JP2011515470A - 臍帯血細胞を用いた脳損傷の処置 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、TREATMENT OF BRAIN DAMAGE USING UMBILICAL CORD BLOOD CELLSと題された、2008年3月28日出願の米国仮出願第61/072,173号の優先権を主張し、その全内容が本明細書に参照として組込まれる。
本発明は、脳損傷を処置するための臍帯血細胞の使用に関する。
本発明は一部、臍帯血細胞が慢性脳卒中に伴う症状を好転させることが可能であるという、注目すべきおよび驚くべき知見を基礎とする。従来、脳卒中の影響の多くが、好転不能であるとみなされてきたか、または他の処置を用いても改善されてこなかったことから、これは驚くべきことである。本発明は、臍帯血細胞を用いた慢性脳卒中対象、脳卒中の発生から何年も経過後であっても、の処置を意図する。
材料および方法
CD34 + /133 + hUCB(hUCB 34/133 )の精製および選択
単核細胞(MNCs)を、ヒト全臍帯血(hUCBW)(Stemcyte, USA)から調製した。MNC層を採取して、1mM EDTAのPBS溶液で2度洗浄した。CD34+およびCD133+MNCsの両方を、製造者の指示書に従い、磁気ビーズ分離法(MACS; Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)によって、2×108個のMNCsから分離した。簡潔には、MNCsを300μLのPBSおよび5mMのEDTA中で懸濁した。これらの細胞を、CD34およびCD133に対する、ハプテン抱合モノクローナル抗体(Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)、続けてマイクロビーズに結合した抗−ハプテン抗体で、108個の細胞毎に100μLのビーズの割合で、4℃で15分間標識した。ビーズ陽性細胞(すなわち、CD34+およびCD133+MNCs)を、磁界中にセットした陽性選択カラム上で富化した。MACSでソートした細胞のフィコエリトリン(PE)(Becton Dickinson, USA)標識化抗−CD34および抗−CD133抗体(Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)を用いたFACS分析は、図1Bに示すように、選択した細胞の90%±3%がCD34およびCD133の両方に陽性であったことを示した。そして、1μg/mLのビスベンズイミド(Hoechst 33342; Sigma, USA)で標識化し、2%FBS(Hyclone, Road Logan, UT)を加えた300μLのイスコフ改変ダルベッコ培地(Gibco/Invitrogen, UK)中で再懸濁した細胞を、37℃で5%CO2/95%大気の加湿雰囲気下で組換サイトカインおよびエリスロポエチン(StemCell Technologies, USA)を含む3mlのMethoCult GF H4434および抗生物質と1時間混合し、移植のために調製した。
体重およそ250〜300gの成熟雄Sprague-Dawleyラット30匹を、3本の血管結紮の対象とした。全ての外科的手技は、University Institutionalガイドラインに沿って、滅菌性/無菌性技術を用いて実施した。ラットを、抱水クロラール(0.4g/kg)で腹腔内麻酔した。右中大脳動脈(MCA)および両側の総頚動脈(CCAs)の結紮を、Chen et al.(Stroke, 1986, 17(4):738-743)に記載されたものを改変した方法によって、0日目に実施した。CCAsを非外傷性の動脈クリップでクランプした。手術用顕微鏡の下、頬骨が側頭骨鱗部(squamosal bone)に融合するところに2×2の開頭部を穿孔した。右MCAを、10−0ナイロン縫合糸で結紮した。麻酔をかけた動物において、皮質血流をレーザードップラー血流計(PF-5010, system, Perimed system, Perimed AB, Stockholm, Sweden)で連続的に測定した。光検出器を設置させるために、穿頭孔(直径1mm)を右前頭頭頂領域(frontoparietal region)に作った。プローブ(直径0.45mm)を定位的に皮質(ブレグマの1.3mm後方、2.8mm側方、および硬膜の1.0mm下方)に設置した。90分の結紮後、MCA上の縫合糸およびCCAs上の動脈クリップを取り外して再灌流させた。中核体温をサーミスタプローブでモニターし、麻酔中は加熱パッドで37℃に保った。各ラットが回復した後、加熱ランプで体温を37℃に保った。予測されたように全てのラットは、脳虚血後および如何なる細胞投与前である1日目に、顕著な身体の不均衡を発症し、虚血脳の反対側へ曲がった。
次に、図1Aに示すように、ラットを3つの群に振り分けた。群1には、ビヒクル単独で実験的脳卒中後1日目に投与した。群2には、hUCB34/133細胞を実験的脳卒中後1日目に投与した。細胞を実験的脳卒中後1日目に投与するので、この群は急性脳卒中の実験モデルを表す。群3には、hUCB34/133細胞を7日目に投与した。この群は慢性脳卒中の実験モデルを表す。細胞またはビヒクル単独は、尾状核被殻の損傷した錐体路へと定位的に注射された。3〜5μLのPBS中で懸濁したビスベンズイミド細胞で標識化した約2×105個のhUCB34/133細胞を、26ゲージのハミルトンシリンジを用いて、硬膜の3〜5mm下方にある3つの皮質領域へ注射した。その皮質部のおおよその座標は(1)ブレグマの1.0〜2.0mm前方および正中線の3.5〜4.0mm側方、(2)ブレグマの0.5〜1.5mm後方および正中線の4.0〜4.5mm側方、ならびに(3)ブレグマの3.0〜4.0mm後方および正中線の4.5〜5.0mm側方である。針を、各注射後5分間所定の位置で保持し、注射溶液の漏洩を防ぐためにボーンワックスの一片を頭蓋骨欠陥へと適用した。ビヒクル群の実験ラットは、生理食塩水で定位的に処置した。シクロスポリンA(10mg/kg, ip, Novartis)の注射を各実験ラットへ毎日投与した一方で、ビヒクル対照には、同等の容量の生理食塩水を、以前に記載したように(Zhao et al., 2004)与えた。
神経機能および他の行動アセスメント。
3つの実験群において神経機能を評価するために、行動アセスメントを脳虚血の3日前(すなわち、−3日目)、ならびに虚血傷害の1、7、14、21、28および35日後に実施した。アセスメントでは、(a)身体の不均衡性、(b)自発運動活性、および(c)握力を測定した。脳虚血後に得られたものを正規化するために、基準値試験のスコアを記録した。
図5は、対照および処置を施した動物における、FDG PETスキャンでモニターした脳代謝を示す。図12は、対照および処置を施したネズミのMRI脳スキャンを示す。
免疫蛍光染色を実施し、投与したhUCB細胞が虚血脳においてニューロン、グリア細胞、または内皮細胞に分化することが可能であるかを決定した。共焦点顕微鏡観察を行い、細胞型特異的マーカーが外因性移植物(ビスベンズイミド標識化)と共存しているかを同定した。ラットを抱水クロラール(0.4g/kg、ip)で麻酔したあと、脳を生理食塩水と共に経心腔的灌流で固定し、続けて4%パラホルムアルデヒドで灌流および浸漬して、30%スクロース中に包埋した。一連の隣接する厚さ20pmの切片を、冠状面上の各脳から切り出した。
図12および13は、細胞および/または注射した色素の、再生した皮質脊髄路に沿った存在および移動を実証する。
Claims (46)
- 慢性脳卒中を処置するための方法であって、脳卒中を経験したヒト対象の脳へ、CD34+、CD133+、またはCD34+/CD133+細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を実質内投与することを含み、ここで前記単離臍帯血細胞集団を脳卒中から7日を超えて経過した後に投与する、前記方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、CD34+臍帯血細胞を富化したものである、請求項1に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、CD133+臍帯血細胞を富化したものである、請求項1に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、CD34+/CD133+両方の臍帯血細胞を富化したものである、請求項1に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも75%がCD34+である単核細胞を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも90%がCD34+である単核細胞を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも75%がCD133+である単核細胞を含む、請求項1または3に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも90%がCD133+である単核細胞を含む、請求項1または3に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも75%がCD34+/CD133+である単核細胞を含む、請求項1または4に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも90%がCD34+/CD133+である単核細胞を含む、請求項1または4に記載の方法。
- 対象が、少なくとも60歳である、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも2×106個の細胞を対象へ投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも5×106個の細胞を対象へ投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも8×106個の細胞を対象へ投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団を、脳卒中から1ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団を、脳卒中から6ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団を、脳卒中から1年を超えて経過した後に投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団を、損傷がある皮質脊髄路に沿って3つの部位へと投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、単一の臍帯血ユニット由来である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、複数の臍帯血ユニット由来である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、6つの組織適合性マーカーのうち4つ未満を対象と共有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、6つの組織適合性マーカーのうち少なくとも4つを対象と共有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 脳組織損傷を経験したヒト対象の脳へ、CD34+、CD133+、またはCD34+/CD133+臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を実質内投与することを含む、脳組織損傷を処置するための方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、CD34+臍帯血細胞を富化したものである、請求項23に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、CD133+臍帯血細胞を富化したものである、請求項23に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、CD34+/CD133+臍帯血細胞を富化したものである、請求項23に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも75%がCD34+である単核細胞を含む、請求項23または24に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも90%がCD34+である単核細胞を含む、請求項23または24に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも75%がCD133+である単核細胞を含む、請求項23または25に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも90%がCD133+である単核細胞を含む、請求項23または25に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも75%がCD34+/CD133+である単核細胞を含む、請求項23または26に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、少なくとも90%がCD34+/CD133+である単核細胞を含む、請求項23または26に記載の方法。
- 対象が少なくとも60歳である、請求項23に記載の方法。
- 少なくとも2×106個の細胞を対象へ投与する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも5×106個の細胞を対象へ投与する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも8×106個の細胞を対象へ投与する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷から1ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷から6ヶ月を超えて経過した後に投与する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団を、脳組織損傷から1年を超えて経過した後に投与する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団を、損傷がある皮質脊髄路に沿って3つの部位へと投与する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、単一の臍帯血ユニット由来である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、複数の臍帯血ユニット由来である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、6つの組織適合性マーカーのうち4つ未満を対象と共有する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 単離臍帯血細胞集団が、6つの組織適合性マーカーのうち少なくとも4つを対象と共有する、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 脳組織損傷が、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、またはハンチントン病に起因するものである、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 脳組織損傷を処置するための方法であって、外傷性脳傷害に起因する脳組織損傷を有するヒト対象の脳へ、CD34+、CD133+、またはCD34+/CD133+臍帯血細胞を富化した単離臍帯血細胞集団を実質内投与することを含み、ここで前記細胞を外傷性脳傷害の発生から1ヶ月を超えて経過した後に投与する、前記方法。
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