TW202120108A - 心血管疾病之治療 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及基於細胞的心血管疾病的治療。本發明還對心血管疾病患者以及遭受其他形式的神經壓力或損傷的患者提供治療以改善神經組織及改善行為及神經功能。

Description

心血管疾病之治療 【相關申請的交叉引用】
本申請主張2019年8月20日提交的美國臨時申請案第62/889,225號的優先權。該申請案的內容以引用方式整體併入本文。
本發明涉及對患者的心血管疾病諸如中風及心肌病之基於細胞的治療。本發明還對心血管疾病患者以及遭受其他形式的神經壓力或損傷的患者提供治療以改善神經組織及改善行為及神經功能。
心血管疾病(CVD)是一類涉及心臟或血管的疾病。CVD包含冠狀動脈疾病(CAD)諸如心絞痛及心肌梗塞(通常稱為心臟病發作)。其他CVD包含中風、心臟衰竭、高血壓心臟病、風濕性心臟病、心肌病、心律不整、先天性心臟病、瓣膜性心臟病、心臟炎、主動脈瘤、周邊動脈疾病、血栓栓塞性疾病及靜脈血栓。心血管疾病是全球死亡的主要原因。例如，中風是導致死亡及身體失能的第二大原因。雖然世界上有六分之一的人受到中風的影響，而每40秒在美國就有一個人中風。在許多國家，中風照護的費用超過醫療保健預算的5%(Mukherjee et al.,Neurosurg.2011,76,S85-S90)。由於人口高齡化，中風給全 世界帶來更大的健康及經濟負擔。小的中風可能只會導致小問題，諸如手臂或腿部無力，而較大的中風可能會導致一側麻痺或無法說話。超過三分之二的中風患者即使在急性中風階段接受最佳照護也無法完全恢復(Hacke et al.,Lancet 2004,363,768-774)。目前，唯一可用的經批准的缺血性中風藥理治療方法是組織血漿素原活化因子(tissue plasminogen factor，TPA)。然而，相對較少的患者合格接受這種治療。需要用於治療心血管疾病的新療法。
本發明在多個態樣解決了上述需求。
在一態樣，本發明提供治療或改善心血管疾病或腦損傷的方法。該方法包括辨識有此需要的受試者，並對受試者投予有效量的包括臍帶血(umbilical cord blood，UCB)或臍帶血(cord blood，CB)的治療組成物。
治療組成物可包括血漿減除(plasma-depleted，PD)UCB或紅血球減少(red cell-reduced，RCR)UCB。在一些具體例中，治療組成物可進一步包括冷凍保護劑，諸如二甲基亞碸(DMSO)。當與全血UCB相比時，PD UCB的紅血球沒有減除。例如，PD UCB可包括至少50體積%的紅血球，或包括所有體積的紅血球。治療組成物可包括5體積%至15體積%(例如，5至10體積%)的冷凍保護劑。該組成物可經由將包括UCB及上述冷凍保護劑的貯存冷凍組成物解凍而獲得。解凍步驟可在1至10分鐘內，諸如5分鐘內完成。在一個實例中，解凍步驟包括在維持於約37℃至約41℃之間，較佳地，於約37℃±2℃之間的浴中培育所貯存的組成物。一旦解凍，所貯存的組成物不必清洗，即可作為治療組成物而直接投予受試者。投予步驟可以在解凍完成後的1至2小時 內完成。UCB包括單核細胞，並且單核細胞以約1×106個細胞/kg至約1×108個細胞/kg的劑量投予受試者。在一個實例中，以約2至5×108個單核細胞/kg至約1×109個細胞/kg的量投予單核細胞。可經由以約1至20ml/分鐘，諸如約5至10ml/分鐘的輸注來投予治療組成物。該方法可進一步包括對受試者投予血腦障壁(BBB)透化劑組成物。BBB透化劑的實例包括甘露醇。
心血管疾病可以是中風或心肌病。中風的實例包含缺血性中風、出血性中風、急性中風或亞急性中風。在較佳的具體例中，受試者是人類患者。在投予步驟之前，患者可具有美國國家衛生研究院腦中風評估表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)評分為4至32或更高，諸如6至18或8至16。心肌病的實例包含缺血性心肌病。
該方法可包括HLA分型接受者-受試者。較佳地，接受者-受試者及選定的臍帶血單位或多臍帶血移植物單位應為4/6或更好的HLA匹配。該方法可包括或可不包括ABO分型接受者-受試者，因為沒有報導過接受者-受試者及供體之間的ABO血型不相容為臍帶血移植上的問題。即，不需要接受者-受試者與供體之間的ABO匹配或相容性。
本文所述的方法可進一步包括對受試者投予免疫抑制劑，諸如氫化可體松。較佳地，在投予細胞之前、期間或之後，不給受試者投予纖維蛋白溶解藥物，諸如組織血漿素原活化因子，因為這種纖維蛋白溶解藥物可能損傷所投予的細胞。
本揭示內容還提供上述治療組成物在製備用於治療心血管疾病或腦損傷之藥物的用途。
在下面的說明中闡述本發明的一個或多個具體例的細節。從說明及申請專利範圍中，本發明的其他特徵、目的及優點將顯而易見。
圖1是顯示中風患者的臨床研究時間表的圖。
圖2是顯示UCB輸注後聯合甘露醇投予的圖。
圖3是顯示患者接受UCB輸注後運動功能改善的圖。
圖4A、圖4B及圖4C是顯示從CB輸液前1天(基線)到CB輸液後12個月的神經功能結果的圖。(A)NIHSS、(B)Berg平衡得分及(C)Barthel指數得分。
圖5A、圖5B、圖5C及圖5D是顯示從中風後2小時到CB輸液後6個月所檢查的擴散加權成像(DWI)結果的照片。(a)中風後2小時、(b)CB輸液後1天、(c)CB輸液後3個月、(d)CB輸液後6個月。
圖6A、圖6B、圖6C及圖6D是顯示從中風後2小時到CB輸液後6個月所檢查的T2影像的照片。(a)中風後2小時、(b)CB輸液後1天、(c)CB輸液後3個月、(d)CB輸液後6個月。
本發明提供治療心血管疾病，諸如中風及心臟病的方法及組成物。本發明的某些態樣至少部分是基於意外發現，即同種異體UCB單位對於治療急性缺血性中風患者是安全及有效的。如本文所揭露，UCB單位不僅具有幹細胞，還具有優異的免疫耐受性及免疫調控活性以及高水平的因子諸如 EGF、VEGF、G-CSF及IL-10。因此，輸注UCB產品不僅可恢復免疫恆定性，而且可以促進急性中風患者的腦修復。
中風
中風是導致死亡的第二大原因，也是導致身體失能的第三大原因，影響全世界六分之一的人並帶來巨大的健康及經濟負擔。每年有超過1500萬人中風。在這些人當中，有30至35%的人死亡，存活的近75%則承受永久性失能。
當將氧氣及營養物質輸送到大腦的血管被血塊阻塞(稱為缺血性中風)或血管破裂並阻止血液流向大腦(稱為出血性中風)時，就會發生中風。發生這種情況時，大腦的一部分無法獲取所需的血液及氧氣，從而導致腦細胞死亡。大約80%的中風是缺血性中風。當大腦的動脈變窄或阻塞，導致血液流量嚴重減少(缺血)時，就會發生缺血性中風。無對比劑施打電腦斷層掃描(CT)是對可疑中風患者進行初步評估的主要成像方式。三個主要階段用於描述中風的CT表現：急性(少於24小時)、亞急性(24小時至5天)及慢性(幾週)。Birenbaum et al.,West J Emerg Med.2011 Feb；12(1)：67-76。
急性期的目前治療包含抗凝血劑、抗血小板劑及血栓溶解劑。此類血栓溶解劑必須在中風後3小時內使用，最多只能有效6小時。再者，血栓溶解劑使出血率增加15至20%。缺血性中風後，每小時約有1.2億個神經元死亡，相當於腦功能衰老3.6年(Lakhan SE et al.,Journal of Translational Medicine.2009；7：97)。再者，由於死亡的神經元無法再生，關鍵是找到一種再生神經元以及其他細胞的方法。細胞療法為中風的治療提供重大突破。例如，發明人團隊使用G-CSF注射結合自體造血幹細胞(CD34+)腦移植治療15例慢性 缺血性中風患者。結果確認其可行性及安全性。然而，結果也表明，患者的細胞年齡對改善程度有重要影響。例如，年齡較大個體(60歲以上)之幹細胞的增殖及分化能力不如較年輕個體的良好。
如本文所揭露，I期臨床研究顯示顯著的治療進展：同種異體PD-臍帶血輸注對於治療中風患者是安全及有效的。
心臟病
心臟病(cardiac disease)或心臟病(heart disease)是存在幾種類別或類型的疾病(例如，缺血性心肌病(ICM)、擴張性心肌病(DCM)、主動脈瓣狹窄(AS))，並且許多需要獨特的治療策略。因此，心臟病不是單一性疾病，而是經由不同的致病機制由不同的細胞類型(例如，心肌細胞)引起的一群族疾病。如本文所使用，心臟病包含下列非限制性實例：心臟衰竭(例如，鬱血性心臟衰竭)、缺血性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、酒精性心肌病、病毒性心肌病、心搏過速性心肌病、壓力性心肌病、類澱粉性心肌病、致心律失常性右心室心肌病、左心室緻密不全、心內膜纖維彈性組織增生症、主動脈瓣狹窄、主動脈瓣閉鎖不全、二尖瓣狹窄、二尖瓣閉鎖不全、二尖瓣脫垂、肺動脈瓣狹窄、肺動脈瓣閉鎖不全、三尖瓣狹窄、三尖瓣閉鎖不全、先天性疾病、遺傳性疾病，或其組合。
本文所揭露的一些具體例涉及用於治療受試者心臟病的方法。該方法包含對受試者投予或提供包括臍帶血的治療組成物。
臍帶血
臍帶血(umbilical cord blood)(或臍帶血(cord blood))是分娩後殘留在胎盤及連接的臍帶中的血液，通常會收集起來，因為其中含有幹細胞，可用 於治療造血及遺傳性疾病。UCB由全血中發現的所有元素組成，即，紅血球、白血球、血漿及血小板。
如本文所揭露的，使用體積減小的臍帶血樣本。目前使用兩種方法用於減少臍帶血樣本並貯存UCB單位：紅血球減少(RCR)方法及血漿減除(PD)方法。RCR方法於1990年代初期開發(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(22)：10119-10122；1995)，該方法在高張溶液(羥乙基澱粉(hetastarch)或白蛋白)中離心臍帶血，除去除21ml外的所有細胞及液體，並加入4ml二甲基亞碸(DMSO)。由Stemcyte開發的PD方法，除去血漿，但保留所有細胞。相較於25ml/單位的RCR單位，PD單位的體積通常為80至120ml/單位。參見US8048619及Biol.Blood Marrow Transplant.13(11)：1346-1357；2007。雖然如此製備的各種方法及UCB都有其優缺點(Young et al.,Cell Transplantation,Vol 23,pp.407-415,2017)，但兩者均可使用於實踐本文所揭露的發明。
為了收集及貯存UCB單位，血庫在臍帶血中添加DMSO，以在冷凍過程中保護細胞。DMSO減少細胞內部的冰形成，並使>90%的細胞得以在冷凍中存活。然而，>1%的DMSO在體溫(37℃)對血球有毒性。由於這個原因，在發明所屬技術領域中的標準是必須小心以對患者的DMSO投予最小化，就在冷凍前才將DMSO添加到臍帶血中，並在解凍後立即將其除去，以使細胞暴露於1%的期間不超過30分鐘。如果臍帶血暴露於>1%的DMSO經30分鐘或更長時間，臍帶血細胞將死亡並結塊。當靜脈輸注臍帶血時，這可能導致心臟栓塞、胸痛及其他症狀。Young et al.,Cell Transplantation,Vol 23,pp.407-415,2017。然而，如本文所揭露，意外的是，未去除DMSO的PD-UCB單位對於治療急性缺血性中風的患者是安全且有效的。
PD-UCB
本發明的PD-UCB組成物具有實質上從UCB單位中減除血漿及沒有從UCB單位中減除紅血球(RBC)的獨特特徵。可經由將血漿減除與造血幹細胞的冷凍保存、選擇、解凍及/或移植相組合的過程來製備此類UCB單位，以經由最大限度地提高後處理細胞的回收率及解凍後的輸注細胞劑量來提供優異的臨床效果。在一個實例中，可經由US8048619中所說明的方法來製備血漿減除、RBC未減除的UCB單位，其內容以引用方式整體併入本文中。
簡言之，將新生兒的UCB收集到諸如含有抗凝血劑的多袋血液收集袋的收集容器中。收集容器通常含有約0.1至約100ml的抗凝血劑(例如，約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ml)。較佳地，收集容器含有約23ml至約35ml的抗凝血劑。抗凝血劑的非限制性實例包含檸檬酸鹽/磷酸鹽/葡萄糖及腺苷混合物(CPDA)、檸檬酸鹽/磷酸鹽及葡萄糖混合物(CPD)，以及酸/檸檬酸鹽及葡萄糖混合物(ACD)。較佳地，抗凝血劑是CPDA，可包括0.299%的無水檸檬酸、0.263%的脫水檸檬酸鈉、0.222%的磷酸二氫鈉(一水合物)、3.19%的葡萄糖及0.0275%的腺苷。CPDA是等張的，並且具有中性pH，因此抗凝血劑與血液的比例並不重要。然而，發明所屬技術領域的技術人員將理解，收集容器中抗凝血劑的組成及/或體積可取決於從供體收集的臍帶血的體積。可稱重收集袋的重量，經由從合併重量減去抗凝劑減去收集袋的重量來測定UCB收集體積。袋中的體積由UCB的體積加上抗凝血劑的體積來測定。
收集到的UCB較佳在大約43小時內送到UCB處理實驗室，以便在出生後約48小時進行冷凍保存。但在出生後約72小時進行冷凍保存也可以產生可接受的結果。
此時可對全臍帶血進行檢測以測定全血球計數。超過95%的樣本，用抗凝血劑預處理的血球比容(即，紅血球的體積百分比)通常為約20%至約60%。紅血球濃度通常在約2至約10x106/μl之間，而白血球濃度通常在約1至約30x106/ml之間。
UCB單位可以在，例如，3袋收集血袋中進行離心，以將細胞部分與上面血漿部分分開。上面血漿部分可移入第二袋中，然後密封。在某些情況下，如果剩餘的大部分細胞部分含量超過60cc，則可將產品分為兩部分(例如，在原來袋中及在第三袋中)，各個都在其自己的收集/轉移袋中。血漿減除後，相對於全血或紅血球減除單位，UCB單位的血球比容(HCT)及RBC濃度均增加約1.2至約3倍(平均值=約1.6至約1.8倍；中位數=約1.7至約1.8倍)。
然後，可以經由無菌對接設備將各收集/轉移袋中的產品轉移到一個冷凍袋(例如，CRYOCYTE袋)中。通常，UCB單位可在血漿減除並添加預冷(即，約4℃)的冷凍保護劑後冷凍保存在一個冷凍袋中，例如，最大體積約75cc。然而，有些UCB單位可分成兩個袋子，例如，最大合併體積約為150cc。
然後可在添加一種或多種冷凍保護劑之前將血漿減除UCB/抗凝血劑混合物冷卻至約4℃。通常，可以以等於UCB/抗凝血劑體積約25%至約50%的量添加溶液形式的冷凍保護劑。例如，在血漿減除樣本中的UCB/抗凝血劑體積為60ml的情況下，冷凍保護劑溶液的體積可以是15ml。結果，UCB 單位一般包括約5體積%至約15體積%的冷凍保護劑，例如，約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的冷凍保護劑體積。在較佳具體例中，冷凍保護劑溶液包括約50% DMSO及約5% Gentran 40的混合物(即，DMSO與Gentran 40的比率為約10：1)，以提供約5%約10%的最終DMSO濃度。DMSO/Gentran 40冷凍保護劑溶液可經由注射泵以每分鐘約0.75ml的速度添加到UCB/抗凝血劑混合物中，冷凍袋位於旋轉器上的冰袋之間，以達到DMSO的最終濃度約5%到約10%。相對於全血或紅血球減除單位，同時含有抗凝血劑及冷凍保護劑的血漿減除UCB單位可具有較高的血球比容(HCT)及RBC濃度(即，至少約1.6倍)。
然後可將同時含有抗凝血劑及冷凍保護劑的血漿減除UCB混合物以US8048619中所述的方式及發明所屬技術領域已知的其他方法冷凍並貯存。經處理的UCB單位通常可以在液態氮(例如，液相及/或氣相)中在約-135℃下，較佳在約-150℃下貯存。
在輸注或移植至受試者之前，如本文所說明來解凍血漿減除UCB單位。解凍的單位在投予前經清洗或未清洗。較佳地，未清洗解凍的單位。在某些實例中，經由直接輸注將解凍的、未清洗的單位投予患者。在某些其他實例中，將解凍的、未清洗的單位用含有例如人血清白蛋白及Gentran(聚葡糖)的等張溶液稀釋及/或重構後，經由輸注而投予患者。如以下實施例所示，解凍後未清洗的血漿減除UCB單位改善移植此類單位的患者的臨床結果。事實上，相對於經清洗單位，血小板植入的累積發生率以及中性粒細胞及血小板的植入速度均增加，指明解凍後的清洗實際上延遲或減少造血幹細胞植 入的累積發生率。此外，相對於清洗單位，解凍後未清洗的血漿減除UCB單位提供更好的有核細胞回收，從而增加所投予的總有核細胞(TNC)劑量。
與成人周邊血液相比，人類臍帶血含有更豐富的造血原始細胞及大量內皮原始細胞，它們在體外及體內具有強大的複製能力。如本文所揭露的，使用R&D Human XL Cytokine Discovery 14 Plex Panel對冷凍保存的血漿減除臍帶血產品樣本進行檢測，以測定細胞激素概況。結果示於表1A。如表中所示，抗炎細胞激素IL-10的水平顯著高於促炎細胞激素諸如IL-1-β、IL-2、IL-6、IFN-γ及TNF-α。與細胞激素IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ及TNF-α相比，觀察到相對較高水平的生長因子(GF)，諸如EGF、FGF-鹼性、VEGF、G-CSF及GM-CSF。PD CB產品中大量的EGF、VEGF、G-CSF及IL-10使發明者不僅可恢復免疫恆定性，而且可加強腦中風患者受損的腦神經系統的修復。
表1A.冷凍保存PD臍帶血產品中細胞激素及生長因子概況
Figure 109128449-A0202-12-0011-1
Figure 109128449-A0202-12-0012-2
表1B.成人血漿/血清中細胞激素及生長因子概況
Figure 109128449-A0202-12-0012-3
(J Cell Mol Med.2018；22：6157-6166)。
此外，已發現臍帶血幹細胞增殖並分化成神經細胞，並且有效地治療數種神經退行性疾病。對於腦中風，靜脈注射臍帶血單核細胞可回復運動能力並具有神經保護功能。人類臍帶血單核細胞移植後，發炎因子(諸如TNF-α、IL-1β、IL-2等)的水平受到抑制。相反地，炎症抑制劑(諸如IL-10、TGF-β1等)的水平則增加。所以，人類臍帶血單核細胞移植後，抗炎過程達到神經細胞的保護作用。除了具有抗炎作用外，臍帶血單核細胞還可自發地轉移到受損的中樞神經系統，有些則轉移到脾臟。因此，臍帶血單核細胞可參與淋巴細胞的生合成，且一些研究已經確認，淋巴細胞與急性中風大鼠的神經保護作用有關。經由靜脈投予進行人類臍帶血單核細胞(HUCBM)在急性缺血性中風的I期臨床試驗。本揭示內容報導在HUCBM療法後12個月幾乎完全從右側偏癱康復的第一位受試者。
用途
本發明提供用於治療或改善受試者的心血管疾病、腦損傷或神經退行性疾患的組成物及方法。在一個具體例中，受試者的腦內或周圍的血液流動受到破壞。較佳地，該損傷或疾患是腦缺血。為此，將本文所述的含有UCB細胞的治療組成物與BBB透化劑一起全身性投予患者。可以在投予治療組成物之前、之後或同時對受試者投予BBB透化劑。
據此，在本發明範圍內的是含有有效量的UCB細胞及視需要地有效量的BBB透化劑的治療組成物。在一個具體例中，UCB細胞得自人類臍帶血，並包括體積減小的臍帶血樣本。在另一個具體例中，細胞包括有效量的 單核細胞。在一個具體例中，儘管考量了其他投予方法，該組成物旨在用於對個體的全身性投予。
投予的單核細胞數，例如，單劑量，可約為或至少或大於，例如，每次投予1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011個細胞。在一個具體例中，單核細胞的有效量為約1×107至1×109個細胞，更佳為約1×108至約1×109個細胞，諸如約2至5×108個細胞。在另一個具體例中，單核細胞的有效量為約0.001至2×108個細胞/kg，諸如0.01至2×108個細胞/kg、0.02至1×108個細胞/kg及0.5至5×107個細胞/kg。
本發明還提供一種治療或改善受試者的心血管疾病、腦損傷或神經退行性疾患的方法。該方法包括對患有該病症或疾病的個體投予有效量的UCB細胞及有效量的BBB透化劑。在一個具體例中，UCB細胞包括體積減少的臍帶血樣本。在另一個具體例中，細胞包括有效量的單核細胞。在一個具體例中，單核細胞可在從人類臍帶血獲得後加以冷凍，並在投予受試者之前解凍。
對於靜脈內投予，可以以，例如，約或不超過10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL，經由靜脈輸注而遞送複數個UCB細胞。可在任何醫學上可接受的期間輸注細胞。例如，可在大約或不超過15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘的過程中，經由如，靜脈內或動脈內，例如，輸注，而投予上述的細胞數量。
可在發展出可歸因於個體中的個體破壞的一種或多種症狀或神經性缺損(例如，缺氧(hypoxic)損傷或乏氧(anoxic)損傷)之後的任何時間將UCB 細胞投予患有大腦或CNS內或周圍的血流中斷的個體。例如，可在發展出個體所展現的第一種症狀或神經功能缺損的最初21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天內投予UCB細胞。較佳地，在發展出個體的第一種可檢測到的症狀或神經功能缺損的最初8、9或10天內投予細胞。預期與未治療的個體中的腦梗塞體積相比，治療導致腦梗塞體積減少。在一個具體例中，體積減小大於約10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%。
上述組成物及方法可用於治療患者，包含獸醫的患者(非人類動物)，以減輕可應用細胞療法的多種病理病症的症狀。例如，可將本發明的細胞投予患者以減輕以下疾病的症狀：神經性疾病或傷害，諸如腦缺血或腦梗塞；神經退行性疾患，諸如亨丁頓舞蹈症、阿滋海默症及帕金森氏症；創傷性腦損傷；脊髓損傷；癲癇；戴薩克斯症(Tay Sach's disease)；溶素體儲積障礙；肌萎縮性側索硬化症；腦膜炎；多發性硬化症及其他脫髓鞘性疾病；神經性疼痛；妥瑞氏症候群；失調症、藥物成癮，諸如酒精中毒；藥物耐受性；藥物依賴；憂鬱症；焦慮；及思覺失調症。在本發明的較佳具體例中，投予細胞以減輕中風、腦缺血或腦梗塞的症狀。
特別是，本發明涉及一種治療由於遺傳缺陷、身體損傷、環境危害或中風、心臟病發作或心血管疾病(最常是由於缺血)造成的損害而導致的大腦或脊髓的神經損害。該方法包括對患者投予有效數目或有效量的UCB細胞，其中對患者共同投予BBB透化劑。在本發明的一態樣，可將UCB細胞移植到患者的大腦或脊髓中，例如，或可全身性投予，諸如但不限於動脈內或靜脈內投予。
治療中風
本發明的組成物及方法可用於治療中風。較佳地，該組成物及方法在中風後立即使用，直到中風後約28天(例如，約8、9或10天)。在較佳的具體例中，本發明的組成物及方法的用途不限於t-PA所限制的中風後3小時時間窗。
根據本文所提供的方法可治療的中風可歸因於任何原因的中風。在一個具體例中，中風可以是缺血性中風。缺血性中風可以是血栓性中風或栓塞性中風。在另一個具體例中，中風可歸因於全身性低灌注，即，流向身體所有部分血流的減少；或者是由於靜脈血栓形成。在另一個具體例中，缺血性中風是起因於心臟的纖維顫動，例如，心房纖維顫動；陣發性心房纖維顫動；風濕性疾病；二尖瓣或主動脈瓣疾病；人工心臟瓣膜；心房或心室的心臟血栓；病竇症候群；持續性心房撲動；心肌梗塞；慢性心肌梗塞伴隨射出分率低於28%；有症狀的鬱血性心臟衰竭伴隨射出分率低於30%；心肌病；心內膜炎，例如，利-薩二氏心內膜炎(Libman-Sacks endocarditis)、消耗性心內膜炎或感染性心內膜炎；乳頭狀纖維彈性組織瘤；左心房黏液瘤；冠狀動脈繞道手術；二尖瓣環鈣化；開放性卵圓孔；心房間隔動脈瘤、無血栓左心室動脈瘤、心臟超音波圖上無二尖瓣狹窄或心房纖維顫動的孤立性左心房中風；及/或升主動脈或弓近端的複雜動脈粥狀硬化。
在另一個具體例中，中風可以是出血性中風。軸內出血(腦內血液滲漏)可造成出血性中風。軸外出血(顱骨內大腦外的血液)也可造成出血性中風。在更明確的具體例中，中風可由以下原因造成：腦實質內出血、腦室內出 血(腦室系統中的血液)、硬腦膜上血腫(硬腦膜與顱骨之間的出血)、硬腦膜下血腫(硬腦膜下腔出血)或蛛網膜下腔出血(在蛛網膜與軟腦膜之間)。大多數出血性中風症候群都有特定的症狀(例如，頭痛、先前的頭部損傷)。在其他更多的具體例中，出血性中風可由高血壓、創傷、出血性疾患、類澱粉血管病變、非法藥物使用(例如，安非他命及古柯鹼)或血管畸形所造成或與之相關。
本文所提供的治療方法導致大腦或CNS內或周圍的血流中斷的一種或多種症狀或歸因於大腦或CNS內或周圍的血流中斷的神經性缺損(例如，中風，例如，造成缺氧損傷或乏氧損傷)的消除、可檢測的改善、嚴重程度的減輕或減緩其進展。在明確的具體例中，症狀或神經性缺損包括偏癱(身體一側的癱瘓)；或半身不遂(身體一側的無力)；面部肌肉無力；麻木；感覺減少；嗅覺、味覺、聽力或視力改變；喪失嗅覺、味覺、聽力或視力；眼皮下垂(眼瞼下垂)；眼肌無力；嘔吐反射降低；吞嚥能力下降；瞳孔對光的反應性降低；面部感覺減少；平衡降低；眼球震顫；呼吸頻率改變；心率改變；胸鎖乳突肌無力、能力降低或無法將頭轉向一側；舌頭無力；失語症(無法說或聽不懂語言)；失用症(改變的自主運動)；視野缺損；記憶力減退；偏側忽視或偏側空間忽視(對與病灶相對視野側的空間注意不足)；思維混亂；迷亂；性慾亢進作態的發展；病覺缺失症(堅持否認存在缺陷)；行走困難；改變的運動協調；眩暈；失衡；意識喪失；頭痛；及/或嘔吐。
可使用一種或多種廣泛被接受的神經功能量表來評估大腦或CNS內或周圍的血流中斷的嚴重性，例如，中風或中風引起的中風症狀及/或神經性缺損的嚴重性。例如，受試者的神經功能可經由一種或多種改良式雷氏量表(Modified Rankin Scale)、NIH中風量表、加拿大神經量表(Canadian Neurological Scale)(CNS)、格拉斯哥昏迷指數(Glasgow Coma Scale)(GCS)、半球中風量表(Hemispheric Stroke Scale)、Hunt & Hess量表、Mathew中風量表、簡易智能測驗(Mini-Mental State Examination)(MMSE)、Orgogozo中風量表、牛津郡社區中風項目分類(Oxfordshire Community Stroke Project Classification)(Bamford)、斯堪的納維亞中風量表、日本昏迷指數(JCS)、Barthel指數及/或日本中風量表(JSS)來評估。在明確的具體例中，一次或多次投予UCB細胞後，在初始評估後1、2、3、4、5或6天內，或1、2、3、4、5、6、8、9、10、11或12週內可檢測到改善。
如本文所揭露的，來自健康供體的冷凍保存臍帶血單核細胞具有更穩定的品質以確保成功的治療。例如，以下實例中顯示針對患有急性缺血性中風的45至80歲患者進行的1期研究的結果。基於匹配的ABO/Rh血型、匹配的HLA 6/6及總有核細胞(例如，介於0.5至5x107個細胞/kg之間)，從StemCyte的公共臍帶血庫中選擇血漿減除的處理過的臍帶血單位。該研究的主要目的包含在12個月的觀察期間發生的不良事件(AE)及嚴重的AE，以及在輸液後100天內發生移植物抗宿主疾病(GVHD)。次要目的包含改變NIHSS、Barthel指數及Berg平衡量表。顯示的結果包含來自46歲男性的研究，該男性以相同的ABO/Rh、匹配的6/6 HLA及可用的2.63x108個單核細胞而納入研究。經由12個月的觀察未發現嚴重的AE或GVHD。患者的NIHSS從9分改善到1分，Berg平衡量表從0分提高到48分，以及Barthel指數從0分提高到90分。這些結果證實，在使用同種異體臍帶血後的12個月時間內，患者的偏癱幾乎完全康復。
治療心臟病
本發明的組成物及方法還可用於治療心臟病。較佳地，在疾病發作後立即使用該組成物及方法。
本揭示內容的一些具體例涉及在受試者中促進心肌再生的方法。該方法包含對受試者投予或提供本文所揭露的治療組成物。在一些具體例中，如本文所揭露的用於治療受試者的心臟病或促進心肌再生的方法視需要地包含辨識或選擇患有或懷疑患有心臟病的受試者之程序。辨識或選擇的程序可以在投予一種或多種治療組成物及治療劑或療法之前進行。
在一些具體例中，心臟病是心肌梗塞、缺血性心臟病、心臟衰竭(例如，鬱血性心臟衰竭)、缺血性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、酒精性心肌病、病毒性心肌病、心搏過速性心肌病、壓力性心肌病、類澱粉性心肌病、致心律失常性右心室心肌病、左心室緻密不全、心內膜纖維彈性組織增生症、主動脈瓣狹窄、主動脈瓣閉鎖不全、二尖瓣狹窄、二尖瓣閉鎖不全、二尖瓣脫垂、肺動脈瓣狹窄、肺動脈瓣閉鎖不全、三尖瓣狹窄、三尖瓣閉鎖不全、先天性障礙、遺傳性障礙，或其組合。在一些特定具體例中，心臟病是心肌梗塞。在一些其他特定具體例中，心臟病是需要心肌再生的缺血性心臟病。
BBB透化劑
如本文所使用，術語"血腦障壁透化劑"或"BBB透化劑"是能夠破壞血腦障壁的物質。在一個具體例中，破壞是暫時的。與UCB細胞一起投予的BBB透化劑的量是有效破壞BBB並使神經營養生長因子以增加的量進入腦 及/或使細胞進入腦的量。在一個具體例中，在投予後0至10天測量時，BBB使得增加神經營養因子或細胞進入大腦。
在發明所屬技術領域中已知有各種BBB透化劑。BBB透化劑可選自甘露醇、Cereport、脂溶性小分子、葡萄糖、胺基酸、二羥基苯丙胺酸、膽鹼及嘌呤鹼以及核苷或其衍生物所構成之群組中的一種。在一個具體例中，BBB透化劑是甘露醇。在另一個具體例中，BBB透化劑是Cereport。甘露醇可以約0.1M至約10M，如約0.5至5M或約1.0M至2.0M的濃度投予。在一個具體例中，甘露醇的濃度為約1.07M(或20%)。Cereport可以約1μg/kg至約50μg/kg，如約5至20μg/kg的濃度投予。在一個具體例中，Cereport的濃度為約9μg/kg。
儘管考量將BBB透化劑在大約與UCB細胞同時投予受試者，但是可以以與細胞分開的組成物來投予BBB。考量可以在投予細胞之前、同時或之後投予BBB透化劑。此外，可考量的是，取決於中風的結果，本發明的方法可進一步包括在初始投予後約1至72小時或之後每天、每週、每月或每年投予的情況下，對個體投予或不投予其他細胞的情況下再投予BBB透化劑。
其他治療劑
本文所述的治療方法可進一步包括對受試者投予一種或多種第二治療劑。可在投予UCB細胞之前、投予細胞期間或投予細胞之後來投予這種第二治療劑。與細胞投予相比，第二治療劑可以投予較少、較多或相等次數。
第二種治療劑可以是對大腦或CNS內或周圍的血流中斷的個體具有治療效益的任何藥劑。在一個具體例中，治療劑是，例如，用於治療中風、缺氧性損傷或乏氧性損傷的藥物。在明確的具體例中，第二治療劑是神經保護劑。
在其中個體患有出血性中風的具體例中，第二治療劑可以是降低該個體血壓的治療劑。在一些具體例中，第二治療劑可以是降血壓藥，例如，β阻斷劑或利尿劑、利尿劑與保鉀利尿劑的組合、β阻斷劑與利尿劑的組合、血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑與利尿藥的組合、血管收縮素-II拮抗劑及利尿藥，及/或鈣通道阻斷劑及ACE抑制劑。在另一個具體例中，可投予第二治療劑以降低顱內壓。在一個更明確的具體例中，第二治療劑可以是利尿劑。
有用的其他治療劑還包含，但不限於，抗血小板療法、血栓溶解、直接性血管成形術、肝素，硫酸鎂、胰島素、阿斯匹靈、降膽固醇藥物及血管收縮素-受體阻斷劑(ARB)。特別是，當使用ACE抑制劑用於治療慢性心臟衰竭及高危急性心肌梗塞的患者時，具有明顯的益處，這可能是因為它們抑制血管收縮素II產生炎性細胞激素。其他治療劑及療法的非限制性清單包含ACE抑制劑，諸如卡托普利(Captopril)、依那普利(Enalapril)、賴諾普利(Lisinopril)或奎那普利(Quinapril)；血管收縮素II受體阻斷劑，諸如纈沙坦(Valsartan)；β-阻斷劑，諸如卡維地洛(Carvedilol)、美托洛爾(Metoprolol)及畢索洛爾(Bisoprolol)；血管擴張劑(經由NO)，諸如聯胺肼(Hydralazine)、異山梨酯二硝酸鹽(Isosorbide dinitrate)及異山梨酯單硝酸鹽(Isosorbide mononitrate)；他汀類，諸如辛伐他汀(Simvastatin)、阿托伐他汀(Atrovastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、洛伐他汀(Lovastatin)、瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)或普伐他汀 (Pravastatin)；抗凝血藥物，諸如阿斯匹靈(Aspirin)、華法林(Warfarin)或肝素(Heparin)；或強心劑，諸如多巴酚丁胺(Dobutamine)、多巴胺(Dopamine)、米利酮(Milrinone)、氨利酮(Amrinone)、硝普鹽(Nitroprusside)、硝酸甘油(Nitroglycerin)或奈西立肽(Nesiritide)；強心配醣體(Cardiac Glycosides)，諸如地高辛(Digoxin)；抗心律不整藥物，諸如鈣通道阻斷劑，例如，維拉帕米(Verapamil)及地爾硫卓(Diltiazem)或第三類抗心律不整藥物，例如，胺碘酮(Amiodarone)、索他洛爾(Sotalol)或多非利特(Dofetilide)；利尿劑，諸如環利尿劑，例如，呋噻米(Furosemide)、布美他尼(Bumetanide)或托拉塞米(Torsemide)，噻嗪類利尿劑(Thiazide diuretics)，例如，氫氯噻嗪(Hydrochlorothiazide)，醛固酮拮抗劑，例如，螺甾內酯(Spironolactone)或依普利酮(Eplerenone)。替代地或附加地，其他心臟病治療方法也適用，諸如心律調節器、去顫器、機械式循環輔助，諸如反搏裝置(主動脈內氣球幫浦或非侵入性反搏)、心肺輔助裝置或左心室輔助裝置；外科手術，諸如心臟移植、心肺移植或心腎移植；或免疫抑制劑，諸如馬替麥考分酯(Mycophenolate mofetil)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、環孢靈(Cyclosporine)、西羅莫司(Sirolimus)、他克莫司(Tacrolimus)，皮質類固醇抗胸腺細胞球蛋白，例如，抗胸腺球蛋白(Thymoglobulin)或ATGAM、OKT3，IL-2受體抗體，例如，巴利昔單抗(Basiliximab)或達利珠單抗(Daclizumab)也適用。
在所投予的細胞與所治療的受試者不是自體的具體例中，第二治療劑可以是免疫抑制劑。免疫抑制劑是發明所屬技術領域中習知的，包含，例如，抗T細胞受體抗體(單株或多株抗體，或其抗體片段或衍生物，例如，莫羅單抗(Muromonab)-CD3)、抗IL-2受體抗體(例如，巴利昔單抗(SIMULECT)或 達利珠單抗(ZENAPAX)、硫唑嘌呤、皮質類固醇、環孢靈、他克莫司、馬替麥考分酯、西羅莫司、鈣調磷酸酶抑制劑等。在明確的具體例中，免疫抑制劑可以是皮質類固醇或針對巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1α或MIP-1β的中和抗體。
可以將本文所揭露的治療組成物、藥物製劑及另外的治療劑或療法調配成適合於特定預期用途的最終藥物製劑。在一些具體例中，治療組成物及另外的治療劑或療法可以單一製劑投予。在一些具體例中，各治療組成物及另外的治療劑或療法是以分開的製劑投予。在本文所揭露的方法的一些具體例中，治療組成物及/或另外的治療劑或療法可以單劑量投予受試者。在一些具體例中，治療組成物及/或另外的治療劑或療法可以多劑量投予受試者。在一些具體例中，該劑量彼此相等。在一些具體例中，該劑量彼此不同。在一些具體例中，將治療組成物及/或另外的治療劑或療法以隨著時間逐漸增加的劑量投予受試者。在一些具體例中，治療組成物及/或另外的治療劑或療法以隨著時間逐漸減少的劑量來投予。
匹配
在本發明的一態樣，可以經由評估供體細胞及接受者之間的HLA差異來進行供體細胞源的匹配。在某些態樣，僅當供體細胞移植物匹配HLA-A、HLA-B及HLA-DRB 1的6個HLA基因座中的4個或更多時才進行供體細胞的移植。
在本發明的其他具體例中，可以使用目前臨床上進行的標準HLA匹配來匹配細胞。臍帶血的匹配可接受程度可以是選自HLA-A、HLA-B及HLA-DRB1的4/6個基因座。HLA-A及HLA-B可經由標準的2階段補體依 賴性微細胞毒性檢測以及如世界衛生組織(WHO)HLA命名委員會所定義的指定抗原來進行分型。可經由將聚合酶連鎖反應(PCR)擴增的DNA與序列特異性寡核苷酸探針(SSOP)雜交來測定HLA-DRB1類型，如需要，可以進行測序。
據此，本發明的具體例涉及將臍帶血或其部分投予已適當地與HLA 4/6基因座匹配及/或與混合淋巴細胞反應匹配匹配的接受者。
下面的實施例說明在不進行任何清洗步驟的情況下，用於解凍及直接輸注本發明的血漿減除、冷凍保存臍帶血單位的示例性規程。不清洗的直接輸注方法由於缺少清洗步驟而可能導致最少量的細胞損失，並排除較長的重建操作。來自移植中心使用StemCyte臍帶血產品的可用臨床數據證實，與清洗後的輸注產品相比，直接輸注可產生優異的結果，儘管DMSO、紅血球及分解的血紅素含量較高，而可能在某些患者中造成臨床上的顯著事件。因為StemCyte臍帶血產品尚未減少紅血球，所以它們不同於其他庫藏的臍帶血單位。因此，重要的是要遵循StemCyte規程以確保正確地投予該產品。
因為該產品未經稀釋，並暴露在有高度細胞毒性的10%DMSO中，因此從解凍到輸注的時間必須最短，所以，應在解凍開始後的20分鐘內完成輸注。輸注期間，由於解凍產品的黏度，IV重力滴注可能無法正常工作。為避免有害的輸液延遲，可能需要使用大(
Figure 109128449-A0202-12-0024-27
60cc)注射器及大口徑針頭來進行IV推注。
因為預期任何含有大量DMSO以及可能與ABO/Rh不相容的分解及完整的紅血球的冷凍保存造血幹細胞產品的投予，可能會產生潛在的不良反應，所以治療/移植中心應按照自己的內部規程進行前置處方、患者監測及干預措施，以治療任何預期的不良反應。治療/移植中心應遵循自己的內部規程對 臍帶血產品進行解凍後測試，包含但不限於ABO/Rh分型、HLA分型、存活力、CBC、CD34 +細胞計數、成株潛力等。然而，根據所使用的規程，可能無法針對列舉具有較高細胞密度的StemCyte臍血單位的真實功能進行優化的CFU檢測。移植中心可向StemCyte或Stem Cell Technologies諮詢有關解凍後的StemCyte臍帶血單位的CFU測試規程。
附著的片段可用於HLA或ABO/Rh類型同一性測試、CFU、CD34 +及/TNC(總有核細胞)計數以及微生物測試目的。也可將取樣點耦合器插入CBU冷凍袋或最終解凍/清洗的CBU袋中，以進行樣品測試。移取而用於取樣的臍帶血量由移植機構自行決定。根據聯邦、州、地方及/或機構要求，將產品/空輸注袋以及與臍帶血產品接觸的所有用品作為生物醫療廢棄物處理。
輸注細胞後可能發生不良反應。儘管可能不會發生此處描述的所有副作用，但如果確實發生，則可能需要患者醫生或護士立即進行醫療照顧。
輕度至中度：
頻繁：噁心、嘔吐、高血壓、低血壓、心搏過緩、血紅素尿、顫抖、甜奶油玉米或大蒜味(由於DMSO過期)。
不太頻繁：頭痛、腹部痛性痙攣、腹瀉、潮紅、發冷、發燒、潮紅、胸悶、眩暈、腦病變、癲癇發作、心搏過緩、高膽紅素血症、血清轉胺酶水平升高。
嚴重至威脅生命：
極為罕見(在1,410名患者之最大的已發表研究中佔~0.4%)，並且通常是自限性的：
心臟-心搏過緩、心臟傳導異常、心律不整、休克及心跳停止。
神經性-腦病變(可能與接受者每公斤體重超過2g DMSO有關，可經由血漿分離術治療)、癲癇發作(與大於3.7x108個有核細胞/mL之非常高的細胞濃度有關；StemCyte的產品通常為此濃度的十分之一)。
肺-呼吸抑制。
免疫-過敏反應。
腎-游離血紅素高濃度引起的急性腎衰竭(經由抗組織胺及皮質類固醇的前置藥物、充分水合作用、尿鹼化、甘露醇利尿劑而緩解)。
潛在不良反應的原因包含下列者：
DMSO毒性：
儘管尚未測定DMSO對人類的急性毒性劑量，但據報告IV投予DMSO的LD50值(殺死50%的測試動物所需的DMSO量)在小鼠為3.1至9.2g/kg之間，在狗為2.5g/kg，猴子則超過11g/kg(參考文獻10.14)。大多數已發表的報告將DMSO劑量維持在1g/kg接受者體重以下(參考文獻10.8)。在典型的StemCyte臍帶血單位中，最大DMSO劑量在7.5(1袋)至15.0g(2袋)之間；因此，對於腎功能受損的患者及小患者(1袋是7kg以下，如果同時投予2袋，則在15.0kg以下)，如果達到足夠的細胞劑量沒有問題，則強烈推薦清洗該產品。根據文獻，建議10%DMSO冷凍保存幹細胞產品的輸注速率在每分鐘5至20ml之間變化，而吾等建議每分鐘輸注5至10ml。
體液過剩：
強烈建議最大輸液量應在5至15ml/kg/劑量的範圍內。
重度ABO血型不相容：
儘管尚未報告患者及供體之間的ABO血型不相容是臍帶血移植的問題，但在重度血型不相容，例如，患者是血型O型，臍帶血單位不是O型的情況下，提供以下附加資訊。雖然已知輸液大量重度ABO不相容的RBC在具有抗A及/或抗B明顯效價的患者中造成輸血反應，但Bensinger等人(Transplantation 33：427-429(1982))指出當受體的抗A及抗B血球凝集素效價為1：16或更低時，可安全地輸液整個單位的ABO不相容RBC。Sauer-Heilborn等人(Transfusion 44：907-916(2004))說明輸液ABO不相容周邊血液幹細胞及骨髓單位的經驗，並指出與BM成分(RBC體積300至400ml)相比，PBSC單位(RBC體積75至100ml)的風險較低。StemCyte臍帶血單位中RBC體積約為40至100ml(後處理)。尚不知道此體積的RBC會造成嚴重的不良影響，但在極少數情況下發生諸如體溫升高、脈搏增加及肌肉酸痛的症狀。由於臍帶血樣本中的溶血作用，預期尿液及血漿呈暗紅色或紅色。
呈現輸注含有ABO不相容RBC的幹細胞產品的其他已發表的經驗如下：Dinsmore等人(Br J Haematol。1983；54：441-449)報告，分別接受68及45ml RBC的2名患者出現沒有腎臟損害的短暫性血紅素尿。另外7名患者出現低燒，及另外10名患者未出現不良反應。Warkentin等人(Vox Sang.1985；48：89-104)報告，某些患者中含有多達21ml的RBC的骨髓產物導致可測量的溶血作用的證據，但是沒有患者具有被判斷為臨床嚴重的反應。Braine等人(Blood 1982；60：420-425)報告在輸液含有多達38ml ABO不相容RBC的單位後，25名患者中有10名出現症狀性反應。症狀包含短暫發燒、高血壓、發冷、血紅素尿、心搏過緩及精神迷亂。
建議在密切監測患者的情況下，輸注速度約為5至10ml/分鐘。Sauer-Heilborn等人(Transfusion 2004；44：907-916)建議患者應預先服用退燒藥及/或抗組織胺，並且應充分補充水分。其他研究人員還預先投予皮質類固醇藥物。不良反應通常在輸注過程中發生，並在輸注停止後緩解。然而，有一些反應可能在輸注完成後的6至7小時發生，因此應在整個該時段內對患者進行監測。必須向臍帶血庫報告顯著的不良反應。
常見的前置處方方案包含充分的水合作用(尤其是重度ABO錯配)、抗組織胺(尤其是重度ABO錯配)、皮質類固醇、甘露醇、止吐藥及退燒藥(尤其是重度ABO錯配)。不良事件的常見治療措施包含利尿劑(體液過剩)、抗痙攣藥(癲癇發作)、阿托品(atropine)(心搏過緩)、血漿分離術(腦病變)、O2(肺部抑制)及麻醉劑。
定義
本文使用的術語"臍帶血"或"UCB"是指從新生兒或胎兒，最佳為新生兒所獲得的血液，並且較佳是指從新生兒的臍帶或胎盤所獲得的血液。較佳地，臍帶血分離自人類新生兒。使用臍帶血作為單核細胞的來源是有利的，因為它可以相對地容易獲得並且不會對供體造成傷害。相反地，從供體收集骨髓細胞是一種創傷經歷。必要時，臍帶血細胞可用於自體移植或同種異體移植。臍帶血較佳從臍帶直接引流及/或從娩出的胎盤的根處及擴張靜脈處經由針抽吸而獲得。如本文所使用，術語"臍帶血細胞"是指存在於臍帶血中的細胞。在一個具體例中，臍帶血細胞是單核細胞，其係使用發明所屬技術領域的 技術人員已知的方法進一步從臍帶血分離。在另一個具體例中，可在投予患者之前進一步擴增及/或分化臍帶血細胞。
如本文所使用，術語"臍帶血單位"及"UCB單位"是指從單一供體所收集的一定體積的臍帶血。本發明的UCB組成物通常含有一個UCB單位，但也可含多個UCB單位，例如，雙臍帶血單位，可投予患者以進一步增加細胞劑量。
術語"臍帶血幹細胞"是指衍生自出生時收集的人類臍帶血及/或胎盤血，富含造血幹細胞，或富含造血幹細胞及先驅細胞的群體。相對於其他類型的造血細胞，造血幹細胞或造血幹細胞及先驅細胞對於在造血幹細胞或造血幹細胞及先驅細胞上以增加的水平表達的特定標記可以是陽性的。例如，此類標記可以是CD34、CD43、CD45RO、CD45RA、CD59、CD90、CD109、CD117、CD133、CD166、HLA DR或其組合。此外，相對於其他類型的造血細胞，造血幹細胞或造血幹細胞及先驅細胞對於表達的標記可以是陰性的。例如，此類標記可以是Lin、CD38或其組合。在特定的具體例中，造血幹細胞或造血幹細胞及先驅細胞是CD34+細胞。
術語"幹細胞"是指具有無限期分裂並產生特化細胞能力的任何細胞。幹細胞發自所有胚層(即外胚層、中胚層及內胚層)。幹細胞的典型來源包含胚胎、骨髓、周邊血液、臍帶血、胎盤血及脂肪組織。幹細胞可以是分化多能的，這意味著它們能夠在生物體上生成大多數組織。例如，多能(pluripotent)幹細胞可產生皮膚、肝臟、血液、肌肉、骨骼等細胞。相反地，專能(multipotent)或成體幹細胞通常產生有限類型的細胞。例如，造血幹細胞通常產生類淋巴系、髓系及類紅血球系譜系的細胞。活細胞是存活的細胞，常常能夠 生長及分裂。發明所屬技術領域的技術人員知道測定細胞存活力的方法，例如，經由排除台盼藍染料的能力。除非另有說明，否則本文所使用的術語幹細胞包含先驅細胞。
"有核細胞"是指具有核的細胞，即，包括染色體DNA的胞器。有核細胞包含，例如，白細胞及幹細胞。"無核細胞"包含，例如，成熟紅血球。
如本文所使用，術語"實質上血漿減除"及"血漿減除"是指本發明的臍帶血組成物，其中體積大於約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的血漿已去除。在較佳具體例中，經由離心臍帶血-抗凝血劑混合物並將細胞部分與血漿部分分離，從而實質上減除血漿。實質上減除後剩餘的血漿體積通常為約0體積%至約30體積%，較佳約10體積%至約30體積%。
如本文所使用，術語"非紅血球減除"及"紅血球未減除"是指臍帶血組成物其中體積小於約30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%的紅血球已去除。如本文所使用，術語"實質上紅血球減除"及"紅血球減除"是指處理過的臍帶血單位，其中體積大於約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的紅血球已去除。儘管本發明不包含從臍帶血單位中去除紅血球的步驟，但是發明所屬技術領域的技術人員將理解，減除血漿單位的步驟及/或任何其他處理步驟可去除少量的紅血球。
如本文所使用，術語"冷凍保護劑"是指在冷凍時用於增強細胞生存力的試劑。冷凍保護劑包含但不限於二甲基亞碸(DMSO)、甘油、乙二醇、 丙二醇、甲醯胺及羥乙基澱粉(HES)。較佳地，將低分子量的多醣諸如聚葡醣(例如，Gentran 40)添加至冷凍保護劑混合物中。在較佳的具體例中，冷凍保護劑溶液包括約10：1比率(體積/體積)的DMSO與Gentran 40，諸如，例如，50%的DMSO與5%的Gentran 40，將其添加到臍帶血及抗凝血劑的混合物中以提供約5%至約10%的DMSO最終濃度。
關於細胞的術語"增殖"及"擴增"在本文中可互換使用，是指經由分裂而增加相同類型的細胞數目。術語"分化"是指發育過程，由此細胞變得特化而用於特定功能，例如，其中細胞獲得與初始細胞類型不同的一種或多種形態特徵及/或功能。臍帶血幹細胞擴增的方法是發明所屬技術領域已知的。此類擴增技術包含那些在U.S.Pat.No.7,399,633；WO/2013/086436、WO/2013/179633、US20180353541；Delaney et al.,2010,Nature Med.16(2)：232-236；Zhang et al.,2008,Blood 111：3415-3423；及Himburg et al.,2010,Nature Med.16,475-482中所說明的技術。
如本文所使用，"治療(treating)"或"治療(treatment)"是指將化合物或藥劑或組成物投予患有失調或有發展失調風險的受試者，目的是治癒、緩解、減輕、治療、延遲發作、預防或改善失調、失調的症狀、繼發於失調的疾病狀態或對失調的易感性。術語"預防(prevent)"、"預防(preventing)"、"預防(prevention)"、"預防性治療"等是指降低未患病但是有風險或易發展失調或病症的受試者發展失調或病症的可能性。"改善"一般是指疾病或失調的徵象或症狀的數量或嚴重程度的降低。
"預防性治療"包含投予不顯示病症的徵象或症狀的受試者的治療，以使投予該治療的目的是用於減少、預防或降低發展病症的風險。"治療性 治療"包含投予顯示出病症的症狀或徵象的受試者的治療，並且為了降低病症的嚴重性或進展的目的而投予受試者。治療性治療也可部分或完全地緩解病症。
藥劑(例如，細胞)的"有效量"是足以產生所需功效，例如，預防或治療疾病或與疾病相關的症狀的量。細胞的治療有效量可根據個體的年齡及/或大小以及缺血區域的大致體積而變化。如，可經由串行磁振造影圖像或電腦斷層(CT)掃描來估計缺血區域的大致體積及位置。
如本文所使用，術語"投予"是指經由任何適當的途徑遞送本發明的組成物。本發明的細胞可按多種方式投予，包含但不限於腸外(此術語是指靜脈內及動脈內以及其他合適的腸外途徑)、冠狀動脈內、心肌內、鞘內、心室內、腦實質內(包括進入脊髓、腦幹或運動皮質)、腦池內、顱內、紋狀體內、鼻腔(intranasal)、鼻內(intranigral)、腹膜內、肌內、皮下、皮內、經皮或經黏膜投予，其中，該術語允許本發明的細胞在需要時遷移到最終標靶位點。較佳地，對患者輸注根據本發明的方法所製備的一個、兩個、三個或更多個的臍帶血單位。可同時或連續(例如，在幾分鐘、幾小時或幾天的時間內)對患者投予多個單位諸如雙臍帶血單位。
投予通常取決於所治療的疾病或病症，並且較佳地可經由腸外途徑，例如，靜脈內，經由投予至腦脊髓液中或經由直接投予至腦部受影響的組織中。在中風的情況，較佳的投予途徑將取決於中風的位置，但是可直接進入受影響的組織(可使用MRI或其他成像技術很容易地確定)，或可全身性投予。在本發明的較佳具體例中，用於治療個體中風後的投予途徑是全身性的，經由靜脈內或動脈內投予。
本發明的細胞可以完整的臍帶血或其部分的形式投予(此術語包含其單核部分或單核細胞部分，包含高濃度的幹細胞或先驅細胞)。根據本發明的組成物可不經驅動劑或分化劑處理("未處理"，即，未經進一步處理以促進臍帶血樣品內的細胞分化)而使用，或經分化劑或其他藥劑處理後("經處理")而使用，該分化劑或其他藥劑造成臍帶血樣品中的某些幹細胞及/或先驅細胞分化成展現出分化表現型，諸如神經元及/或神經膠質表現型的細胞。
術語"移植(grafting)"及"移植(transplanting)"以及"移植(graft)"及"移植(transplantation)"是用於說明將細胞遞送至預期表現出有利作用的部位的過程，諸如修復對患者中樞神經的損傷(可減少由損傷所造成的認知或行為缺陷)，治療神經退行性疾病或治療由中風、心血管疾病、心臟病或身體損傷或創傷或遺傳損傷或例如由意外或其他活動引起的對大腦及/或脊髓的環境危害所造成的神經損傷影響。還可以經由如上述的任何投予方式將細胞遞送到身體的遠端區域，這依賴於細胞遷移到合適的區域以實現移植。較佳地，可將細胞與血腦障壁透化劑一起投予。
本文所使用術語"神經退行性疾病"來說明由中樞神經系統損傷所造成的疾病，並且該損傷可經由投予本文所述的細胞來降低及/或緩解。示例性的神經退行性疾病包含帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症、肌萎縮性側索硬化症、阿滋海默症、雷特氏症候群、溶素體儲積障礙("白質病"或神經膠質/脫髓鞘病，例如Folkerth,J.Neuropath.Exp.Neuro.,September 1999,58：9中所說明的)，包含聖菲利柏氏症(Sanfilippo disease)、高雪氏症(Gaucher disease)、戴薩克斯症(β己糖胺酶缺乏症)、其他遺傳性疾病、多發性硬化症、由缺血、意外、環境危害等引起的腦損傷或創傷、脊髓傷害、失調症及酒精中毒。此外，本發明可用於 降低及/或消除患者之中風或心臟病發作對中樞神經系統的影響，這是由於該患者的大腦部位缺乏血流或缺血所引起的或由於對大腦及/或脊髓的身體傷害而發生的。除此之外神經退行性疾病還包含神經發育障礙，包含例如自閉症及相關的神經性疾病諸如思覺失調症等。
術語"治療組成物"或"醫藥組成物"是指活性劑與惰性或活性載體的組合，使得該組成物特別適合於體內或離體的診斷或治療用途。
如本文所使用，"治療性細胞"是指可改善患者病症、疾病及/或損傷的細胞群。治療性細胞可以是自體的(即，源自患者)、同種異體的(即，源自與患者相同物種的不同個體)或異種細胞的(即，源自與患者不同的物種)。治療性細胞可以是同質的(即，由單一細胞類型所組成)或異質的(即，由多種細胞類型所組成)。術語"治療性細胞"包含治療活性細胞以及能夠分化成治療活性細胞的先驅細胞。
本文所使用短語"醫學上可接受的"是指在合理的醫學判斷範圍內，適用於與人類及動物的組織接觸而不會有過多毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的獲益/風險比相稱的那些化合物、材料、組成物及/或劑型。在投予受試者或給予受試者之後，"醫學上可接受的載體"不會造成不良的生理作用。醫藥組成物中的載體在與活性成分相容並且能夠使其穩定的意義上還必須是"可接受的"。可使用一種或多種助溶劑作為遞送活性化合物的藥物載體。醫學上可接受的載體的實例包含但不限於生物相容性媒介物、輔劑、添加劑及稀釋劑，以實現可用作為劑型的組成物。其他載體的實例包含膠態氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素及十二烷基硫酸鈉。
術語"受試者"包含人類及非人類動物。較佳的治療受試者是人類。如本文所使用，術語"受試者"及"患者"可互換使用，而與受試者是否已經或目前正接受任何形式的治療無關。如本文所使用，術語"受試者"及"受試者等"可指任何脊椎動物，包含但不限於哺乳動物(例如，牛、豬、駱駝、美洲駝羊、馬、山羊、兔子、綿羊、倉鼠、天竺鼠、貓、狗、大鼠及小鼠，非人類靈長類動物(例如，猴子，諸如食蟹獼猴、黑猩猩等)及人類)。在一個具體例中，受試者是人。在另一個具體例中，受試者是實驗的非人類動物或適合作為疾病模型的動物。
本文使用術語"患者"來描述動物，較佳為人，對其提供用根據本發明的細胞之治療，包含預防性治療。術語"供體"用於描述捐獻臍帶血或臍帶血細胞以供患者使用的個體(動物，包含人類)。
如本文所使用，術語"心肌病"具有發明所屬技術領域使用的常規含義；即，通常是由於任何原因的心肌(心臟的肌肉)功能劣化。"缺血性心肌病"是指由於對心肌的氧輸送不足，通常是由於其血液供應的缺乏或相對不足而導致的心臟肌肉無力。
如本文所使用，術語"心肌"具有發明所屬技術領域使用的常規含義；即，通常是心臟的肌肉。本發明設想將包括細胞的組成物直接投予至受試者的心肌，這意味著將組成物從投予裝置(特別是設想注射導管)轉移至心肌組織而無需通過任何居間組織(例如冠狀血管)。"心肌內注射"是指經由注射直接投予受試者的心肌。
如本文所揭露，提供多數個值範圍。應當理解，除非上下文另外明確指出，否則每個中間值，直到下限單位的十分之一，也具體地揭示該範 圍的上限及下限之間。在所述範圍內的任何所述值或中間值及該所述範圍內的任何其他所述值或中間值之間的各較小範圍都包含在本發明內。這些較小範圍的上限及下限可獨立地包含在該範圍內或排除在該範圍外，並且該較小範圍內包含其中一個範圍，或兩個範圍都不包含或包含兩個範圍的每個範圍都包含在本發明中，接受所述範圍內的任何明確排除限制的約束。當所述範圍包含限制中的一個或兩個時，排除那些所包含限制中的一個或兩個的範圍也包含在本發明中。
術語"約(about)"或"大約(approximately)"意指在特定值的可接受範圍內，該特定值由發明所屬技術領域普通熟練技術人員測定，這將部分取決於如何測量或測定該值，例如，測量系統的局限性。例如，"約(about)"可表示指定值的至多20%，較佳地至多10%，更佳地至多5%，還更佳地至多1%的範圍。除非另有說明，否則術語"約(about)"意指在特定值的可接受誤差範圍內。
[實施例]
實施例1
此實施例說明用於解凍及直接輸注本發明的血漿減除、冷凍保存臍帶血單位而不進行任何清洗步驟的規程。在此實施例及實施例2至3中，使用來自StemCyte的臍帶血產品。
樣本(Sample)/試樣(Specimen)
與DMSO一起冷凍保存並貯存於<-150℃的StemCyte臍帶血單位。
試劑/設備/用品
˙37℃±2℃水浴
˙止血鉗或止血夾
˙無菌水
˙用於測量水浴37℃溫度的校準溫度計
˙大塑料袋，較佳無菌且可密封。(例如，ZIPLOC)
˙液態氮儲存容器
˙酒精濕巾
˙多個60cc無菌注射器
˙無菌寬口針(16或18號)
˙在0.9%NaCl中的10%Gentran 40注射液500ml
˙將12.5g白蛋白溶於50ml緩衝稀釋液的25%人血清白蛋白(HAS)。
校準/質量控制
解凍程序已經過驗證，並顯示維持無菌性、生存力及最小的TNC損失。
程序
解凍前
Figure 109128449-A0202-12-0037-4
Figure 109128449-A0202-12-0038-5
製備HSA/Gentran沖洗液
(註：僅在計畫於輸注後沖洗袋子時才準備。請參考下面的"輸注"步驟)
Figure 109128449-A0202-12-0039-6
解凍臍帶血產品
Figure 109128449-A0202-12-0039-7
Figure 109128449-A0202-12-0040-8
輸注
Figure 109128449-A0202-12-0041-9
使用R & D Human XL Cytokine Discovery 14 Plex Panel對冷凍保存血漿減除臍帶血產品的樣本進行檢測，以測定細胞激素概況。結果顯示在上面的表1A中。結果顯示抗炎細胞激素IL-10的水平顯著高於促炎細胞激素，諸如IL-1-β、IL-2、IL-6、IFN-γ及TNF-α。此外，與細胞激素IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ及TNF-α相比，觀察到相對較高水平的GFs、EGF、FGF-鹼性、VEGF、G-CSF及GM-CSF。由於在PD CB產品中檢測到大量的 EGF、VEGF、G-CSF及IL-10，因此輸注PD CB產品不僅可以恢復免疫恆定性，還可以促進急性中風患者的腦修復。
實施例2
此實施例說明有關同種異體PD-UCB輸注成人急性缺血性中風的1期臨床研究的設計及規程。這是一項針對45至80歲之未接受t-PA療法而患有急性中風的患者的多中心研究。根據以下所述的納入及排除標準，總共招募6名受試者。對受試者進行一系列基線神經衡鑑、血液檢查及MRI。基於ABO/Rh血型匹配、HLA匹配及細胞劑量從公共臍帶血庫中選擇臍帶血單位，目標範圍是0.5至5x107個總有核細胞/kg。
在中風後3至10天之間以單次輸注的形式靜脈內投予來自台灣StemCyte的血漿減除處理臍帶血。在輸注後6小時對受試者進行監測，並在24小時後進行追蹤。隨後的追蹤電話在第1、6及12個月進行，包含對中風後復原及功能的電話調查。90天的追蹤門診包含神經檢查、MRI及血液檢查。
臍帶血單位的選擇
從移植中心收到受試者之包含HLA分型的資料後，即進行檢索。據此創建急性中風臨床試驗的摘要檢索報告，以包含符合下列標準的候選CB單位：(1)在低解析度HLA分型上至少與受試者為4/6匹配；(2)受試者與供體之間的ABO/Rh血型相同，及(3)總單核細胞(TNC)計數在2至5x108之間。
UCB單位
從Stemcyte獲得PD-UCB單位。篩檢這些單位並測試其HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HBc、CMV IgM+IgG、梅毒RPR、HBSAg及WNV為陰性。如需要，選擇UCB細胞以匹配受試者的ABO/Rh或HLA。使用單次IV輸注對受試者投予同種異體UCB。投予後，對受試者投予20%甘露醇200ml i.v.，30±10分鐘兩次，相隔8±2小時。或者，對受試者投予20%甘露醇100ml/60分鐘i.v.q4h。兩者都有效地透化血腦障壁。
受試者
這項針對成年人缺血性中風的UCB輸注研究是一項多位點、I期探索性臨床試驗，是在研究對各經歷缺血性中風的6名成年人單次i.v.輸注同種異體UCB的安全性及可行性。這項研究是在中華民國台灣佛教慈濟醫學基金會花蓮慈濟醫院進行的。該研究得到各臨床位點的當地機構審查委員會的批准。
納入標準：
Figure 109128449-A0202-12-0043-10
排除標準
Figure 109128449-A0202-12-0044-11
Figure 109128449-A0202-12-0045-12
測試時間及進度
從開始時間到試驗結束，總共追蹤試驗中的各受試者12個月。
研究設計及程序
細胞製備及操作：
一旦解凍後，臍帶血細胞的活性開始下降，必須在醫院現場進行解凍臍帶血的過程。可使用保健設施中用於加熱液體或血液產品的液體加熱器來解凍細胞。
臨床程序
這項研究是以逐案方式進行的I期研究，招募6名受試者。對於表現出肢體偏癱的受試者，中風發作後第9天投予UCB，對受試者使用單次IV輸注投予同種異體UCB(含2到5x108的MNC)。投予後，對受試者投予20%甘露醇200ml i.v.，30±10min兩次，相隔8±2小時。或者，對受試者投予20%甘露醇100ml/60分鐘i.v.q4h。
以下是參加試驗及例行檢查的程序。
1.基本資料、健康疾病史及用藥史(可追溯至進入研究前三個月)。
2.生命徵象測量。
3.體檢
4.血液檢查如下：
1)組織分型HLA-HLA-ABC多抗原、組織分型HLA-HLA-DR多抗原及ABO血型測試(A、B、AB、O血型、RH(D))。
2)CBC-1(WBC、RBC、Hb、Hct、血小板計數、MCV、MCH、MCHC)及WBC差異計數。
3)APTT(活化的部分凝血酶時間)、凝血酶原時間及凝血酶原時間及國際標準化比值(INR)。
4)血液生化檢查，包含Na+(鈉)、K+(鉀)及Cl+(氯)濃度、血糖水平(ac或pc)、血清麩胺酸-草醯乙酸轉胺酶(S-GOT)、血清麩胺酸-丙酮酸轉胺酶(SGPT)、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐(B)CRTN。
5)紅血球沈降率(E.S.R)、C.R.P(C反應蛋白)-比濁法。
6)細胞激素，包含IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ及TNF-α。
5.Glasgow昏迷指數(GCS)。
6.心電圖(EKG)。
7.胸部X光。
8.腦部MRI。
9.腹部超音波檢查。
10.NIHSS、Berg平衡量表(BBS)及Barthel指數(BI)。
訪視1：篩檢(以下活動在醫院內進行)：
檢查受試者以獲取上述十類資料。其中，兩次獲取NIHSS，間隔24±1小時，以建立基線/基線。
訪視2：輸注人類臍帶血(第0天)
1.確認已簽署受試者的同意書。
2.根據組織分型HLA-HLA-ABC多抗原、組織分型HLA-HLA-DR多種抗原及ABO血型檢查(A、B、AB、O血型及RH(D))，確認匹配的臍帶血單位，並將匹配的冷凍臍帶血單位送到醫院。
3.輸注前監測受試者的生命徵象。
4.根據上述程序在醫院實驗室解凍冷凍的臍帶血單位。
5.靜脈注射一次臍血(約含2至5x108個單核細胞)，兩次注射給予受試者甘露醇(20%甘露醇，200ml I.V.，30±10min)(間隔8小±2小時)。投予後，如以下所述監測生命徵象：
˙開始輸注後每15±5分鐘4次；
˙第一次甘露醇注射後1次；
˙在第二次甘露醇注射之前1次；
˙第二次甘露醇注射後每6小時±30分鐘，4次。
訪視3：恢復期(UCB輸注後24±8小時)
UCB輸注後24±8小時，檢查受試者的以下各項：
1.生命徵象；
2.GCS；
3.下列的血液檢查：
1)CBC-1(WBC、RBC、Hb、Hct、血小板計數、MCV、MCH、MCHC)及WBC差異計數；
3)APTT(活化的部分凝血酶時間)、凝血酶原時間及凝血酶原時間及國際標準化比值(INR)；
4)血液生化檢查，包含Na+(鈉)、K+(鉀)及Cl+(氯)濃度、血糖水平(ac或pc)、血清麩胺酸-草醯乙酸轉胺酶(S-GOT)、血清麩胺酸-丙酮酸轉胺酶(SGPT)、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐(B)CRTN；
5)紅血球沈降率(E.S.R)、C.R.P(C反應蛋白)-比濁法；及
6)細胞激素，包含IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ及TNF-α。
4.腦部MRI；
5.腹部超音波檢查；
6.NIHSS、Berg平衡量表(BBS)及Barthel指數(BI)；
7.觀察並記錄不良事件，評估受試者是否患有GVHD；
8.查看用藥記錄；及
9.查看受試者的病歷，並匿名記錄數據以供研究使用。
訪視4：恢復期(UCB輸注後48±8小時)
UCB輸注後48±8小時，再次檢查受試者的訪視3項目1至3及6至9。
訪視5：恢復期(UCB輸注後72±8小時)
UCB輸注後72±8小時，再次檢查受試者的訪視3項目1至3及5至9。
訪視6：恢復期(UCB輸注後7±1天或出院前1天)
檢查受試者的生命徵象、GCS、NIHSS、BBS、BI、不良事件(包含GVHD)，並查看受試者的用藥及病歷。
訪視7：觀察期(UCB輸注後1個月±7天)
檢查受試者的生命徵象、腦部MRI、NIHSS、BBS、BI、不良事件(包含GVHD)，並查看及記錄受試者的用藥及病歷。
訪視8、9、10及11：觀察期(UCB輸注後3、6、9、12個月±7天)：
檢查受試者的生命徵象、與訪視3相同的血液檢查方法、腹部超音波檢查(UCB輸注後3及12個月±7天)、腦部MRI(UCB輸注後6及12個 月±7天)、NIHSS、BBS、BI及不良事件(包含GVHD)。查看並記錄受試者的用藥及病歷。
實施例3
此實施例說明，對於患有急性缺血性中風的成年患者，已經實質上減除血漿但未減除紅血球的同種異體UCB單位是安全且有效的。
患者特徵：
1.年齡：46
2.性別：男
3.中風發作時間：6/3/2019，9pm
4.NIHSS：基線8；24小時後9
5.於2019/06/06簽署ICF參加急性中風研究
6.Dx：帶有左側偏癱的右MCA/ACA梗塞
其他身體史：胃潰瘍、高血壓、自2011年以來在QW1、3、5進行血液透析(HD)下的末期腎臟病(ESRD)的慢性腎臟病(CKD)、心絞痛及副甲狀腺機能亢進s/p部分副甲狀腺切除術。
根據患者的HLA類型，使用下列UCB概況識別出匹配的UCB單位：
1.TW-02-04191；
2.台灣StemCyte於2002年7月22日收集；
3.輸注前貯存17年；
4.經由血清減除方法處理；
5.HLA匹配=6/6；
6.冷凍前TNC=65.28x107；及
7.冷凍前CD34=105.8x104。
在中風後第8天，按照上述方式給患者投予UCB(2.63x108)，UCB輸注開始於上午12：47結束於下午13：13。在UCB輸注期間患者的狀況穩定。休息30分鐘後，每4小時給患者投予4劑20%100mL甘露醇的靜脈注射(甘露醇100mL/60分鐘i.v.q4h)。
UCB輸注後24小時(中風發作後約9天)，按上述方式檢查患者，腦部MRI顯示，隨著時間的流逝，水腫逐漸發展至最大。
在UCB輸注後7至14天，患者顯示出運動功能改善。在UCB輸注後1個月，患者顯示出進一步及更顯著的運動功能改善。在此期間相關的NIHSS、BI及BBS變化如圖3所示。特別是在輸注臍帶血之前的第0天，該患者顯現出左側麻痺；在第7天，輸注UCB後7天，患者的左手指可動。在輸注UCB後1個月，患者可移動左手/手指及腿，並且可以握拳。他的NIHSS從9降低到3.5。
以上結果證實，患有缺血性中風的成年患者在接受血漿減除方法處理的HLA 6/6匹配同種異體臍帶血後，在短期間內顯著復原。這種復原是前所未有的，在其他臨床試驗中未觀察到。
患者在CB輸液後8天出院，並在第1、3、6、12個月追蹤，按照上述方式檢查NIHSS、神經功能及MRI。發現患者的神經功能在臍帶血輸液後逐漸改善。他的NIHSS在CB輸液後12個月從基線的9分提高到1分(圖4A)，Berg平衡得分從0分提高到48分(圖4B)，及Barthel指數得分從0分提 高到90分(圖4C)。經由腹部超音波檢查的12次觀察未發現脾腫大。發生包含失眠及上呼吸道感染的兩項不良事件並用藥物成功地治療。未觀察到嚴重的不良事件。擴散加權成像(DWI)在中風後2小時及8天顯示右側輻射冠梗塞(白色強度增加)，該梗塞在3個月後散開並在6個月後消失(圖5A至圖5D)。在梗塞後2小時、8天、3個月及6個月檢測T2加權影像顯示右側輻射冠的白色強度增加(圖6A至圖6D)。
細胞療法對腦中風的有效性取決於多種因素，包含細胞類型、細胞來源、細胞數量、細胞治療時機及細胞遞送途徑。中風引發後修復受損神經細胞或更新神經細胞的時間窗是短促的，例如，根據動物實驗，在72小時內。急性或亞急性期中風的早期細胞治療可能會導致較好的結果。上述患者在中風後3個月從MRI檢查確認遭受亞臨床第二次中風。T2影像顯示僅在第二次中風區域中喪失腦實質及積聚CSF，但在急性期已經由細胞療法治療的第一期中風區域中則沒有(圖6C及圖6D)。
CB細胞在中風的急性及亞急性期展現更好的治療潛力。CB細胞除了具有再生作用外，還具有免疫調節及抗炎作用，因此可以保護半影組織免受中風後炎症反應所導致的進一步傷害。經由改變脾細胞的表現型，CB細胞也可發揮其免疫調節活性。在急性或亞急性期，靜脈遞送CB療法可通過改變全身性免疫調節來達到神經保護作用。
間質幹細胞(MSC)療法的益處已在實驗室中實現並得到擴展。MSC的安全性已記錄在許多臨床試驗中，然而療效尚不清楚。供體幹細胞的質量、活性及發展潛力對成功的幹細胞療法是重要的。細胞狀況相當取決於供體的來源。在自體細胞移植中，從患有疾病的患者中回收的供體細胞可能沒有令 人滿意的質量、活性或發展潛力。不同於自體移植，來自健康供體用於同種異體移植的冷凍保存HUCBM提供更好的穩定性及質量的替代方法。
發明所屬技術領域的技術人員可確定用於中風治療的幹細胞的合適數目。建議靜脈內注射MSC的最低要求為8.4億的單劑量(Borlongan CV et al.Stem Cells Translational Medicine.2019；8(9)：983-8)。發明所屬技術領域的技術人員將理解，對細胞數量及毒性的風險和收益考慮應是最大的益處及最小的細胞劑量(Sarmah D,et al.,Translational stroke research.2018；9(4)：356-74)。增強幹細胞穿越血腦障壁的透化性可能有助於減少幹細胞的數量。為此，甘露醇可用於破壞血腦障壁，以促進乾細胞的周邊遞送。儘管該報告病例的細胞數量約為2.63億，使用甘露醇在細胞輸注後30分鐘打開血腦障壁。除了增強幹細胞的透化性外，甘露醇還可增強神經營養因子及神經生長因子穿越血腦障壁。因此，本文所說明的方法允許一個人受益於從自身及其他人移植的CB細胞的有利作用，包含突觸發生、未成熟神經元的增殖及除CB細胞再生之外的神經元細胞的遷移。
上述實施例及較佳具體的描述應作為說明性的，而不是限制申請專利範圍所定義的本發明。將容易理解的是，在不脫離如申請專利範圍所闡述的本發明的情況下，可利用上述特徵的許多變化及組合。這些變化不被認為脫離本發明的範圍，而旨在將所有這些變化包含在下列申請專利範圍的範圍內。以引用方式將本文所引用的所有參考文獻整體併入本文中。
本案圖式皆為實驗數據或流程。

Claims (26)

  1. 一種治療或改善心血管疾病或腦損傷之方法，該方法包括辨識有此需要的受試者，及
    對該受試者投予有效量的包括臍帶血(UCB)之治療組成物。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該治療組成物包括血漿減除(PD)UCB或紅血球減少(RCR)UCB。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中該治療組成物進一步包括冷凍保護劑。
  4. 如請求項3所述之方法，其中該冷凍保護劑為二甲基亞碸(DMSO)。
  5. 如請求項2所述之方法，其中當與全血UCB相比時，該PD UCB沒有減除紅血球。
  6. 如請求項2所述之方法，其中該PD UCB包括所有體積的紅血球。
  7. 如請求項3所述之方法，其中該治療組成物包括約5體積%至10體積%的冷凍保護劑。
  8. 如請求項1或2所述之方法，其中該治療組成物係藉由解凍包括UCB之貯存組成物而獲得。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該解凍之步驟在5分鐘內完成。
  10. 如請求項8所述之方法，其中該解凍之步驟包括將貯存之組成物於維持在37℃±2℃之間之水浴中培育。
  11. 如請求項8所述之方法，其中該貯存之組成物在解凍後未經清洗，且係作為治療組成物而投予受試者。
  12. 如請求項8所述之方法，其中在解凍完成後1至2小時內完成該投予之步驟。
  13. 如請求項1所述之方法，其中該UCB包括單核細胞，及該單核細胞係以大約2至5x108個單核細胞/kg至約1x108細胞/kg投予該受試者。
  14. 如請求項1所述之方法，其中藉由輸注而投予該治療組成物。
  15. 如請求項13所述之方法，其中以約5至10ml/分鐘投予該治療組成物。
  16. 如請求項1所述之方法，進一步包括將血腦障壁(BBB)透化劑組成物投予該受試者。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該BBB透化劑包括甘露醇。
  18. 如請求項1所述之方法，其中該心血管疾病為中風或心肌病。
  19. 如請求項18所述之方法，其中該受試者為人類患者。
  20. 如請求項19所述之方法，其中在投予步驟前，該患者具有美國國家衛生研究院腦中風評估表(NIHSS)評分為4至32或更高。
  21. 如請求項1所述之方法，其中該方法進一步包括針對該受試者之大於4/6的HLA分型。
  22. 如請求項1所述之方法，其中該方法確實包括與該受試者相容的ABO。
  23. 如請求項1所述之方法，其中該方法進一步包括對該受試者投予免疫抑制劑。
  24. 如請求項1所述之方法，其中在該投予之步驟前不對該受試者投予纖維蛋白溶解藥物。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該纖維蛋白溶解藥物是組織血漿素原活化因子(TPA)。
  26. 如請求項18所述之方法，其中該心肌病是缺血性心肌病。
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