DE69531712T2

DE69531712T2 - Hybridgel, das eine biologisch aktive Substanz sekretiert

Info

Publication number: DE69531712T2
Application number: DE69531712T
Authority: DE
Inventors: Susumu Yoshida; Andrew R. Cuthbertson; Katsutoshi Hiroshima-shi Yoshizato
Original assignee: Japan Science and Technology Corp; Genentech Inc
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Genentech Inc
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-25
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2015-04-26
Also published as: AU1766595A; DE69531712D1; EP0679402B1; EP0679402A2; CA2147810A1; US6485721B1; EP0679402A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hybridgel, das biologisch aktive Substanzen absondert. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Hybridgel, das biologisch aktive Substanzen absondert und sich als äußerlich anzuwendende, verordnete Medikamente, wie künstliche Haut, eignet, die zur Behandlung verschiedener, schwer heilbarer Erkrankungen verwendet werden, die eine Langzeit- und Dauermedikation von physiologisch aktiven Substanzen erfordern, um die biologischen Funktionen zu erhalten.
Stand der Technik
Drei Verfahren sind zur Heilung von Erkrankungen verfügbar, die durch einen Verlust oder eine Abnahme der Funktionen menschlicher Zellen aus irgendeinem Grund verursacht werden. Die verlorenen oder verringerten Funktionen werden kompensiert durch

1) Arzneimittelmedikation,
2) Transplantation von Organen, Geweben oder Zellen oder
3) Gentherapie

Insulin-abhängiger Diabetes mellitus wird beispielsweise durch die Zerstörung der Insulin produzieren β-Zellen verursacht, welche die Funktion haben, den Blutzuckerspiegel in negativer Richtung einzustellen und die in den Langerhansschen Inseln des Pankreas vorkommen. Patienten mit Insulin-abhängigem Diabetes mellitus haben einen hohen Blutzuckerspiegel, wodurch die Konzentration an Zucker in ihrem Urin ansteigt. Wenn der Blutzuckerspiegel hoch bleibt, werden die Funktionen verschiedener menschlicher Zellen beschädigt, was zu schwerwiegenden Komplikationen führt.
Somit ist es notwendig, Insulin von Außen zuzuführen und den Blutzuckerspiegel zu kontrollieren, um die Patienten mit Insulin-abhängigem Diabetes mellitus zu heilen. Insulin-abhängige Diabetiker müssen lebenslang mehrmals täglich eine Insulindosis erhalten. Dies bedeutet für den Patienten schweres physisches und mentales Leid, und zudem beinhaltet Selbstmedikation stets ein Lebensrisiko aufgrund möglicher Falschdosierung.
Eines von alternativen Verfahren zur Selbstmedikation mit Insulin ist eine Transplantation des Pankreas oder der Langerhansschen Inseln (K. Kubota und Y. Idezuki, Nippon Rinsho: auf japanisch, 48: 1052, 1990). Diese Behandlung bereitet jedoch eine Reihe von Problemen, wie zum Beispiel wenige Spender, Schwierigkeiten, die Immunabstoßung zu kontrollieren, die durch das transplantierte Pankreas oder die Gewebe verursacht wird, komplizierte chirurgische Operationen für die Transplantation, die hochkomplizierte Techniken erfordern, und Gefahren in Zusammenhang mit der Operation.
Gentherapie gehört zu den aufregendsten medizinischen Techniken zur Lösung der vorstehenden Probleme, und verschiedene Gentherapien zur Behandlung von Patienten mit schwerwiegenden Erkrankungen werden in den Vereinigten Staaten und anderen Ländern in den Neunzigerjahren klinisch getestet (N. M. Summers, Biotechnology 12: 42, 1994). Ein Verfahren zur Behandlung von Diabetes auf der Basis der vorstehenden Technik wurde vorgeschlagen (R. F. Selden et al., The New England Journal of Medicine, 317(17): 1067, 1987). Bei diesem besonderen Verfahren wird das Insulingen in Kulturzellen eingebracht, und die Zellen werden in den Körper des Patienten transplantiert, um eine kontinuierliche Sekretion von Insulin sicherzustellen, das von dem eingebrachten Gen produziert wird. Dieses Verfahren bereitet eine Reihe von Problemen, wie zum Beispiel die Schwierig keit, die Sekretion von Insulin aus den transplantierten Insulin-produzierenden Zellen zu kontrollieren, und die Unfähigkeit, die transplantierten Zellen später aus dem Körper zu entfernen. Es ist allgemein bekannt, dass die Gentherapie eine vielversprechende und fortgeschrittene medizinische Technik nicht nur für Insulin-abhängigen Diabetes mellitus und genetische Erkrankungen, wie schwere Immunschwächekrankheiten, sondern auch für Krebs, AIDS und andere schwierig zu heilende Erkrankungen ist. Aus diesem Grund wurden viele Ansätze vorgeschlagen, und die Gentherapie wird tatsächlich in praktischen klinischen Fällen durchgeführt. Der Großteil dieser Gentherapie verwendet von Retroviren stammende Vektoren zur Einführung von Genen in die Zellen, wobei die Zellinfektion des Virus genutzt wird.
Diese Technik der Verwendung von Vektoren, die von Viren hergeleitet sind, (Retroviren abgeleiteter Vektoren) hat den Mangel, dass die Wirksamkeit der Einbringung eines Gens von der Affinität des Virus zu den Zellen abhängt, und dass die Möglichkeit besteht, dass sich die inaktivierten Virusvektoren in Wildtyp-Retroviren umwandeln. Zusätzlich leidet die herkömmliche Gentherapie allgemein an dem Problem, dass die eingebrachten Gene von Außen schwierig zu kontrollieren sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung will eine neue Technik für die Transplantation von Zellen, die ein Gen enthalten, das eine biologisch aktive Substanz codiert, in die Haut und für die externe Kontrolle der Expression des Gens bereitstellen. Genauer gesagt, will die vorliegende Erfindung die Probleme des Standes der Technik lösen, indem Mittel zur Transplantation von Zellen, die biologisch aktive Substanzen produzieren, in die Haut eines menschlichen Körpers als Hybridgel (ein Zellen enthaltendes Gel) bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Gel bereit, das biologisch aktive Substanzen absondert und aus Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, tierischen bzw. von Lebewesen stammenden Hautzellen und einem biopolymeren Gel besteht.
Im Fall des Hybridgels ist eine bevorzugte Ausführungsform, dass die tierischen Hautzellen auf das biopolymere Gel laminiert werden, das die Zellen einschließt, die biologisch aktive Substanzen herstellen; die Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, auf das biopolymere Gel laminiert werden, das die tierischen Hautzellen einschließt; die tierischen Hautzellen und die Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, auf das biopolymere Gel laminiert werden oder die tierischen Hautzellen oder die Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, auf das biopolymere Gel laminiert werden, das die tierischen Hautzellen und die Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, einschließt.
Außerdem sind im Fall der Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen und in dem biopolymeren Gel eingeschlossen sind, diese Zellen zusammen mit einem Netz- bzw. Maschenmaterial oder einer porösen Membran eingeschlossen.
Außerdem können bei der vorliegenden Erfindung die Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, Hautzellen sein (d. h. Hautfibroblasten oder epidermale Hautzellen), die einen rekombinanten Expressionsvektor mit einer DNA-Sequenz enthalten, welche die biologisch aktive Substanz, beispielsweise Insulin, codiert. Überdies kann dieser Expressionsvektor der Plasmidvektor pBMG-neo-ins sein, der Insulin-cDNA und ein Neomycin-Resistenzgen besitzt, oder der Plasmidvektor pRIS-proins-Ifur-IIfur-B10D, der ein mutiertes Insulingen besitzt, welches Insulin durch die Einwirkung von Furin stabil exprimiert.
Die vorliegende Erfindung eignet sich zur Entwicklung einer Gentherapie mittels Hauttransplantation, welche eine stabile Arzneimittelmedikation für einen langen Zeitraum erlaubt; die Linderung der Schmerzen der Patienten und eine Feineinstellung der Dosierung sowie eine externe Kontrolle des Gens ermöglicht, ohne dass, wie bei der herkömmlichen Technik, von Retroviren stammende Vektoren verwendet werden, die ein mögliches Risiko der Mutation zu Wildtypen in sich tragen.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die Zellen, die in dem biopolymeren Gel eingeschlossen oder darauf laminiert sind, produzieren eine biologisch aktive Substanz, die der Körper benötigt oder an der es ihm mangelt, und die Substanz wird stetig in dem Körper abgesondert. Die Produktion einer biologisch aktiven Substanz wird erhöht, wenn ein Maschenmaterial oder eine poröse Membran zusammen mit den Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, in das Gel eingeschlossen werden. Somit kann das erfindungsgemäße Hybridgel wirksam verwendet werden, beispielsweise als ein äußerlich zu verwendendes, verschriebenes Medikament, wie künstliche Haut. Tierische bzw. von Lebewesen stammende Hautzellen werden in das Gel eingeschlossen, um diesem Festigkeit zu verleihen, oder auf das Gel geschichtet werden, so dass es oberflächenaktiv gemacht und eine gute Anheftung gewährleistet wird. Das Gen, das die biologisch aktive Substanz exprimiert, wird in die Zellen beispielsweise durch einen Plasmidvektor eingebracht, und daher besteht im Gegensatz zur üblichen Gentherapie kein Risiko einer Umwandlung in Wildtyp-Retroviren aufgrund der von Retroviren stammenden Vektoren. Zusätzlich kann das eingebrachte Gen leicht von Außen kontrolliert werden, weil die das Gen enthaltenden Zellen auf die Haut transplantiert werden.
Konkret sind die folgenden Funktionen verfügbar:

1) Nach der Transplantation wird die biologisch aktive Substanz für einen langen Zeitraum stabil ohne Kenntnis des Patienten abgegeben. Dies verringert drastisch das physische und mentale Leid des Patienten, der bei der herkömmlichen Behandlung einer wiederholten Medikation unterliegt.
2) Eine sehr einfache Operation wird zur Transplantation oder Entfernung des erfindungsgemäßen Gels in die oder aus der Haut verwendet. Aus diesem Grund kann die zu transplantierende Menge an künstlicher Haut zu jeder Zeit frei eingestellt werden, während der Verfahrenszustand der Behandlung beobachtet wird. Somit ist es leicht, die optimalen Bedingungen für die Behandlung zu bestimmen.
3) Die Rate der Absonderung der Substanz aus den Zellen in oder auf dem Gel kann mithilfe induzierbarer Promotoren, die eine DNA-Sequenz antreiben, die eine biologisch aktive Substanz codiert, und verschiedener Induktionsstimuli (Hormone, Schwermetalle, Temperatur usw.), die auf die transplantierte künstliche Haut aufgebracht werden, kontrolliert werden. Dies ermöglicht eine Feineinstellung der Absonderungsrate der Substanz.
4) Die transplantierten Zellen werden in oder auf dem Gel eingeschlossen und werden somit kaum durch eine Immunabstoßung des Patienten beeinflusst. Daher ist es möglich, die Menge an Immunsuppressiva zu verringern, die man gewöhnlich bei der Transplantation von Geweben bei der üblichen Technik einsetzt. Das Risiko von Nebenwirkungen aufgrund der Verwendung von Immunsuppressiva ist daher stark verringert. Natürlich gibt es kein Problem einer Immunabstoßung, wenn die eigenen Zellen des Patienten bei der Gentherapie verwendet werden, weil es sich dabei um eine Eigentransplantation handelt.
5) Die einfache Operation, ohne dass der Patient ins Krankenhaus eingewiesen werden muss, ist sicher und frei von dem Risiko, das die herkömmliche Behandlung mit sich bringt. Weil es sich um eine Transplantation auf die Haut handelt, ist der Zustand der Transplantation zu allen Zei ten von Außen sichtbar. Wenn nötig, kann die transplantierte künstliche Haut entfernt werden.

Verschiedene Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, können bei der vorliegenden Erfindung zum Einbringen des Expressionsvektors mit einem Gen dafür in die Zellen verwendet werden. Zum Beispiel können Insulinproduzierende Zellen hergestellt werden, indem der Plasmidvektor pBMG-neo-ins, der die cDNA von Insulin und ein Neomycin-Resistenzgen (Selektionsmarker) besitzt, unter Verwendung eines bekannten Verfahrens in tierische Zellen transfiziert wird. Ein anderes Verfahren ist die Transfektion des Plasmidvektors pRIS-proins-Ifur-IIfur-B10D in tierische Zellen. Dieser Plasmidvektor enthält ein mutiertes Insulingen, welches das von dem Gen exprimierte Proinsulin durch Einwirkung von Furin und durch Substitution der 10. Aminosäure in der Insulin-B-Kette in Insulin umwandelt.
Das Gel, das die Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, aufnehmen soll, kann beispielsweise aus Kollagen, Fibrin, Agarose usw. hergestellt werden. Zum Beispiel kann das Gel, das Zellen mit Insulingenen darin enthält, auf die folgende Weise hergestellt und als künstliche Haut zur Heilung von Diabetikern verwendet werden:

(1) Hautstücke eines Versuchstiers werden gewonnen. Epidermiszellen und Fibroblasten, die Zellen, welche die beiden Hauptbestandteile der Haut ausmachen, werden aus der Haut abgetrennt und kultiviert.
(2) Ein Expressionsvektor, der das Insulingen enthält, wird in diese Zellen tranduziert, so dass Insulin absondernde Zelllinien hergeleitet werden.
(3) Künstliche Haut des Hybridtyps mit der Insulinabsonderungsfunktion wird aus diesen Zelllinien unter Verwendung von Kollagengelen usw. konstruiert.
(4) Die Insulin-absondernde künstliche Haut des Hybridtyps wird transplantiert.

Genauer gesagt, kann das erfindungsgemäße Gel, das eine biologisch aktive Substanz absondert, gemäß dem Verfahren von Asaga et al. (H. Asaga et al., Experimental Cell Research 193: 167, 1991) wie folgt hergestellt werden:
Vierfach konzentriertes Zellkulturmedium, Serum, gereinigtes Wasser und zum Beispiel Kollagen (0,5%ige Lösung) werden in einem Verhältnis von 2,5 : 1 : 2,5 : 4 in Abhängigkeit von der benötigten Menge gemischt, wobei das Gemisch mit Eis gekühlt wird. Eine wässrige Lösung von 1 N Natriumhydroxid wird tropfenweise in das Gemisch eingemischt, um den pH auf 7,4 einzustellen. Das Gemisch wird getrennt in hydrophobe Kunststoff-Laborschalen mit 35 mm Durchmesser, 2 ml in jede Schale, eingespritzt. Die Schalen werden sofort in einen 37°C-Brutschrank überführt. Das Kollagen verfestigt sich in wenigen Minuten unter Bildung eines Gels. Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, werden in das vorstehende Gemisch eingemischt, kurz bevor sich das Kollagen verfestigt, so dass die Zellen im Gel eingeschlossen werden.
Damit sich gleichzeitig ein Maschenmaterial oder eine poröse Membran in dem Gel befinden, muss man diese nur zusammen mit den Zellen, die biologisch aktive Substanzen herstellen, in die vorstehende Lösung einmischen.
Kulturlösungen, Serum und Kollagen, die kommerziell erhältlich sind, können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Es ist wirksam, den Kollagengelen eine angemessene Festigkeit zu verleihen, um die Transplantation des Produkts auf die Haut zu erleichtern. Eine angemessene Festigkeit kann dem Gel beispielsweise durch Einmischen einer angemessenen Anzahl von aus der Haut stammenden Fibroblasten gemäß dem Verfahren von Bell et al. (E. Bell et al ., Proceedings of the National Academy of Sciences 76(3): 1274, 1979) verliehen werden. Eine geeignete Festigkeit kann dem Gel infolge einer Kontraktion des Gels aufgrund der Fibroblasten verliehen werden. Aus der Haut stammende Fibroblasten können zum Beispiel durch Kultivieren eines kleinen, von dem Patienten entnommenen Hautstücks gemäß der Primärexplantat-Technik (R. I. Freshey, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York 1987) erhalten werden.
Es ist ebenfalls wirksam, die Geloberfläche aktiv zu machen, um eine gute Anheftung an die Haut zu gewährleisten, indem man kultivierte, aus der Haut stammende Epidermiszellen auf das Gel aufbringt, bevor sie auf die Haut transplantiert werden.
Aus der Haut stammende Epidermiszellen zum Aufbringen auf das Gel lassen sich durch Kultivieren von Epidermiszellen erhalten, die aus der Patienten-eigenen Haut erhalten werden, auf die gleiche Weise wie für die Fibroblasten beschrieben erhalten, wobei zum Beispiel das Verfahren von Green et al. (H. Green et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 76: 5665, 1979) verwendet wird.
Beispiele
Nachstehend werden Beispiele vorgestellt, um die vorliegende Erfindung eingehend zu beschreiben. Diese Beispiele sollten nicht als beschränkend verstanden werden.
Beispiel 1
Erfindungsgemäße Hybridgele (oder nachstehend einfach Gele) wurden hergestellt, um das Medikationsverfahren und ihre Anwendung auf die Behandlung von Diabetikern mittels Durchführung von In-vitro-Experimenten und In-vivo-Experimenten mit Modelltieren für Diabetes wie im folgenden beschrieben zu untersuchen.
In-vitro-Experiment
Gele, die Proinsulin-produzierende Zellen enthielten, wurden kultiviert, und die in das Kulturmedium abgesonderten Proinsuline wurden gemessen.
1) Materialien
Drei Arten von aus Haut stammenden Zelllinien wurden verwendet.

(1) Mausembryo-Fibroblasten (NIH3T3)
(2) Rattenhaut-Fibroblasten, die das Insulingen enthalten (RSFins)
(3) Rattenhaut-Epidermiszellen, die das Insulingen enthalten (RSKins)

RSFins und RSKins wurden mittels Transduktion des Insulingens (G. I. Bell et al., Nature 284(6): 26, 1980) in Fibroblasten (RSF) bzw. Epidermiszellen (RFK) hergestellt, die aus einer Primärkultur von Rattenhaut erhalten wurden. Das Insulingen wurde in die Fibroblasten und Epidermiszellen unter Verwendung des Plasmidvektors pBMG-neo-ins, der die menschliche Insulin-cDNA besitzt (Y. Kawakami et al., Diabetes 41: 956, 1992), gemäß dem Verfahren von Chen und Okayama (C. Chen und H. Okayama, Molecular and Cellular Biology 7(8): 2745, 1987) transfiziert. Die den Vektor enthaltenden Zellen wurden dann in Kulturmedien mit G418 in einer Konzentration von 400 μg/ml selektiv angereichert.
Diese Zellen besaßen keine Prozessierungsenzyme für Insulin und sezernierten somit Proinsulin, den Vorläufer von Insulin. Es sollte beachtet werden, dass Proinsulin ebenfalls die Funktionen von Insulin ausübt (S. N. Davis et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 75(5): 1282–1288, 1992).
2) Kulturmedium
Das Kulturmedium für RSFins bestand aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Gibco, Grand Island, NY), zu dem fötales Rinderserum (HyClone, Logan, Utah) in einem Verhältnis von 10% gegeben wurde (Medium A).
Das Kulturmedium für RSKins bestand aus einem 7 : 3-Gemisch von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium und MCDB- Medium (Kyokuto, Tokio), zu dem Hydrocortison (0,4 μg/ml), Insulin (5 μg/ml), Transferrin (5 μg/ml), Triiodthyronin (2 nM), Choleratoxin (0,1 nM), Adenin (100 uM) und fötales Rinderserum (10%) hinzufügt wurden (Medium B).
Die Zellen wurden in das Gel eingeschlossen und/oder auf das Gel laminiert. Das erhaltene Hybridgel wurde in Medium A kultiviert.
3) Verfahren
Jeweils 5 × 10⁵ RSFins-Zellen wurden in dem Gel eingeschlossen und auf ein anderes Gel laminiert, um die Gele A bzw. B herzustellen. Die Gele C und D wurden weiter hergestellt, indem jeweils 5 × 10⁵ RSKins-Zellen in bzw. auf den Gelen untergebracht wurden. Eine gleiche Anzahl von NIH3T3-Zellen wurde in den Gelen C und D eingeschlossen, um ihnen eine Kontraktionsfunktion zu verleihen. Die Struktur dieser Gele ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Diese Zellen wurden bei 37°C kultiviert. Einen Tag nach der Herstellung wurden 2 ml Kulturmedium zur Fortsetzung der Kultur hinzugefügt. Danach wurde das Kulturmedium jeden zweiten Tag durch neues ersetzt. Das gewonnene Kulturmedium wurde zur Aufbewahrung eingefroren, wenn nötig geschmolzen und hinsichtlich der Proinsulin-Konzentration im Kulturmedium gemessen. Die Proinsulin-Konzentration wurde als Wert des immunreaktiven Insulins (IRI) unter Verwendung des EIA-Kits (Sanko Junyaku, Tokio) gemessen.
Tabelle 1
4) Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 2 gezeigt. Beide Zelllinien, die in das Gel eingeschlossen oder auf das Gel laminiert waren, sonderten eine stabile Menge an Proinsulinen in das Kulturmedium während 25 Kulturtagen ab. Somit ist es möglich, dem Körper Proinsuline zuzuführen, wenn diese Gele auf die Haut transplantiert werden.
Tabelle 2 Sekretion von Proinsulinen aus Gelen in das Kulturmedium (μU/ml/Tag)
In-vivo-Experiment 1
Hybridgele mit eingeschlossenen Proinsulinproduzierenden Zellen wurden diabetischen Modelltieren transplantiert, um die Heilwirkungen durch Messen des Blutzuckerspiegels zu untersuchen.
1) Versuchstiere
200 mg/kg Streptozotocin (Sigma, St. Louis, Mo) wurden intraperitoneal an Balb/c-Nacktmäuse (5 Wochen alt, männlich) dreimal in vier Tagen verabreicht, um einen diabetischen Zustand herbeizuführen. Die Mäuse wurden für Experimente verwendet, wenn sie 7 Wochen alt waren.
1) Materialien
Drei Arten von aus Rattenhaut stammenden Zelllinien wurden verwendet.

(1) RSF
(2) RSFins
(3) RSKins

2) Verfahren zur Herstellung von Gelen
5 × 10⁵ RSFins-Zellen wurden in Kollagengel eingeschlossen, und eine gleiche Anzahl von RSKins-Zellen wurde auf die Oberfläche des Gels laminiert, um das Gel E herzustellen. 5 × 10⁵ RSF-Zellen wurden in Kollagengel eingeschlossen, und eine gleiche Anzahl von RSKins-Zellen wurde auf die Oberfläche des Gels laminiert, um das Gel F herzustellen. Die Struktur dieser Gele ist in Tabelle 3 zusammengefasst. Diese Zellen wurden bei sechs Tage bei 37°C kultiviert und dann zur Transplantation verwendet. Die Gele E und F produzierten 484 bzw. 404 μIU Proinsulin/Tag.
Tabelle 3
3) Verfahren
Die Haut von zwei der vorstehenden diabetischen Modelltiere wurden in einem Bereich von etwa 25 bzw. 200 m² entfernt, und die Gele E und F, die nach der Herstellung sechs Tage lang kultiviert wurden, wurden geschnitten und auf den vollständig nackten Bereich transplantiert (das Gewicht der geschnittenen Gele betrug 24, bzw. 191 mg, bezogen auf das Feuchtgewicht). Nach der Transplantation wurden jeden zweiten Tag etwa 20 μl Blut aus dem Schwanz der Tiere entnommen (ID-Nr. 3 und 4), um den Blutzuckerspiegel zu messen. Zwei untransplantierte diabetische Tiere (ID-Nr. 1 und 2) wurden als Kontrollen verwendet. Der Blutzuckerspiegel wurde unter Verwendung des Glucose-CII-Tests (Wako Pure Chemical Industry, Osaka) gemessen
4) Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 4 gezeigt. Die Kontrolltiere zeigen einen kontinuierlichen Anstieg des Blutzuckerspiegels, während bei den mit einem Gel transplantierten Tieren dieser Anstieg des Blutzuckerspiegels unterdrückt und eine Tendenz zur Senkung des Blutzuckerspiegels angedeutet ist.
Tabelle 4 Wirkung der Geltransplantation auf die diabetische Maus
In-vivo-Experiment 2
Hybridgele mit eingeschlossenen Proinsulinproduzierenden Zellen wurden Modelltieren für Diabetes transplantiert, um die Heilwirkungen durch Messen des Blutzuckerspiegels und des Körpergewichts der Tiere zu untersuchen.
1) Versuchstiere
200 mg/kg Streptozotocin (Sigma) wurden intraperitoneal an Balb/c-Nacktmäuse (7 Wochen alt, männlich) an jeweils zwei Tagen verabreicht, um einen diabetischen Zustand herbeizuführen. Die Transplantation des Hybridgels erfolgte nach zwei Tagen Streptozotocin-Verabreichung.
2) Materialien
Drei Arten von aus Rattenhaut stammenden Zelllinien wurden verwendet.

(1) RSF
(2) RSFins
(3) RSK

3) Verfahren zur Herstellung von Gelen
10⁶ RSFins-Zellen wurden in Kollagengel eingeschlossen, und eine gleiche Anzahl von RSK-Zellen wurde auf die Oberfläche des Gels laminiert, um das Gel M herzustellen. 10⁶ RSK-Zellen wurden in Kollagengel eingeschlossen, und eine gleiche Anzahl von RSFins-Zellen wurde auf das Gel laminiert, um das Gel N herzustellen. Die Struktur dieser Gele ist in Tabelle 5 zusammengefasst. Diese Zellen wurden für 7 Tage bei 37°C kultiviert und dann zur Transplantation verwendet. Die Gele M und N produzierten 300,8 bzw. 1,5 μIU Proinsulin/Stunde.
Tabelle 5
4) Verfahren
Die Haut auf der rechten Abdomenseite von drei Tieren wurde in Form eines Kreises mit 8–10 mm Durchmesser entfernt, und Gel M, das nach der Herstellung 7 Tage lang kul tiviert wurde, wurde auf den nackten Bereich transplantiert. Nach der Transplantation wurden jeden zweiten Tag etwa 5 μl Blut aus dem Schwanz des Tieres entnommen, um den Blutzuckerspiegel zu messen. Das Körpergewicht der Tiere wurde ebenfalls jeden zweiten Tag gemessen. Die verbleibenden drei Tiere, denen Gel N auf die gleiche Weise transplantiert wurde, wurden als Kontrolle verwendet. Der Blutzuckerspiegel wurde unter Verwendung des Gultest-E (Sanwa Chemical Institute, Nagoya, Japan) gemessen.
5) Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Tiere, denen Gel N transplantiert wurde, zeigen einen kontinuierlichen Anstieg des Blutzuckerspiegels, während dieser Anstieg des Spiegels bei der Gruppe unterdrückt ist, der Gel M transplantiert wurde. Die Gel-M-Gruppe zeigte eine hemmende Wirkung auf die Abnahme des Körpergewichts, wie bei der Gel-N-Gruppe im Verlauf des Experiments gezeigt.
Beispiel 2
Eine andere Form des erfindungsgemäßen Hybridgels wurde hergestellt, und die Wirkungen wurden unter Verwendung von In-vitro-Experimenten und In-vivo-Experimenten mit diabetischen Modelltieren wie im folgenden beschrieben untersucht.
In-vitro-Experiment 1
Dieses Experiment wurde durchgeführt, indem das Hybridgel, das Insulin-produzierende Zellen enthielt, in die ein mutiertes Insulingen eingebracht worden war, das ein für Furin empfängliches Proinsulin codierte, kultiviert wurde und die Spiegel an in das Kulturmedium abgesondertem IRI gemessen wurden.
1) Materialien
Zwei Arten von aus Haut stammenden Zelllinien wurden verwendet.

(1) Rattenhaut-Fibroblasten mit einem mutierten Insulingen, das mit Furin umgewandelt werden kann (RSFinsfur).
(2) RSK

RSFinsfur wurden hergestellt, indem ein mutiertes Insulingen (D. J. Groskreutz et al., The Journal of Biological Chemistry 269(8), 6241, 1994), das zur Prozessierung durch Furin befähigt ist (Insuline treten auf, wenn die Proinsulin-Ketten in zwei Teile gespalten werden), in die aus Rattenhaut mittels Primärkultur erhaltenen Fibroblasten (RSF) eingebracht wird. Das Gen wurde unter Verwendung von pRISproins-Ifur-IIfur-B10D-Plasmidexpressionsvektoren, die das vorstehend genannte mutierte Insulingen enthielten, nach dem gleichen Verfahren, wie im Beispiel 1 beschrieben, in RSF transduziert. Die mit dem Vektor transduzierten Zellen wurden dann in Kulturmedien mit G418 in einer Konzentration von 600 μg/ml selektiv angereichert.
Zweiunddreißig Klone wurden aus diesen Zellen isoliert, und der Klon mit dem höchsten IRI-Wert wurde ausgewählt. Dieser Klon (RSFinsfur) sonderte 24,5μIU IRI/Stunde pro 10⁶ Zellen in das Kulturmedium ab.
Diese Zellen exprimierten gleichzeitig das Prozessierungsenzym, Furin, für die Umwandlung von Insulin, und daher wurde Proinsulin, der Vorläufer von Insulin, in Abhängigkeit von der Furin-Aktivität der Zellen in Insulin umgewandelt.
Die RSFinsfur-Zellen wurden unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Furin-Antikörpers (Genentech, South San Francisco, Ca²⁺-) und Anti-Insulin-Kaninchenserum (Austral Biological, San Ramon, Ca²⁺-) immunhistochemisch untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Es wurde immunhistochemisch bestätigt, dass diese Zellen Insulin und Furin produzieren.
Tabelle 7
2) Kulturmedium
Die im Beispiel 1 verwendeten Kulturmedien A und B wurden für RSFinsfur bzw. RSK verwendet. Das Kulturmedium A wurde verwendet, nachdem die Zellen in das Gel eingeschlossen und auf das Gel laminiert worden waren.
3) Verfahren
Gel G wurde hergestellt, indem 3 × 10⁶ RSFinsfur-Zellen in das Gel eingeschlossen wurden, das dann mit der gleichen Anzahl an RSK-Zellen laminiert wurde. Die Struktur des Gels G ist in Tabelle 8 zusammengefasst. Gel G wurde bei 37°C in 6 ml Kulturmedium kultiviert. Das Kulturmedium jeden zweiten Tag durch neues ersetzt. Am 8. Tag der Kultur wurde das Gel dreimal mit Kulturmedium gespült, und das Kulturmedium wurde durch neues ersetzt. Das Gel wurde weitere 8 Stunden kultiviert. Der IRI-Wert des Kulturmediums wurde mit dem Insulin-EIA gemessen.
Tabelle 8
4) Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Experiments bestätigten, dass Gel G 25,5 μIU IRI in acht Stunden absonderte. Das Gel G sondert Insulin für viele Stunden stabil ab, und somit kann Insulin dem Körper zugeführt werden, wenn das Gel auf die Haut transplantiert wird.
In-vitro-Experiment 2
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um ein Verfahren zur Erhöhung der Absonderung von Insulin aus dem Hybridgel zu untersuchen, das Insulin-produzierende Zellen enthält, in die ein mutiertes Insulingen, das ein für Furin empfängliches Proinsulingen codiert, eingebracht worden ist.
1) Materialien
Es wurden die gleichen Zellen verwendet, wie sie in dem vorstehenden In-vitro-Experiment verwendet wurden.
2) Kulturmedium
Es wurden die gleichen Kulturmedien auf die gleiche Weise verwendet, wie sie in dem vorstehenden In-vitro-Experiment verwendet wurden.
3) Verfahren
Gel H wurde hergestellt, indem 10⁶ RSFinsfur-Zellen in das Gel eingeschlossen wurden, das dann mit der gleichen Anzahl an RSK-Zellen laminiert wurde. Die Gele I und J wurden mittels Einbringen von Polyglycolsäure- (PGA-) Maschengeweben (Davis + Geck, Manati, PR), die in eine Kreisform mit einem Durchmesser von 15 cm bzw. 25 cm geschnitten wurden, gleichzeitig mit dem Einschluss einer gleichen Anzahl an RSFinsfur-Zellen in die Gele hergestellt. Das Gel wurde dann mit RSK laminiert. Die Struktur dieser Gele ist in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9
Diese Gele wurden jeweils bei 37°C in 2 ml Kulturmedium kultiviert. Das Kulturmedium wurde jeden oder jeden zweiten Tag durch neues ersetzt. Am 8. Tag der Kultur wurden die Gele dreimal mit Kulturmedium gespült, und das Kulturmedium wurde durch neues ersetzt. Die Gele wurden weitere 8 Stunden in dem neuen Medium kultiviert. Eine kleine Menge (50 μl) Kulturmedium wurde während des Zeitraums entnommen, um den IRI-Wert im Kulturmedium mittels Insulin-EIA zu messen.
4) Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 10 dargestellt. Die Gele I und J, die sowohl Maschengewebe als auch Zellen enthalten und zudem mit RSK-Zellen laminiert sind, sonderten eine signifikant höhere Menge an Insulin ab als das Gel H, das nur Zellen in und auf dem Gel enthielt. Somit wird bestätigt, dass das Vorliegen von Maschengewebe in dem Gel die Absonderung von Insulin aus den Zellen wirksam erhöht.
Tabelle 10 Sekretion von Insulin aus Gelen in das Kulturmedium
In-vivo-Experiment
Ein Gel mit eingeschlossenen Insulin-produzierenden Zellen wurden diabetischen Modelltieren transplantiert, um die Wirkungen der Hybridgeltransplantation durch Messen des Gewichts und des Blutzuckerspiegels der Tiere zu untersuchen.
1) Versuchstiere
200 mg/kg Streptozotocin wurden intraperitoneal an Balb/c-Nacktmäuse (7 Wochen alt, männlich) zweimal in zwei Tagen verabreicht, um einen Zustand mit hohem Blutzucker herbeizuführen. Das Experiment wurde gestartet, nachdem bestätigt worden war, dass die Mäuse hohe Blutzuckerspiegel aufwiesen.
2) Materialien
Drei Arten von aus Rattenhaut stammenden Zelllinien wurden verwendet.

(1) RSF
(2) RSFinsfur
(3) RSK

3) Verfahren zur Herstellung von Gelen (künstlicher Haut)
3 × 10⁶ RSFinsfur-Zellen wurden in Kollagengel eingeschlossen, und eine gleiche Anzahl von RSK-Zellen wurde auf die Oberfläche des Gels laminiert, um das Gel K herzustellen. 3 × 10⁶ RSF-Zellen wurden in Kollagengel eingeschlossen, und eine gleiche Anzahl von RSK-Zellen wurde auf die Oberfläche des Gels laminiert, um das Gel L herzustellen. Die Struktur dieser Gele ist in Tabelle 11 zusammengefasst.
Tabelle 11
4) Verfahren
Die Haut auf dem Rücken der diabetischen Modelltiere wurde in Form eines Kreises von etwa 11 mm Durchmesser entfernt, und Gel K, das nach der Herstellung 8 Tage lang kultiviert wurde und auf etwa 10 mm Durchmesser kontrahiert war, wurde auf den nackten Bereich auf den Tieren transplantiert. Gel L, dessen Zellen nicht mit einem Gen transduziert waren, wurde zur Kontrolle auf die gleiche Weise transplantiert. Nach der Transplantation wurde das Gewicht der Tiere gemessen, und etwa 5 μl Blut wurden jeden zweiten Tag aus dem Schwanz entnommen, um den Blutzuckerspiegel unter Verwendung des Gultest-E zu messen.
5) Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 12 gezeigt. Die Kontrolltiere (die mit Gel L transplantierte Gruppe) zeigen eine Abnahme des Gewichts und einen Anstieg des Blutzuckerspiegels, während eine Tendenz zur Erhöhung des Gewichts und einer Abnahme des Blutzuckerspiegels für die mit dem Gel K (das die mit einem mutierten Insulingen transduzierten Zellen enthielt) transplantierte Gruppe beobachtet wurde. Dies bestätigt Verbesserungen der diabetischen Symptome.
Tabelle 12 Wirkungen einer Geltransplantation auf die diabetische Maus

Hinweis) Körpergewicht: oben
Blut-Insulinspiegel: unten

Claims

Gel, das biologisch aktive Substanzen absondert, das aus Zellen, die biologisch aktive Substanzen erzeugen, Hautzellen von Lebewesen und einem biopolymeren Gel besteht.
Hybridgel nach Anspruch 1, bei dem die Hautzellen von Lebewesen auf das biopolymere Gel laminiert sind, das die Zellen enthält, die die biologisch aktive Substanz erzeugen.
Hybridgel nach Anspruch 1, bei dem die Zellen, die die biologisch aktive Substanz erzeugen, auf das biopolymere Gel laminiert sind, das die Hautzellen von Lebewesen enthält.
Hybridgel nach Anspruch 1, bei dem die Zellen, die die biologisch aktive Substanz erzeugen, und die Hautzellen von Lebewesen in dem biopolymeren Gel enthalten sind.
Hybridgel nach Anspruch 1, bei dem die Hautzellen der Lebewesen oder die Zellen, die die biologisch aktive Substanz erzeugen, auf das biopolymere Gel laminiert sind, das die Hautzellen der Lebewesen und die Zellen, die die biologisch aktive Substanz erzeugen, enthält.
Hybridgel nach Anspruch 2, 4 oder 5, bei dem die Zellen, die die biologisch aktive Substanz erzeugen, im biopolymeren Gel zusammen mit einem Netzmaterial oder einer porösen Membran enthalten sind.
Hybridgel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die enthaltenen Hautzellen von Lebewesen Hautfibroplaste und die laminierten Hautzellen von Lebewesen epiderme Hautzellen sind.
Hybridgel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Zellen, die die biologisch aktive Substanz erzeugen, Zellen sind, die einen rekombinanten Expressionsvektor mit einer DNA-Sequenz enthalten, die eine biologisch aktive Substanz codiert.
Hybridgel nach Anspruch 8, bei dem die Zellen, die die biologisch aktive Substanz erzeugen, Hautfibroplaste oder epiderme Hautzellen sind, die einen rekombinanten Expressionsvektor mit einer DNA-Sequenz enthalten, die Insulin codiert.
Hybridgel nach Anspruch 9, bei dem der Expressionsvektor der Plasmidvektor pBMG-neo-ins ist.
Hybridgel nach Anspruch 9, bei dem der Expressionsvektor der Plasmidvektor pRIS-proins-Ifur-IIfur-B10D ist.
Medikament zur äußerlichen Verwendung, das ein Gel gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das biologisch aktive Substanzen erzeugt, enthält.
Medikament nach Anspruch 12, bei dem das Medikament künstliche Haut ist.