WO2015174087A1 - 脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬 - Google Patents

脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬 Download PDF

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bone marrow
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明彦 田口
由紀子 新納
研一 山原
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Definitions

  • the present invention relates to a medicament for the prevention and / or treatment of cerebral infarction.
  • Cerebral infarction is a disease that causes cerebral ischemia due to blockage or narrowing of an artery that nourishes the brain, and the brain tissue becomes necrotic due to lack of oxygen or nutrition. About half a million people are affected. It is a frequent disease that accounts for a large portion of the causes of death among Japanese, and it is a disease that often requires care after leaving sequelae and also has a major problem in terms of welfare.
  • Regeneration of the brain microvascular network is essential for regeneration of nerve tissue damaged by cerebral infarction, and in recent years, cell therapy has been found to be effective for this tissue regeneration.
  • Non-Patent Document 1 describes cerebral infarction treatment in which bone marrow mesenchymal stem cells are administered intravenously to a patient.
  • Non-Patent Document 2 describes a cerebral infarction treatment in which autologous bone marrow-derived mononuclear cells are administered intravenously to a patient. This non-patent document 2 is directed to a group of patients with severe cardiogenic cerebral embolism who still do not sufficiently recover their neurological function even one week after the onset of cerebral infarction.
  • the outline of the treatment protocol is the onset of cerebral infarction 7
  • bone marrow cells are collected under local anesthesia, separation of mononuclear cell fraction is performed using specific gravity centrifugation, and treatment with a technique in which the whole dose is intravenously administered for 5 minutes is used. Have been described.
  • Non-Patent Document 3 describes that human CD34 positive stem cells are transcarotidly transplanted into rat brain, but the survival rate is low.
  • bone marrow-derived cells are intravenously administered to a cerebral infarction patient, but the majority of the cells are trapped in the lung, spleen or liver, so that cerebral infarction It is difficult to reach the goal and achieve a sufficient effect.
  • the present invention has been made in view of such problems, and it is an object of the present invention to provide a medicine for the prevention and / or treatment of cerebral infarction which exerts a sufficient effect even in a small amount.
  • the medicament according to the present invention is a medicament for preventing and / or treating cerebral infarction, which comprises CD133 positive cells as an active ingredient and is administered to the common carotid artery or vertebral artery.
  • a sufficient therapeutic effect on cerebral infarction can be obtained even with a small amount.
  • Atrophy index X / Y ⁇ 100 (%). It is a figure which shows the therapeutic effect regarding brain damage reduction by the carotid artery administration of human umbilical cord blood origin CD133 positive cell. It is a figure which shows the therapeutic effect regarding cerebral cortex function recovery promotion by the carotid artery administration of human umbilical cord blood origin CD133 positive cell. It is a figure which shows the therapeutic effect regarding brain damage reduction by carotid artery administration of human bone marrow derived CD133 positive cell. It is a figure which shows the therapeutic effect regarding cerebral cortex function recovery acceleration by carotid artery administration of human bone marrow origin CD133 positive cell. Fig.
  • FIG. 6 shows that administration of human bone marrow-derived mononuclear cells to the carotid artery has no therapeutic effect on alleviation of brain damage.
  • FIG. 6 shows that administration of mouse bone marrow-derived mononuclear cells to the carotid artery has no therapeutic effect on alleviation of brain damage.
  • FIG. 6 shows comparative examination about the cerebral-damage reduction effect of carotid artery administration and intravenous administration of human cord blood derived CD133 positive cell.
  • FIG. 6 shows that administration of human bone marrow-derived mononuclear cells to the carotid artery has no therapeutic effect on alleviation of brain damage.
  • the medicament for the prevention and / or treatment of cerebral infarction contains CD133 positive cells as an active ingredient, and the common carotid artery, internal carotid artery, anterior cerebral artery, middle cerebral artery, posterior cerebral artery or vertebral artery Administered to
  • the present inventors isolated only the CD133 positive cell fraction and administered the CD133 positive cells to blood vessels which feed the brain directly, with a surprisingly small number of cells and without aggravation of brain lesions.
  • the inventors have found as a new finding that functional recovery of the brain is brought about, and completed the present invention based on such facts.
  • the medicament according to the present invention is for the prevention and / or treatment of cerebral infarction, but in the present specification, “prevention” includes suppressing and delaying the onset of a disease, before becoming a disease As well as prevention of the disease, prevention of recurrence of the disease after treatment is included. “Treatment”, on the other hand, includes curing the condition, ameliorating the condition and suppressing the progression of the condition.
  • the medicament according to the present invention is suitably used in cases where the target cerebral infarction is lacunar infarction, atherothrombotic cerebral infarction, or cardiogenic cerebral embolism.
  • the medicament according to the present invention can be used in any of the super acute phase, acute phase, sub acute phase, and chronic phase, but can be suitably used particularly in acute phase and sub acute phase.
  • the hyperacute phase is a period within 8 hours after onset, and it is a time when there is a high possibility that neural cell death can be prevented by thrombolysis or thrombus removal.
  • the acute phase is a period of 8 hours to 7 days after onset, and the subacute phase is a period of 1 week to 4 weeks after onset.
  • the chronic phase is a period of one month or more after onset, and is a period in which the symptoms are almost fixed and relapsing is central with the prevention of recurrence, and it is a pathological condition in which cell necrosis and scarring of tissue are observed.
  • CD133 positive cells are administered to the common carotid artery, the internal carotid artery, the anterior cerebral artery, the middle cerebral artery, the posterior cerebral artery or the vertebral artery.
  • the brain is fed by four large arteries, but the common carotid artery (and the arteries that branch from it, the internal carotid artery, the anterior cerebral artery, and the middle cerebral artery) are arteries for the anterior circulation and the vertebral arteries ( And the posterior cerebral artery), which is an artery branching from it, is an artery for posterior circulation.
  • CD133 positive cells have high division ability, pluripotency, and ability to produce cytokines involved in neural and vascular development.
  • the CD133 positive cells are not particularly limited, and cord blood derived cells, human bone marrow derived cells, human peripheral blood derived cells, fetal liver derived cells and the like are adopted, preferably human cord blood derived cells or human bone marrow derived ones It is a cell.
  • the concentration of CD133 positive cells to be administered is not particularly limited, and may be, for example, 5 ⁇ 10 4 cells / kg to 1 ⁇ 10 7 cells / kg, preferably 1 ⁇ 10 5 cells / kg. It is from kg to 1 ⁇ 10 6 / kg, particularly preferably 5 ⁇ 10 5 / kg.
  • neurotrophic factor is not particularly limited, and, for example, BDNF, VEGF, NGF, GDNF, LIF, MYC, Neurotrophin3, TP53 or BAX can be used, and preferably BDNF.
  • BDNF is said to enhance the brain's resistance to ischemia, activate neural stem cells to promote neurogenesis, and promote synapse formation.
  • the present invention is a kit for the prevention and / or treatment of cerebral infarction, the kit comprising a container containing a composition containing CD133 positive cells as an active ingredient.
  • the kit contains instructions for administering a composition containing CD133 positive cells as an active ingredient to the common carotid artery or vertebral artery.
  • the present invention is a product for the prevention and / or treatment of cerebral infarction, which product comprises (i) a composition containing CD133 positive cells as an active ingredient, (ii) a container, and (iii) 2.) Instructions, instructions, insert, indicating that the composition can be used for the prevention and / or treatment of cerebral infarction, and administering the composition to the common carotid artery or vertebral artery Or a product label.
  • Example 1 Therapeutic effect by carotid artery administration of human cord blood-derived CD133 positive cells
  • the highly reproducible cerebral infarction model mouse Japanese Patent No. 4481706 developed by the inventors was used. Forty-eight hours after cerebral infarction, physiological saline and human umbilical cord blood-derived CD133 positive cells were administered from the left common carotid artery.
  • a cerebral atrophy score (Taguchi et al. Eur J Neurosci. 2007; 26 (1): 126-33.) By a macro specimen was used.
  • This model causes cerebral infarction localized in the cerebral cortex, it responds to light-and-dark conditions by open field test as an evaluation method of cranial nerve function recovery promotion (Taguchi et al. J Clin Invest. 2004; 114 (3): 330- 8) was used.
  • the number of cells administered was 5 ⁇ 10 3 (cells / animal) and 1 ⁇ 10 4 (cells / animal).
  • Four cerebral infarction mice in each group were used in the experiment.
  • the cerebral infarction model was created by the following method.
  • An 8-week-old severe combined immunodeficiency mouse (SCID mouse; CB-17 / lcr-scid / scidJcl) is anaesthetized by halothane anesthesia and approached from the left zygomatic region to direct the left middle cerebral artery 1.5 at the skull base A hole of about mm was made.
  • the left middle cerebral artery is coagulated using a bipolar electric scalpel immediately after passing through the olfactory cord (distal side of the olfactory intersection) and cut after the coagulation to permanently occlude the left middle cerebral artery, and left A cerebral infarction model localized to the cortex of the middle cerebral artery region was created.
  • the CD133 positive cells used for administration were purified by the following method.
  • Umbilical cord blood is diluted threefold with RPMI 1640 medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and then layered on a specific gravity centrifugal fluid (specific gravity 1.077, manufactured by Ficoll GE Healthcare), using a swing rotor centrifuge for 40 minutes at 400G. It was centrifuged. The mononuclear cell fraction observed immediately above the specific gravity centrifugal liquid layer was collected with a pipet, and 5 volumes of RPMI 1640 medium was added, followed by centrifugation at 300 G for 10 minutes to obtain a cell pellet.
  • the cell pellet was resuspended, anti-CD133 antibody (Miltenyi) labeled with magnetic beads was added, and incubation was performed at 4 degrees for 30 minutes. Thereafter, only cells bound with anti-CD133 antibody were isolated using a magnetic column. The quality of the isolated cells was verified by flow cytometry to confirm that the purity of CD133 positive cells was 90% or more.
  • anti-CD133 antibody Miltenyi
  • the details of the brain atrophy score by the macro specimen are as follows.
  • the cerebral infarction model mouse used in this study is localized to the cerebral cortex perfused by the left middle cerebral artery, but after cerebral infarction, it is compared to the contralateral side (the side where cerebral infarction is not created) due to the infiltration of inflammatory cells etc. And, on the side of cerebral infarction, obvious atrophy of the brain occurs.
  • the measurement method of the atrophy index is shown in FIG. As shown in FIG. 1, the Atrophy index is indicated by X / Y ⁇ 100 (%).
  • mice are nocturnal, it is known that in normal mice, the amount of activity decreases under light conditions, and the amount of activity increases by darkening the environment. Cerebral cortical function is important in behavior suppression under light conditions, and it has been shown that cell therapy restores cortical function recovery and light suppression under behavioral conditions (Taguchi et al. J. Clin Invest. 2004; 114 (3): 330-8).
  • mice were raised for 30 minutes under light conditions using an open field measuring device (30 cm ⁇ 30 cm, free movement space, manufactured by Yukiken Ken Co., Ltd.), and the number of rearing was automatically counted, and then raised for 30 minutes under dark conditions. The number of reactions was counted. An increase in momentum when changing from light to dark was used as an index of functional recovery.
  • Atrophy index is an index indicating brain atrophy. It was shown that administration of 1 ⁇ 10 4 (human / animal) human cord blood-derived CD133 positive cells also has a statistically significant effect of reducing brain damage.
  • FIG. 3 The therapeutic effect on promoting cranial nerve function recovery is shown in FIG.
  • 5 ⁇ 10 3 (animals / animal) of human cord blood-derived CD133 positive cells were administered, and 1 ⁇ 10 4 human cord blood derived CD133 positive cells were administered.
  • Rearing indicates the change of momentum when changing from the bright state to the dark state.
  • 1 ⁇ 10 4 (animals / animal) human cord blood-derived CD133-positive cells resulted in statistically significant An increase in the amount of activity for dark reaction was observed. That is, it was shown that administration of 1 ⁇ 10 4 (animals / animal) human cord blood-derived CD133 positive cells has a brain nerve function recovery promoting effect.
  • Example 2 Therapeutic effect by carotid artery administration of human bone marrow-derived CD133 positive cells
  • the left middle cerebral artery is permanently occluded immediately after passing the olfactory cord, and it is physiological than the left common carotid artery 48 hours after the cerebral infarction Saline solution and human bone marrow-derived CD133 positive cells were administered.
  • the number of cells administered was 5 ⁇ 10 3 (cells / animal) and 1 ⁇ 10 4 (cells / animal).
  • Three cerebral infarction mice in each group were used for the experiment.
  • We used brain atrophy score by macro specimen as evaluation method about brain damage reduction after cerebral infarction, and used reactivity to light and dark condition by open field test as evaluation method of cranial nerve function recovery promotion.
  • Bone marrow-derived CD133 positive cells used for administration were purified by the following method in the same manner as cord blood derived CD133 positive cells.
  • Human bone marrow fluid was diluted 3-fold with RPMI 1640 medium, then layered on a specific gravity centrifuge, and centrifuged at 400 G for 40 minutes using a swing rotor centrifuge.
  • the mononuclear cell fraction observed immediately above the specific gravity centrifugal liquid layer was collected with a pipet, and 5 volumes of RPMI 1640 medium was added, followed by centrifugation at 300 G for 10 minutes to obtain a cell pellet.
  • the cell pellet was resuspended, anti-CD133 antibody labeled with magnetic beads was added, and incubation was performed for 30 minutes at 4 degrees. Thereafter, only cells bound with anti-CD133 antibody were isolated using a magnetic column. The quality of the isolated cells was verified by flow cytometry to confirm that the purity of CD133 positive cells was 90% or more.
  • FIG. The therapeutic effect on promoting cranial nerve function recovery is shown in FIG.
  • Administration of 1 ⁇ 10 4 (human / mouse) human bone marrow-derived CD133 positive cells resulted in a statistically significant increase in the amount of behavioral activity against dark reaction, indicating that the brain injury was alleviated .
  • Example 3 Carotid Arterial Administration of Human Bone Marrow Derived Mononuclear Cells Has No Therapeutic Effect
  • the left middle cerebral artery is permanently occluded immediately after passing the olfactory cord, and it is physiological than the left common carotid artery 48 hours after the cerebral infarction Saline solution and human bone marrow-derived bone marrow-derived mononuclear cells were administered.
  • the number of cells administered was 5 ⁇ 10 3 (cells / animal), 1 ⁇ 10 4 (cells / animal) and 1 ⁇ 10 5 (cells / animal).
  • Three cerebral infarction mice in each group were used for the experiment.
  • a macro specimen brain atrophy score was used as an evaluation method for the reduction of brain damage after cerebral infarction.
  • the bone marrow mononuclear cells used for administration were purified by the following method. Human bone marrow fluid was diluted 3-fold with RPMI 1640 medium, then layered on a specific gravity centrifuge, and centrifuged at 400 G for 40 minutes using a swing rotor centrifuge. The mononuclear cell fraction observed immediately above the specific gravity centrifugal liquid layer was collected with a pipet, and after adding 5 volumes of RPMI 1640 medium, it was centrifuged at 300 G for 10 minutes to obtain bone marrow mononuclear cells. .
  • the therapeutic effect on brain damage reduction is shown in FIG. Contrary to our predictions before the experiment, administration of 5 ⁇ 10 3 (animals / animal), 1 ⁇ 10 4 (animals / animal) or 1 ⁇ 10 5 (animals / animal) of human bone marrow-derived bone marrow-derived mononuclear cells from the carotid artery In, it was shown that there was no brain damage reducing effect.
  • Example 4 Intracarotid administration of mouse bone marrow mononuclear cells has no therapeutic effect
  • Example 3 contrary to the inventors' expectation, no therapeutic effect was observed in carotid artery administration of human bone marrow-derived mononuclear cells. Therefore, in order to reexamine the experimental results, administration of mouse bone marrow mononuclear cells was performed in the carotid artery.
  • the left middle cerebral artery is permanently occluded immediately after passing the olfactory cord, and it is physiological than the left common carotid artery 48 hours after the cerebral infarction Saline and mouse bone marrow derived bone marrow derived mononuclear cells were administered.
  • the number of cells administered was 5 ⁇ 10 3 (cells / animal), 1 ⁇ 10 4 (cells / animal) and 1 ⁇ 10 5 (cells / animal).
  • Six cerebral infarction mice in each group were used for the experiment.
  • a macro specimen brain atrophy score was used as an evaluation method for the reduction of brain damage after cerebral infarction.
  • the bone marrow mononuclear cells used for administration were purified by the following method.
  • the bone marrow fluid obtained from the mouse femur was suspended in RPMI 1640 medium, overlaid with a specific gravity centrifuge, and centrifuged at 400 G for 40 minutes using a swing rotor centrifuge.
  • the mononuclear cell fraction observed immediately above the specific gravity centrifugal liquid layer was collected with a pipet, and after adding 5 volumes of RPMI 1640 medium, it was centrifuged at 300 G for 10 minutes to obtain bone marrow mononuclear cells. .
  • FIG. Similar to intracarotid administration of human bone marrow mononuclear cells, intracarotid arteries of 5 ⁇ 10 3 (per animal), 1 ⁇ 10 4 (per animal) or 1 ⁇ 10 5 (per animal) mouse bone marrow-derived mononuclear cells from mouse bone marrow The administration was shown to have no brain damage reducing effect.
  • Example 5 Comparison of Carotid Artery Administration and Tail Vein Administration of Human Umbilical Cord Blood-Derived CD133 Positive Cells
  • human cord blood-derived CD133 positive Cells were administered from the left tail vein. It was 5 ⁇ 10 3 (animals / animal), 1 ⁇ 10 4 (animals / animal) and 1 ⁇ 10 5 (animals / animal).
  • Three cerebral infarction mice in each group were used for the experiment.
  • FIG. 9 The therapeutic effect on brain damage reduction by tail vein administration of human umbilical cord blood-derived CD133 positive cells is shown in FIG.
  • administration of 1 ⁇ 10 4 (animal / animal) and administration of 1 ⁇ 10 5 (animal / animal) in the left carotid artery was found to have comparable therapeutic effects (FIG. 9).
  • FIG. 11 The therapeutic effect on the recovery of cranial nerve function recovery by tail vein administration of human umbilical cord blood-derived CD133 positive cells is shown in FIG.
  • administration of 1 ⁇ 10 4 (animal / animal) and administration of 1 ⁇ 10 5 (animal / animal) in the left carotid artery It was found that left tail vein administration had the same degree of cranial nerve function recovery promotion effect (FIG. 11).
  • It can be used for cerebral infarction treatment.

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Abstract

　少量でも十分な効果を発揮する脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬を提供する。脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬であって、CD133陽性細胞を有効成分として含有し、総頚動脈又は椎骨動脈に投与される。CD133陽性細胞は、ヒト臍帯血由来細胞又はヒト骨髄由来細胞である。本発明にかかる医薬は、ラクナ梗塞、アテローム血栓症脳梗塞、又は心原性脳塞栓症のいずれの場合でも好適に使用される。また、超急性期、急性期、亜急性期、及び、慢性期の何れにおいても使用可能である。

Description

脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬
　本発明は、脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬に関する。
　脳梗塞は、脳を栄養する動脈の閉塞又は狭窄のため脳虚血を来たし、脳組織が酸素又は栄養の不足のため壊死になる疾患であり、日本においては患者数約150万人であり毎年約50万人発症とされている。日本人の死亡原因の中でも多くを占めている高頻度な疾患である上、後遺症を残して介護が必要となることが多く福祉の面でも大きな課題を伴う疾患である。
　脳梗塞により障害された神経組織の再生には、脳微小血管網の再生が必要不可欠であり、近年、この組織再生には細胞治療が有効であることが判明している。
　非特許文献１には、骨髄間葉系幹細胞を患者の静脈内に投与する脳梗塞治療が記載されている。また、非特許文献２には、自己の骨髄由来単核球細胞を患者の静脈内に投与する脳梗塞治療が記載されている。この非特許文献２では、重症の心原性脳塞栓症症例で、且つ脳梗塞発症１週間後においても神経機能回復が十分でない患者群を対象としており、治療プロトコールの概略は、脳梗塞発症7～10日目に、局所麻酔身麻酔下で骨髄細胞の採取を行い、比重遠心法を用いて単核球分画の分離を行い、そして静脈内に５分間で全量投与する手技での治療が記載されている。
　また、非特許文献３では、ヒトCD34陽性幹細胞を経頸動脈的にラット脳内へ移植した例はあるが、生存率が低いことが記載されている。
中枢神経再生臨床試験の黎明　脳梗塞に対する再生医療　本望修　臨床評価　第36巻　別冊　2009年 脳梗塞後の修復メカニズムと細胞治療　田口明彦　脳循環代謝24：67～70　2013年 科学研究費助成事業（科学研究費補助金）研究成果報告書　課題番号22791119　CD34陽性細胞移植によるラット脳内血管・神経再生、抗うつ効果の検討　研究期間2010～2011
　しかし、上述の技術においては、脳梗塞患者に対して骨髄由来細胞を経静脈的に投与しているが、それらの細胞の大多数は、肺、脾臓あるいは肝臓で捕捉されるので、脳梗塞巣に到達して十分な効果を発揮するのが難しい。
　これに対して、投与細胞数を多くすることも考えられるが、骨髄由来間葉系幹細胞を大量に投与した場合には肺塞栓症を起こす可能性が高く、また骨髄由来単核球細胞投与に関しては大量の骨髄細胞を採取することによる血圧低下及びそれによって引き起こされる脳梗塞病変の拡大の危険性があるため、脳梗塞患者における採取可能量は血圧低下の危険性がない用量に限定されている。
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、少量でも十分な効果を発揮する脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬を提供することを目的とする。
　本発明にかかる医薬は、CD133陽性細胞を有効成分として含有し、総頚動脈又は椎骨動脈に投与されることを特徴とする、脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬である。
　本発明によれば、少量でも十分な脳梗塞の治療効果が得られる。
Atrophy indexの測定方法を示す図である。Atrophy index(％)＝X/Y×100(％)で算出される。 ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の頚動脈投与による脳障害軽減に関する治療効果を示す図である。 ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の頚動脈投与による大脳皮質機能回復促進に関する治療効果を示す図である。 ヒト骨髄由来CD133陽性細胞の頚動脈投与による脳障害軽減に関する治療効果を示す図である。 ヒト骨髄由来CD133陽性細胞の頚動脈投与による大脳皮質機能回復促進に関する治療効果を示す図である。 ヒト骨髄由来単核球細胞の頚動脈投与には、脳障害軽減に関する治療効果がないことを示す図である。 マウス骨髄由来単核球細胞の頚動脈投与には、脳障害軽減に関する治療効果がないことを示す図である。 ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の静脈投与による脳障害軽減作用に関する治療効果を示す図である。 ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の、頚動脈投与と静脈投与の脳障害軽減作用に関する比較検討を示す図である。 ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の静脈投与による大脳皮質機能回復促進に関する治療効果を示す図である。 ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の頚動脈投与と静脈投与の大脳皮質機能回復促進作用に関する比較検討を示す図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本実施形態にかかる脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬は、CD133陽性細胞を有効成分として含有し、総頸動脈、内頚動脈、前大脳動脈、中大脳動脈、後大脳動脈又は椎骨動脈に投与される。
　細胞を経静脈的に投与しても、肝臓等で捕捉されることにより、脳梗塞巣への到達の程度が十分ではない。そこで治療効果を上げるため、頚動脈や中大脳動脈等脳を直接栄養している大脳動脈内に細胞を投与することも考えられる。しかしながら、これは後述の実施例にて発明者らが見いだしたことであるが、骨髄由来単核球細胞には、脳の病変を悪化させる可能性のあるマクロファージ等の炎症性細胞が含まれており、頚動脈からの投与では、却って効果が減弱あるいは消失する可能性があり、単純に細胞を動脈内投与したのでは十分な治療効果が得られない。また、非特許文献３のように、CD34陽性細胞の経頸動脈投与は、何らかの理由により著しく生存率が低いことが報告されている。
　本発明者は、CD133陽性細胞分画のみを単離し、そのCD133陽性細胞を、脳に直接栄養する血管に投与することにより、驚くべき少量の細胞数で且つ脳病変の悪化を伴うことなく、脳の機能回復をもたらすことを新知見として見いだし、かかる事実に基づいて本発明を完成させた。
　本発明にかかる医薬は、脳梗塞の予防及び／又は治療の為のものであるが、本明細書において「予防」には疾患の発症を抑えること及び遅延させることが含まれ、疾患になる前の予防だけでなく、治療後の疾患の再発に対する予防も含まれる。一方、「治療」には、症状を治癒すること、症状を改善すること及び症状の進行を抑えることが含まれる。
　本発明にかかる医薬は、対象となる脳梗塞が、ラクナ梗塞、アテローム血栓症脳梗塞、又は心原性脳塞栓症のいずれの場合でも好適に使用される。
　また、本発明にかかる医薬は、超急性期、急性期、亜急性期、及び、慢性期の何れにおいても使用可能であるが、特に急性期および亜急性期において好適に使用可能である。ここで、超急性期は発症してから8時間以内の期間であり、血栓溶解療法や血栓除去などにより神経細胞死を阻止できる可能性が高い時期である。急性期は発症してから8時間～７日以内の期間であり、亜急性期は発症してから１週～４週以内の期間である。慢性期は発症してから１か月以上の期間であり、症状がほぼ固定されてリハビリとともに再発予防が中心となる期間であり、細胞壊死や組織の瘢痕化が見られる病態である。
　本発明においては、CD133陽性細胞は総頸動脈、内頚動脈、前大脳動脈、中大脳動脈、後大脳動脈又は椎骨動脈に投与される。脳は４本の大きな動脈によって給血されているが、総頸動脈(およびそれより分岐する動脈である内頚動脈、前大脳動脈、中大脳動脈)は前方循環用の動脈であり、椎骨動脈(およびそれより分岐する動脈である後大脳動脈)は後方循環用の動脈である。
　CD133陽性細胞は、高い分裂能、多分化能を有し、神経・血管発生に関わるサイトカインの産生能力を有する。CD133陽性細胞は、特に限定されるものではなく、臍帯血由来細胞、ヒト骨髄由来細胞、ヒト末梢血由来細胞、胎児肝臓由来等が採用されるが、好ましくはヒト臍帯血由来細胞又はヒト骨髄由来細胞である。
　投与されるCD133陽性細胞の濃度は、特に限定されるものではないが、例えば５×１０4個／ｋｇ～１×１０7個／ｋｇとすることができ、好適には1×１０5個／ｋｇ～１×１０6個／ｋｇであり、特に好適には５×１０5個／ｋｇである。
　本発明においては、更に神経栄養因子を含有することも可能である。神経栄養因子は、特に限定されるものではないが、例えば、BDNF、VEGF、NGF、GDNF、LIF、MYC、Neurotrophine3、TP53又はBAX等を使用することができるが、好ましくはBDNFである。BDNFは、脳は虚血に対する抵抗性を強め、神経幹細胞が活性化させることで神経新生を促進し、シナプス形成を促すとされている。
　また、本発明は、脳梗塞の予防及び／又は治療の為のキットであって、該キットは、CD133陽性細胞を有効成分として含有する組成物を含む容器を備える。該キットは、CD133陽性細胞を有効成分として含有する組成物を、総頚動脈又は椎骨動脈に投与することに関する説明書を含む。
　また、本発明は、脳梗塞の予防及び／又は治療の為の製品であって、該製品は、(i)CD133陽性細胞を有効成分として含有する組成物と、(ii)容器と、(iii)前記組成物が、脳梗塞の予防及び／又は治療のために使用することができる旨を示し、前記組成物を総頚動脈又は椎骨動脈に投与することに関する、指示書、説明書、添付文書、又は製品ラベルと、を含む。
　（実施例１：ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の頚動脈投与による治療効果）
　発明者らが開発した再現性の非常に高い、脳梗塞モデルマウス(特許第4481706号)を用いた。脳梗塞作成48時間後に、左総頸動脈より生理食塩水、ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞を投与した。脳梗塞後の脳障害軽減に関する評価法として、マクロ標本による脳萎縮スコア(Taguchi et al. Eur J Neurosci. 2007;26(1):126-33.)を使用した。本モデルは、大脳皮質に限局した脳梗塞が生じるため、脳神経機能回復促進評価法として、オープンフィールドテストによる明暗条件に対する反応性(Taguchi et al. J Clin Invest. 2004;114(3):330-8)を使用した。細胞投与数は5ｘ103(個/匹)、1ｘ104(個/匹)であった。実験には各群4匹の脳梗塞マウスを使用した。
　脳梗塞モデルは下記の手法で作成した。8週齢の重症複合免疫不全マウス(SCIDマウス;CB-17/lcr-scid/scidJcl)をハロセン麻酔により全身麻酔し、左頬骨部よりアプローチして左中大脳動脈に直達できるよう頭蓋底に1.5mm程度の穿孔を行った。嗅索を通過した直後(嗅索交差部の遠位側)の左中大脳動脈を、バイポーラ電気メスを用いて凝固させ、凝固後切断することにより、左中大脳動脈を永久に閉塞し、左中大脳動脈領域の皮質に限局する脳梗塞モデルを作成した。
　投与に用いるCD133陽性細胞は下記の手法で精製を行った。臍帯血をRPMI1640培地(Thermo Fisher Scientific社製)で3倍に希釈した後、比重遠心液(比重1.077、[フィコール　GEヘルスケア製)に重層し、スイングロータ式遠心機を用いて400Gで40分間遠心した。比重遠心液層の直上に観察される単核球細胞分画をパイペットで採取し、5倍量のRPMI1640培地を加えた後、300Gで10分間遠心を行い、細胞ペレットを得た。細胞ペレットを再懸濁し、磁気ビーズで標識された抗CD133抗体(Miltenyi社製)を加え、4度で30分間インキュベートを行った。その後、磁気カラムを用いて、抗CD133抗体がバインドしている細胞のみを単離した。単離した細胞の品質をフローサイトメトリーにより検証し、CD133陽性細胞の純度が90％以上であることを確認した。
　頚動脈からの投与は下記の方法で行った。脳梗塞モデルマウスをハロセン麻酔により全身麻酔し、頸部を正中切開した。左総頸動脈を剥離し、近位部を動脈止血クリップで血流を遮断した後、31G注射針で穿刺し、細胞(あるいは生理食塩水)の投与を行った。細胞投与後は穿刺部を医療用アロンアルファ―で止血し、止血確認後クリップを外して血流を再開し、皮膚創部の縫合を行った。
　マクロ標本による脳萎縮スコアの詳細は下記の通りである。本研究で使用した脳梗塞モデルマウスは左中大脳動脈が潅流する大脳皮質に限局したものであるが、脳梗塞後は炎症細胞の浸潤等により、対側(脳梗塞を作成しない側)に比し、脳梗塞側では明らかな脳の委縮が生じる。我々はその委縮の程度の定量的な評価にAtrophy indexが有用であることを示してきた(Taguchi et al. Eur J Neurosci. 2007;26(1):126-33.)。Atrophy indexの測定方法を図1に示す。図１に示されるように、Atrophy indexはX/Y×100(％)にて示される。
　大脳皮質機能評価法として、オープンフィールドテストを実施した。その測定原理及び測定法は下記の通りである。マウスは夜行性であるため、正常のマウスにおいては、明条件では行動量が低下し、環境を暗くすることにより行動量が増加することが知られている。明条件下における行動抑制においては大脳皮質機能が重要であり、また細胞治療により大脳皮質機能回復が回復し、明条件下における行動抑制機能が回復することが示されてきた(Taguchi et al. J Clin Invest. 2004;114(3):330-8)。本研究では、マウスをオープンフィールド測定装置((株)行医研製、自由移動空間30cmｘ30cm)にて明条件下で30分間立ち上がり反応(rearing)の回数を自動カウントし、その後暗条件下で30分間立ち上がり反応の回数をカウントした。明状態から暗状態に変化した時の運動量の増加を、機能回復の指標として用いた。
　脳障害軽減に関する治療効果を図２に示す。Atrophy indexは脳萎縮を示す指標である。1ｘ104(個/匹)のヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の投与により、統計学的にも有意に脳障害軽減効果があることが示された。
　脳神経機能回復促進に関する治療効果を図３に示す。図３では、コントロールの場合、5ｘ103(個/匹)のヒト臍帯血由来CD133陽性細胞が投与された場合、及び、1ｘ104個のヒト臍帯血由来CD133陽性細胞が投与された場合のそれぞれにつきrearing(立ち上がり)が示されている。Rearingは明状態から暗状態に変化させた場合の運動量の変化を示す。生理食塩水投与コントロール群では暗状態への変化によっても有意な運動量の増加を認めなかったが、1ｘ104(個/匹)のヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の投与により、統計学的に有意な暗反応に対する行動量の増加が観察されるようになった。即ち1ｘ104(個/匹)のヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の投与で脳神経機能回復促進効果があることが示された。
　（実施例２：ヒト骨髄由来CD133陽性細胞の頚動脈投与による治療効果）
　発明者らが開発した再現性の非常に高い、脳梗塞モデルマウスを用いて、嗅索を通過した直後における左中大脳動脈を永久閉塞し、脳梗塞作成48時間後に、左総頸動脈より生理食塩水、ヒト骨髄由来CD133陽性細胞を投与した。細胞投与数は5ｘ103(個/匹)、1ｘ104(個/匹)であった。実験には各群3匹の脳梗塞マウスを使用した。脳梗塞後の脳障害軽減に関する評価法として、マクロ標本による脳萎縮スコアを使用し、脳神経機能回復促進評価法として、オープンフィールドテストによる明暗条件に対する反応性を使用した。
　投与に用いる骨髄由来CD133陽性細胞は臍帯血由来CD133陽性細胞と同様に下記の手法で精製を行った。ヒト骨髄液をRPMI1640培地で3倍に希釈した後、比重遠心液に重層し、スイングロータ式遠心機を用いて400Gで40分間遠心した。比重遠心液層の直上に観察される単核球細胞分画をパイペットで採取し、5倍量のRPMI1640培地を加えた後、300Gで10分間遠心を行い、細胞ペレットを得た。細胞ペレットを再懸濁し、磁気ビーズで標識された抗CD133抗体を加え、4度で30分間インキュベートを行った。その後、磁気カラムを用いて、抗CD133抗体がバインドしている細胞のみを単離した。単離した細胞の品質をフローサイトメトリーにより検証し、CD133陽性細胞の純度が90％以上であることを確認した。
　脳障害軽減に関する治療効果を図４に示す。1ｘ104(個/匹)のヒト骨髄由来CD133陽性細胞の投与により、統計学的にも有意に脳障害軽減効果があることが示された。
　脳神経機能回復促進に関する治療効果を図５に示す。1ｘ104(個/匹)のヒト骨髄由来CD133陽性細胞の投与により、暗反応に対する統計学的に有意な行動量の増加が観察されるようになり、脳障害軽減効果があることが示された。
　（実施例３：ヒト骨髄由来単核球細胞の頚動脈投与では治療効果はない）
　発明者らが開発した再現性の非常に高い、脳梗塞モデルマウスを用いて、嗅索を通過した直後における左中大脳動脈を永久閉塞し、脳梗塞作成48時間後に、左総頸動脈より生理食塩水、ヒト骨髄由来骨髄由来単核球細胞を投与した。細胞投与数は5ｘ103(個/匹)、1ｘ104(個/匹)、1ｘ105(個/匹)であった。実験には各群3匹の脳梗塞マウスを使用した。脳梗塞後の脳障害軽減に関する評価法として、マクロ標本による脳萎縮スコアを使用した。
　投与に用いる骨髄単核球細胞は下記の手法で精製を行った。ヒト骨髄液をRPMI1640培地で3倍に希釈した後、比重遠心液に重層し、スイングロータ式遠心機を用いて400Gで40分間遠心した。比重遠心液層の直上に観察される単核球細胞分画をパイペットで採取し、5倍量のRPMI1640培地を加えた後、300Gで10分間遠心を行い、骨髄単核球細胞を得た。
　脳障害軽減に関する治療効果を図６に示す。発明者らの実験前の予想に大きく反し、5ｘ103(個/匹)、1ｘ104(個/匹)あるいは1ｘ105(個/匹)のヒト骨髄由来骨髄由来単核球細胞の頚動脈からの投与では、脳障害軽減効果がないことが示された。
　（実施例４：マウス骨髄単核球細胞の頚動脈内投与では治療効果はない）
　実施例3では発明者らの予想に反して、ヒト骨髄由来単核球細胞の頚動脈投与では治療効果が見られなかった。そこで、その実験結果を再検討するため、マウス骨髄単核球細胞の頚動脈内投与を行った。
　発明者らが開発した再現性の非常に高い、脳梗塞モデルマウスを用いて、嗅索を通過した直後における左中大脳動脈を永久閉塞し、脳梗塞作成48時間後に、左総頸動脈より生理食塩水、マウス骨髄由来骨髄由来単核球細胞を投与した。細胞投与数は5ｘ103(個/匹)、1ｘ104(個/匹)、1ｘ105(個/匹)であった。実験には各群6匹の脳梗塞マウスを使用した。脳梗塞後の脳障害軽減に関する評価法として、マクロ標本による脳萎縮スコアを使用した。
　投与に用いる骨髄単核球細胞は下記の手法で精製を行った。マウス大腿骨より得られた骨髄液をRPMI1640培地で懸濁した後、比重遠心液に重層し、スイングロータ式遠心機を用いて400Gで40分間遠心した。比重遠心液層の直上に観察される単核球細胞分画をパイペットで採取し、5倍量のRPMI1640培地を加えた後、300Gで10分間遠心を行い、骨髄単核球細胞を得た。
　脳障害軽減に関する治療効果を図７に示す。ヒト骨髄単核球細胞の頚動脈内投与と同様に、5ｘ103(個/匹)、1ｘ104(個/匹)あるいは1ｘ105(個/匹)のマウス骨髄由来骨髄由来単核球細胞の頚動脈内投与では、脳障害軽減効果がないことが示された。
　（実施例５：ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の頚動脈投与と尾静脈投与の比較）
　発明者らが開発した再現性の非常に高い、脳梗塞モデルマウスを用いて、嗅索を通過した直後における左中大脳動脈を永久閉塞し、脳梗塞作成48時間後に、ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞を左尾静脈より投与した。5ｘ103(個/匹)、1ｘ104(個/匹)、1ｘ105(個/匹)であった。実験には各群3匹の脳梗塞マウスを使用した。脳梗塞後の脳障害軽減に関する評価法として、マクロ標本による脳萎縮スコアを使用し、脳神経機能回復促進評価法として、オープンフィールドテストによる明暗条件に対する反応性を使用した。
　ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の尾静脈投与による脳障害軽減に関する治療効果を図８に示す。実施例１において全く同一条件で実施したヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の頚動脈投与による治療効果との比較検討において、1ｘ104(個/匹)の左頚動脈内投与と1ｘ105(個/匹)の左尾静脈内投与が同程度の治療効果を有していることが判明した(図９)。
　ヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の尾静脈投与による脳神経機能回復促進に関する治療効果を図10に示す。実施例1において全く同一条件で実施したヒト臍帯血由来CD133陽性細胞の頚動脈投与による治療効果との比較検討において、1ｘ104(個/匹)の左頚動脈内投与と1ｘ105(個/匹)の左尾静脈内投与が同程度の脳神経機能回復促進効果を有していることが判明した(図11)。
　脳梗塞治療に利用できる。

Claims (6)

  1. 　脳梗塞の予防及び／又は治療の為の医薬であって、CD133陽性細胞を有効成分として含有し、総頚動脈又は椎骨動脈に投与されることを特徴とする医薬。
  2. 　前記CD133陽性細胞は、ヒト臍帯血由来細胞又はヒト骨髄由来細胞であることを特徴とする請求項１に記載の医薬。
  3. 　前記CD133陽性細胞は、1×１０5個／ｋｇ～１×１０6個／ｋｇであることを特徴とする請求項１又は２に記載の医薬。
  4. 　更に神経栄養因子を含有することを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の医薬。
  5. 　急性期あるいは亜急性期脳梗塞において投与されることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の医薬。
  6. 　血栓溶解薬、脳保護薬、抗脳浮腫薬、抗トロンビン薬、抗血小板薬又は抗凝血薬の何れかと併用されることを特徴とする請求項５に記載の医薬。
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