но в других органах и тканях. Стоимость препарата «Ниволумаб», в России зарегистрированного как «Опдиво» составляет от 200000 рублей до 400000 рублей на месячный курс, то есть стоимость его годового курса по минимальной цене составляет 2400000 рублей. Чтобы обеспечить пятилетнюю выживаемость больного на данном лечении, понадобится минимум 12 млн. рублей.

Поэтому разработка альтернативных подходов к созданию молекулярнонацеленных препаратов, основанных на более экономичном носителе и более дешевом сырье, является крайне актуальным. Одним их таких альтернативных подходов является создание клеточных препаратов с заданными таргетными свойствами на основе стволовых клеток (СК).

Смысл лечения клеточными препаратами, содержащими СК, состоит в том, что весь потенциал для здоровой и продолжительной жизни в нашем организме заложен в нем с самого начала в СК, которые постоянно возвращают организм человека к норме. Современная медицина позволяет забрать СК из организма человека и использовать в виде препарата для лечения заболеваний, ранее считавшихся неизлечимыми. На данный момент для целого ряда серьезных заболеваний клеточные препараты, содержащие СК, являются практически единственным способом лечения. Кроме того, применение клеточных технологий повышает эффективность традиционных методов лечения, существенно облегчает течение заболевания и приближает момент выздоровления.

Клеточная таргетная терапия открывает принципиально новые подходы для регуляции и управления эффекторными функциями как ОК и сосудов опухолевой ткани, так и регуляцией функциями здоровых клеток в опухолевом очаге. Это обусловлено рядом уникальных молекулярно-биологических феноменов, свойственных клеточным препаратам, изготовленным из СК и клеток-прогениторов. Во-первых, клеточная таргетная терапия это универсальное решение проблемы направленного транспорта и маршрутизации терапевтического регуляторного агента в ОК. Это связано с тем, что клеточные системы, введенные в организм, всегда достигают патологические клетки хозяина путем хорошо известного механизма «хоуминга» или «направленной миграции» (патотропизма). То есть СК и клетки-прогениторы имеют генетическую «программу самонаведения» на поврежденную зону и «придут» в патологический очаг органа. Они мигрируют к патологическим клеткам по градиенту концентрации воспаления независимо от его генеза (онкопроцесса, ишемии, инфекции, повреждения, геморрагии и т.д.). Во-вторых, по молекулярному механизму клеточной адгезии эти клетки всегда «прилипнут» исключительно к патологическим клеткам. В-третьих, молекулярно-биологический феномен «рядомстоящего» (bystander effect) обеспечит целенаправленное управляющее воздействие белков-лигандов и лигандов в виде микроРНК, секретируемые этими СК на объект регуляции - ОК и ОСК. Еще одним важным биологическим эффектом воздействия СК на ОК, является возможность репаративной регенерации за счет слияние генома СК с геномом патологических клеток и осуществление как вертикального, так и горизонтального переноса информации из СК в ОК. Таким образом, клеточная таргентная терапия может быть использована как самонаводящая на цель «боевая клеточная система» для терапевтического воздействия как на специфические мембранные мишени ВКСП ОК, так и на неспецифические ВКСП внутри клетки, то есть на ВКСП, не пострадавшие в процессе канцерогенеза болезни.

Феномен направленной миграции СК в опухолевый очаг проливает свет на исключительно важный молекулярный механизм межклеточного взаимодействия между ОК и тканеспецифичными СК. Мигрируя в зону неопластической трансформации, СК взаимодействуют с мутантными ОК и обмениваются регуляторными белками, ремоделирующими их протеом. Они запускают естественные регуляторные механизмы ОК, которые позволяют СК выполнять регуляторные противоопухолевые функции на самых ранних стадиях канцерогенеза, когда накопившие мутации клеточные элементы еще недоступны воздействию собственных противоопухолевых интегративных регуляторных систем. Протеомный обмен составляет основу локального молекулярно-биологического гомеостаза. Неопластическая трансформация и дальнейшая эволюция ОСК модифицирует протеомный профиль клетки, делая его недоступным для регуляторного воздействия натуральных тканеспецифичных СК (тсСК). Однако таргетная модификация транскриптомного профиля тсСК в отношении продукции белков-лигандов, воздействующих на конкретные цели в ОСК, открывает возможности дополнительной противоопухолевой коррекции регуляторных функций ОК и ОСК, и возможности преодоления их терапевтической резистентности, основанные на управлении ключевыми пролиферативными и репаративными функциями ОСК ЗНО.

В июле 2016 года в России принят Федеральный закон №180 ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах», который на государственном уровне регулирует разработку и создание БМКП, доклинические исследования и ограниченные клинические испытания БМКП, оборот БМКП и их широкое применение в клинике на людях. Поэтому актуальность создания новых клеточных продуктов очевидна, так как до настоящего времени в России говорили преимущественно о клеточных технологиях и СК, а не о БМКП. Под биомедицинским клеточным продуктом указанный закон понимает комплекс, состоящий из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ, либо из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ в сочетании с прошедшими государственную регистрацию лекарственными препаратами для медицинского применения и (или) медицинскими изделиями.

Очень важно понимать, какие клеточные системы СК можно использовать и включать в молекулярнонацеленные или таргетные БМКП, а какие нельзя использовать. Оптимальным противоопухолевым потенциалом могла бы обладать линия СК, способная секретировать регуляторные белки-лиганды, способные в рамках белок-белкового взаимодействия блокировать или активировать ВКСП ОК и ОСК. Именно эти клеточные системы могли бы составить реальную альтернативу таргетным фармакологическим препаратам, созданным на основе МКАТ и микроРНК и значительно снизить финансовую нагрузку на государства и на онкологических больных в области оказания высокотехнологической медицинской помощи пациентам с различными формами рака.

В настоящее время для целей получения таргетных БМКП используются различные типы тсСК взрослого организма - гемопоэтические СК (ГСК), являющиеся предшественниками клеток крови (патент RU 2283119, 2006 г., МПК А61К 35/14, А61Р 25/00), нейрональные СК (НСК), являющиеся предшественниками клеток нервной ткани (патент RU 2394593, 2010 г., МПК А61К 38/39, А61К 35/12, А61К 35/14, А61Р 25/00), мезенхимальные стромальные СК (МССК), способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения (патент RU 2252252, 2005 г., МПК C12N 5/08), а также СК других зародышевых листков.

ГСК уже более 50 лет успешно используются в медицине. В онкологии они применяются в нескольких областях. Во-первых, ГСК применяются в онкогематологии после высокодозной химиотерапии для снижения длительности депрессии костного мозга и снижении риска инфекционных и геморрагических осложнений. Во-вторых, для восстановления иммунного противоопухолевого ответа используются донорские ГСК. Третьим направлением использования долгоживущих кроветворных предшественников является генотерапия, когда в них искусственно внедряется ген, изменяющий регуляторные свойства клетки и определяющий презентацию антигена для инициирования иммунного ответа.

МССК и НСК, наряду с ГСК, являются основными тсСК организма и также могут быть широко использованы в новых таргетных БМКП. Опыт применения НСК в лечении глиом и глиобластом широко известен (Е. Snyder et al., 2002, 2005, 2010; Aboody et al., 2005; Bryukhovetskiy A.S. et al., 2006, 2009). Роль МССК и их противоопухолевые эффекты были широко продемонстрированы американскими исследователями (D. Caplan, 2012; D. Caplan et al., 2013) и отечественными учеными (А.Г. Коноплянников с соавт., 2014). Особенностью МССК для приготовления таргетных БМКП является их иммунопривелегированность. Профессор А.Г. Коноплянников и ученики его школы (2011-2015 г. г.) из г. Обнинска (Россия) продемонстрировали, что донорские МССК не распознаются иммунной системой организма как чужеродные и могут быть использованы для лечения рака, хронической эмфиземы легких, хронической обструктивной болезни легких (Аверьянов А.В. с соавт., 2015).

В Федеральном научно-клиническом центре ФМБА России донорские МССК широко применяют в пульмонологии и неврологии (Аверьянов А.В. с соавт., 2014,2015, 2016). Поскольку донорские клеточные системы МССК практически не отторгаются иммунной системой реципиента, они могут стать основой клеточной линии таргетных БМКП. Протеомное картирование ГСК, МССК и НСК, проведенное с участием авторов настоящего изобретения и описанное в отдельной монографии (Брюховецкий А.С., 2014), показало их высокую протеомную идентичность с ОСК, полученными из опухолей различных органов - НСК на 67% белков идентично с ОСК МГБ (глиомасферами), МССК на 72% белков идентична ОСК рака легкого и рака молочной железы. Остальные белки ОСК являются онкоспецифическими или, по-другому, не являются человеческами белками. Это белки других видов животных и млекопитающих, которые делают ОСК недоступными коррекции регуляторными сигналами человеческих белков. Онкоспецифические белки видоизменяют протеомную структуру ВКСП ОК и ОСК, формируют онкофенотип этих СК и поэтому основной задачей диагностики является выявление в ОК и ОСК ВКСП, не пострадавших в результате канцерогенеза, так как нерегулируемой клеткой нельзя управлять. В мутантной ОК и ОСК нужно найти те ВКСП, которые доступны регуляторному воздействию с использованием регуляторных человеческих белков. Поэтому применение тсСК с таргетными молекулярнонацеленными свойствами в БМКП имеет четкое научное обоснование на уровне онкопротеома клеток.

Другой особенностью противоопухолевого таргетного клеточного воздействия является необходимость учета тканеспецифической принадлежности СК. Тканевая специфичность СК дает им большие преференции в регуляции процессов гомеостаза в клетках, родоначальниками которых они являются (НСК для нервной ткани, МССК для тканей солидных органов и т.д.). Универсальными клеточными регуляторными системами являются в организме человека только ГСК. Известно, что трансплантация ГСК является единственным методом полного излечения от хронического миелолейкоза и других онкозаболеваний крови. Но именно эти клетки можно использовать при опухолях различной тканевой специфичности.

В настоящее время можно с уверенностью заявить, что новым универсальным биотерапевтическим инструментом для воздействия на ОСК рака и ЗНО головного мозга могут быть собственные и донорские ГСК. МССК и НСК менее пластичны, чем ГСК, но в критических ситуациях НСК в организме человека и животных может полностью «заменить» ГСК. В современных руководствах по гематологии описываются экспериментальные исследования на крысах с моделированным миелолейкозом, когда у самца с онкогематологическим заболеванием после высокодозной химиотерапии убивали все клетки костного мозга (в том числе и ГСК) и осуществляли трансплантацию НСК, взятой у самки в лейконцентрате мононукларов. Итогом эксперимента по трансплантации НСК стало то, что все клетки крови самца-реципиента имели генотип НСК донора-самки. С другой стороны, МССК наименее вовлечены в неопластический процесс в головном мозге, что позволяет предположить, что они наиболее полно сохранили свой противоопухолевый биотерапевтический потенциал (Тепляшин А.В., 2014).

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) настоящего изобретения принят препарат аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (патент RU 2283119,2006 г., МПК А61К 35/14, А61Р 25/00). При составлении этого известного препарата и его применении абсолютно не учитывалась роль МССК в нем, поэтому сейчас этот препарат представляется недостаточно сбалансированным по клеточному составу при том, что в настоящее время требуется более высокая эффективность БМКП такого типа.

Задачей настоящего изобретения является создание нового БМКП на основе линий СК, который был бы сбалансирован по клеточному составу и имел высокую противоопухолевую эффективность.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения решение указанной задачи достигается тем, что предложен БМКП для лечения и профилактики рака и других злокачественных новообразований, содержащий аутологичные или иммуносовместимые аллогенные мононуклеарные клетки (МНК) мобилизованной периферической крови (ПК) человека (компонент А), содержащие ГСК с маркерами CD34+, CD45+ в количестве 1-2% клеток от общего числа МНК и МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- в количестве 0,5-2% клеток от общего числа МНК, а также линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных НСК с маркером CD133+ (компонент Б), транскриптом-модифицированных путем обработки пертурбагеном, приводящей к формированию секретома НСК, способного к блокированию внутриклеточного сигнального пути интегринов/фокальной адгезии у ОК и ОСК, и/или линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- (компонент В), транскриптом-модифицированных путем обработки пертурбагеном, приводящей к формированию секретома МССК, способного к блокированию внутриклеточного сигнального пути интегринов/фокальной адгезии у ОК и ОСК; и вспомогательное вещество в виде стерильной трансфузионной среды при следующих концентрациях клеток на 1 мл вспомогательного вещества:

компонент А (МНК) - 0,8×10⁶ - 4×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 4×10³ - 3,3 ×10⁵ клеток;

компонент В (МССК) - 0,5×10⁶ - 2×10⁶ клеток.

Для внутритканевого введения БМКП по настоящему изобретению при терапии первичных и метастатических злокачественных новообразований в головном и спинном мозге (далее вариант 1) в качестве вспомогательного вещества использован биодеградируемый полимерный матрикс при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 2,5 ×10⁶ - 4×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 2,5×10⁵ - 3,3×10⁵ клеток.

При профилактике рецидива злокачественных новообразований в мозге предложенный БМКП (далее вариант 2) дополнительно содержит компонент В при концентрации этого компонента 0,5×10⁶ - 1,3×10⁶ клеток/мл матрикса.

Для внутривенного и внутриартериального введения предложенного БМКП при регуляции опухолевых клеток, оставшихся после конвенциональной лучевой и химиотерапии опухолей головного и спинного мозга (вариант 4), в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl при следующих концентрациях клеток на 1 мл раствора:

компонент А (МНК) - 0,8 ×10⁶ - 1,2×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 4×10³ - 6×10³ клеток;

компонент В (МССК) - 0,5 ×10⁶ - 1 ×10⁶ клеток.

Для внутривенного и внутриартериального введения предложенного БМКП при лечении отдаленных метастазов рака в солидных органах и костных тканях, а также в случае невыявленного очага опухолевого процесса (вариант 6) в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl при следующих концентрациях клеток на 1 мл раствора:

компонент А (МНК) - 0,8×10⁶ - 2×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 1,2×10⁴ - 1,8×10⁴ клеток;

компонент В (МССК) - 1×10⁶ - 2 ×10⁶ клеток.

Для внутритканевого введения предложенного БМКП при метастатических злокачественных новообразованиях в мозге и костных тканях (вариант 3) в качестве вспомогательного вещества использован биодеградируемый полимерный матрикс при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 2,5×10⁶ - 4×10⁶ клеток;

компонент В (МССК) - 1,5×10⁶ - 2×10⁶ клеток.

Для внутривенного и внутриартериального введения предложенного БМКП при регуляции опухолевых клеток, оставшихся после конвенциональной лучевой и химиотерапии опухолей солидных органов (вариант 5), в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl при следующих концентрациях клеток на 1 мл раствора:

компонент А (МНК) - 0,8 ×10⁶ - 1,2×10⁶ клеток;

компонент В (МССК) - 0,5×10⁶ - 1×10⁶ клеток.

Согласно настоящему изобретению во всех вариантах БМКП аллогенные МНК, НСК и МССК иммуносовместимы по группе крови, резус-фактору и иммунофенотипу крови, а пертурбаген выбран из группы, состоящей из никлозамида, ацетилсалициловой кислоты, трихостатина А и пропидия иодида.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ получения ex tempore вышеописанного БМКП, включающий в себя:

получение аутологичных или иммуносовместимых аллогенных МНК мобилизованной ПК человека (компонент А), содержащих ГСК с маркерами CD34+, CD45+ в количестве 1-2% клеток от общего числа МНК и МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- в количестве 0,5-2% клеток от общего числа МНК, путем их выделения из лейкоконцентрата (ЛК) ПК или костного мозга, а также

получение линии аутологичных или иммуносовместимых аллогенных НСК с маркером CD 133+(компонент Б) путем их выделения из эпителия обонятельной выстилки носа и модифицирования их транскриптома путем обработки пертурбагеном, приводящей к формированию секретома НСК, способного к блокированию внутриклеточного сигнального пути интегринов/фокальной адгезии у ОК и ОСК, и/или получение линии аутологичных или иммуносовместимых аллогенных МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- (компонент В) путем их выделения из костного мозга или жировой ткани и модифицирования их транскриптома путем обработки пертурбагеном, приводящей к формированию секретома МССК, способного к блокированию внутриклеточного сигнального пути интегринов/фокальной адгезии у опухолевых и опухолевых стволовых клеток, и

смешивание ex tempore компонентов А, Б, В и вспомогательного вещества в виде стерильной трансфузионной среды при следующих концентрациях клеток на 1 мл вспомогательного вещества:

компонент А (МНК) - 0,8×10⁶ - 4×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 4×10³ - 3,3×10⁵ клеток;

компонент В (МССК) - 0,5×10⁶ - ×10⁶ клеток.

Согласно настоящему изобретению полученные компоненты А, Б, В, как правило, криоконсервируют, а перед их смешиванием ex tempore со вспомогательным веществом размораживают.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложено применение БМКП по любому из вариантов 1-6 для лечения и профилактики рака и других злокачественных новообразований.

Механизм действия предложенного БМКП объясняется следующим.

ГСК, МССК и НСК способны самостоятельно мигрировать в очаг опухоли, преодолевать гематоэнцефалический барьер и активно взаимодействовать с ОК. Взаимодействие CDF-la\CXCR4 на СК активизирует в поврежденных клетках внутриклеточные пути сигнальной трансдукции Nek, Crk, Crk-L, MARK p42\44-ELK-1 и PI3K-AKT-NF-kB, STAT, что выражается в выживании, пролиферации и активной продукции противовоспалительных и ангиогенных молекул. Экспрессия белка CXCR4 в СК всех типов позитивно контролируется фактором, индуцированным гипоксией (HIF-1α).

Теоретически, специфика противоопухолевого межклеточного взаимодействия ГСК и МССК и НСК с ОК (например, глиомы и МГБ) позволяет выделить два ключевых механизма - активизация рецепторов клеточной поверхности и протеомный обмен. Способность ГСК и МССК подавлять рост глиом отчасти можно объяснить активизацией в ОК рецепторов семейства фактора некроза опухолей (TNF), в частности, десятого лиганда этого суперсемейства, известного как TNFSF10 или TRAIL, фактора роста нервов (NGFR), белка CD95, рецепторов смерти DR3, DR4, RD5. Активизация этими клетками (ГСК, МССК и НСК) рецепторов эпидермального фактора роста и инсулиноподобного фактора роста также ведет к запуску апоптоза в ОК. Кроме того, сигнал клеточной гибели может быть передан ГСК, НСК или МССК в ОК через щелевые межклеточные контакты посредствам костного морфогенетического белка (ВМР7), интерлейкинов IL3, IL4, IL10, IL12, IL23, интерферона-альфа, циклинов Е и D, регуляторного белка р53.

Целенаправленное регуляторное воздействие на конкретные цели в ядре ОСК для получения адекватного ответа от ее генома требует поиска нужной мишени в нем. Авторы настоящего изобретения полагают, что потенциальной мишенью в ОСК могут быть только те пути внутриклеточной сигнальной трансдукции, которые на всем своем протяжении (в мембране, цитоплазме, органеллах и ядре) не изменены неопластическим процессом. Они будут способны донести регуляторный сигнал с клеточной поверхности до конкретных целей в ядре ОСК.

Выявление функционально значимых путей внутриклеточной сигнальной трансдукции в ОСК открывает перспективы воздействия на эти мишени белками-лигандами, которое модифицирует транскриптомно-протеомный профиль ОСК и может приводить к нарушению ее репродуктивных и репаративных функций. Продукция белков-лигандов постнатальными тсСК (ГСК, МССК, НСК) после обработки ремоделирующим агентом (пертурбагеном) обеспечит выработку этими клетками необходимого регуляторного белка-партнера, способного воздействовать на акцепторные белки-мишени в ОСК. Поиск ремоделирующих пертурбагенов для модификации транскриптомного профиля ГСК, НСК и МССК, применяемых в таргетном БМКП, с целью таргетного воздействия на выявленные ВКСП в ОСК и ОК, может быть проведен с использованием международных баз данных белок-белковых взаимодействий, например, в базе данных Национального института здоровья США. В эту базу данных представлялись результаты исследования транскриптома исходных клеточных культур, низкомолекулярное химическое вещество, которое применялось для модификации транскриптома клеток (пертурбаген), и результаты микрочипового полнотранскриптомного анализа экспрессии генов этих клеток, а также анализ секретома этих транскриптом-модифицированных клеток. В итоге была создана единая международная база данных транскриптомов (4 млн. транскриптов) и пертурбагенов.

Анализируя межклеточные взаимоотношения между различными тсСК и ОК различных раков и ЗНО, можно сделать вывод, что эти СК способны самостоятельно подавить функциональную активность большинства ОК ЗНО (Милькина Е.В. с соавт., 2016).

Исследования авторов настоящего изобретения показали, что механизмом регуляторного воздействия тсСК (ГСК, НСК, МССК) на ОК и ОСК различных типов рака и ЗНО является горизонтальный путь обмена цитоплазмой. Взаимообмен между СК и ОК везикулярно-экзосомальными фракциями цитоплазмы СК, содержащей регуляторные микроРНК, ДНК и белки-лиганды, позволяет осуществить таргетное воздействие на белки-акцепторы ВКСП, расположенные на мембранах ОК и заблокировать эти пути. Взаимообмен цитоплазмой между СК и ОК позволяет также осуществлять горизонтальный перенос информации из СК в ОК и обратно и заблокировать ВКСП, управляющие эффекторными функциями внутри ОК. Подобный горизонтальный перенос информации происходит и между ОК и ОСК.

Было экспериментально продемонстрировано, что при соотношении трех ГСК к одной ОК или ОСК (3:1) в патологическом очаге происходит полное блокирование функционирования ОК и репродукции ОСК за счет регуляторного ингибиторного воздействия этих СК (Брюховецкий И.С. с соавт., 2016). Аналогичные результаты получены и при сокультивировании ОК с НСК и МССК (Брюховецкий А.С., 2016)

Таким образом, наличие разных тсСК и их количество в клеточном препарате является крайне важным и определяющим для создания противоопухолевого эффекта клеточного продукта. Учитывая тот факт, что противоопухолевые БМКП должны содержать СК определенной линии, встает вопрос о количестве таких тсСК и о том, какие из них необходимо использовать в качестве максимальной и разовой дозы противоопухолевого клеточного препарата.

Вопрос о количестве тсСК в препарате для обеспечения его противоопухолевых свойств имеет важное практическое значение для выбора дозы и кратности введения этого клеточного продукта. Авторами сделаны расчеты на основе общеизвестных фактов. Так известно, что в организме любого здорового человека имеется около 500 тысяч ОК (Арчаков А.И., 2010). Это количество является постоянным и поддерживается клетками иммунной системы человека путем регуляторных саногенетических механизмов организма. Считается, что при солидном раке это количество ОК содержит около 1-2% ОСК в различных новообразованиях (Чехонин В.П., 2012). Однако есть точка зрения китайских ученых, что при глиобластоме 96% ОК являются опухолеинициирующими, то есть ОСК (Н. Homing et al., 2015). Количество в 500 тысяч ОК невозможно обнаружить стандартными визуальными методами диагностики и онкопоиска (КТ, МРТ, ПЭТ/КТ, УЗИ, сцинтиграфия и.т.д.), но их наличие можно определить с использованием специфичных онкомаркеров в биологических жидкостях организма человека и иммуногистохимическими методами в тканях организма (Брюховецкий И.С. с соавт., 2016). Очевидно, что применять БМКП с противоопухолевой целью нужно только тогда, когда полностью завершен курс циторедуктивного, цитотоксического и цитостатического лечения ракового пациента и визуализировать ОК у онкологического пациента современными диагностическими методами не представляется возможным (Черных Е.Р. с соавт., 2010). Следовательно, если предположить, что все 100% ОК являются объектом терапевтического воздействия таргетного БМКП, то общая доза тсСК в нем на одно введение должна составлять не менее 1,5×10⁶ тсСК. Хотя на самом деле ГСК, НСК и МССК для борьбы с ОК и ОСК нужны в значительно меньшем количестве, так как при наличии биологического эффекта блокирования эффекторных функций у части ОК и ОСК сработает хорошо известный эффект биологической индукции (пример осеннего листопада, эмбриогенеза) и, следовательно, можно вполне ограничиться меньшей дозой - 1 ×10⁶ тсСК.

В организме взрослого человека количество ГСК составляет около 30000. Они находятся в основном в кровяных депо - в костном мозге, в пейеровых бляшках тонкой кишки, тимусе, лимфатических узлах и селезенке (А.И. Воробьев, А.Н. Смирнов, 2010; А.В. Полевщиков, 2016). При этом в норме общее количество ГСК в ПК составляет около 0,01-0,001% ГСК на 1 литр, а остальные ГСК надежно находятся в кровяных депо. Цикл жизни ГСК самый большой по сравнению с другими клеточными системами - 12 месяцев (Пальцев М.А., 2010). То есть ГСК это самые «медленные» клетки в организме и поэтому они являются системообразующими в производстве, обороте и регуляции клеток крови и других клеток организма онкобольного. Их регуляторные возможности в организме также самые значительные из всех тсСК и регуляторных клеток организма. В организме взрослого мужчины находится около 5,5 литров крови. В 1 литре крови взрослого человека содержится 50 миллиардов кровяных клеток (http://zablugdenivam-net..ru/chelovek/skolko-krobi-v-cheloveke/), из которых 4-9 миллиардов это лейкоциты, т.е. количество лейкоцитов составляет 4000-9000/мкл крови). Лейкоцитов в крови в 500-1000 раз меньше, чем эритроцитов. При мобилизации костного мозга гранулоцитарными колониестимулирующими факторами (Г-КСФ) в ответ на воспаление количество ГСК в лейкоцитах ПК увеличивается до 1,5-2% в течение 3-4 дней, а затем снова возвращается к норме в течение двух дней. Поэтому количество всех собственных ГСК и их регуляторных потомков не в состоянии обеспечить противоопухолевый эффект их воздействия на те 500000 ОК (норма в организме любого человека), которые всегда присутствуют в организме онкобольного даже после комплексного циторедуктивного, цитостатического и цитотоксического лечения.

Содержание МССК в тканях у взрослого человека составляет всего от 0,001 до 0,01% (по данным разных авторов), а количество НСК вообще не превышает 10000 клеток. Однако общее количество МССК (5000000 клеток) превышает долю ГСК (30000 клеток) в организме человека за счет наличия МССК в подкожной и внутренней жировой ткани и ткани каждого из внутренних органов, мышечной ткани, костной и хрящевой ткани. Поэтому, в естественных условиях суммарное количество в организме всех ГСК, НСК и МССК, необходимое для осуществления противоопухолевых эффектов, даже в норме явно недостаточное.

Расчеты были основаны на функционировании только одной линии тсСК в лечении онкопатологии, например, ГСК (Брюховецкий А.С, 2016), НСК (Брюховецкий А.С. с соавт., 2015) или МССК (Аверьянов А.В. с соавт., 2013). Поэтому в реальных условиях поддержания гомеостаза организма при норме и обеспечения противоопухолевого эффекта тсСК на ОК и ОСК общее количество тсСК в соотношении 3:1 явно завышено. В отношении вопроса о сроках и дозах применения клеточного препарата известно, что всего в организме взрослого человека имеется кровяная клеточная масса, состоящая из 275 млрд. клеток, из которых 20-45 млрд. составляют лейкоциты. Учитывая, что средний цикл жизни большинства постоянно регенерирующих клеток крови составляет 100-120 дней, то получатся, что одна ГСК за этот период (3,5-4 месяца) производит в среднем 9 166 клеток крови, из которых 50% составляют эритроциты, которые умирают каждые 100-120 дней. Таким образом, каждые 100 дней происходит утилизация и восстановление одной четвертой части клеток крови и, соответственно, с противоопухолевой целью источниками ГСК должно производиться дочерних ГСК каждые 25-30 дней в количестве 10000 новых клеток. Из этого следует, что ГСК надо применять каждые 25-30 дней, по крайней мере, в течение первых 100 дней противоопухолевого лечения клеточными препаратами. Очевидно, что для онкобольного решение проблемы терапевтического количества СК в организме может быть обеспечено не только за счет увеличения количества ГСК, а также за счет обогащения вводимых препаратов другими тсСК - МССК и (или) НСК.

Обобщая вышеизложенное, можно утверждать, что самой универсальной СК с противоопухолевыми свойствами в клеточном препарате является ГСК, однократная доза которой не должна превышать общую дозу более 0,5 млн. клеток с интервалом применения 25-30 дней. Однако для целей адекватной тканеспецифичной клеточной терапии применение при раках солидных органов и нейроонкологических заболеваниях целесообразно использовать дополнительно донорские ГСК и НСК или аутологичные или донорские МССК, а при солидных раках обогащать БМКП преимущественно донорскими МССК до общего количества СК равное 1,5 млн. клеток на одну интратекальную трансфузию.

Другим важнейшим этапом планирования эффективности противоопухолевой терапии вообще и таргетной клеточной терапии с использованием СК в частности является правильный выбор молекулярной цели в ОК или ОСК неопластического новообразования. Как отмечалось ранее, молекулярными целями таргетной фармакотерапии являются онкоспецифические белки, которые есть в ВКСП ОК, и их блокада приводит к гибели ОК. Однако «убить» или «разрушить» ОСК блокадой ВКСП практически невозможно, так как ОСК обладают фантастическими возможностями приспособления и способны адаптироваться даже к условиям, которые для обычной ОК являются фатальными. Поэтому механизмом КТТ должно стать не уничтожение ОСК, а регуляция и ограничение их эффекторных функций, таких как миграция, пролиферация, деление, репродукция и т.д. Регуляция эффекторных функций в ОСК позволит перевести рак и другие ЗНО из смертельного и острого процесса в хроническое и несмертельное заболевание с редкими рецидивами.

Таким образом, молекулярной целью КТТ могут стать, например, видоспецифичные мембранные акцепторные белки ВКСП, ответственные за эти функции. Однако в ОК и ОСК это могут быть только ВКСП ОСК, непострадавших в результате канцерогенеза. С участием авторов настоящего изобретения было проведено выделение и иммуносепарация ОСК (CD44+) из культуры рака легкого линии A3 и ОСК (CD133+) из культуры клеток МГБ линии U87 и U257 с последующим лизированием этих ОСК и их протеомного анализом. Протеомное картирование 2000 белков в каждом типе ОСК показало, что в них канцерогенез не затронул только десять ВКСП и только один универсальный ВКСП - путь интегринов/фокальной адгезии. Блокирование этого пути в ОСК опухоли будет препятствовать ее репродукции, делению, миграции и пролиферации (Брюховецкий А.С., 2013, 2014) и будет способствовать профилактике рецидива. То есть, молекулярнонацеленное воздействие белков-лигандов, секретируемых тсСК (ГСК, МСК, НСК) с мембранными белками-акцепторами пути интегринов/фокальной адгезии в ОК и ОСК способно обеспечить таргетное блокирование функционирования этого пути в ОСК и ОК, что остановит в этих клетках активные процессы миграции, пролиферации, репродукции. ОСК в неблагоприятных условиях войдет в нулевую фазу клеточного цикла. Таким образом, авторы полагают, что транскриптом-модифицированные тсСК могут и должны стать уникальным инструментом молекулярнонацеленного воздействия на мишени пути интегринов/фокальной адгезии в ОК и ОСК.

Предложенный в данном изобретении БМКП молекулярнонацелен на блокирование функционирования ВКСП интегринов/фокальной адгезии в ОК, и в первую очередь, в ОСК рака и других ЗНО. Как отмечалось ранее, путь интегринов и фокальной адгезии в любой клетке, в том числе в ОК и ОСК, отвечает за процессы пролиферации, деления и миграции клеточной системы в организме. Молекулярно-биологическое блокирование функционирования пути интегринов/фокальной адгезии в ОК и ОСК способно препятствовать репродукции ОСК и пролиферации потомков ОСК, а также предотвратить метастазирование ОК в организме онкобольного и профилактировать рецидивы онкозаболеваний. Таким образом, регуляция и блокирование эффекторных функций деления, миграции и пролиферации в ОСК путем воздействия на ВКСП интегринов/фокальной адгезии ОК является одним из основных путей профилактики новых рецидивов и метастазирования большинства онкозаболеваний.

Правильность и обоснованность выбора молекулярно-биологической цели в ОК и ОСК опосредованно подтверждается работами ряда групп скандинавских ученых, пытавшихся заблокировать этот сигнальный путь в опухоли при МГБ с использованием генетически модифицированных СК, секретирующих цитокины интерлейкинового ряда: IL-1, IL-6, IL-8, IL-23. Секретирование IL-23 нейральными СК было реализовано генно-инженерным путем с использованием вирусных векторов и плазмидий. Секретируемый IL-23 блокировал на мембране ОК акцепторные белки сигнального пути интегринов/фокальной адгезии в ОК, и это приводило к подавлению пролиферации и роста культуры МГБ in vitro и ограничивало рост опухоли в мозге in vivo. К сожалению, генно-инженерные технологии лечения рака еще долго не смогут найти своего потребителя в клинической онкологии, так как приводят к необратимым изменениям генома и могут иметь фатальные последствия в будущем для большинства функций (в том числе, наследственных) всего генома клеток человека. Реализованное в настоящем изобретении получение транскриптом-модифицированных тсСК с заданными свойствами молекулярнонацеленного воздействия на мишени ВКСП в ОК и ОСК может не только стать полноценной заменой генно-инженерных технологий, но обладает преимуществом перед последними в большей емкости экспрессии для терапевтического гена.

Изменение (модификация) транскриптомного профиля экспрессии генов ядра тсСК разными низкомолекулярными химическими веществами (пертурбагенами, способными функционально модифицировать транскриптом, не изменяя структуру генома), позволяет приводить к транзиторному (временному) функциональному изменению профиля экспрессии генов и изменить протеом клетки на несколько часов или несколько суток. Этого времени вполне достаточно, чтобы осуществить регуляторное воздействие на ОСК и ОК. Другими словами, направленная транзиторная модификация профиля экспрессии генов СК позволяет изменить ее секретом в нужном направлении на определенный временной интервал и осуществить требуемое молекулярнонацеленное воздействие на ОК и ОСК.

Для решения задачи создания транскриптом-модифицированных СК в БМКП по настоящему изобретению был использован статистический метод Колмогорова-Смирнова. Он был применен для построения ранжированного (упорядоченного) списка пертурбагенов в соответствии со степенью их воздействия на клетку для изменения ее протеомного профиля и фенотипа. Был разработан алгоритм, основанный на методе Колмогорова-Смирнова и позволяющий автоматизировать построение ранжированных списков пертурбагенов. Создана компьютерная программа, реализующая данный алгоритм и генерирующая ранжированный список воздействий (пертурбагенов) по заданным спискам «активированных» и «подавленных» генов. Созданная программа была применена для выявления веществ, оказывающих максимальное воздействие на ГСК, МССК и НСК и нейрональные прогениторные клетки с целью ремоделирования их протеомов для воздействия на ОСК разных линий опухолей (клеточной линии глиобластомы человека U87 и клеточной линии рака легких A3).

На вход программы подавали два списка проб (соответствующих пробам микрочипа Affymetrix Microarray HG-133A) в формате текстовых файлов. В списках находились названия проб микрочипа HG-133A, соответствующие генам, активность которых должна быть либо увеличена (список UP), либо подавлена (список DOWN) для изменения протеомного профиля клетки. Названия проб чипа Affymetrix Microarray HG-133А были получены с помощью сервиса NetAffx по заданному списку белков. Результатом работы программы явился текстовый файл с упорядоченным списком пертурбагенов, оказывающих воздействие на клетку с целью ремоделирования ее траснкриптома в соответствии с заданным списками UP и DOWN.

Были получены предварительные результаты при обработке данных и были выявлены наборы ядерных, мембранных и внеклеточных белков ГСК, ММСК и НСК), нормализованные сигнальные интенсивности которых больше (список UP), либо меньше (список DOWN), чем в ОСК. Были проведены четыре численных эксперимента, моделирующие изменение траснкриптомного профиля ГСК, ММСК и НСК под воздействием пертурбагенов мембранных, ядерных, внеклеточных и совместно всех указанных типов исследуемых белков. В результате получены четыре файла, содержащие списки воздействий, отсортированные по степени эффективности. Далее приведены первые двадцать строк из каждого файла. Каждое воздействие идентифицируется уникальным номером, по которому можно определить тип воздействующего вещества, его концентрацию и другие параметры.

С биоинформационных позиций был проанализирован сигнальный путь интегрина/фокальной адгезии в ОК и ОСК и указаны участвующие в нем белки, а именно:

1) Ростовые факторы: EGF, FIGF, HGF, IGF1, PDGFA, PDGFB, PGF, PDGFC, PDGFD, VEGFA, VEGFB, VEGFC;

2) Белки внеклеточного матрикса: а) ламинины: LAMA1, LAMA2, LAMA3, LAMA4, LAMA5, LAMC3, LAMB4, LAMB1, LAMB2, LAMB2, LAMC1, LAMC2, б) коллагены: COL1A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL4A1, COL4A2, COL4A4, COL4A5, COL4A6, COL5A1, COL5A1, COL5A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL11A1, C0L11A2, в) фибронектин FN1, хондроадгерин CHAD, олигомерный матриксный протеин СОМР, тенасцины TNC, TNN, TNR, TNXB, интегрин-связьшающий сиалопротеин IBSP, реелин RELN, секретируемый фосфопротеин 1 SPP1, тромбоспинодины THBS1, THBS2, THBS3, THBS4, витронектин VTN и фактор фон Виллебранда VWF;

3) Мембранные белки: а) интегрины: ITGA11, ITGA6, ITGA1, ITGA2, ITG2AB, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA7, ITGA9, ITGAV, ITGA10, ITGA8, ITGB1, ITGB3, ITGB4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, ITGB8, б) кавеолины CAV1, CAV2, CAV3, в) тирозинкиназные рецепторы: EGFR, ERBB2, FLT1, FLT4, IGF1R, KDR, MET, PDGFRA, PDGFRB.

Итак, вся совокупность белков, участвующих в выделенном пути, оказывается естественным образом разбита на три подгруппы, каждая из которых в свою очередь представлена определенными типами белков. Представляется целесообразным уменьшить экспрессию ростовых факторов в нормальных НСК, поскольку они являются цитокинами и, следовательно, могут передавать сигналы непосредственно в ОК и таким образом влиять на развитие и рост раковых клеток.

Цитокины - антиген-неспецифические факторы. Поэтому специфическая диагностика инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний с помощью определения уровня цитокинов невозможна. Но определение их концентрации в крови дает информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток, о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и о прогнозе заболевания. Цитокины регулируют активность гормональной оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники. Например, интерлейкин-1, воздействуя на гипоталамус, усиливает синтез кортиколиберина, что, в свою очередь, повышает выработку адренокортикотропного гормона.

Поскольку таких ростовых факторов несколько, имеет смысл проверить, насколько коррелируют между собой результаты, полученные для каждого из этих белков. Для этого необходимо разработать и применить специальный статистический алгоритм, который бы сравнивал списки воздействий, которые программа выдает в качестве результата, и находил бы общие закономерности.

Ученые из Cedars-Sinai Medical Center (Лос-Анжелес, Калифорния) показали, что НСК, полученные из СК костного мозга, выделяют цитокины, уничтожающие клетки злокачественных опухолей головного мозга и дающие надежную долговременную защиту от рецидивов (http://www.cytspb.rssi.ru/eotk/semenova 27 ru.pdf). Предпосылкой такого влияния, возможно, является способность стволовых и прогениторных нейроклеток, ГСК и МССК продуцировать цитокины с противоопухолевым действием. Так, известно, что мультипотентные нейральные прогениторные клетки человека экспрессируют как провоспалительные, так и супрессорные цитокины (IL-1a, IL-1b, TGF-b1, TGF-b2, TNF-a). Нейральные прогенитроные клетки крыс и мышей также экспрессируют некоторые из них при тех же условиях. НСК in vivo продемонстрировали высокую миграционную способность и супрессивный эффект на пролиферацию клеток глиомы (глиобластомы, медуллобластомы). Введение прогениторных НСК в мозг увеличивало выживаемость животных с глиомой и угнетало развитие опухоли. Более того, генетическая модификация СК терапевтическими цитокинами и лигандами (S-TRAIL, CXCR3) усиливала противоопухолевый эффект и удлиняла срок выживания животных-опухоленосителей. В частности, НСК с трансфицированным геном IL-12, а также нейральные прогениторные клетки, генетически сконструированные к продукции IL-23, имели выраженный противоопухолевый эффект - увеличивали срок выживания животных-носителей внутримозговой и диссерминированной глиомы по сравнению с несекретирующими НСК.

Таким образом, для достижения поставленной цели необходимо подобрать набор веществ, которые при воздействии на НСК, ГСК и МССК обеспечат увеличение производства цитокинов, необходимых для воздействия на сигнальный путь интегринов/фокальной адгезии ОК, одновременно уменьшив концентрацию факторов роста для ухудшения ее роста и развития. Для выявления наиболее эффективных воздействий была проведена серия экспериментов с помощью вышеуказанной программы. Up_tag_list был сформирован из пробсетов, соответствующих интересующему нас цитокину IL-23. В качестве же Down_tag_list последовательно рассматривались отдельные пробы из множества пробсетов, соответствующих определенному фактору роста или рецептору (всего 12 генов). В геномной лаборатории было произведено определение геномного профиля НСК и глиобластомы U87 и U251. Из результатов исследования следует, что экспрессия шести из рассматриваемых генов (PDGFB, PDGFD, PDGFA, EGF, FIGF, IGF1) низкая даже в контрольных клетках, поэтому уменьшать их экспрессию нецелесообразно. Уровень экспрессии генов HGF, PGF и PDGFA средний, поэтому понижение их экспрессии необязательно. Оставшиеся гены (VEGFA, VEGFC, PDGFC, VEGFB) обладают высоким уровнем экспрессии и поскольку они являются факторами роста (цитокинами), то желательно уменьшить их уровень экспрессии. В табл. 2 приведены данные, на основании которых выбирались факторы роста с наибольшим уровнем экспрессии.

Пороговое значение, по которому определялись вещества с высокой экспрессией генов, было предложено лабораторией «Биоклиникум» и было взято равным 256.

Действительно, если рассмотреть экспрессии всех исследованных генов, среднее значение в логарифмической шкале будет равно 2⁸=256.

Далее была использована программа, строящая упорядоченный список пертурбагенов для каждого фактора роста. В результате были получены списки веществ, воздействие которых должно повысить содержание IL-23 и понизить содержание каждого фактора роста.

Было построено соответствие между наиболее эффективными воздействиями для каждого фактора роста и его местом в списке для остальных. В результате анализа полученного массива данных выявлены вещества, чьи позиции почти во всех списках находятся выше определенного порогового значения (50 или 100) как номера позиций веществ, имеющих достаточно сильную степень воздействия. В случае, если среди первых n=50, 10, … файлов не находилось совпадения по номеру воздействия (т.е. для влияния на соответствующий фактор роста данное вещество не подходит), соответствующий счетчик увеличивался на единицу. Таким образом, наиболее эффективные вещества должны иметь значение этого счетчика минимальным.

В результате работы программы были выявлены вещества, которые присутствуют в списке первых 50 пертурбагенов, оказывающих необходимое воздействие - повышают экспрессию IL-23 и понижают экспрессию соответствующего фактора роста. Для контроля также были проведены расчеты для списка факторов роста со средним уровнем экспрессии. В результате сравнения полученных результатов были выделены вещества, наиболее вероятно оказывающие нужный эффект (табл. 3).

Следует еще раз отметить, что под пертурбагенами в настоящем описании понимаются низкомолекулярные химические вещества и соединения, которые способны изменить транскриптомный профиль в заданном направлении и обработка которыми ГСК, НСК и ММСК в течении заданного времени и в заданной концентрации способна обеспечить секрецию этими тсСК требуемых белков-лигандов, способных блокировать путь интегринов и клеточной адгезии в ОСК. Путем многократных повторов изучения полнотранскриптомной экспрессии генов различных линий ГСК, НСК и МССК, полученных от разных доноров, количество пертурбагенов, способных воздействовать на путь интегринов/фокальной адгезии при различных типах рака и злокачественных опухолей был ограничен преимущественно этими четырьмя наименованиями.

Таким образом, основной технический результат, достигаемый в настоящем изобретении, заключается в обеспечении противоопухолевой эффективности предложенного препарата путем молекулярнонацеленного воздействования на ВКСП интегринов/фокальной адгезии в ОК и ОСК для блокирования их функций инвазии, миграции, пролиферации и деления.

На фиг. 1 показана средняя продолжительность жизни крыс в эксперименте применения нативньгх ГСК и ГСК, транскриптом которых модифицирован пертубагеном, используемым в настоящем изобретении;

на фиг. 2 - объемы опухолеьгх узлов у крыс в эксперименте применения нативньгх ГСК и ГСК, транскриптом которых модифицирован пертубагеном, используемым в настоящем изобретении

Для иллюстрации эффективности применения транскриптом-модифицирования тсСК в противоопухолевом клеточном препарате можно привести результаты эксперимента по применению нативньгх ГСК и ГСК с модифицированным транскриптомом. Эксперимент был проведен на моделях глиобластомы линии U87 in vivo. Результаты сопоставления полученных данных свидетельствуют о выраженном противоопухолевом эффекте культур ГСК, предобработанньгх пертурбагеном в виде ацетилсалициловой кислоты. Механизмом действия предложенного транскриптом-модифицированного таргетного БМКП составляет блокада сигнальных путей интегринов/фокальной адгезии, которые остаются сохранными в процессе трансформации нормальной тсСК в ОСК и остаются доступными для циторегуляторных воздействий. Сигнальный путь фокальной адгезии начинается с передачи сигнала в клетку ростовыми факторами (EGF, FIGF, HGF, IGF1, PDGFA, PDGFB, PGF, PDGFC, PDGFD, VEGFA, VEGFB, VEGFC) и белками внеклеточного матрикса (ламининами, фибронектином FN1, хондроадгерином CHAD, олигомерным матриксным протеином СОМР, интегрин-связывающим сиалопротеином IBSP, тенасцинами TNC, TNN, TNR, TNXB, реелином, секретируемым фосфопротеином 1, тромбоспинодинами THBS1, THBS2, THBS3, THBS4, витронектином и фактором фон Виллебранда).

Способность ГСК подавлять рост опухолей in vitro увеличивается по мере увеличения соотношения числа ОК к ГСК от 1:1 до 1:3. На этой основе был разработан эксперимент, предусматривающий имплантацию в мозг иммунодефицитных животных (крыс) клеток следующиего состава:

- группа "контроль" - имплантация в мозг 100 тысяч клеток глиобластомы линии U87 иммунофенотипа CD133+, нестин+, CD44-;

- группа «клетки» - имплантация 400 тысяч клеток (включающих 100 тысяч клеток глиобластомы линии U87 иммунофенотипа CD133+, нестин+ СВ44- и 300 тысяч CD34+ ГСК);

- группа «культура ГСК» - имплантация 400 тысяч клеток (включающи×100 тысяч клеток глиобластомы линии U87 иммунофенотипа CD133+, нестин+, СВ44- и 300 тысяч клеток, предобработанных пертурбагеном - ацетилсалициловой кислотой CD34+ ГСК).

Исследование выполнено на 45 животных породы Вистар массой 220-250 г к началу эксперимента (N=40). С целью иммунодепрсессии все животные в течение 5 дней получали 0,5 мл дексаметазона в/м в сочетании с общим облучение 2 Гр (суммарная доза 10 гр). Введение клеток произведено путем стереотаксической имплантации в головной мозг с использованием установки Harvard Apparatus (Lab Standard). Операцию проводили в условиях общей анестезии. Клетки вводили с помощью гамильтоновского шприца в 5 мкл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM). Содержание и уход за животными осуществлялся в соответствии с требованиями GLP и «Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным». Изучали среднюю продолжительность жизни крыс и размер опухоли. Динамику развития опухоли отслеживали морфологически.

Как показано на фиг. 1, средняя продолжительность жизни животных группы «культура ГСК» составила 42,1±12,3 дня, что больше подобного показателя в группе контролен, но уступает таковой в группе «клетки» (фиг. 1). Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, N=15 по каждой точке. Знаками * и ** указаны достоверные различия в сравнении с контролем.

Крысы групп «культура ГСК» и «клетки» длительно не обнаруживали симптомов заболевания, сохраняли активность, интересовались событиями в клетке и за ее пределами, охотно принимали еду, пили воду. При выкладывании на поверхность стола координированно и целенаправленно передвигались, обнюхивали новые предметы. У крыс группы "контроль", напротив, в начальные дни эксперимента отмечено усиление груминга (лизание шерсти, умывание, почесывание), что свидетельствовало о нарастании напряжения и дискомфорта. У некоторых животных отмечалось появление птоза и экзофтальма на стороне опухоли, угнетение рефлексов на переворачивание, дискоординация между конечностями, появление манежных движений, заторможенность, отсутствие реакции на прикосновение к вибрисам, появление судорожных подергиваний в мышцах, повышение мышечного тонуса в контралатеральных опухоли конечностях. При нарастании симптоматики до глубокой комы животные выводились из эксперимента. Данные морфометрии опухолевых узлов представлены на фиг. 2. Данные представленны в виде средних значений ± стандартное отклонение, N=15 для каждой точки.

На внешней стороне плазматической мембраны передача сигнала происходит за счет интегринов, кавеолинов и тирозин-киназных рецепторов (EGFR, ERBB2, FLT1, FLT4, IGF1R, KDR, MET, PDGFRA, PDGFRB). Этот набор белковых мишеней позволяет таргетно воздействовать на процессы адгезии ОСК. Модификация транскриптомного профиля ГСК в отношении продукции ИЛ-23 и других лигандов активизирует акцепторные белки клеточной поверхности сигнальных путей интегринов и фокальной адгезии в ОСК глиобластомы линии U87.

Таким образом, клеточными компонентами предложенного БМКП являются нативные ГСК, а также НСК и/или МССК, предобработанные раствором одного из четырех пертурбагенов (раствор иодида пропидия, ацетилсалициловой кислоты, трихостатина А, никлозамида) в требуемой концентрации и нужной временной экспозиции (табл. 3) для обеспечения молекулярнонацеленного воздействия на ВКСП интегринов/фокальной адгезии в ОК и ОСК различных типах рака с целью блокирования их функций инвазии, миграции, пролиферации и деления.

Что касается количества СК и основных пропорций клеточных элементов в таргетном БМКП, то это количество касается в первую очередь количества нативньгх и предобработанных пертурбагенами тсСК (ГСК, НСК, МССК). Обязательными противоопухолевыми клеточными системами или системами прямого воздействия на опухолевый очаг в организме человека представляются именно ГСК (Брюховецкий А.С., 2005-2016), так как они уже получили свой вектор дифференцировки и обладают уникальными регуляторными возможностями.

Известно, что при пересадке ГСК в различные здоровые органы (почки, мозг, печень и т.д.) не наблюдалась их дифференцировка в специализированные клетки (кардиомиоциты, миоциты и клетки кожи), а трансплантация клеток-предшественников гемопоэза в здоровое сердце не приводила к формированию нейронов или секреторных клеток кишечника. Локальная дифференцировка in situ, как правило, контролировалась «сигналами» микроокружения. Ограниченные клинические наблюдения также подтвердили отсутствие аномалий дифференцировки СК в трансплантате. В то же время ГСК СД 34+ имели направленную миграцию к зонам повреждения в головном мозге (Чехонин В.П. с соавт., 2005; Брюховецкий И.С. с соавт., 2014), как и НСК (Abody K.S., Braun A., Rainov, 2000) и МССК (Аверьянов А.В. с соавт, 2014).

Трансплантированные клетки формировали кластеры ГСК и гемопоэтических прогениторных клеток в ткани органа (Ono K. et al., 1999). Этот феномен может быть ключевым не только в решении вопроса регенерации поврежденных органов и тканей, но и в разработке и создании противоопухолевых клеточных препаратов на основе ГСК и МССК. В практике клинического применения трансплантации костного мозга терапия клеточными препаратами ГСК при гемато-онкологических заболеваниях применяется в виде трансплантации костного мозга или ГСК используют в составе очищенного лейконцентрата (ЛК), полученного из нативного костного мозга или из лейкоферезного продукта мобилизованных в ПК мононуклеаров костного мозга человека.

Стандартная концентрация ГСК (CD34+CD133+) в лейкоконцентрате составляет 1-2% от общего количества всех клеток в ЛК. Изолированное применение только очищенных ГСК (CD34+CD133+CD45+) для восстановления нарушенного гемопоэза после химиотерапии или лучевой терапии при трансплантации костного мозга оказалось абсолютно неэффективным, и все больные, получавшие только очищенные ГСК (CD34+CD133+), умирали, так как эти клетки не приживались в костном мозге и чистая культура клеток ГСК не обеспечивала восстановление гемопоэза (Blood Stem Cell Transplantation, edited by J.Reiffers, J.M. Goldman, J.O. Armitage, 1998). Применение ГСК в ЛК МНК костного мозга позволяет применять их в лечении различных онкологических больных - использовать для трансплантации костного мозга, демонстрировать отчетливые противоопухолевые свойства, восстанавливать нарушенный гемопоэз после курса химиотерапии или лучевой терапии, участвовать в реабилитации онкологических больных

Исследования показали, что эффективность мобилизации ГСК (CD34+) в ПК у больных с неонкологическими заболеваниями достаточно высокая (до 95,1%). Хорошо известно, что в условиях спокойного, неповрежденного гемопоэза в ПК человека обязательно циркулируют ГСК, однако, их концентрация столь ничтожна (менее 0,01%), что делает их детальное изучение или, тем более, использование для целей трансплантации практически невозможным. Выход ГСК из центральных органов гемопоэза (костный мозг) наблюдается после травмирования гемопоэза (чаще всего, как результат химиотерапии), а также под действием колониестимулирующих факторов. В клинике наибольшее распространение получили Г-КСФ) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор. Под действием этих факторов концентрация ГСК и клеток-предшественников крови возрастает в 100-1000 раз, что позволяет собрать эти клетки и использовать для трансплантации в клинике. Сбор ГСК в этих случаях преимущественно осуществлялся для последующего восстановления нарушенного гемопоэза после высокодозной химиотерапии. У онкологических больных, как следствие предшествовавшей химиотерапии, костный мозг является к моменту проведения мобилизации в определенном смысле «истощенным», и эффективные мобилизации СК (более 20 клеток в мкл крови) достигались не во всех случаях. Как правило, набрать необходимое для трансплантации количество клеток (2×10⁶ клеток/кг) удавалось только за 2-3 сеанса лейкоцитофереза. Это, по-видимому, связано с тем, что мобилизованные МНК костного мозга являются важной частью костно-мозговой ниши, в которой располагаются ГСК, и МССК в костном мозге и клетки микроокружения даже в ПК сопровождают ГСК и имеют важнейшее значение в поддержании активности и функциональности ГСК в ПК. ГСК и клетки их микроокружения при внутривенном, внутриартериальном или интратекальном введении человеку движутся в биологических жидкостях организма в виде организованного кластера и клетки естественного микроокружения ГСК обеспечивают активность и системную функциональность ГСК. В этом отношении применение ГСК и при других нозологических заболеваниях целесообразно использовать совместно с клетками их ближайшего микроокружения (Брюховецкий А.С., 2013). Не до конца ясно, какие именно клетки микроокружения являются определяющими в функциональной активности ГСК, поэтому в предложенном БМКП использован весь мононуклеарный кластер мобилизованной крови.

Объем ГСК, содержащихся в предложенном БМКП, не должен превышать 10% от всего максимального объема ГСК, содержащегося в организме человека, то есть ГСК, дополнительно введенное в организм однократно, не может превышать 90000 клеток. Большее количество ГСК может нарушить репаративные процессы кроветворения в организме. Поэтому количество ГСК в одной дозе должно быть не более 75000-90000 ГСК (2% от общего количества клеток ЛК). А недостающий объем противоопухолевых СК (до 1,5 млн. для блокирования эффекторных функций ОК и ОСК может быть восполнен другими клеточными системами (МССК и НСК) в зависимости от формы онкозаболевания.

Таким образом, инновационное решение проблемы создания сбалансированного противоопухолевого таргетного БМКП заключается в получении БМКП, состоящего из ГСК в количестве не более 90000-100000 клеток, содержащихся в ЛК в виде МНК (общее количество около 5-6 млн.) на однократное введение, с добавлением к ним донорских или аутологичных линий НСК и/или МССК (в количестве до 1000000 клеток), предобработанных пертурбагенами в нужной концентрации и временной экспозиции, и вспомогательного вещества в виде биологически стабильной и стерильной трансфузионной среды.

Механизм действия предложенного БМКП состоит в том, что ГСК, введенные в организм пациента (в кровь, лимфу, спинно-мозговую жидкость) вместе со всем кластером своего микроокружения (МНК и предобработанные МССК и/или НСК) через ткани мигрируют в направлении опухоли, начинают вторгаться в ее ткань, прилипают к ОК и ОСК и сопровождают ОК, «оседлав, подобно наезднику», или по типу «inpiggy-backfashion» (Abody K.S., Braun A., Rainov, 2000). Данное явление наблюдалось авторами изобретения в процессе взаимодействия ГСК и ОК, ГСК и МССК с клетками глиобластомы. В литературе подобные функции ГСК были найдены в зоне ишемического инсульта (M. Chopp et al., 2016). Более того, вероятно целесообразно говорить не только, и не столько о высокой подвижности ГСК к опухолевым клеткам МГБ, а скорее об их высокой взаимной подвижности по отношению друг к другу. В этой связи допустимо предположить, что в ответ на гипоксическое поражение вещества мозга растущей опухолью или прогрессирующей ишемией, с одной стороны, происходит запуск процессов направленной миграции СК, а с другой стороны, активизируется миграция клеток глиобластомы в направлении участков ишемии. Следуя этой логике, не лишенным смысла представляется рассмотрение процессов инвазивного роста как результата взаимодействия различных типов СК и ОК в условиях гипоксически прекондиционированной среды. Как было показано в ходе предшествующих экспериментов, адгезируя к клеткам глиальных опухолей, ГСК обмениваются с ними цитоплазматической меткой, что проявляется накоплением флуоресцентного красителя, неразрывно связанного с белками цитоплазмы ГСК в клетках глиомы (Брюховецкий И.С., Мищенко П.В., Толок Е.В., 2014). Было показано, что этот процесс сопровождается некоторым угнетением жизнедеятельности ОК. Детальное изучение межклеточного взаимодействия свидетельствует о высокой динамичности этого процесса «горизонтального переноса информации». В ходе эксперимента при взаимодействии СК и ОК наблюдалось два принципиально противоположных эффекта. В первом случае клетки рака легкого преимущественно накапливают флуоресцентную метку, неразрывно связанную с белками цитоплазмы, привнесенную из ГСК, что вероятно является одним из механизмов противоопухолевого действия этого типа клеток. Данный механизм и был использован нами при создании противоопухолевых биопрепаратов на основе тсСК. Во втором случае, при культивировании ГСК с клетками линии U87 глиобластомы наблюдается перенос цитоплазматической метки из ОК в ГСК. При этом важно, что к 96 часу после начала эксперимента в сокультуре ГСК с клетками глиобластомы практически не остается СК, позитивных только в отношении одного из используемых красителей, что может говорить о рекрутировании клеток этого типа в неопластический процесс. В этой связи обнаруженные эффекты трансфера флуоресцентной метки, неразрывно связанной с белками цитоплазмы, могут быть способом переноса инвазивного молекулярного фенотипа как между различными типами ОК, так и из ОК в нормальные СК.

Таким образом, результаты проведенного эксперимента позволили сделать следующие важные выводы для создания БМКП по настоящему изобретению -миграционная активность ГСК, НСК И МССК в отношении клеток глиальной опухоли линии U87 превосходит их миграционные возможности в отношении ОК других типов; ГСК, НСК и МССК обладают способностью адгезировать к поверхности ОК клеток различных линий, однако эта способность особенно ярко выражена в отношении клеток глиобластомы; в процессе межклеточного взаимодействия наблюдается перенос части цитоплазмы из ГСК в ОК и наоборот. Поэтому теоретически верно, что чем большее количество тсСК будет в БМКП, тем больше шансов имеется на подавление активности онкопатологической клетки, но наличие большого количества только ГСК имеет и отрицательные последствия, описанные выше. Поэтому наличие незначительной части ГСК в БМКП может быть компенсировано наличием в препарате предобработанных пертурбагенами МССК и/или НСК, и тем гораздо быстрее произойдет горизонтальный обмен регуляторной информацией между ГСК, НСК и МССК и патологической ОК и это завершится насыщением цитоплазмы ОК регуляторными веществами СК. Сочетание аутологичных или донорских ГСК с донорскими МССК и НСК, предобработанными пертурбагенами, способно стать решением проблемы недостаточной эффективности терапий только аутологичными клеточными системами. Наличие в БМКП транскриптом-модифицированных МССК и НСК усилит противоопухолевый потенциал препарата и мобилизует реконструктивно-восстановительные возможности репарации поврежденных тканей и органов человека.

Роль НСК в подавлении пролиферативной активности ОК известна. Ученые из Institute of Bioengineering and Nanotechnology, IBN (Сингапур) открыли, что НСК обладают врожденной способностью выбирать своей мишенью ОК за пределами центральной нервной системы. Группа исследователей во главе с доктором Shu Wang установили, что НСК, полученные из человеческих индуцированных плюрипотентных СК, могут быть использованы для лечения рака молочной железы. Эффективность НСК, ведущих свое происхождение от клеток центральной нервной системы, в лечении опухолей головного мозга уже исследована. Работа ученых из IBN впервые демонстрирует, что мишенями полученных таким образом НСК могут быть как первичные, так и вторичные опухоли за пределами центральной нервной системы (www.cellexperts.ru). Поэтому использование НСК в предложенном БМКП также научно обосновано.

Изобретение позволяет применять предложенный БМКП «ОнкоКомб» как терапевтическое и профилактическое противоопухолевое средство выбора при реабилитации онкологических больных после лучевой терапии и химиотерапии, а также для улучшения качества жизни онкологических и соматически ослабленных больных и продления их жизни.

Получение и криоконсервация компонента А для предложенного БМКП «ОнкоКомб» Мобилизация ГСК в ПК. С целью увеличения количества СК в ПК донор или пациент получает 8 инъекций Г-КСФ подкожно с интервалом 10-12 часов в течение 4-5 дней. Г-КСФ представляет собой медицинский препарат, полученный путем генной инженерии, и является абсолютным аналогом человеческого фактора. В первые три дня доза препарата составляет 2,5 мкг/кг, в последний день доза удваивается. Ежедневно производят общий анализ крови и на 4-5 день делается УЗИ брюшной полости и фиброгастроскопия.

Сбор ГСК и клеток-предшественников гемопоэза. Сбор осуществляют на 5 день от начала стимуляции Г-КСФ на сепараторе крови COBE-Spectra с использованием одноразовой системы для сепарации и стандартных растворов. Длительность процедуры 3-4 часа в зависимости от скорости процедуры, веса донора и параметров анализа крови.

Процедура проводится путем забора крови из одной вены, обработки ее внутри сепаратора, забора определенного объема СК и возврата остальных компонентов крови донору через другую вену. Венозный доступ осуществляется путем пункции 2-х периферических вен или через 2-х просветный центральный катетер, установленный в подключичную вену на время проведения сеанса. Средний объем собранного материала 300-400 мл. Собранный материал оценивают по двум параметрам - по общему количеству ядерных клеток в сепарате и по количеству CD34⁺клеток на килограмм веса больного. Ядерные клетки в сепарате определяются путем подсчета в камере Горяева до проведения каких-либо манипуляций. Процент CD34⁺клеток в клеточной суспензии, полученной в ходе цитофереза, определяют методом проточной цитофлуориметрии.

Определение периферических СК и клеток-прогениторов гемопоэза. Установление субпопуляционного состава CD34+ клеток проводится цитофлуориметрически с применением метода тройной метки (одновременная окраска клеток антителами к 3 разным антигенам, нагруженным различными флуорохромными красителями).

Стандартизация компонента «А». Определение количества клеток-предшественниц проводится цитофлуориметрически в прямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Проводится метод двойной метки с одновременным окрашиванием клеточного субстрата моноклональными антителами к антигену CD34+ как основному маркеру клеток пула ГКС и к молекуле CD45-, лейкоцитарному антигену, определяющему ГСК. Подобная методика позволяет сразу рассчитать соотношение количества CD34+ клеток и всех ГСК (CD45+) в материале. Для оценки уровней неспецифического связывания часть клеток окрашивают изотипическими контролями. В качестве изотипических контролей стандартно применяются мышиные иммуноглобулины IgG1 изотипа (IgG1), меченные красителями, аналогичными метке используемых моноклональных антител (РЕ, FITC, РегСР).

Подготовка клеточных проб. Перед постановкой реакции клетки ПК и цитоферезного продукта освобождают от примеси эритроцитов путем стандартной процедуры лизиса и последующей отмывки в ЗФР-БСА центрифугированием при 1000 g в течение 5 минут. ЗФР-БСА может быть заменен средой Хенкса или 199.

Методика лизиса эритроцитов

1. Добавить 2 мл лизирующего раствора к 0,2-0,5 мл клеточного осадка, перемешать, инкубировать до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (лаковым).

2. Отмыть клетки два раза средой 199 при центрифугировании (1000 g, 5-7 мин).

С выделенными клетками проводят прямую РИФ в 96-луночном планшете, при этом для определения количества клеток в любом материале используется панель из трех лунок - 1) неокрашенные клетки; 2) клетки, окрашенные изотопическими контролями с меткой, соответствующей метке использованных моноклональных антител (МКА); 3) клетки, окрашенные одновременно МКА к антигенам CD34 и CD45.

Следует обратить особое внимание, что МКА к CD34+ предпочтительнее использовать с фикоэритриновой (РЕ) или перидининхлорофиловой (PerCP) метками. Данные флуорохромы имеют более высокий уровень специфического сигнала по сравнению с флуоресцеинизотиоционатом (FITC).

Для определения количества CD34+ клеток оптимальными являются антитела к антигену CD34 клона НРСА-2 (8G12), изотипа IgG1.

Таким образом, стандартная панель имеет вид

1. контроль IgG1 РЕ + контроль IgG1 FITC

2. контроль IgG1 РЕ + МКА к CD45 FITC

3. МКА к CD34 РЕ (НРСА-2) + МКА к CD45 FITC

Постановка РИФ

1. В лунки вносят клетки в количестве не менее 500000 на лунку.

2. Далее в каждую лунку вносят коктейль антител в соответствии с панелью и аккуратно ресуспендируют пипеткой. Каждое МКА берут в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем МКА в лунке - 20 мкл.

3. Клетки инкубируют с антителами в течение 30 минут при 4°С (нижняя полка обычного холодильника).

4. По окончании времени инкубации клетки дважды отмывают от не связавшихся антител путем центрифугирования в течение 5-7 минут при 1000 g.

5. Клетки переносят в специальные пластиковые пробирки для счета на проточном цитометре.

6. Объем клеточной суспензии в каждой пробирке доводят до 200-500 мкл путем добавления к клеткам ЗФР-БСА.

Счет должен быть осуществлен сразу после постановки реакции.

Счет и запись на проточном цитофлуориметре. Оценку реакции проводят на проточном 5-параметровом цитометре. Данная схема применима для проточного цитофлуориметра любой конфигурации. CD34+ клетки в ПК представляют собой малую клеточную популяцию. Даже в условиях предварительной стимуляции кроветворения максимальный процент данных клеток составляет 1-3%. Поэтому при подсчете данных клеток в каждой анализируемой пробе следует накапливать не менее 20000 клеточных событий.

Сбор и анализ клеток осуществляется в гейте CD45+ клеток, который включает все ГСК. В данном контексте гейт подразумевает область накопления событий, ограниченную определенными параметрами. В данном случае SSC/ FL-1 (CD45 FITC). То есть, по оси абсцисс (FL-1) на точечной цитограмме будут видны все CD45+ события. По оси ординат (параметр SSC- боковое светорассеяние) клеточные события будут расположены в соответствии с их гранулярностью (цитометрический, а не морфологический термин). Подсчет абсолютного числа CD34+ клеток в 1 мкл крови и цитоконцентрата проводили на основании числа лейкоцитов в гемограмме на день исследования.

Принцип определения CD34+ клеток в гемопоэтической ткани. Запись проб

1. Выбор области анализа - гейта. В приборе открыто меню записи клеточных образцов Acquisition. На первом этапе в режиме Setup (режим просмотра клеточного образца без записи) просматриваются пробы №1 (IgG1 РЕ + IgG1 FITC) и №2 (IgG1 РЕ + CD45 FITC) и выявляются CD45+ события. Данные события расположены правее значений 10¹ (среднее пороговое значение уровня специфического сигнала для флуоресцеина FITC) по оси абсцисс - FL-1 (СБ45+ клетки) и достаточно четко визуализируются по сравнению с контрольной пробой №1. По пробе №1 ограничивается вся область, расположенная правее основной клеточной плотности - гейт, включающий только CD45+ события в пробе №2 и содержащая минимальное количество клеточных событий в пробе №1.

2. Прибор переводится в режим записи образцов (normal), и проба №1 собирается и записывается на 20000 клеточных событий без гейта (вся клеточная популяция). Запись данной пробы в гейте не имеет смысла, так как в ней отсутствуют МКА к CD45 антигену. Как показано выше, данная проба необходима для правильного выбора гейта, содержащего только CD45+ события.

3. Пробы №2 и №3 собираются и записываются в гейте CD45+. Данный гейт идентичен для этих проб (то есть изменения параметров гейта в процессе сбора не происходит). Минимальное количество клеточных событий - 20000 для каждой пробы.

Анализ записанных проб

1. Переходим в меню анализа записанных образцов Analysis. Открываем цитограмму (dot-plot) пробы №2 в параметрах SSC/FL-2, в гейте R1 - CD45+ (гейт выбран нами ранее в момент записи сбора и автоматически перенесен в режим анализа).

При этом по оси ординат будет отражен параметр SSC - гранулярность событий, попавших в анализируемый гейт, а по оси абсцисс FL-2 - детектор, отражающий уровни неспецифического связывания для фикоэритринового красителя, выявляемые анителами к иммуноглобулинам мыши IgG1 РЕ.

2. По данной цитограмме устанавливается контрольный маркер таким образом, чтобы в правом нижнем квадранте практически не оказалось клеточных событий. В среднем, для вертикальной планки маркера, значения будут около 130 (правее 10²), а для горизонтальной планки маркера средние значения составят 60, что соответствует понятию SSC-low. То есть клетки с минимальным количеством клеточных включений. Таким образом, уровни неспецифического связывания будут равны или близки к нулю.

3. Автоматически переходим к пробе №3. Все показания прибора, принятые для второй пробы, сохраняются. То есть, цитограмма открыта в параметрах SSC/FL-2, сохранен гейт, выбранный ранее при сборе по CD45+ клеточным событиям, и сохранены значения контрольного маркера, установленного по пробе №2. Только на данной цитограмме по оси абсцисс будут отражены не уровни неспецифического связывания, как во второй пробе, а специфичные CD34+ события. Процент CD34+ клеток выводится прибором автоматически.

Криоконсервирование СК крови и клеток-предшественников гемопоэза. Традиционный метод криоконсервирования заключается в добавлении диметисульфоксида (ДМСО) к клеточной суспензии в конечной концентрации 10% и стандартного замораживании на 1 градус в минуту до -80°С или -120°С с использованием стандартных программ электронного программного замораживателя и хранением в жидком азоте или парах жидкого азота.

Выделение клеточной фракции. Сепарированные клетки концентрируются путем центрифугирования при скорости вращения центрифуги 2000 оборотов в минуту в течение 10 мин при +18°С. С помощью ручного плазмоэкстрактора из контейнера максимально удаляется плазма, клетки остаются в объеме 40-60 мл.

Добавление криопротектора. В качестве криопротектора кроветворных клеток используется высокоочищенный ДМСО. К полученным клеткам добавляют при постоянном перемешивании равный объем полиглюкина с ДМСО. Смешивание ДМСО с полиглюкином происходит по типу экзотермической реакции с выделением умеренного количества тепла. Концентрация ДМСО в полиглюкине - 10-12%. Таким образом, его конечная концентрация в замораживаемом материале составит 5-6%.

Применение полиглюкина позволило снизить количество ДМСО вдвое, до 5-6% конечной концентрации, так как полиглюкин обладает следующими свойствами: - во-первых, способностью дезагрегировать клетки и тем самым улучшать проникновение криофилактика в клетки, во-вторых, полиглюкин (6% декстран) сам по себе является криофилактиком.

Подсчет количества криоконсервируемых клеток. На следующем этапе обязательно производят подсчет ядросодержащих клеток, а также CD34+ клеток, подлежащих заморозке.

Выбор оптимального объема замораживаемого материала. При криоконсервировании для создания наилучших условий важное значение имеют соотношение объема пластикового контейнера к объему замораживаемого в нем материала и концентрация замораживаемых клеток. Как было установлено, оптимальная концентрация замораживаемых клеток составляет (40-100)×10⁶ клеток в мл.

Замораживание ГСК и мобилизованных МНК. В зависимости от конечного объема замораживаемого материала выбирается количество полимерных ампул (20-25) для глубокого программного замораживания. Далее клеточную взвесь переводят в эти термостойкие пластиковые пробирки.

В настоящее время методики криоконсервирования клеточных препаратов предполагают использование электронных программных замораживателей. Для замораживания ампул с клеточной взвесью их помещают в электронный программный замораживатель. Скорость охлаждения биоматериала при температуре от 0°С до -40°С составляет 1,1 градус в минуту, а затем 1 градус в минуту до -80°С или -120°С. После завершения цикла программного электронного замораживания пробирки с замороженным материалом переносят в хранилище для длительного хранения. Затем пробирки с замораживаемым материалом помещают в пары жидкого азота при температуре от -165 до -170°С, где они будут находиться в жидком азоте или его парах до использования.

В этой методике учтены и реализованы основные требования, предъявляемые к биоматериалу, подвергнутому криоконсервированию, а именно максимальное сохранение жизнеспособности СК, минимальный объем (100-120 мл) замораживаемого материала при максимальном количестве содержащихся клеток (до 100×10⁶/мл), для ПК минимальный объем 50-60 мл; минимальное количество объема аутотрансплантата. Преимуществами криоконсервирования в парах жидкого азотаявляются большая безопасность хранения пробирок с клеточным биоматериалом; значительно меньший расход азота.

Получение МССК для компонента А осуществляют по такой же методике, которая подробно описана ниже применительно к получению компонента В (см. ниже подразделы "Выделение и культивирование МССК", "Пример выделения МССК из костного мозга" и "Подготовка материала МССК".

Получение и криоконсервация компонента Б предложенного БМКП «ОнкоКомб»

Способ выделения и культивирования НСК CD133+из обонятельной выстилки носа. Доноры должны быть предварительно обследованы на инфекции ВИЧ 1 и ВИЧ 2, синдром иммунодефицита; сифилис, гепатиты В и С, острые инфекционные заболевания. Методика и протокол получения НСК описан в работах Zhang X. et al., (2004-2006). Ткань обонятельной выстилки носа получают от и обрабатывают по стандартному культуральному протоколу СТ. Marshal et al. (2005-2006). В отечественной практике используется модификации метода, предложенная проф. И.В. Викторовым (2012).

Для получения здоровых НСК берут ткань обонятельной выстилки носа путем эндоскопической резекции куска слизистой (10×10 мм) верхних хоан носа донора. Полученную ткань доставляют в лабораторию в охлажденном растворе Хенкса без Са²⁺и Mg²⁺(HBSS), содержащем антибиотики и антимикотики (1:100; Gibco). Время доставки не превышет 2 ч. После повторной промывки в том же растворе из ткани опухоли удаляют кровеносные сосуды, после чего ткань измельчают и инкубировают в течение 40 мин при 36,5°С в растворе трипсина/ЭДТА 025%, приготовленном на 0.01 М фосфатном буфере (PBS, рН 7,4). Действие ферментов блокируют средой DMEM (Gibco), содержащей 3% сыворотки, ткань промывают в трех сменах сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS; Hanks' balanced salt solution, Sigma) и диссоциируют повторным пипетированием в питательной среде. Состав среды: минимальная среда Игла (MEM, Sigma) 90%, эмбриональная сыворотка телят (Fetal bovine serum. FBS.Gibco.Ivitrogen), глюкоза 0.8%, глутамин 2 мМ (Gibco), добавок В27 (Sigma), HEPES 20 мМ, ростовые факторы (только для первичных культур) фактор роста фибробластов (FGF2, lng/ml Sigma), нейроростовой фактор (NGF 2 ng/ml, Sigma).

Полученную суспензию клеток центрифугируют (3 мин, 1200 об/мин), осадок ресуспендируют в питательной среде того же состава. Количество и жизнеспособность диссоциированных клеток определяют в камере Горяева после окраски 0,1% раствором трипанового синего. Для последующего культивирования используют клеточные суспензии только с 85-95% жизнеспособных клеток. Диссоциированные клетки (5×10⁵кл/мл) культивируют в 12-луночных планшетах на полилизин-ламининовом субстрате в течение 14 суток (36,5°С, 5% СО₂). Частичную смену 1/3 питательной среды производят два раза в неделю. Первичную культуру после формирования сливного монослоя снимают с помощью раствора трипсина/ЭДТА. После промывки в HBSS и центрифугирования клетки ресуспезируют в питательной среде. Клеточную суспензию (10000-12000 кл/см²) переносят в 12-луночные планшеты или флаконы (площадь 25 см²). Таким способом культуры пассируют 4 раза до формирования сливного монослоя. Формирующиеся в клеточном монослое прикрепленные к субстрату и свободноплавающие нейросферы отбирают с помощью Пастеровских пипеток и диссоциируют описанным выше методом ферментной обработки. Выделение нейросфер позволяет отделить их от прикрепленных к субстрату обкладочных глиальных клеток, фибробластов и стромальных (опорных) клеток. Клеточную суспензию клеток нейросфер после промывки и центрифугирования ресуспендируют в питательной среде и культивируют в 12-луночных планшетах (10000-12000 кл/см²) и на покровных стеклах (18×18 мм) в чашках Петри до формирования сливного монослоя. Полученные культуры используют для цитологических и иммуноцитохимических исследований. Часть клеток последних пассажей замораживют в среде для криоконсервирования (90% сыворотки, 10% ДМСО) и хранят в жидком азоте.

Клеточный монослой фиксируют в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 30 мин. После промывки в PBS (3×10 мин) клетки инкубируют 24 ч при 4°С с первичными антителами к β-тубулину (1:300; Chemicon), нестину (1:100, Chemicon) и нейрональной специфической енолазе (1:100). После промывки в PBS клетки последовательно обрабатывают биотинилированными антителами с авидин-биотиновым комплексом (ABC, Vector Laboratories, Inc), раствором диаминобензидина, приготовленном на фосфатном буфере (DBA 0.5 мг/мл., перекись водорода 0.03%,). Препараты обезвоживают и заключают под покровные стекла в синтетическую смолу (Entellan, Merk).

Производят отмывание полученного клеточного биоматериала от среды культивирования с 0,9% физиологическим раствором NaCl путем двухкратного центрифугирования клеток при 2000 g, и материал может быть использован сразу для трансплантации. Он отмывается от среды культивирования физиологическим раствором и переводится в пробирку с физиологическим раствором. Если материал планируется для интратекального введения, то он расфасовывают на аликвоты по (0,5-0,6)×10⁶ НСК в криопробирки по 2 мл и замораживают в программном замораживателе.

Получение, стандартизация и криоконсервация компонента В предложенного БМКП «ОнкоКомб»

Выделение и культивирование МССК. Эти клетки выделяли и изолировали из разных источников по известным международным протоколам: из костного мозга (P. Penfornis, R. Pochampally et al., 2011) пуповинной крови (Can A. and Balci D., 2011) или из жировой ткани (Zachar V., Rasmussen J. G., and Fink Т., 2011) самого пациента или донора. Для изоляции МССК из жировой ткани использовали отечественную модификацию (Тепляшин А.А., 2012), а для изоляции и выделения МССК из костного мозга использовали модификацию профессора Коноплянникова А.Г. (2014).

Для забора костного мозга осуществляли эксфузию 50 мл костного мозга из гребня подвздошной кости специальными биопсийными иглами.

Пример выделения МССК из костного мозга. Доноры должны быть предварительно обследованы на инфекции ВИЧ 1 и ВИЧ 2, синдром иммунодефицита, сифилис, гепатиты В и С, острые инфекционные заболевания. Эксфузия костного мозга производится в операционной посредством пункции дистальной части гребня подвздошной кости под общей или местной анестезией. Пункцию проводят стернальной иглой; забор костного мозга производят шприцем типа «Луер», костномозговую суспензию переносят в мешок с изотоническим антикоагулянтом. Отобранный оразец сопровождается документацией, содержащей сведения, характеризующие данный образец (данные о доноре, идентификационный код, источник, время и условия забора, условия хранения). Полученный образец в стерильном биксе и изотермическом транспортном контейнере доставляют в лабораторию для выделения МССК.

Подготовка материала МССК. После отстаивания образца костного мозга в течение 1-2 часов при комнатной температуре выделенная верхняя фракция клеток отбирается пастеровской пипеткой и ресуспендируется в ростовой среде. В качестве ростовой среды служит среда RPMI-1640, содержащая пенициллин-стрептомицин (100 ед/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ, 20% эмбриональной телячей сыворотки. Культивирование проводится в пластиковых флаконах с площадью дна 25 см², в которые вносили (2-10)×10⁵ клеток/см² в 8 мл ростовой среды. Флаконы помещаются в СО₂-инкубатор (5% СО₂). Через 48 часов среда с неприкрепившимися клетками удаляется и заменяется на свежую. При достижении конфлюентного монослоя (90-100%) клетки пересевают с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в новые флаконы сначала с площадью дна 75 см², а впоследствии при нарастании клеточной массы - во флаконы с площадью дна 175 см². Такой метод позволяет к концу 5-6 недели добиться получения популяции МССК в количестве (1-2)×10⁸ клеток, что достаточно для трансплантации в организм реципиентов. Изучение специфических маркеров полученных культур МСК методом проточной цитофлюорометрии показало, что они относятся к популяции CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- клеток, что характерно для клеток МССК, происходящих из мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток взрослого организма.

Обработка пертурбагеном и хранение материала МССК

Вся клеточная масса МССК в количестве (1-2)×10⁸ клеток проходит транскриптом-модифицирующую предобработку путем кондинционирования культуры МССК с одним из четырех пертурбагенов в определенной концентрации (микромоль/л): Sol. Propidium iodide (0,000006 мкМ/л), Sol. Acidi acetylsalicylic (0,0001 мкМ/л), Sol. Trichostatin A (0,0000001 мкМ/л), Sol. Niclosamide (0,0000122 мкМ/л). Через 6 часов среда удаляется и заменяется на 0,9% физиологический расствор NaCl. Производится отмывание полученного клеточного биоматериала от среды культивирования тем же 0,9% физиологическим расствором NaCl путем двухкратного центрифугирования клеток при 2000 g, и материал может быть использован сразу для трансплантации. Он отмывается от среды культивирования физиологическим раствором и переводится в 200 мл физиологического раствора с 10 ед/мл гепарина. Если материал планируется для интратекального введения, то он должен быть расфасован на аликвоты по 1×10⁶ МСК в криопробирки по 2 мл и заморожен в программном замораживателе. Если материал будет использоваться для внутривенного или внутриартериального введения, то криоконсервируется весь объем (1-2)×10⁸ МССК в криопробирки по 5-10 мл или специальные мешки для хранения костного мозга.

Использование клеточного материала для трансплантации

1. Материал, предназначенный для трансплантации, отмывается от среды культивирования физиологическим раствором и переводится в 200 мл физиологического раствора с 10 ед\мл гепарина.

2. Транспортировка клеточного материала осуществляется на льду в термоизолированном контейнере.

3. Клеточный материал вводится внутривенно с использованием трансфузионной системы в течение 1 ч. За 10 мин до начала процедуры пациент получает 4 мг метипреда.

Пример выделения МССК из жировой ткани. Жировую ткань забирали биопсией в объеме 10 г. Полученные 10 г трижды промывают PBS (Gibco) при рН 7,2 без ионов Са2⁺и Mg2⁺, содержащим однократный раствор антибиотиков и антимикотика (Gibco), конечная концентрация пенициллина составляет 100 ед/мл, стрептомицина 100 мкг/мл, амфотерицина В 0.25 мкг/мл, и удаляют примеси плотной соединительной ткани. Далее проводят механическую фрагментацию ткани медицинскими ножницами в культуральных чашках диаметром 10 см (Costar) до получения мелкодисперсной массы, которую переносят в две пробирки объемом 50 мл с коническим дном (Costar) и суспендируют каждый образец в 25 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик. Далее проводят стадию обработки ферментом: в полученные суспензии вводят по 1 мл 2% раствора коллагеназы I типа (Gibco) в буферном растворе PBS без ионов Са2⁺и Mg2⁺до конечной концентрации фермента 0,075%, инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут при медленном покачивании. Полученную смесь тщательно перемешивают, затем добавляют эквивалентный объем DMEM, содержащий 10% FBS, антибиотики и антимикотик, и центрифугируют в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость и жировые капли удаляют, осадки объединяют и суспендируют в 10 мл холодного лизирующего буфера (+4°С), содержащего 155 мМ NH₄Cl, 10 мМ KHCO₃, 0.1 мМ Na₂EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре. Далее в клеточную суспензию добавляют 10 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость удаляют и проводят стадию промывания. Клеточный осадок ресуспендируют в 30 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик, и центрифугируют в режиме 1000 g в течение 10 минут. Полученный осадок ресуспендируют в 25 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик. Полученную клеточную суспензию пропускают через фильтр с размером пор 100 мкм и центрифугируют в течение 10 минут при 300 g. Осадок ресуспендируют в среде DMEM, дополненной антибиотиками и антимикотиком, 10% FBS и однократным раствором заменимых аминокислот (Non-Essential Amino Acids, Gibco) в объеме 25 мл. Суспензию пропускают через фильтр с размером пор 10 мкм. Таким образом, получают гомогенную фракцию клеток, свободную от клеточного дебриса и клеток крови.

Полученную клеточную суспензию оценивают подсчетом в камере Горяева и высевают во флаконы площадью 75 см² из расчета 106 клеток/см². Доля прикрепившихся клеток составляет приблизительно 1-1,5%. Таким образом, количество МССК, выделенных из 1 г жировой ткани, составляет около (1,5-3)×10⁴ клеток. По истечении 24 часов проводят смену среды на DMEM, содержащей антибиотики (100 ед/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина, Gibco), 10% FBS и однократный раствор заменимых аминокислот (Non-Essential Amino Acids, Gibco). По достижении монослоя клетки субкультивируют, проводят визуальную оценку морфологии клеток методом фазово-контрастного микроскопирования, оценивают митотический индекс и время цитогенерации. По результатам морфологического анализа в полученной после выделения фракции клеток выявлено две субпопуляции. Первый тип клеток представляет собой субпопуляцию малых веретеновидных клеток диаметром 10-15 мкм с четко выделенным ядром и гомогенной цитоплазмой. Второй тип представлен клетками округлой формы с вытянутым с одной стороны плоским выростом цитоплазмы, размер клеток достигает 40 мкм; отмечается темное ядро, смещенное к одному краю, гетерогенная цитоплазма и повышенная гранулярность в ядерной области. В фазе логарифмического роста клеток подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации. Соотношение количества митотических клеток к общему количеству клеток составляет 34%. Время удвоения 54-62 час. Полученные клетки иммунофенотипируют методом непрямой иммунофлуоресценции. Посредством проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter) выявлен высокий уровень экспрессии следующих антигенов CD10, (CALLA), CD13 (APN), CD44 (hyaluronic acid receptor), CD90 (Thy-1), CD105 (endoglin) (Becton Dickinson). Также показано отсутствие экспрессии маркеров ГСК CD34, CD45 и CD117 (Becton Dickinson). Результаты иммунофенотипирования показывают, что популяция полученных клеток соответствует МССК по экспрессии поверхностных антигенов.

Получение компонента Г предложенного БМКП «ОнкоКомб»

В качестве биологической стабильной стерильной среды для получения БМКП по настоящему изобретению используется стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, приготовленный в заводских условиях в ампулах по 10 мл или стерильный раствор во флаконе объемом 200 мл или 400 мл. Эту среду применяют при изготовлении БМКП для цитотранфузий. Для получения формы БМКП для имплантаций применяют гетерогенный биодеградируемый полимерный матрикс. Подобным матриксом может служить универсальный коллагеновый матрикс для имплантации, описанный в патенте RU 2249462, 2005 г., МПК А61К 38.39, А61К 35/12), являющийся официальным медицинским изделием и разрешенный к клиническому применению в РФ, или его аналог, имеющий разрешение на клиническое использование.

Подготовка к использованию и применение предложенного БМКП «ОнкоКомб»

Комбинация клеточных компонентов предложенного БМКП может изменяться в зависимости от задач клеточной противоопухолевой терапии. Базовым компонентом в этом препарате всегда является компонент А.

Вариант 1. Если предполагается интратекальное введение препарата при терапии первичных и метастатических ЗНО в головном и спинном мозге, то доза препарата для однократного введения должна составлять (5-6)×10⁶ МНК, содержащих (0,5-1,2)×10⁵ГСК и (0,25-1,2)×10⁵ МССК. Учитывая, что интратекальные введения будут использоваться при опухолевом поражении головного и спинного мозга человека, вторым клеточным компонентом препарата является компонент Б в дозе 5×10⁵ НСК, предобработанных пертурбагеном. Компонент Г в виде биодеградируемого полимерного матрикса используют в необходимом количестве (quantum satis), но не более 2 мл.

Вариант 2. Для профилактики рецидива ЗНО в мозге В предназначен другой вариант интратекального применения препарата, в котором состав препарата по варианту 1 дополнен компонентом В дозе 1×10⁶ транскриптом-модифицированных МССК.

Вариант 3. В этом варианте доза препарата для одноразового интратекального введения содержит компонент А в количестве (5-6)×10⁶ МНК (включая (0,5-1,2)×10⁵ ГСК и (0,25- 1,2)×10⁵ МССК), компонент В количестве 3×10⁶ транскриптом-модифицированных МССК и компонент Г в виде биодеградируемого полимерного матрикса в необходимом количестве, но не более 2 мл. Компонент Б не используется. Этот вариант наиболее применим к метастазам рака в мозге и костных тканях.

Вариант 4. При использовании препарата для его внутривенного и внутриартериального введения с целью регуляции ОК, оставшихся после конвенциональной лучевой и химиотерапии опухолей головного и спинного мозга (метастазы солидного рака в головной или спинной мозг, МГБ, астроцитомы, глиомы и т.д.) однократная доза препарата содержит компонент А в количестве 2×10⁸ МНК (включая (2-4)×10⁶ ГСК и (1-4)×10⁶ МССК), компонент Б в количестве 1×10⁶транскриптом-модифицированных НСК, компонент В количестве (1-2)×10⁸транскриптом модифицированных МССК и компонент Г в виде 200 мл 0,9% физиологического раствора NaCl.

Вариант 5. При использовании препарата для его внутривенного и внутриартериального введения с целью профилактики рецидивов опухоли путем регуляции функций ОК и ОСК, оставшихся после конвенционального противоопухолевого лечения солидного рака (рака легких, рака груди, рака желудка и т.д.), однократная доза препарата содержит компонент А в количестве 2×10⁸ МНК (включая (2-4)×10⁶ ГСК и (1-4)×10⁶ МССК), компонент В в количестве (1-2)×10⁸транскриптом-модифицированных МССК и компонент Г в виде 200 мл 0,9% физиологического раствора NaCl. Этот вариант наиболее приемлем для стадии реабилитации онкологических больных.

Вариант 6. При использовании препарата для его внутривенного и внутриартериального введения при лечении отдаленных метастазов рака в солидных органах и костных тканях, а также в случае невыявленного очага опухолевого процесса однократная доза препарата содержит компонент А в количестве (2-4)×10⁸ МНК, содержащих (2-8)×10⁶ ГСК и (1-8)×10⁶ МССК, а также компонент Б в количестве 3×10⁶транскриптом модифицированных НСК, компонент В в количестве (2-4)×10⁸транскриптом модифицированных МССК и компонент Г в виде 200 мл 0,9% физиологического раствора NaCl.

Если предполагается внутривенное или внутриартериальное введение предложенного БМКП, то его однократная доза должна уточняться с учетом нозологической принадлежности и тканеспецифичности злокачественной опухоли. Выбор варианта препарата осуществляет врач-онколог, имеющий соответствующую квалификацию в области таргетной лекарственной терапии рака и других ЗНО.

Размораживание компонентов А, Б и В производится непосредственно перед трансплантацией или трансфузией в процедурном кабинете на водяной бане при температуре 37-40°С до момента перехода замороженного материала в жидкую фазу. В дальнейшем путем центрифугирования при 1500 об/мин каждый используемый компонент осаждают на дно центрифужной пробирки, отсасывают надосадочную жидкость и заливают 0,9% физиологическим раствором NaCl в требуемом количестве или помещают в гетерогенный биополимерный коллагеновый матрикс. Процедуру повторяют дважды. Каждый компонент препарата в размороженном состоянии может применяться в течение 6 часов после приготовления. Если препарат за это время не использован, то он подлежит утилизации.

Внутривенная или внутриартериальная трансфузия БМКП производится путем стандартного внутривенного или внутриартериального медленного капельного введения препарата «ОнкоКомб» в течение 1 часа под постоянным наблюдением поста медицинской сестры и врача-траснфузиолога. Больной нуждается в динамическом наблюдении и мониторинге витальных функций в течение суток. Для коррекции возможных аллергических реакций с профилактической целью до трансфузии делается однократное внутримышечное введение кортикостероидных препаратов (4 мг дексаметазона).

Интратекальное введение БМКП должно производиться только в условиях реанимационного отделения. Трансфузия препарата осуществляется через люмбальный прокол, выполненный в типичном месте (в L3-L4 промежутке) под местной анестезией 1% раствора лидокаина. Затем забирают 3 мл ликвора и смешивают с одной или 2-мя биодозами клеточного препарата (максимальный объем до 3 мл), ресуспензируют клеточный препарат в ликворе и медленно вводят в субарахноидальное пространство. Накладывают асептическую повязку. При необходимости повторяют интратекальные трансфузии препарата «ОнкоКомб», но не ранее чем через 7 дней после цитотранфузии. Для коррекции возможных аллергических реакций с профилактической целью делается однократное внутримышечное введение кортикостероидных препаратов (4 мг дексаметазона).

Основными критериями эффективности проведенного вмешательства являются улучшение клинической симптоматики, отсутствие данных о рецидиве заболевания и увеличение сроков выживаемости онкопациентов. Срок ожидаемого результата крайне индивидуален для каждого пациента и зависит от объема вовлечения органа в онкопроцесс, давности травмы, степени компенсации нарушенных функций. Эффективность терапии варьирует от 1-3 дней до 12-16 месяцев после трансфузии и оценивается клиническими шкалами и электрофизиологическими методами исследования (ЭКГ, церебральным картированием ЭЭГ, транскраниальной магнитной стимуляцией, соматосенсорными вызванными потенциалами и электонейромиографией, а так же комплексным онкологическим исследованием и т.д.).

Пример 1. Пациентка Г. 06.01.1967 г. р. находилась в клинике с 24.08.2016 г. по 25.09.2016 г. с клиническим диагнозом:

Основной: Мультифокальная глиобластома левой теменно-височной долей правого полушария головного мозга. Состояние после резекции глиобластомы височно-теменной доли правого полушария головного мозга (16.06.2013). Патологоанатомический диагноз: в препаратах фрагменты злокачественной МГБ с выраженной пролиферацией эндотелия сосудов, очагами некротических изменений, клеточным и ядерным полиморфизмом, нередкими митозами. Заключение: мультиформная глиобластома WHO grade IV. Сопутствующие заболевания: Желчнокаменная болезнь: холецистэктомия. Хронический гастро дуоденит. Перенесенные операции: Аппендэктомия 2009 г. Москва).

Жалобы при поступлении: на общую слабость, на легкую дискоординацию движений, пошатывание при ходьбе, отмечался единичный эпилептиформный припадок. Анамнез заболевания: Со слов пациентки: считает себя больной с января 2014 г., когда потеряла сознание на работе, упала, ударилась головой, отмечались судорожные подергивания в конечностях. Была оказана скорая медицинская помощь, после чего пациентку доставили больную в ГКБ №15 (Москва), где при госпитализации на МРТ головного мозга выявили опухоль головного мозга в правой теменно-височной области. От операции отказалась. По месту жительства проведено повторное МРТ головного мозга, которая подтверждила кистозно-солидное образование полушария головного мозга правой теменной и височной области, отек головного мозга, выраженное смешение срединных структур и ствола мозга. Была консультирована нейрохирургом. Заключение: показано оперативное лечение. 10.02.2014 была госпитализирована в нейрохирургическом отделении ГКБ №15, где 13.02.2014 проведено удаление опухоли. Предварительный результат патогистологического исследования: мультиформная глиобластома полиморфноклеточная теменной доли левого полушария головного мозга. Патологоанатомический диагноз (НИИ им. Бурденко 25.05.2016, №557/16): в предоставленных препаратах фрагменты злокачественной астроцитарной глиомы с выраженной пролиферацией эндотелия сосудов, очагами некротических изменений, клеточным и ядерным полиморфизмом, нередкими митозами. Заключение: глиобластома WHO grade IV. После операции пациентка консультирована в клинике им. Герцена для подбора лучевой и химиотерапии, но от лечения отказалась. Прошла курс лучевой терапии в марте-апреле 2014 года по поводу МГБ. Получила облучение в дозе 65 Грей. 20.06.2014 первичная консультация химиотерапевта-нейроонколога Заключение: Ds Мультифокальная глиобластома правой височной, теменной долей правого полушария головного мозга. Состояние после: Хирургическое удаления глиобластомы височной, теменной долей правого полушария головного мозга. Патологоанатомический диагноз: в предоставленных препаратах фрагменты злокачественной астроцитарной глиомы с выраженной пролиферацией эндотелия сосудов, очагами некротических изменений, клеточным и ядерным полиморфизмом, нередкими митозами. Заключение: глиобластома WHO grade IV. Прошла почти 12 курсов химиотерапии темозаламидом по стандартной схеме. В октябре 2015 года был выявлен рецидив МГБ - в правой височной области очаг размерами 0,5 на 1,2 см. Больной успешно проведен курс стереотаксической лучевой терапии на аппарате «Кибернож» в Санкт-Перетбурге, в дальнейшем продолжены курсы темозаламида, авастина, иринотекана с улучшением. После завершения стандартного лечения обратилась в клинику "НейроВита"и с 2 декабря 2015 года была включена в протокол клинических испытаний «Протеом-основанной терапии глиобластомы человека». Больной начат курс иммунотерапии дендритными вакцинами и цитотоксических лимфоцитов (декабрь 2015, январь-апрель 2016). В этот период проведено 4 курсовых химиотерапевтических лечения: темозаламид по схеме 280 мг - 5 дней + Карбоплатин 600 мг внутривенно в первый день на фоне антиэметиков. С марта 2016 к лечению добавлен в целях профилактики рецидива таргетный клеточный препарат «ОнкоКомб». Применялось интратекальное введение препарата в комбинации варианта 1 (5 трансфузий) и внутривенное введение препарата (вариант 5, две цитотрансфузии) с периодическими курсами химиотерапии: по два курса по 5 дней (2-й курс с 22.07.2016 по 30.07.2016): 1-й день: Раствор Карбоплатин 600 мг внутривенно на фоне антиэметиков. Таблетки Темозоламид 260 мг/сутки - утром за 60 минут до еды. 2-4-й день: Таблетки Темозоламид 280 мг/сутки - утром за 60 минут до еды. 5-й день: Таблетки Темозоламид 300 мг/сутки - утром за 60 минут до еды, на фоне антиэметиков. Курс перенесла удовлетворительно. Согласно МРТ головного мозга с контрастным усилением (от 22 августа 2016 г.) без отрицательной динамики. Даны рекомендации продолжить курсовое лечение: Темозаламид по схеме 280 мг - 5 дней + Карбоплатин 600 мг внутривенно в первый день на фоне антиэметиков. С 10.09.2016 по 12.12.2016 получила 4 дозы препарата "ОнкоКомб" для внутривенного введения (вариант 5) и 2 интератекальные трансфузии препарата. Согласно МРТ головного мозга с контрастным усилением (от 23 ноября 2016 г. ) без отрицательной динамики. Соматический статус: Состояние удовлетворительное, ECOG-1. Температура тела 36,2°С. Кожные покровы чистые, бледные, тургор мягких тканей сохранен. Молочные железы симметричные. Периферические лимфатические узлы не пальпируются. Тоны сердца ясные, ритмичные, ЧСС=66 уд/мин. АД=125/70 мм рт.ст. В легких дыхание самостоятельное, везикулярное, хрипов нет, ЧДД=18/мин, проводится над всей поверхностью обоих легких. SpO₂ - 98% на воздухе. Живот мягкий, не увеличен, при пальпации безболезненный, перистальтический шум выслушивается, печень по краю реберной дуги. Мочеиспускание контролирует. На волосистой части головы справа в теменной области послеоперационный рубец (заживший первичным натяжением, (после операции в 2014 г/).

В неврологическом статусе: сознание ясное, в пространстве времени и личности ориентирована. Передвигается самостоятельно. На вопросы отвечает правильно. Лицо симметрично. Глазные щели S=D. Фотореакции сохранены. Фонация и глотание не нарушено. Язык по центру. Слух сохранен. Вызываются рефлексы орального автоматизма. Чувствительность сохранена. Мышечный тонус незначительно ослаблен в верхних и нижних правых конечностях, сухожильные рефлексы с конечностей сохранены оживлены S>D. При выполнении пальце-носовой пробы определяется интенционный тремор с двух сторон. При выполнении пяточно-коленной пробы акционный тремор. Пошатывание при проведении пробы Ромберга.

Результаты лабораторных, инструментальных методов обследования в пределах нормы Группа крови: В(Ш) Rh+ полож. Анализы крови на ВИЧ, РВ, гепатиты В - отрицательные. ЭКГ - Синусовая аритмия, горизонтальное положение ЭОС. ЧСС - 68 в мин. Частичное нарушение внутрижелудочковой проводимости. 14.12.2016 г. - в отделении начато проведение [имиотерапевтического лечения: Темозаламид по схеме 280 мг - 5дней + Карбоплатин 600 мг внутривенно - первый день на фоне антиэметиков. Проведено интратекальное введение препарата "ОнкоКомб" (вариант 1). Пациентка в стабильном состоянии выписывается под наблюдение онколога для продолжения химиотерапевтического лечения по месту жительства. Копии результатов обследования выданы на руки. Повторная госпитализация в клинику через неделю (18.01.2017) для контрольного обследования и проведении иммунотерапии в группе консервативной иммунотерапии согласно протоколу научно-исследовательской программы: «Протеом-основанная персонифицированная иммунотерапия глиобластом головного мозга» при участии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, ФГБУ ФНКЦ ФМБА России».

Пример 2. Пациентка Т., 06.01.1960 г.р. находилась в клинике (история болезни №2016/0552) с 14.09.2016 г. по 15.09.2016 г. с клиническим диагнозом:

Основной: Мультифокальная глиобластома правой височной, теменной долей правого полушария головного мозга. Состояние после хирургического удаления глиобластомы височной, теменной долей правого полушария головного мозга (11.05.2016 г.; Москва, НИИ неврологии). Патологоанатомический диагноз: в предоставленных препаратах фрагменты злокачественной астроцитарной глиомы с выраженной пролиферацией эндотелия сосудов, очагами некротических изменений, клеточным и ядерным полиморфизмом, нередкими митозами. Заключение: глиобластома WHO grade IV. Сопутствующие заболевания: Мочекаменная болезнь, ремиссия. Хронический колит, ремиссия. Сопутствующие заболевания: Желчнокаменная болезнь: холецистэктомия (г. Москва, 1984 г. ). Хронический гастрит. Носительство HCV.

Перенесенные операции: Удаление матки (миома матки), 2009 г. Москва).

Жалобы при поступлении: на легкую дискоординацию.

Анамнез заболевания: Со слов пациентки: считает себя больной с 08.01.2016, когда дома потеряла сознание, упала, ударилась головой. Вызвала БСМП, которая оказала помощь пациентке, после чего доставила больную в ГКБ, где пациентка отказалась от госпитализации. Накануне отмечала повышение температуры тела 39,3°С, «тяжесть», «заложенность» в грудной клетке. Наблюдалась по месту жительства. По месту жительства проведено МРТ головного мозга: кистозно-солидное образование полушария головного мозга правой теменной и височной области, отек головного мозга, выраженное смешение срединных структур и ствола мозга. Была консультирована нейрохирургом. Заключение: показано оперативное лечение. Пациентка находилась с 10.05.2016 г. по 19.05.2016 г. в нейрохирургическом отделении НИИ Неврологии (г. Москва), где 11.05.2016 г. проведено удаление опухоли. Предварительные результат патогистологического исследования: глиобластома полиморфноклеточная теменной доли левого полушария головного мозга. Патологоанатомический диагноз (НИИ им. Бурденко 25.05.2016 г. №557/16): в предоставленных препаратах фрагменты злокачественной астроцитарной глиомы с выраженной пролиферацией эндотелия сосудов, очагами некротических изменений, клеточным и ядерным полиморфизмом, нередкими митозами. Заключение: глиобластома WHO grade IV. После операции пациентка консультирована в клинике им. Герцена для подбора лучевой и химиотерапии. Представлены снимки и заключение МРТ головного мозга с контрастом 12.08.2016 г. в динамике (от 22.02.2016 г.; от 03.03.2016 г.; от 31.03.2016 г.; от 24.05.2016 г.; 12.08.2016 г.).

20.06.2016 г. первичная консультация химиотерапевта-нейроонколога. Заключение: Ds Основной: Мультифокальная глиобластома правой височной, теменной долей правого полушария головного мозга. Состояние после хирургического удаления глиобластомы височной, теменной долей правого полушария головного мозга (11.05.2016 г.; Москва НИИ Неврологии). Патологоанатомический диагноз: в предоставленных препаратах фрагменты злокачественной астроцитарной глиомы с выраженной пролиферацией эндотелия сосудов, очагами некротических изменений, клеточным и ядерным полиморфизмом, нередкими митозами. Заключение: глиобластома WHO grade IV. Сопутствующие заболевания: Мочекаменная болезнь, ремиссия. Хронический колит ремиссия. Сопутствующие заболевания: Желчнокаменная болезнь: холецистэктомия (г. Москва, 1984 г.). Хронический гастрит. Носительство HCV. Даны рекомендации курсовое лечение: Темозаламид по схеме 280 мг - 5дней + Карбоплатин 600 мг внутривенно в первый день на фоне антиэметиков (протокол консультации выдан на руки). Учитывая, что у больной имеет место ЗНО головного мозга, собраны ГСК здорового гаплоидентичного донора (родной сын больной), и на основе этого лейкоферезного продукта был изготовлен аллогенный (гаполоидентичный) БМКП «ОнкоКомб». Сразу после проведения первого курса химиотерапии больной проведено интратекальное введение 2-х доз препарата «ОнкоКомб» с интервалом в 7 дней. Больной в стационаре были проведены еще два курса химиотерапии. Больной проведены двукратные внутривенные введения БМКП «ГемаКомб» в объеме по 5 биодоз в целях коррекции соматического состояния и реабилитации после химиотерапии. Отметила позитивный эффект от введения БМКП «ОнкоКомб». Консультация (08.09.2016 г.) химиотерапевта-нейроонколога (повторно): Пациентке проведено Х/Т лечения - два курса по 5 дней (2-й курс с 25.07.2016 г. по 29.07.2016 г.): 1-й день: Раствор Карбоплатин 600 мг внутривенно на фоне антиэметиков. Таблетки ТЕМОЗОЛОМИД 260 мг/сутки - утром за 60 минут до еды. 2-4-й день: Таблетки ТЕМОЗОЛОМИД 280 мг/сутки - утром за 60 минут до еды. 5-й день: Таблетки ТЕМОЗОЛОМИД 300 мг/сутки - утром за 60 минут до еды, на фоне антиэметиков. Курс перенесла удовлетворительно. Согласно МРТ головного мозга с контрастным усилением (от 12 августа 2016 г.) без отрицательной динамики. Даны рекомендации продолжить курсовое лечение: Темозаламид по схеме 280 мг - 5 дней + Карбоплатин 600 мг внутривенно в первый день на фоне антиэметиков (протокол консультации выдан на руки).

Анамнез жизни: росла и развивалась соответственно возрасту, в физическом и умственном развитии от сверстников не отставала.

Аллергические реакции: новокаин.

Пациентка проходит лечение в клинике в группе консервативной иммунотерапии согласно протоколу научно-исследовательской программы «Протеом-основанная персонифицированная иммунотерапия глиобластом головного мозга» при участии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, ФГБУ ФНКЦ ФМБА России».

Госпитализирована в клинику для дообследования и начала третий курс химиотерапии и терапии БМКП «ГемаКомб».

Соматический статус: Состояние удовлетворительное, ECOG-1. Температура тела -36,2°С.Кожный покровы чистые, бледный, тургор мягких тканей сохранен. Молочные железы симметричные. Периферические лимфатические узлы не пальпируются. Тоны сердца ясные, ритмичные, ЧСС=66 уд/мин. АД=115/70 мм рт.ст .В легких дыхание самостоятельное, везикулярное, хрипов нет, ЧДД=18/мин, проводится над всей поверхностью обоих легких. SpO₂ - 98% на воздухе. Живот мягкий, не увеличен, при пальпации безболезненный, перистальтический шум выслушивается, печень по краю реберной дуги. Мочеиспускание контролирует. На волосистой части головы справа в теменной области послеоперационный рубец (заживший первичным натяжением, (после операции 11.05.2016 г.). В неврологическом статусе: сознание ясное, в пространстве времени и личности ориентирована. Передвигается самостоятельно. На вопросы отвечает правильно. Лицо симметрично. Глазные щели S=D. Фотореакции сохранены. Фонация и глотание не нарушено. Язык по центру. Слух сохранен. Вызываются рефлексы орального автоматизма. Чувствительность сохранена. Мышечный тонус незначительно ослаблен в верхних и нижних правых конечностях, сухожильные рефлексы с конечностей сохранены оживлены S>D. При выполнении пальце-носовой пробы определяется интенционный тремор с двух сторон. При выполнении пяточно-коленной пробы акционный тремор. Пошатывание при проведении пробы Ромберга. Результаты лабораторных, инструментальных методов обследования:

Дата исследования 10.06.2016 г. Группа крови: В(III) Rh+ полож. Дата исследования 06.09.2016 г. Анализы крови на ВИЧ, РВ, гепатиты В - отрицательные. Носительство HCV. ЭКГ - синусовая аритмия, горизонтальное положение ЭОС. ЧСС - 68 в мин. Частичное нарушение внутрижелудочковой проводимости. 14.09.2016 г. в отделении начато проведение химиотерапевтического лечения: Темозаламид по схеме 280 мг - 5 дней + Карбоплатин 600 мг внутривенно - первый день на фоне антиэметиков (протокол консультации выдан на руки).

Пациентка в стабильном состоянии выписывается под наблюдение онколога для продолжения химиотерапевтического лечения по месту жительства. В соответствии с протоколом научно-исследовательской программы «Протеом-основанная персонифицированная иммунотерапия глиобластом головного мозга» при участии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, ФГБУ ФНКЦ ФМБА России» больной введены дендритные вакцины. С предварительного информированного согласия пациентке было выполнено интратекальное введение (2 биодозы) БМКП «ОнкоКомб» посредством люмбальной пункции, и однократная цитотрансфузия парентерально - процедуры пациентка перенесла удовлетворительно. Пациентка в удовлетворительном, относительно стабильном состоянии выписывается для продолжения лечения под наблюдением терапевта, невролога по месту жительства. Копии результатов обследования выданы на руки.

Катамнез. При обследовании данных за рецидив нейроонкологического злокачественного заболевания в течение 10 месяцев системного лечения не получено.

Рекомендовано:

- Наблюдение онколога, окулиста, нейрохирурга (невропатолога) по месту жительства.

Провести исследования: клинический, биохимический анализы крови, коагулограмма 26-28.09.2016 г., и перед следующим - 4-м курсом Х/Терапии (12.10.2016 г.)

- Продолжить противосудорожную терапию согласно подобранной схеме:

- Конвулекс (Депакин хроно) 500 мг 1 таблетка утром, 1 таблетка вечером - 3 месяца. Омез (париет) 20 мг × 2 раза в день - постоянно. Диакарб 250 мг 1 таблетка утром.

Повторная госпитализация в клинику 12.09.2016 г. для контрольного обследования и проведении иммунотерапии в группе консервативной иммунотерапии согласно протоколу научно-исследовательской программы «Протеом-основанная персонифицированная иммунотерапия глиобластом головного мозга» при участии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, ФГБУ ФНКЦ ФМБА России».

Применение предложенного БМКП "ОнкоКомб" для лечения и профилактики рака и других ЗНО показало его лучшую эффективность по сравнению с применением для этих целей клеточных препаратов, содержащих только ГСК в ЛК МНК.

Перечень используемых сокращений

DMEM - модифицированная по способу Дульбекко среда Игла

EGFR - рецепторы эпидермального фактора роста

ВКСП - внутриклеточные сигнальные пути

БМКП - биомедицинский клеточный продукт

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

ДМСО - диметилсульфоксид

ЗНО - злокачественные новообразования

КТТ - клеточная таргетная терапия

ЛК - лейкоконцентрат

МГБ - мультиформная глиобастома

МКАТ - моноклональные антитела

МНК - мононуклеарные клетки

мРНК - микроРНК

МССК - мезенхимальные стромальные стволовые клетки

НСК - нейральные стволовые клетки

ОК - опухолевые клетки

ОСК - опухолевые стволовые клетки

ПК - периферическая кровь

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

СК - стволовые клетки

тсСК - тканесцецифичные стволовые клетки.

Claims

1. Биомедицинский клеточный продукт (БМКП) для лечения и профилактики рака и других злокачественных новообразований, содержащий:

аутологичные или иммуносовместимые аллогенные мононуклеарные клетки (МНК) мобилизованной периферической крови человека (компонент А), содержащие гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) с маркерами CD34+, CD45+ в количестве 1-2% клеток от общего числа МНК и мезенхимальные стромальные стволовые клетки (МССК) с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- в количестве 0,5-2% клеток от общего числа МНК, а также

линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных нейральных стволовых клеток (НСК) с маркером CD133+ (компонент Б), транскриптом-модифицированных путем обработки пертурбагеном, приводящей к формированию секретома НСК, способного к блокированию внутриклеточного сигнального пути интегринов/фокальной адгезии у опухолевых и опухолевых стволовых клеток, и/или линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- (компонент В), транскриптом-модифицированньгх путем обработки пертурбагеном, приводящей к формированию секретома МССК, способного к блокированию внутриклеточного сигнального пути интегринов/фокальной адгезии у опухолевых и опухолевых стволовых клеток;

и вспомогательное вещество в виде стерильной трансфузионной среды при следующих концентрациях клеток на 1 мл вспомогательного вещества:

компонент А (МНК) - 0,8×10⁶ - 4×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 4×10³ - 3,3×10⁵ клеток;

компонент В (МССК) - 0,5×10⁶ - 2×10⁶ клеток.

2. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что для его внутритканевого введения при терапии первичных и метастатических злокачественных новообразований в головном и спинном мозге в качестве вспомогательного вещества использован биодеградируемый полимерный матрикс при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 2,5×10⁶ - 4×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 2,5×10⁵ - 3,3×10⁵ клеток.

3. БМКП по п. 2, отличающийся тем, что при профилактике рецидива злокачественных новообразований в мозге БМКП дополнительно содержит компонент В при концентрации этого компонента 0,5×10⁶ - 1,3×10⁶ клеток/мл матрикса.

4. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что для его внутривенного и внутриартериального введения при регуляции опухолевых клеток, оставшихся после конвенциональной лучевой и химиотерапии опухолей головного и спинного мозга, в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl, а препарат содержит компоненты А, Б и В при следующих концентрациях клеток на 1 мл раствора:

компонент А (МНК) - 0,8×10⁶ - 1,2×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 4×10³ - 6×10³ клеток;

компонент В (МССК) - 0,5×10⁶ - 1×10⁶ клеток.

5. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что для его внутривенного и внутриартериального введения при лечении отдаленных метастазов рака в солидных органах и костных тканях, а также в случае невыявленного очага опухолевого процесса в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl, а препарат содержит компоненты А, Б и В при следующих концентрациях клеток на 1 мл раствора:

компонент А (МНК) - 0,8×10⁶ - 2×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 1,2×10⁴ - 1,8×10⁴ клеток;

компонент В (МССК) - 1×10⁶ - 2×10⁶ клеток.

6. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что для его внутритканевого введения при метастатических злокачественных новообразованиях в мозге и костных тканях в качестве вспомогательного вещества использован биодеградируемый полимерный матрикс при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 2,5×10⁶ - 4×10⁶ клеток;

компонент В (МССК) - 1,5×10⁶ - 2×10⁶ клеток.

7. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что для его внутривенного и внутриартериального введения при регуляции опухолевых клеток, оставшихся после конвенциональной лучевой и химиотерапии опухолей солидных органов, в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl при следующих концентрациях клеток на 1 мл раствора:

компонент А (МНК) - 0,8×10⁶ - 1,2×10⁶ клеток;

компонент В (МССК) - 0,5×10⁶ - 1×10⁶ клеток.

8. БМКП по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что аллогенные МНК, НСК и МССК иммуносовместимы по группе крови, резус-фактору и иммунофенотипу крови.

9. БМКП по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что пертурбаген выбран из группы, состоящей из никлозамида, ацетилсалициловой кислоты, трихостатина А и пропидия иодида.

10. Способ получения ex tempore биомедицинского клеточного продукта по любому из пп. 1-9, включающий в себя:

получение аутологичных или иммуносовместимых аллогенных мононуклеарных клеток (МНК) мобилизованной периферической крови человека (компонент А), содержащих гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) с маркерами CD34+, CD45+ в количестве 1-2% клеток от общего числа МНК и мезенхимальные стромальные стволовые клетки (МССК) с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- в количестве 0,5-2% клеток от общего числа МНК, путем их выделения из лейкоконцентрата периферической крови или костного мозга, а также

получение линии аутологичных или иммуносовместимых аллогенных нейральных стволовых клеток (НСК) с маркером CD133+ (компонент Б) путем их выделения из эпителия обонятельной выстилки носа и модифицирования их транскриптома путем обработки пертурбагеном, приводящей к формированию секретома НСК, способного к блокированию внутриклеточного сигнального пути интегринов/фокальной адгезии у опухолевых и опухолевых стволовых клеток, и/или получение линии аутологичных или иммуносовместимых аллогенных МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+( Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- (компонент В) путем их выделения из костного мозга или жировой ткани и модифицирования их транскриптома путем обработки пертурбагеном, приводящей к формированию секретома МССК, способного к блокированию внутриклеточного сигнального пути интегринов/фокальной адгезии у опухолевых и опухолевых стволовых клеток, и

компонент А (МНК) - 0,8×10⁶ - 4×10⁶ клеток;

компонент Б (НСК) - 4×10³ - 3,3×10⁵ клеток;

компонент В (МССК) - 0,5×10⁶ - 2×10⁶ клеток.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что полученные компоненты А, Б, В криоконсервируют, а перед их смешиванием ex tempore со вспомогательным веществом размораживают.

12. Применение биомедицинского клеточного продукта по любому из пп. 1-9 для лечения и профилактики рака и других злокачественных новообразований.