DE10330216A1

DE10330216A1 - Verwendung von Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Verhinderung von Hirnschäden infolge Sauerstoffmangel und zur Neuroprotektion

Info

Publication number: DE10330216A1
Application number: DE10330216A
Authority: DE
Inventors: Arne Wilhelm Oluf Jensen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-07-03
Filing date: 2003-07-03
Publication date: 2005-01-20
Also published as: WO2005003333A3; WO2005003333A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft unter anderem ein Verfahren zur Erzeugung neuronal vordifferenzierter Stammzellen aus Nabelschnurblut und die Verwendung dieser Stammzellen zur Verhinderung von Hirnschäden, insbesondere von frühkindlichen Hirnschäden, infolge Sauerstoff- und/oder Glucosemangel, Entzündungen, Trauma oder genetischer Defekte. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von Stammzellen aus Nabelschnurblut in Kombination mit neuroprotektiven Substanzen, wie z. B. Kreatin, Magnesium, Sauerstoffradikalfänger, NO-Inhibitoren, Glutamatantagonisten, Calciumantagonisten (z. B. Flunarizin), Wachstumsfaktoren und Anticytokinen und Apoptose-Hemmern, oder anderen neuroprotektiven Interventionen, wie z. B. Hypothermie, zur Neuroprotektion und Förderung der Eigenregeneration durch Stimulation endogener Stammzellen des Gehirns.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft unter anderem ein Verfahren zur Erzeugung neuronal vordifferenzierter Stammzellen aus Nabelschnurblut und die Verwendung dieser Stammzellen zur Verhinderung von Hirnschäden, insbesondere von frühkindlichen Hirnschäden, infolge Sauerstoff- und/oder Glucosemangel, Entzündungen, Trauma oder genetischer Defekte. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von Stammzellen aus Nabelschnurblut in Kombination mit neuroprotektiven Substanzen, wie z.B. Kreatin, Magnesium, Sauerstoffradikalfänger, NO-Inhibitoren, Glutamatantagonisten, Calciumantagonisten (z.B. Flunarizin), Wachstumsfaktoren, Anticytokinen und Apoptose-Hemmern, oder anderen neuroprotektiven Interventionen, wie z.B. Hypothermie, zur Neuroprotektion und Förderung der Eigenregeneration durch Stimulation endogener Stammzellen des Gehirns.
Stand der Technik
Das Gehirn ist ein komplexes Organ und reagiert empfindlich auf äußere Einflüsse. Im Gegensatz zu Herz, Leber oder Lunge übersteht es einen Sauerstoffmangel kaum länger als acht bis zehn Minuten. Darüber hinaus ist es besonders empfindlich gegenüber Entzündungsreaktionen, Trauma und genetischen Aberrationen.
Die Ursachen für Hirnschäden sind vielfältig und reichen von Durchblutungsstörungen der Plazenta über während der Geburt abgeklemmte Gefäße, Infektionen, traumatischen Geburtsereignissen und genetischen Defekten bis hin zu Beatmungsfolgen bei sehr unreifen zu früh geborenen Kindern. In Deutschland bleiben bei rund 1000 Kindern jährlich allein aufgrund eines Sauerstoffmangels unmittelbar vor, während oder nach der Geburt schwerste Hirnschäden zurück. Neugeborene mit einem Geburtsgewicht unter 1500 Gramm sind besonders gefährdet. Je nach Ausmaß der Schädigung und der betroffenen Hirnregionen können sie leichte Funktionsstörungen des Gehirns (z.B. "minimal brain dysfunction", "Zappelphilipp-Syndrom") oder schwerste körperliche und weitreichende geistige Behinderungen davon tragen. Dazu gehören Bewegungsstörungen bis hin zu Lähmungen der Arme und Beine, selbst ein Zusammenhang mit dem Auftreten von Schizophrenien wird heute vermutet. Zudem kann die Kontrolle emotionaler Impulse beeinträchtigt sein, was im Erwachsenenalter eine geringere geistige Leistungsfähigkeit, Beziehungsstörungen, Ängste, Depressionen oder Schwierigkeiten in der beruflichen Anpassung verursachen kann.
Die Belastungen für die Betroffenen und ihre Angehörigen sind beträchtlich und erfordern eine enge Kooperation zwischen Geburtshelfern, Kinderärzten, Psychologen sowie Sprach- und Bewegungstherapeuten. Die für die Solidargemeinschaft entstehenden Kosten pro Geburtenjahrgang werden in Deutschland auf mindestens 500 Millionen EUR geschätzt.
Ein Sauerstoffmangel während der Geburt schädigt bei sehr früh geborenen Kindern meist die weiße Hirnsubstanz, die im Inneren des Gehirns die natürlichen Hohlräume (Ventrikel) umgibt. Durch diese sog. periventrikuläre Leukomalazie werden Nervenbahnen angegriffen, die von der Hirnrinde u.a. zu den Beinen führen, was die genannten Bewegungsstörungen verursacht. Zudem können die empfindlichen Blutgefäße des unreifen Gehirns bei Blutdruckschwankungen, die mit dem Sauerstoffmangel verbunden sind, leicht zerreißen. Blutungen in das Hirnwasser oder in die weiße Hirnsubstanz sind die Folge.
Bei reifen Kindern führt ein Sauerstoffmangel dagegen eher zu Schäden in der grauen Substanz der Hirnrinde. Betroffen sind davon jedoch maximal 0,04 Prozent der Kinder, während bei 10 bis 15 Prozent aller Frühgeborenen unter 1 500 Gramm Geburtsgewicht schwere Hirnschädigungen auftreten.
Durch klinische Strategien zum Schutz der kindlichen Hirnzellen, die vor allem bei frühgeborenen Kindern Hirnschäden vermeiden sollen, wurden in den vergangenen zehn Jahren zum Teil gute Erfolge erzielt. Dabei steht zunächst die Senkung der Frühgeburtenrate im Vordergrund, zugleich aber auch, Sauerstoffmangelzustände rechtzeitig zu erkennen und entsprechend einzugreifen.
Stresssituationen für Mutter und Kind, Blutungen und in die Gebärmutter aufsteigende Infektionen steigern das Frühgeburts risiko. Um Risikopatientinnen rechtzeitig zu erkennen, muss daher zunächst eine umfassende Anamnese erhoben werden. Mit der frauenärztlichen Untersuchung sollten zugleich Infektionen kontrolliert, eine Ultraschallaufnahme des Gebärmutterhalses erfolgen und das Vaginalsekret auf Entzündungsanzeichen untersucht werden. Mit einem Vorsorgeprogramm, das eine intensive psychosoziale Betreuung, gegebenenfalls wehenhemmende Medikamente und Antibiotika umfasst und die Möglichkeit einschließt, dass sich Frauen selbst regelmäßig auf vaginale Infektionen kontrollieren (Teststreifen), lässt sich das Frühgeburtsrisiko senken.
In einer umfangreichen Ultraschall-Reihenuntersuchung des kindlichen Gehirns nach der Geburt (ca. 5 300 Kinder) zeigte sich, dass mit abnehmender Vitalität insbesondere bei frühgeborenen Kindern Hirnblutungen in allen Schweregraden (I bis IV; vgl. Berger et al., Eur. J. Obstet. Gynaecol. Reprod. Biol. 75 (1997) 191–203) zunehmen. Als Maß für den Vitalitätszustand wird dabei der sog. Apgar-Wert (0 bis 10 Punkte) genutzt, der Herzschlag, Atmung, Muskelspannung, Hautfärbung und Reaktionsfähigkeit der Kinder berücksichtigt. Er wird eine, fünf und zehn Minuten nach jeder Geburt bestimmt und liegt bei vitalen Kindern zwischen acht und zehn Punkten. Ein niedriger Apgar-Wert spiegelt hier unter Umständen einen durch den Sauerstoffmangel hervorgerufen Schockzustand des Kindes wieder. Während bei Sauerstoffmangel im Gehirn normalerweise das sympatische Nervensystem (Teil des vegetativen Nervensystems) den Blutfluss aus anderen weniger gefährdeten Bereichen des Organismus verstärkt in lebenswichtige Organe lenkt, sind Frühgeborene nur eingeschränkt zu einer solchen Umverteilung in der Lage. Zusammen mit der Empfindlichkeit ihrer Blutgefäße gegenüber Blutdruckschwankungen führt das zu einer äußerst geringen Toleranz gegenüber Sauerstoffmangel.
Diese Ergebnisse führten zu einem Konzept der Frühintervention: Schon bei ersten Anzeichen eines möglichen Sauerstoffmangels wird eine Risikoabwägung vorgenommen und alle Vorbereitungen getroffen, damit das Kind bei Sauerstoffmangel (abfallende Herzfrequenz) sofort und unter optimalen Bedingungen geboren wird. Wenn das gelingt, kann es in gutem Zustand vom Kinderarzt weiter betreut werden, und das unreife Gehirn bleibt vor Schäden bewahrt. Selbst bei Geburten vor der 30. Schwangerschaftswoche traten in keinem Fall schwere Hirnblutungen (Grad IV) auf, wenn die Kinder mit einem Apgar-Wert von 8 bis 10 zur Welt kamen.
Die Studie zeigte zudem, dass vor allem frühgeborene Kinder, deren Mütter während der Geburt Fieber bekamen, ein erhöhtes Risiko für eine Hirnblutung tragen. Das Fieber war in diesen Fällen Anzeichen einer in die Gebärmutter aufsteigenden bakteriellen Infektion. In Tierversuchen wurde nachgewiesen, dass die aus den Bakterien freigesetzten Endotoxine bei Sauerstoffmangel die Umverteilung der kindlichen Durchblutung zugunsten des Gehirns beeinträchtigen. Bei fortschreitender Infektion sollte – im Sinne der Frühintervention – die Geburt konsequent beendet werden, da extrem unreifen Kindern sonst Hirnblutungsraten von bis zu 80 Prozent drohen.
Da sich Hirnschäden nicht in jedem Fall durch Vorsorgeprogramme oder Frühintervention verhindern lassen, werden auch therapeutische Strategien erforscht, die das kindliche Gehirn schützen und sogar regenerieren sollen, wenn der Schaden bereits eingetreten ist. Das setzt voraus, dass die Mechanismen, die zu einem Hirnschaden führen, bekannt sind.
Es wurde festgestellt, dass das Absterben von Nervenzellen im Gehirn bei Sauerstoffmangel nach Unterschreiten eines Schwellenwertes beginnt und dann in zwei Wellen erfolgt: Durch die mangelnde Durchblutung bricht der Energiestoffwechsel im Ge hirn zusammen und als Reaktion auf den Sauerstoffmangel wird vermehrt Glutamat freigesetzt – einer der wichtigsten aktivierenden Botenstoffe im Gehirn. Wenn dem Ionenaustausch an der Zellmembran keine Energie mehr zur Verfügung steht, kann auch die elektrische Membranspannung an den Nervenzellen nicht aufrecht erhalten werden. Als Folge dringen über verschiedene Ionenkanäle große Mengen Kalzium in die Zellen ein. Ein Teil dieser Kanäle wird durch Glutamat gesteuert. Der exzessive Anstieg der intrazellulären Kalzium-Konzentration, der sog. calcium-overload, aktiviert verschiedene Enzyme, die schließlich die Zellen schädigen.
Wenn der akute Sauerstoffmangel vorüber ist, normalisiert sich der Energiestoffwechsel in einigen Hirnbereichen zunächst wieder. Doch wenige Stunden später setzt eine zweite Welle des Absterbens von Nervenzellen ein: Die Nervenzellen schwellen an, es werden epileptische Aktivitätsmuster in den Hirnströmen registriert, die Anzeichen einer Schädigung der Nervenzellen sind. Als Gründe dafür vermuten wir u. a. Entzündungsreaktionen und ein Ungleichgewicht zwischen hemmenden und aktivierenden Botenstoffen im Gehirn, wodurch möglicherweise der programmierte Zelltod (Apoptose) in Gang gesetzt wird. Da ein beträchtlicher Teil der Zellschäden aber erst Stunden oder Tage nach dem Sauerstoffmangel zustande kommt, wird versucht, während dieses „therapeutischen Fensters" einzugreifen.
Es werden bereits unterschiedliche medikamentöse Strategien untersucht, die Hirnschäden durch Sauerstoffmangel vermindern können, wie zum Beispiel neuroprotektive, d.h. die Nervenzellen schützende Substanzen. Verwendet werden beispielsweise Flunarizin, das bei Sauerstoffmangel den unkontrollierten Einstrom von Kalzium in die Nervenzelle mindert (Kalzium-Kanal-Antagonist), und Lubeluzole, ein Gegenspieler des Glutamats (Glutamat-Antagonist). Beide Substanzen haben bereits bei Schlaganfall positive Resultate gezeigt. Während Lubeluzole jedoch bei Neugeborenen nicht die erhoffte Wirkung hatte, scheint Flunarizin geeignet, das kindliche Gehirn vor schweren Schäden durch Sauerstoffmangel zu bewahren.
Da die Einführung jeglicher Pharmaka in der Geburtshilfe umfangreiche Unbedenklichkeitsprüfungen erfordert, wird zugleich nach anderen, körpereigenen Substanzen mit einer ähnlich guten Wirkung gesucht. Mit der energiereichen Verbindung Kreatin, einem Stoffwechselprodukt des Organismus, zeichnen sich schon jetzt hoffnungsvolle Ergebnisse ab (R. Berger et al., Creatine protects the immature brain from hypoxic-ischemic injury, Middelanis et al., 2003, J. Soc. Gynecol. Investig. Vol. 10, No: 2, Abstract No. 290).
Von den experimentell bei Meerschweinchen-Feten überprüften Strategien führte auch die leichte Absenkung der Gehirntemperatur (Hypothermie) zu einer guten Schutzwirkung: Eine milde Unterkühlung um ca. 3°C innerhalb der ersten zwei Stunden nach dem Sauerstoffmangel senkt die Freisetzung von Glutamat und bewahrt das Gehirn vor weiterreichenden Schädigungen. Hier scheint die prinzipielle Verlangsamung physiologischer Prozesse bei niedrigeren Temperaturen und damit auch der schädigenden Mechanismen ein Zeitfenster zu schaffen, in dem sich Nervenzellen vom Schock des Sauerstoffmangels selbst erholen können. Ein Einsatz der Hypothermie ist bisher allerdings nur nach Geburt des Kindes vorstellbar, er wird derzeit in multizentrischen Studien überprüft.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, zum einen eine alternative, für den Patienten gut verträgliche Behandlungsmethode bereitzustellen und andererseits neben einer neuroregenerativen Wirkung, insbesondere bei bzw. nach Sauerstoffmangelzuständen, auch eine neuroprotektive Wirkung zu erzielen.
Zur Lösung der Aufgabe wird u.a. ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2 sowie die Verwendung nach den Ansprüchen 3 bis 11 vorgeschlagen. Insbesondere wird die Verwendung von Stammzellen aus Nabelschnurblut, gegebenenfalls in Kombination mit neuroprotektiven Substanzen, wie z.B. Kreativ, Magnesium, Sauerstoffradikalfängern, NO-Inhibitoren, Glutamatantagonisten, Calciumantagonisten (z.B. Flunarizin), Wachstumsfaktoren, Anticytokinen und Apoptose-Hemmern, oder anderen neuroprotektiven Interventionen, wie z.B. Hypothermie, vorgeschlagen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass bereits durch Sauerstoffmangel geschädigte Gehirnregionen regeneriert oder vor einem endgültigen Absterben der geschützt werden können, wenn man zur Behandlung (autologe) Stammzellen aus dem Nabelschnurblut verwendet, um das geschädigte Nervengewebe zu ersetzen oder wenn man endogene Stammzellen vor dem Absterben schützt oder zur Vermehrung anregt.
Diese undifferenzierten Vorläuferzellen können sich zu Blut-, Herzmuskel-, Bauchspeicheldrüsen- oder Nervenzellen entwickeln, im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen aber nicht zu einem neuen Organismus.
Vorzugsweise werden die Stammzellen intravenös (i.v.) appliziert. Es ist aber auch möglich, die Stammzellen intraperetoneal, intraventrikulär oder direkt in die geschädigte Region zu verabreichen.
Nach Applikation, beispielsweise i.v., wandern die Stammzellen von selbst in geschädigte Hirnregionen (sogen. "homing"). Dies konnte bereits experimentell nachgewiesen werden, indem menschliche Stammzellen über die Nabelschnur von Schaf-Feten transplantiert wurden und sich mit dem Blutfluss in wenigen Sekunden im ganzen Organismus verteilten. Ein Teil der Zellen gelangte in die peripheren Organe, ein anderer zum Herz und wieder ein anderer zum Gehirn, wo sie schließlich in die geschädigten Areale einwandern (sogen. "homing").
Da sich im Mittel 80 ml Blut aus der Nabelschnur entnehmen lassen, ist die Vermehrung von Nabelschnurstammzellen eine wichtige Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz der Stammzellen zur Vermeidung von Hirnschäden durch Sauerstoffmangel, sowohl bei Neugeborenen (wie z.B. zur Vermeidung frühkindlicher Hirnschädigungen infolge eines geburtsbedingten Sauerstoffmangels), als auch bei größeren Kindern und Erwachsenen.
Im Rahmen der Erfindung ist es gelungen, diese Zellen in Kultur zur Teilung zu bringen, indem man die Stammzellen in einem EGF und bFGF enthaltenden Proliferationsmedium kultiviert.
In der Zellkultur wurde in einem weiteren Schritt ferner eine neuronale Vordifferenzierung der Stammzellen durch Kultivierung in Gegenwart von humanem Nervenwachstumsfaktor β (β-NGF), vorzugsweise in Kombination von all-traps Retinsäure, durchführt. Da Nabelschnurstammzellen bereits (immunologisch) vorprogrammiert sind, ist es möglich, die "Stammzellmischung", die natürlicherweise im entnommenen Nabelschnurblut vorliegt, zu trennen. Der Mischung werden vorzugsweise nur die nichtblutbildenden Stammzellen entnommen, bei denen es sich um CD34-negative (CD34^-) Zellen handelt, und man isoliert damit jene Zellen, die zu Zellen des Nervensystems differenzieren können. In kultivierten Stammzellen wurden Eiweißstrukturen nachgewiesen, die typisch sind für Vorstufen von Nerven- und Gliazellen (1). Das zeigt, dass die Stammzellen die gewünschte neuronale Entwicklungsrichtung eingeschlagen haben.
Ein weiterer, wichtiger Aspekt in der experimentellen Phase ist die Markierung der Stammzellen vor der Transplantation, damit sie später im Wirtsorganismus wieder auffindbar sind. Menschliche Zellen lassen sich im tierischen Organismus auch mit Hilfe immunzytochemischer Methoden wiederfinden, doch ist dieser Weg schwierig und störanfällig. Ideal ist daher, mit Hilfe eines Virus Genabschnitte in die Nabelschnurstammzelle zu übertragen, die dort in das Genom eingebaut werden und für die Bildung des Green Fluorescent Proteins (GFP) sorgen. Durch die GFP-Markierung leuchten die Stammzellen unter Fluoreszenzlicht grün auf und sind damit auch im Wirtsorganismus gut sichtbar.
Auch bei der therapeutischen Anwendung kann die Transfektion mit Fremdgenen von Vorteil sein, z.B. wenn die in die Stammzellen eingeschleuste genetische Information für ein Polypeptid oder Protein kodiert, das für die Regeneration der geschädigten Nervenzellen förderlich ist, wie z.B. in Analogie zur Behandlung von Immunschwächen durch genmanipulierte eigene Nabelschnurstammzellen. Das heisst, durch eine Gentransfektion wird eine für ein in den Zellen natürlicherweise nicht exprimiertes Protein oder Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz ("Fremdgen") eingeführt. Im erfindungsgemäßen Verfahren kann auf besonders einfache Weise eine Gentransfektion der Stammzellen vorgenommen werden, ohne daß es zu einer Behinderung der Zellexpansion kommt. Die gentransfizierten Stammzellen können analog den genetisch unveränderten Stammzellen neuronal differenzieren und somit der vorgenannten Vordifferenzierung unterzogen werden. Entsprechende Verfahren zur Gentransfektion mittels Vektoren, Liposomen, nackter DNA oder durch Elektroporation sind dem Fachmann gut bekannt.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Erzeugung neuronal vordifferenzierter Stammzellen aus Nabelschnurblut, bei dem man Nabelschnurblut einer präparativen Dichtegradientenzentrifugation unterzieht und man Stammzellen isoliert, man anschliessend CD34⁺-Zellen in einer Fluoreszenz-aktivierten- Zellsortierung (FACS) abtrennt und man die verbleibenen CD34^–-Zellen in einem geeigneten Kulturmedium, das vorzugsweise β-Mercaptoethanol enthält, kultiviert, man anschliessend eine Proliferation der Zellen in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und basischem Fibroblasten Wachstumsfaktor (bFGF bzw. FGF-2) durchführt, und man schliesslich eine neuronale Vordifferenzierung in Gegenwart von humanem Nervenwachstumsfaktor β (β-NGF) durchführt.
Gemäß einer Ausführungsform werden neuronal vordifferenzierte Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Verhinderung von Hirnschäden durch Sauerstoff- und/oder Glucosemangel, Entzündungen, Trauma oder genetische Defekte verwendet.
Erfindungsgemäß bedeutet "Verhinderung von Hirnschäden" jegliche Schädigung von Nervenzellen im Gehirn, beispielsweise durch Sauerstoff- und/oder Glucosemangel, Entzündungen, Trauma oder genetische Defekte.
Vorzugsweise handelt es sich bei den verwendeten Stammzellen um neuronal vordifferenzierte Zellen, die nach einem vorgenannten bzw. im Beispielteil beschriebenen Verfahren (Beispiele 1, 2 und 4) hergestellt sind.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zum Ersatz geschädigter Nervenzellen und zur Förderung der Eigenregeneration durch Stimulation endogener Stammzellen des Gehirns, bei der man die Stammzellen bzw. das diese Zellen enthaltende Präparat zusammen mit neuroprotektiven Substanzen, wie z.B. Kreatin, Magnesium, Sauerstoffradikalfängern, NO-Inhibitoren, Glutamatantagonisten, Calciumantagonisten (z.B.
Flunarizin), Wachstumsfaktoren, Anticytokinen und Apoptose-Hemmern, oder anderen neuroprotektiven Interventionen, wie z.B. Hypothermie, verwendet.
Erfindungsgemäß schließt "Neuroprotektion" und "Förderung der Eigenregeneration des Gehirns" den Schutz von Nervenzellen oder von endogenen neuronalen Stammzellen im Gehirn vor degenerativen Veränderungen, insbesondere bei Sauerstoffmangelzuständen/hypoxisch-ischämischen Zuständen, und traumatische Verletzungen des Nervensystems sowie Entzündungen und genetischen Defekten ein.
Bei den Stammzellen kann es sich um undifferenzierte und/oder neuronal vordifferenzierte Stammzellen handeln, einschließlichlich pluripotenter und multipotenter Stammzellen, (s.o.).
Gemäß einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung auch die Verwendung von (undifferenzierten oder neuronal vordifferenzierten) Stammzellen aus Nabelschnurblut (s.o.) zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zum Ersatz geschädigter Nervenzellen und zur Förderung der Eigenregeneration des Gehirns, bei der man die Stammzellen einerseits und neuroprotektiven Substanzen, wie z.B. Kreatin, Magnesium, Sauerstoffradikalfänger, NO-Inhibitoren, Glutamatantagonisten, Calciumantagonisten (z.B. Flunarizin), Wachstumsfaktoren, Anticytokinen und Apoptose-Hemmern, oder anderen neuroprotektiven Interventionen, wie z.B. Hypothermie, andererseits verwendet. Die Applikation kann z.B. sequentiell oder gleichzeitig, z.B. in Form eines Kombinationspräparates, erfolgen. Bei Verwendung neuroprotektiver Substanzen in Verbindung mit den Stammzellen handelt es sich somit bei dem pharmazeutischen Präparat um ein Mittel zur Neuroprotektion und Regeneration. In diesem Zusammenhang ist Neuroprotektion auch wirksam zur Erhaltung der Eigenregenerationskapazität des Gehirns durch Schutz der endogenen neuronalen Stammzellen vor Schädigung.
Die Stammzellen werden vorzugsweise intravenös (i.v.), intraperetoneal, intraventrikulär und/oder direkt in den Bereich der Schädigung appliziert, wobei sie beispielsweise in Form einer Suspension, formuliert sind, in der sich neben den Zellbestandteilen auch die neuroprotektiv wirksamen Substanzen befinden können.
Erfindungsgemäß wird somit auch ein pharmazeutisches Präparat bereitgestellt, das Stammzellen umfasst, die nach einem vorgenannten oder im Beispielteil beschriebenen Verfahren zur Erzeugung neuronal vordifferenzierter Stammzellen aus Nabelschnurblut enthalten sind.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen veranschaulicht, ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
Gewinnung von Stammzellen aus Nabelschnurblut
Die Entnahme des Nabelschnurbluts erfolgte unter sterilen Kautelen und unter Zusatz von gerinnungshemmenden Substanzen.
Anschließend erfolgte eine dem Fachmann bekannte Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung isotoner Lösungen, üblicherweise Ficoll^® oder Percoll^®. Zur Abtrennung nicht-blutbildender Stammzellen wurde eine Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) durchgeführt, wobei CD34⁺ Zellen abgetrennt wurden, die etwa 70–95% der Stammzellen aus Nabelschnurblut ausmachen. Die CD34^– mononukleären Nabelschnurblutzellen wurden im folgenden verwendet.
Beispiel 2
Kultivierung und Proliferation der Stammzellen
Nach Gewinnung der Zellen erfolgte eine Kultivierung in folgendem Kultivierungsmedium:
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM),
10% Fötales Kälberserum (FCS),
2 mM L-Glutamin,
0,001% β-Mercaptoethanol und
1% nicht-essentielle Aminosäuren.
Dabei wurden die Zellen in einer T12,5-Kulturflasche (12,5 cm²) zu 1 × 10⁶ Zellen/ml einen Tag lang im oben genannten Kulturmedium kultiviert.
Die Proliferation erfolgte schliesslich über einen Zeitraum von 16 Tagen in folgendem Proliferationsmedium:
DMEM/F12 (1:1, Gibco/BRL),
0,6% Glucose,
25 μ Insulin,
100 μg Transferrin,
20 nM Progesteron,
60 μg Putrescin,
30 nM Selen,
2 mM L-Glutamin,
3 mM Natriumdicarbonat,
5 mM Hepes,
2 μg/ml Heparin/Liquemin,
20 ng/ml EGF und
20 ng/ml bFGF.
Vor der weiteren Verwendung wurden die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, mit 0,25 Trypsin + 0,2% Ethylendiaminteraacetat (EDTA) abgelöst, in serumhaltigem Medium aufgenommen und zentrifugiert.
Beispiel 3
Vordifferenzierung
Das Zellpellet aus Beispiel 2 wurde zur neuronalen Vordifferenzierung in folgendem Medium aufgenommen:
DMEM/F12 (s.o.),
0,6% Glucose,
25 μ Insulin,
100 μg Transferrin,
20 nM Progesteron,
60 μg Putrescin,
30 nM Selen,
2 mM L-Glutamin,
3 mM Natriumdicarbonat,
5 mM Hepes,
2 μg/ml Heparin/Liquemin,
0,5 μM all-trans Retinsäure,
100 ng/ml humanes β-NGF.
Anschließend wurden die Zellen zu je 2000 Zellen auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen (12 mm) ausplattiert und für drei Tage kultiviert.
Beispiel 4
Tiermodell zum Nachweis des Homings in geschädigte Hirnareale
Die Wanderung der transplantierten Nabelschnur-Stammzellen durch den Körper zu den verletzten Arealen und ihre Integration in das Nervensystem wurde an verschiedenen Versuchstieren erforscht. Dafür wurde ein experimentelles Modell verwendet, mit dem Hirnschäden bei geburtsreifen Schaf-Feten erzeugt wurden, die dem Schädigungsmuster beim menschlichen Neugeborenen ähnlich sind, wenn vor oder unter der Geburt ein entsprechender ischämischer Hirnschaden eingetreten ist; vgl. Berger et al., Pediatric Research (1998) 44: 277–282.
Ein zweites tierexperimentellen Modell zur Prüfung der Wirksamkeit der oben genannten Behandlungsformen ist das cerebrale Ischämiemodell der neugeborenen Ratte nach Levine et al., Am. J. Pathol. 1960; 36: 1–17.
Dieses Modell hat den Vorzug, dass es die Induktion eines typischen Hirnschadens beim Neugeborenen ermöglicht und nach Gabe von Stammzellen und/oder neuroprotektiven Substanzen in variablem Abstand zur Behandlung die Überprüfung der grobmotorischen und feinkoordinativen Funktionen der behandelten Tiere im Vergleich zu den unbehandelten Tieren ermöglicht, wodurch sich der "therapeutische" Effekt der Maßnahmen objektivieren läßt.
Beispiel 5
Kombination von neuroprotektiv wirksamen Substanzen und Stammzelltransplantation
Die Nutzung dieser Behandlungsformen zur Verhinderung von Hirnschäden kann im geburtshilflichen Bereich durch präventive Behandlung von Risikogeburten mittels neuroprotektiver Substanzen erfolgen, die nach Entnahme der Nabelschnurstammzellen zum Zeitpunkt der Geburt im Falle einer festgestellten cerebralen Schädigung nach der Geburt mit der Transplantation der autologen, gegebenenfalls vordifferenzierten Stammzellen kombiniert wird. Die Zuführung der neuroprotektiven Substanzen zur Prävention von Hirnschäden des Kindes kann hierbei über die Mutter (bei Placentagängigkeit der Substanzen) oder durch direkte Applikation in den fötalen Kreislauf über eine Nabelschnurpunktion in utero erfolgen.
Ebenso kann eine Behandlung mit Nabelschnurstammzellen dergestalt erfolgen, dass noch in utero das Nabelschnurblut durch Punktion der Nabelschnurgefäße oder kindlicher Gefäße gewonnen wird und durch geeignete Behandlung im Sinne einer Vordifferenzierung und/oder genetischen Manipulation vorbereitet dann dem Kind in utero zur Behandlung wieder zugeführt bzw. retransplantiert wird.
Andererseits ist eine Behandlung mit neuroprotektiven Substanzen (s.o.) auch möglich und sinnvoll, wenn die eigentlich schädigende Noxe bereits eingewirkt hat, jedoch vor Ausbildung des sogenannten sekundären Neuronenverlustes, der durch Freisetzung von excitatorischen Aminosäuren in den synaptischen Spalt zu generalisierten Krampfpotentialen mit der Folge des Absterbens von Neuronen auf dem Boden einer Imbalance zwischen Energiezufuhr und Energiebedarf erfolgt. Zusätzlich würden diese neuroprotektiven Maßnahmen die endogenen neuronalen Stammzellen vor Schaden bewahren und somit die Eigenregenerationskapazität des kindlichen Hirns erhalten. Das hierfür in Frage kommende Zeitfenster wird mit bis zu 12 Stunden nach Einsetzen der Noxe in der Literatur beschrieben, könnte aber auch größer sein. Im Anschluß daran kann diese ex post-Neuroprotektion mit der oben beschriebenen Stammzelltransplantation kombiniert werden.
Beschreibung der Figur
1 zeigt die erfindungsgemäß aus Nabelschnurblut isolierten, nicht-blutbildenden Zellen, die die für Vorstufen von Nervenzellen typischen Eiweißstrukturen aufweisen.

A. Mononukleäre Fraktion des Nabelschnurblutes im Ausstrich; Primärantikörper anti-HNA (monoklonal) (Human Nuclear Antigen; spezifische Markierung der Kerne humaner Zellen); Sekundärantikörper: Ziege anti Maus Alexa 543.
B. Mononukleäre Zellen in Kultur (Differenzierungsmedium) Expression neuronaler Markerproteine Primärantikörper anti-NSE (polyklonal) (Neuron Spezifische Enolase; Markierung neuronaler Zellen bzw. ihrer Vorläufer); Sekundärantikörper: Ziege anti Kaninchen Alexa 488.
C. Mononukleäre Zellen in Kultur (Differenzierungsmedium) Expression neuronaler Markerproteine Primärantikörper anti-β tubulin Isoform III (monoklonal) (Markierung neuronaler Zellen bzw. ihrer Vorläufer); Sekundärantikörper: Ziege anti Maus Alexa 488. Expression besonders konzentriert im Bereich des Golgi und des Endoplasmatischen Retikulums, evtl. Hinweis auf frühe Phase der Differenzierung bzw. der Proteinsynthese.

Die Markierung mononukleärer Zellen in vitro wurde zudem mit GFAP-Antikörpern durchgeführt (Glial Fibrillary Acidic Protein; Marker für neurale Zellen in der Differenzierung bzw. im reifen Hirn für ausdifferenzierte Astrozyten).

Claims

Verfahren zur Erzeugung neuronal vordifferenzierter Stammzellen aus Nabelschnurblut, dadurch gekennzeichnet, dass man Nabelschnurblut einer präparativen Dichtegradientenzentrifugation unterzieht und man Stammzellen isoliert, man anschliessend CD34⁺-Zellen in einer Fluoreszenzaktivierten-Zellsortierung (FACS) abtrennt und man die verbleibenen CD34^–-Zellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert, man anschliessend eine Proliferation der Zellen in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und basischem Fibroblasten Wachstumsfaktor (bFGF) durchführt, und man schliesslich eine Vordifferenzierung in Gegenwart von humanem Nervenwachstumsfaktor β (β-NGF) durchführt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Nabelschnurblut einer präparativen Dichtegradientenzentrifugation unterzieht und man Stammzellen isoliert, man anschliessend CD34⁺-Zellen in einer Fluoreszenz-Aktivierten-Zellsortierung (FACS) abtrennt und man die verbleibenen CD34^–-Zellen in Kulturmedium kultiviert, das Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% Fötales Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 0,001% β-Mercaptoethanol und 1% nicht-essentielle Aminosäuren umfasst, man anschliessend eine Proliferation der Zellen in Proliferationsmedium durchführt, das DMEM, F12, 0,6% Glucose, 25 μ Insulin, 100 μg Transferrin, 20 nM Progesteron, 60 μg Putrescin 30 nM Selen, 2 mM L-Glutamin, 3 mM Natriumdicarbonat, 5 mM Hepes, 2 μg/ml Heparin/Liquemin, 20 ng/ml EGF und 20 ng/ml bFGF umfasst, und man schliesslich eine Vordifferenzierung in Differenzierungsmedium durchführt, das DMEM, F12, 0,6% Glucose, 25 μ Insulin, 100 μg Transferrin, 20 nM Progesteron, 60 μg Putrescin 30 nM Selen, 2 mM L-Glutamin, 3 mM Natriumdicarbonat, 5 mM Hepes, 2 μg/ml Heparin/Liquemin, 0,5 μM all-trans Retinsäure und 100 ng/ml humanes β-NGF umfasst.
Verwendung von neuronal vordifferenzierten Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Verhinderung von Hirnschäden infolge Sauerstoff- und/oder Glucosemangel, Entzündungen, Trauma oder genetischer Defekte.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 erhaltene Zellen sind.
Verwendung von Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zum Ersatz geschädigter Nervenzellen und zur Förderung der Eigenregeneration durch Stimulation endogener Stammzellen des Gehirns, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stammzellen zusammen mit neuroprotektiven Substanzen oder anderen neuroprotektiven Interventionen verwendet.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die neuroprotektiven Substanzen Kreatin, Magnesium, Sauerstoffradikalfänger, NO-Inhibitoren, Glutamatantagonisten, Calciumantagonisten, Wachstumsfaktoren, Apoptose-Hemmer oder Anticytokine sind.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Calciumantagonist Flunarizin ist.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die neuroprotektive Intervention Hypothermie ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen undifferenzierte und/oder neuronal vordifferenzierte Stammzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 erhaltene Zellen sind.
Verwendung nach den Ansprüchen 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stammzellen einerseits und die neuroprotektiven Substanzen oder die anderen neuroprotektiven Interventionen sequentiell oder gleichzeitig verwendet.
Pharmazeutisches Präparat umfassend Stammzellen, die nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 erhalten sind.