DE60123988T2

DE60123988T2 - Methoden und zubereitungen für die gewebsregeneration

Info

Publication number: DE60123988T2
Application number: DE60123988T
Authority: DE
Inventors: Edward E. Baetge; Thomas Hunziker; Modex Therapeutiques Vincent Ronfard
Original assignee: DFB Pharmaceuticals Inc
Current assignee: DFB Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2001-08-31
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2021-09-01
Also published as: WO2002017980A3; DE60123988D1; US6673603B2; WO2002017980B1; EP1326654A2; CA2426107A1; ES2274903T3; WO2002017980A9; US20020048563A1; EP1326654B1; DK1326654T3; CA2426107C; ATE342741T1; WO2002017980A2; AU8695201A; PT1326654E

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zellpaste zur Geweberegeneration, z.B. zur Behandlung von Wunden, und betrifft insbesondere eine Zellpaste, die Wachstumsfaktor- oder Angiogenesefaktor-sezernierende Zellen umfasst, die mit einer biologischen oder synthetischen extrazellulären Matrix vermischt und/oder auf einen Wundverband oder eine feste nicht-abbaubare Trägermatrix angeheftet/aufgebracht sind. Der Erfinder bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Zellpaste und die Verwendung einer derartigen Zellpaste zur Herstellung von Medikamenten zur Geweberegeneration oder zur Behandlung eines Gewebedefekts oder einer Wunde.
Wunden (d.h. Risse oder Öffnungen) in Säugergewebe können zu Gewebezerstörung und Koagulation der Mikrovaskulatur auf der Wundfläche führen. Eine Reparatur eines solchen Gewebes stellt eine geordnete, kontrollierte zelluläre Reaktion auf eine Verletzung dar. Alle Weichgewebewunden heilen ungeachtet ihrer Größe auf die gleiche Weise. Die Mechanismen von Gewebewachstum und -reparatur sind biologische Systeme, wobei Zellproliferation und Angiogenese in Anwesenheit eines Sauerstoffgradienten auftreten. Die aufeinander folgenden morphologischen und strukturellen Veränderungen, die während der Gewebereparatur auftreten, wurden in genauen Einzelheiten charakterisiert und in einigen Fällen qualifiziert.
Siehe Hunt, T. K., et al., "Coagulation and macrophage stimulation of angiogenesis and wound healing", in The surgical Wound, S. 1–18, Hrsg. F. Dineen & G. Hildrick-Smith (Lea & Febiger, Philadelphia: 1981).
Die Geweberegeneration in verschiedenen Organen, wie z.B. der Haut oder dem Herzen, hängt von Bindegewebe ab, das die Blutversorgung wiederherstellt und es verbleibenden organspezifischen Zellen, wie Keratinozyten oder Muskelzellen, ermöglicht, die Organintegrität wiederherzustellen. So ist eine relevante Funktion der Mesenchymzellen, d.h. der Fibroblasten oder zusätzlich der Endothelzellen der Vaskulatur, die Sekretion von Faktoren, die den Heilungsprozess verstärken, z.B. Faktoren, die die Bildung neuer Blutgefäße (Angiogenese) fördern oder Faktoren, die die Reepithelialisierung durch proliferierende und wandernde Keratinozyten fördern.
Die Zellmorphologie einer Wunde besteht aus drei getrennten Zonen. Der zentrale avaskuläre Wundraum ist sauerstoffarm, azidotisch und hyperkarb und weist hohe Lactatspiegel auf. In der Nähe des Wundraums befindet sich eine Gradientenzone lokaler Anämie (Ischämie), die von sich teilenden Fibroblasten besiedelt ist. Hinter der Führungszone befindet sich ein Bereich aktiver Kollagensynthese, der durch reife Fibroblasten und zahlreiche neu gebildete Kapillaren (d.h. Neuvaskularisierung) gekennzeichnet ist. Während das Wachstum neuer Blutgefäße (Angiogenese) für die Heilung von Wundgewebe notwendig ist, sind angiogene Mittel in der Regel nicht in der Lage, den seit langem bestehenden Bedarf an den zusätzlichen biosynthetischen Gewebereparaturwirkungen zu erfüllen. Trotz des Bedarfs an schnellerer Heilung von Wunden (d.h. schweren Verbrennungen, operativen Schnitten, Rissen oder anderem Trauma) gab es bis heute nur einen beschränkten Erfolg bei der Beschleunigung der Wundheilung mit pharmakologischen Mitteln.
Das Hauptziel bei der Behandlung von Wunden ist es, einen Wundverschluss zu erreichen. Offene Hautwunden stellen eine hauptsächliche Wundenkategorie dar. Diese Kategorie enthält akute chirurgische und traumatische, z.B. Verbrennungswunden, sowie chronische Wunden, wie neuropathische Geschwüre, Druckabszesse, arterielle und venöse (Stase-) oder gemischte arteriovenöse Geschwüre und Diabetesgeschwüre. Offene Hautwunden heilen gewöhnlich durch einen Prozess, der sechs Hauptkomponenten umfasst: i) Entzündung, ii) Fibroblastenproliferation, iii) Blutgefäßproliferation, iv) Bindegewebesynthese, v) Epithelisierung und vi) Wundkontraktion. Die Wundheilung ist gestört, wenn diese Komponenten entweder einzeln oder als Ganzes nicht richtig funktionieren. Zahlreiche Faktoren können die Wundheilung beeinflussen, einschließlich Fehlernährung, pharmakologischen Mitteln (z.B. zytotoxische Arzneistoffe und Kortikosteroide), Diabetes und fortgeschrittenes Alter. Siehe Hunt et al., in Current Surgical Diagnosis & Treatment (Way; Appleton & Lange), S. 86–98 (1988).
Hautwunden, die nicht leicht heilen, können für das Individuum erhebliche physische, emotionale und soziale Belastung sowie hohe finanzielle Kosten verursachen. Siehe z.B. Richey et al., Annals of Plastic Surgery 23(2): 159–65 (1989). Tatsächlich können Wunden, die nicht richtig heilen, eine mehr oder weniger aggressive operative Behandlung, z.B. autologe Hauttransplantation, erfordern. Eine Reihe von Behandlungsmodalitäten wurden entwickelt, als das Grundverständnis der Wissenschaftler von Wunden und Wundheilungsmechanismen voranschritt.
Die am häufigsten verwendete herkömmliche Modalität zur Unterstützung der Wundheilung beinhaltet die Verwendung von Wundverbänden. In den 1960er Jahren kam es zu einem wichtigen Durchbruch bei der Wundversorgung, als entdeckt wurde, dass die Wundheilung mit feuchten, abschließenden Verbänden, allgemein gesagt, wirksamer war als die Verwendung trockener, nicht-abschließender Verbände. Siehe Winter, Nature 193: 293–94 (1962). Heutzutage werden zahlreiche Typen von Verbänden routinemäßig verwendet, einschließlich Filmen (z.B. Polyurethanfilmen), Hydrokolloiden (an Polyurethanschaum gebundene hydrophile kolloidale Partikel), Hydrogelen (vernetzten Polymeren mit mindestens 60% Wasser), (hydrophilen oder hydrophoben) Schäumen, Calciumalginaten (Vlieskomposite aus Fasern von Calciumalginat) und Zellophan (Cellulose mit einem Weichmacher). Siehe Kannon et al., Dermatol. Surg. 21: 583–590 (1995); Davies, Burns 10: 94 (1983). Unglücklicherweise heilen bestimmte Wundentypen (z.B. Diabetesgeschwüre, Druckabszesse) und die Wunden bestimmter Individuen (z.B. Empfänger exogener Kortikosteroide) nicht zeitig (oder überhaupt nicht) unter Verwendung solcher Verbände.
Mehrere pharmazeutische Modalitäten wurden ebenfalls bei einem Versuch, die Wundheilung zu verbessern, verwendet. Zum Beispiel wurden Behandlungsschemata unter Einbeziehung von Zinksulfat von einigen Ärzten verwendet. Die Wirksamkeit dieser Schemata wurde jedoch hauptsächlich ihrer Umkehrung der Wirkungen subnormaler Zinkspiegel (z.B. verringerter Widerstandsfähigkeit des Wirts und veränderter intrazellulärer bakterizider Aktivität) zugeschrieben. Siehe Riley, Am. Fam. Physician 24: 107 (1981). Während andere Vitamin- und Mineralmängel ebenfalls mit verringerter Wundheilung in Verbindung gebracht wurden (z.B. Mängel der Vitamine A, C und D sowie Calcium, Magnesium, Kupfer und Eisen), gibt es keinen deutlichen Hinweis, dass eine Steigerung der Serumspiegel dieser Substanzen über ihre normalen Spiegel hinaus tatsächlich die Wundheilung verstärkt. Somit hatte mit Ausnahme von sehr beschränkten Umständen die Förderung der Wundheilung mit diesen Mitteln wenig Erfolg.
Benötigt wird eine sichere, wirksame und interaktive Maßnahme zur Verstärkung der Heilung von großen und/oder schwer zu heilenden Wunden, die ungeachtet des Typs der Wunde oder der Art der Patientenpopulation verwendet werden kann.
Unter einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher eine Zellpaste gemäß dem nachstehenden Anspruch 1 bereitgestellt.
Unter einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Zellpaste gemäß dem nachstehenden Anspruch 15 bereitgestellt.
Unter noch einem anderen Aspekt des Erfinders wird die Verwendung der Zellpaste des Erfinders oder zur Herstellung eines Medikaments zur Gewebereorganisation bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Gewebereorganisation bereitgestellt.
Unter noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellpaste zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Gewebeabstoßung oder Wunde bereitgestellt.
Aniogene oder andere Wachstumsfaktoren, die von menschlichen Zellen exprimiert werden, in nicht-eingekapselten erfindungsgemäßen Pasten (gemischt mit Matrixmaterial oder synthetischen biologisch verträglichen Substanzen) können auf Wunden oder Defekte in der Haut oder anderen Geweben zeitweise aufgebracht werden, um Blut zuführendes Bindegewebe wiederherzustellen oder es organspezifischen Zellen zu ermöglichen, die Organintegrität wiederherzustellen, sowie um übermäßige Narbenbildung zu verhindern.
Die erfindungsgemäße Zellpaste kann eine Kombination von Zelltypen enthalten, die biologisch aktive Substanzen sezernieren.
Bei verschiedenen Ausführungsformen können diese Zellen Stroma-, Epithel- oder organspezifische oder eine aus Blut stammende Zelle, wie der Fibroblast und die Keratinozyte (einschließlich äußerer Wurzelscheidenzellen) und eine Melanozyte, eine Endothelzelle, eine Perizyte, eine Monozyte, eine Lymphozyte (einschließlich Plasmazellen), eine Thrombozyte, eine Mastzellen, eine Adipozyte, eine Muskelzelle, eine Hepatozyte, ein Neuron, eine Nerven- oder Gliazelle, eine Osteozyte, ein Osteoblast, Corneaepithelzellen, Chondrozyte und/oder eine adulte oder embryonale Stammzelle sein.
Der hauptsächlich Zelltyp von Bindegewebe ist der Fibroblast. Bis vor kurzem wurden Fibroblasten als homogene, nicht-differenzierende Zellpopulationen behandelt. Die Fibroblastenzellsysteme in verschiedenen Spezies, einschließlich Mensch, sind jedoch ein Stammzellensystem, wobei sich die Fibroblasten entlang von sieben Stadien, von denen drei mitotische und vier postmitotische Zellen beinhalten, terminal differenzieren. Siehe Bayreuther et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5112–16 (1988); Bayreuther et al., J. Cell. Sci. Suppl. 10: 115–30 (1988). Eine In-vitro-Induktion der Fibroblastendifferenzierung kann mit chemischen oder biologischen Mitteln, wie Mitomycin C (Brenneisen et al., Exp. Cell. Res. 211: 219–30 (1994)) oder Wachstumsfaktoren oder Cytokinen (Hakenjos et al., Int. J. Radiat. Biol. 76: 503–09 (2000)), wie TGF beta 1, IL-1, IL-6, Interferon alpha, durchgeführt werden. Eine In-vitro-Induktion kann auch durch Bestrahlung mit z.B. Röntgenstrahlen (Bumann et al., Strahlenther. Onkol. 171: 35–41 (1995)); UV-Licht (Rodemann et al., Exp. Cell. Res. 180: 84–93 (1989)); oder physischem Aussetzen gegenüber elektromagnetischen Feldern (Thumm et al., Radiat. Environ. Biophys. 38: 195–99 (1999)) erzielt werden. Außerdem kann eine Induktion der Differenzierung auch durch Kulturbedingungen, wie Serumverarmung und Kontakthemmung, erreicht werden. Siehe Palka et al., Folia Histochem. Cytobiol. 34: 121–27 (1996).
Bis heute sind die Funktion/die biologischen Eigenschaften differenzierter Fibroblasten schlecht untersucht. Das Muster der Polypeptidexpression und -sekretion variiert jedoch von mitotischen zu postmitotischen Stadien. Die jeweiligen Polypeptide werden zurzeit noch analysiert. Siehe z.B. Francz, Eur. J. Cell. Biol. 60: 337–45 (1993).
Das biologisch aktive Molekül kann ein angiogener Faktor oder ein Wachstumsfaktor oder eine Kombination von mindestens einem angiogenen Faktor und mindestens einem Wachstumsfaktor sein. Beispiele für geeignete biologisch aktive Moleküle sind u.a. die epidermaler-Wachstumsfaktor-Wachstumsfaktorfamilie (EFG); transformierender Wachstumsfaktor alpha; HGF/SF; heparinbindender epidermaler Wachstumsfaktor, basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor; andere Fibroblasten-Wachstumsfaktoren; Keratinozyten-Wachstumsfaktor; die transformierenden Wachstumsfaktoren β1 und β2; transformierender Wachstumsfaktor β3; Plättchen-Wachstumsfaktor; vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor; Tumornekrosefaktor; Interleukin 1 und 6; andere Mitglieder der Interleukin/Cytokin-Familie; insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1; koloniestimulierender Faktor 1; GM-CSF und PDGF, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Fachmann erkennt, dass zusätzliche biologisch aktive Moleküle bei den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können.
Bei verschiedenen Ausführungsformen können die extrazelluläre Matrix und das Matrixmaterial Kollagene, Alginate, Alginatkugeln, Agarose, Fibrin, Fibrinkleber, blaue Plasmafibrinkugeln, Gesamtplasma oder Komponenten davon, Laminine, Fibronectine, Proteolgykane, HSP, Chitosan, Heparin und/oder andere synthetische Polymergerüste und feste Trägermaterialien, die solche Zellen halten oder daran haften könnten, wie Wundverbände, sein.
Die Zellen können mitotisch inaktiviert, d.h. zur Differenzierung auf verschiedene Stufen induziert, sein. Diese Inaktivierung kann zum Beispiel durch Verabreichung von Mitomycin C oder anderen Mitoseinhibitoren auf chemischer Basis, Bestrahlung mit γ-Strahlen, Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Bestrahlung mit UW-Licht erreicht werden.
Bei noch einer anderen Ausführungsform sind die Zellen gentechnisch verändert, so dass sie einen exogenen Spiegel an angiogenen Faktoren oder Wachstumsfaktoren sezernieren. Diese Sekretion kann konstitutiv sein. Alternativ kann diese Sekretion durch Genswitching kontrolliert werden.
Bei verschiedenen anderen Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Zellpasten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Gewebedefekten oder Wunden bei einem Patienten verwendet, der eine Behandlung benötigt.
Wenn nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, die der Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, üblicherweise versteht. Obwohl ähnliche oder äquivalente Verfahren und Materialien, wie die hier beschriebenen, bei der Ausführung oder Untersuchung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Im Fall einer Streitigkeit gilt die vorliegende Beschreibung einschließlich der Definitionen. Außerdem sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend.
Wundheilung ist ein komplexer Prozess, an dem lösliche Mediatoren, Blutzellen, extrazelluläre Matrix und Parenchymzellen beteiligt sind. Wundheilung hat drei Phasen – die Entzündungsphase, die Gewebebildungsphase und die Gewebeumstrukturierungsphase. Diese Phasen können zeitlich überlappen.
Im Allgemeinen zerstört eine Verletzung an einem Gewebe Blutgefäße und Extravasation von Blutbestandteilen. Blutgerinnung trägt dazu bei, die Hämostase wiederherzustellen, und liefert eine vorläufige extrazelluläre Matrix für die Zellwanderung zur Wunde. Am Wundort erleichtern Plättchen (Thrombozyten) die Bildung eines hämostatischen Pfropfes und sezernieren außerdem mehrere Mediatoren des Wundheilungsprozesses. Zu diesen Mediatoren gehören zum Beispiel Moleküle, wie Plättchen-Wachstumsfaktor, die Monozyten und Fibroblasten anlocken und aktivieren.
Kurz nach der Verletzung infiltrieren neutrophile Zellen die Wunden und reinigen die Wunde von Fremdpartikeln und Bakterien. Die Neutrophilen werden dann mit dem Schorf ausgestoßen oder unterliegen der Phagozytose durch Makrophagen. Monozyten infiltrieren ebenfalls die Wunde als Reaktion auf spezifische Chemoattraktantien, wie Fragmente von extrazellulären Matrixproteinen, transformierenden Wachstumsfaktoren β, das Monozyten-Chemoattraktansprotein 1, und werden zu aktivierten Makrophagen. Diese aktivierten Makrophagen setzen Wachstumsfaktoren frei, wie Plättchen-Wachstumsfaktor und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, die die Bildung von Granulationsgewebe einleiten. Makrophagen binden über ihre Integrin-Rezeptoren an Proteine in der extrazellulären Matrix. Diese Bindung stimuliert die Makrophagen-Phagozytose jeglicher Mikroorganismen sowie von Fragmenten der extrazellulären Matrix.
Monozyten, die durch Anhaften an die extrazelluläre Matrix stimuliert werden, unterliegen außerdem der Metamorphose in inflammatorische Makrophagen. Diese Anhaftung erfolgt an die extrazelluläre Matrix, induziert die Expression von koloniestimulierendem Faktor 1, Tumornekrosefaktor β und Plättchen-Wachstumsfaktor durch Monozyten und Makrophagen. Weitere wichtige Cytokine, die von Monozyten und Makrophagen exprimiert werden, sind transformierender Wachstumsfaktor α, Interleukin-1, die transformierenden Wachstumsfaktoren β 1–3 und der insulinähnliche Wachstumsfaktor 1. Es wird angenommen, dass die von Monozyten und Makrophagen stammenden Wachstumsfaktoren für die Einleitung und Fortsetzung der Bildung von neuem Gewebe in Wunden benötigt werden.
Innerhalb von Stunden nach der Verletzung beginnt die Reepithelialisierung der Wunde. Keratinozyten von den Wundrändern sowie von restlichen Hautanhängen, wie Haarfollikeln, unterliegen deutlichen Veränderungen im Phänotyp, einschließlich Zurückziehen intrazellulärer Tonofilamente, Auflösung der meisten interzellulären Desmosomen und Bildung peripherer cytoplasmatischer Aktinfilamente. Ferner lösen sich die hemidesmosomalen Verbindungen zwischen den Keratinozyten und der epidermalen Basalmembran, wodurch sich die Keratinozyten bewegen können.
Innerhalb weniger Tage nach der Verletzung beginnen die Keratinozyten am Rand der Wunde hinter den wandernden Zellen zu proliferieren. Mit Auftreten dieser Reepithelialisierung erscheinen die Basalmembranproteine wieder in einer geordneten Reihenfolge vom Rand der Wunde nach außen. Die Keratinozyten kehren dann zu ihrem normalen Phänotyp zurück und heften sich an die wiederhergestellte Basalmembran und die darunter liegende Dermis.
Innerhalb von etwa vier Tagen nach der Verletzung beginnt neues Stroma die Wunde zu infiltrieren. Gleichzeitig infiltrieren auch Makrophagen, Fibroblasten und Blutgefäße die Wunde. Makrophagen liefern eine Quelle für Wachstumsfaktoren, die die Fibroplase und die Angiogenese stimulieren. Die Fibroblasten produzieren die neue extrazelluläre Matrix, die das Einwachsen von Zellen unterstützt. Die neuen Blutgefäße führen Sauerstoff und Nährstoffe heran, die die Zellen erhalten.
Es wird angenommen, dass Wachstumsfaktoren, insbesondere Plättchen-Wachstumsfaktor und transformierender Wachstumsfaktor β1, die Fibroblasten des Gewebes um die Wunde dazu stimulieren zu proliferieren. Tatsächlich wurde gezeigt, dass Plättchen-Wachstumsfaktor die Heilung von chronischen Druckabszessen und Diabetesgeschwüren beschleunigt. Außerdem wurde der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor mit einigem Erfolg zur Behandlung chronischer Druckabszesse eingesetzt.
Es gibt jedoch viele Faktoren, die zu anomaler Wundheilung führen können. Ein Beispiel tritt bei Diabetesgeschwüren auf. Üblicherweise zeigen Diabetesgeschwüre mehrere biochemische Pathologien, die zu gestörter Heilung führen können. Diese Geschwüren treten bei Patienten auf, die aufgrund bestimmter Typen der diabetischen Neuropathie keinen Hautdruck spüren und lindern können. Häufig werden Diabetesgeschwüre aufgrund gestörter Granulozytenfunktion und -chemotaxis infiziert. Patienten mit Diabetesgeschwüren unterliegen auch Entzündung, gestörter Neuvaskularisierung, verringerter Kollagensynthese, erhöhten Proteinasespiegeln und mangelhafter Makrophagenfunktion.
Die gesamte klinische Erfahrung unter Verwendung isolierter, z.B. rekombinanter, Wachstumsfaktoren und anderer Mediatoren zur Beschleunigung der Wundheilung erbrachte keinen großen Erfolg, weil es sich bei der Wundreparatur um das Ergebnis eines komplexen Satzes von Wechselwirkungen zwischen löslichen Faktoren, gebildeten Blutbestandteilen, extrazellulärer Matrix und Zellen handelt. Die Kombination verschiedener Wachstumsfaktoren in sorgfältig kontrollierten Zeitabständen kann eine wirksamere Wundheilung fördern.
Die vorliegende Erfindung stellt somit Stroma- und Epithel- sowie aus Blut stammende Zellen, einschließlich Fibroblasten, Keratinozyten, einschließlich follikulärer äußerer Wurzelscheidenzellen, Endothelzellen, Perizyten, Monozyten, Lymphozyten, einschließlich Plasmazellen, Thrombozyten, Mastzellen, Adipozyten, Muskelzellen, Hepatozyten, Nerven- und Neurogliazellen, Osterozyten, Osteoblasten, Corneapeithelzellen und Chondrozyten, bereit, die mit entweder synthetischer oder natürlicher extrazellulärer Matrix ("ECM") unter Bildung einer Zellpaste vermischt sind, die zur Verbesserung der Gewebegranulation während der Wundheilung verwendet werden kann. Bei einer Ausführungsform können die Zellen endogene angiogene Faktoren oder andere Wachstumsfaktoren zuführen. Bei einer anderen Ausführungsform können die Zellen gentechnisch verändert sein, so dass die exogene Mengen des gewünschten Faktors produzieren.
Die Zellen können entweder immortalisierte oder primäre Zellkulturen sein. Die Zellen können durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren immortalisiert werden. Ein üblicher Ansatz zur Verlängerung der Lebensdauer einer Zelle ist, ein Virus oder ein Plasmid zu übertragen, das ein oder mehrere immortalisierende Gene trägt. Zellimmortalisierung verlängert die Lebensdauer einer Zelle, und die erhaltene Zelllinie kann viele weitere Male als die ursprünglichen Zellen passagiert werden. Siehe z.B. Katakura et al., Methods of Cell Biol. 57: 69–91 (1998). Immortalisierende Proteine oder Polypeptide umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die 12S- und 13S-Produkte der Adenovirus-EIA-Gene, hTERT, small und large T-Antigen von SV40, Papillomaviren-E6 und -E7, das Epstein-Barr-Virus (EBV), Epstein-Barr nukleäres Antigen-2 (EBNA2), humanes T-Zell-Leukämievirus-1 (HTLV-1), HTLV-1 tax, Herpesvirus saimiri (HVS), mutiertes p53 und die Proteine von Onkogenen, wie myc, c-jun, c-ras, c-Ha-ras, h-ras, v-src, c-fgr, myb, c-myc, n-myc und Mdm2. Eine bevorzugte Immortalisierungsstrategie ist durch Übertragung des Gens, das Telomerase-reverse-Transkriptase (TERT) codiert, in die Zellen, so dass TERT entweder stabil oder transient dadurch exprimiert wird, was zur Expression von Telomerase-Aktivität führt. Telomerase-Aktivität, wenn sie in normalen somatischen Zellen exprimiert wird, kann zu einer Verlängerung der Chromosomenspitzen oder -schutzkappen, die als Telomere bezeichnet werden, führen, was zu der Fähigkeit der Telomerase exprimierenden Zellen führen kann, immortalisiert zu werden, ohne transformiert zu werden (siehe Jiang, et al., Nature Genetics 21: 111–14 (1999) und Morales, et al., Nature Genetics 21: 115–18 (1999)).
Telomere sind spezialisierte Strukturen an den Enden eukaryotischer Chromosomen und scheinen zur Chromsomenstabilisierung, -positionierung und -replikation zu dienen. Siehe Blackburn & Szostak, 53 Ann. Rev. Biochem. 163–194 (1984); Zakian, 23 Ann. Rev. Genetics 579–604 (1989); Blackburn, 350 Nature 569–573 (1991). Bei allen Vertebraten bestehen die Telomere aus Hunderten bis Tausenden von Tandem-Wiederholungen der 5'-TTAGGG-Sequenz und assoziierter Proteine. Siehe Blackburn, 350 Nature 569–573 (1991); Moyzis et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. 6622–6626 (1988). Eine Southern-Blot-Analyse terminaler Restriktionsfragmente (TRF) von Chromosomen liefert die gemeinsamen Längen aller Telomere in einer Zellpopulation. Siehe Harley et al., 3445 Nature 458–460 (1990); Allsopp et al., 89 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10114–10118 (1992); Vaziri et al., 52 Am. J. Human Genetics 661–667 (1993). In allen bis heute untersuchten normalen somatischen Zellen hat die TRF-Analyse gezeigt, dass die Chromosomen etwa 50–200 Nucleotide an Telomersequenz pro Zellteilung verlieren, was mit der Unfähigkeit der DNA-Polymerase, lineare DNA bis zu den Enden zu replizieren, übereinstimmt. Siehe Watson, 239 Nature New Biology 197–201 (1972).
Es wurde vorgeschlagen, dass diese Verkürzung der Telomere die mitotische Uhr ist, anhand derer Zellen ihre Teilungen zählen (siehe Harley, 256 Mut. Res. 271–282 (1991)), und ausreichend kurze Telomere können das Signal für die Replikationssenezenz in normalen Zellen sein. Siehe Hastie et al., 346 Nature 866–868 (1990); Lindsey et al., 256 Mut. Res. 45–48 (1991); Wright & Shay, 8 Trends Genetics 193–197 (1992). Dagegen zeigt die große Mehrheit der bis heute untersuchten unsterblichen Zellen keinen Verlust an Telomerlänge oder -sequenz mit den Zellteilungen, was daruaf hindeutet, dass die Erhaltung der Telomere erforderlich ist, damit die Zellen der replikativen Seneszenz entkommen und unendlich proliferieren. Siehe Counter et al., 11 EMBO 1921–1929 (1992); Counter et al., 91 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2900–2940, 1994).
Telomerase, eine einzigartige Ribonucleoprotein-DNA-Polymerase, ist das einzige Enzym, von dem bekannt ist, dass es telomere DNA an den Chromosomenenden synthetisiert, wobei es als Matrize eine Sequenz verwendet, die innerhalb der RNA-Komponente des Enzyms enthalten ist. Siehe Greider & Blackburn, 43 Cell 405–413 (1985); Greider & Blackburn, 337 Nature 331–337 (1989); Yu et al., 344 Nature 126–132 (1990); Blackburn, 61 Ann. Rev. Biochem. 113–129 (1992). Im Hinblick auf menschliche Zellen und Gewebe wurde eine Telomerase-Aktivität in unsterblichen Zelllinien und in Ovarkarzinomen identifiziert, wurde aber nicht in sterblichen Zellstämmen oder in normalen Nicht-Keimliniengeweben nachgewiesen. Siehe Morin, 59 Cell 521–529, 1989. Zusammen mit der TRF-Analyse legen diese Ergebnisse nahe, dass Telomerase-Aktivität direkt an der Telomerenerhaltung beteiligt ist, wodurch dieses Enzym mit der Zellimmortalität verknüpft wird.
Eine Expression der humanen katalytischen Telomerase-Komponente (hTERT) wurde kürzlich in humanen somatischen Zellen untersucht. Siehe Jiang et al., 21 Nature Genetics 111–114 (1999). Die Telomerase-Expression in normalen somatischen Zellen induzierte anscheinend keine Veränderungen in Zusammenhang mit einem malignen Phänotyp, wie anomale Wachstumskontrolle oder onkogene Transformation. Das Fehlen krebsassoziierter Veränderungen wurde auch bei mit Telomerase immortalisierten humanen Fibroblasten berichtet. Siehe Morales et al., 21 Nature Genetics 115–118 (1999). Es wurde gezeigt, dass das Eindringen von Telomerase in normale menschliche Körperzellen nicht zu einer Wachstumstransformation führt, zellzyklusinduzierte Kontrollpunktregulationen nicht umgeht und nicht zu genomischer Instabilität dieser Zellen führt. Verfahren zum Nachweis von Telomerase-Aktivität sowie zur Identifikation von Verbindungen oder Polypeptiden, die die Telomerase-Aktivität regulieren oder beeinflussen, zusammen mit Verfahren zur Therapie oder Diagnose von zellulärer Seneszenz und Immortalisierung durch Steuern oder Messen der Telomerlänge und der Telomerase-Aktivität, wurden ebenfalls beschrieben (siehe internationale PCT-Patentanmeldung WO 93/23572). Die Identifikation von Verbindungen, die die Telomerase-Aktivität beeinflussen, liefert einen wichtigen Nutzen für die Anstrengungen zur Behandlung menschlicher Erkrankung.
Die erfindungsgemäßen Zellen können überdies gentechnisch verändert werden, um ein oder mehrere biologisch aktive Moleküle zu produzieren, so dass die Moleküle konstitutiv aus den Zellen sezerniert werden. Mit "konstitutiv sezerniert" ist gemeint, dass das gewünschte biologisch aktive Molekül von den Zellen kontinuierlich exprimiert wird oder dass das Gen stetig exprimiert wird. Alternativ können die Zellen gentechnisch verändert sein, so dass ihre Expression durch Genswitching reguliert wird.
Wie hier verwendet, betreffen die Begriffe "Genswitch" und "Genswitching" Verfahren zur Regulation der Genexpression. Genauer gesagt, wird die Expression eines Proteins, das von einem Gen codiert wird, durch die Wechselwirkung bestimmter regulatorischer Proteine, die als DNA-Bindungsproteine bekannt sind, mit einer Region stromaufwärts des Gens reguliert. Innerhalb der Promotorregion befinden sich mehrere Operatorregionen, die eine spezifische Oligonukleotidsequenz enthalten, an die diese DNA-bindenden Proteine spezifisch binden. Diese Proteine können entweder zur Aktivierung oder zur Repression der Genexpression führen. So steuern sie die regulierte Expression von Genen.
Das Regulatorprotein wird von einem regulatorischen Gen codiert, das sich an anderer Stelle auf dem Chromosom befindet. Die Wechselwirkung von Regulator und Operator wird durch das Vorliegen oder Fehlen besonderer chemischer Faktoren (Induktoren) beeinflusst. So wird unter normalen Umständen der Regulator exprimiert, wodurch er den Operator bindet und die Expression des Gens hemmt, bis ein Bedarf an dem besonderen, von dem Gen codierten Protein durch das Auftreten eines spezifischen Induktors in der Umgebung angezeigt wird, der mit den Regulator wechselwirkt und so die Bindung an den Operator hemmt, wodurch die Expression des Gens ermöglicht wird.
Zum Beispiel wird ein Enzym, das auf ein Zuckermolekül einwirkt, nicht benötigt, solange der Zucker nicht vorliegt, und daher exprimiert in Abwesenheit des Zuckers das regulatorische Gen den Regulator, der den Genoperator bindet und die Expression des Enzyms hemmt. Der Zucker selbst wirkt als der Induktor, der dann mit dem Regulator wechselwirkt, um dessen Bindung an den Operator zu verhindern und so die Expression des Enzyms zu ermöglichen. Spaltung des Zuckers durch das Enzym entfernt es aus der Umgebung und gestattet es dem Regulator, in seinen normalen Modus zurückzukehren und normal die Inaktivierung der Enzymexpression zu bewirken.
Ein solcher Mechanismus kann als Umschaltanordnung betrachtet werden, die die Genexpression an- und ausschaltet, wie es vom chemischen Inhalt der Umgebung vorgegeben wird. Genswitching-Systeme des beschriebenen Typs sind am besten in Bakterien bekannt, und viele der Proteine und ihrer Ziel-DNA-Bindungsstellen sind in erheblichen Einzelheiten bekannt. Die Regulatorproteine binden gewöhnlich als Dimere an die Operatoren, die eine zweifache Symmetrie zeigen. Die Spezifität der Regulator/Promoter-Wechselwirkung wird durch die sequenzspezifische Wechselwirkung spezifischer Aminosäuren des Regulators mit der Operator-DNA bestimmt. In einigen Systemen waren die Wechselwirkungen Gegenstand eingehender biochemischer Analyse sowie von hochauflösender Röntgenkristallographie. Die am besten charakterisierte Klasse DNA-bindender Proteine zeigt ein gemeinsames Helix-Turn-Helix-Motiv mit einem gewissen Grad an Sequenzhomologie. Es ist klar, dass die entscheidende DNA-bindende Domäne des Regulators in der Helix-Turn-Helix-Region enthalten ist.
Es wurde gezeigt, dass bei Eukaryoten die Steuerung der Genexpression ebenfalls durch die Wechselwirkung spezifischer Proteinfaktoren, die an DNA-Sequenzen nahe der Promotorregion von Genen binden, reguliert wird. Eine Reihe von Faktoren wurde aus Hefe- und Säugerzellen isoliert, und es wurde gezeigt, dass sie mit spezifischen Sequenzmotiven auf sequenzspezifische Weise ähnlich bakteriellen Systemen wechselwirken. Die Charakterisierung einiger dieser Faktoren hat ein neues "Finger"-Motiv enthüllt, das an der sequenzspezifischen Bindung von Proteinen beteiligt sein könnte.
Außerdem wurde gezeigt, dass die eukaryotische Genexpression durch Verwendung bakterieller Repressormoleküle in eukaryotischen Zellen gesteuert werden kann. Bei diesen Experimenten wurden bakterielle Operatorsequenzen nahe den Promotoren von Säugergenen inseriert. Zelllinien wurden erstellt, die den bakteriellen Repressor exprimieren. Die Steuerung der Genexpression der eukaryotischen Zielgene mit Operatorinsertionen durch Repressormoleküle wurde unter Verwendung transienter Expressionstests demonstriert. In diesen Experimenten wurde nicht nur eine Repression der Genexpression durch den lac-Repressor gezeigt, sondern auch eine Induktion der Genexpression, d.h. eine Aufhebung der Repression, unter Verwendung von IPTG, Isopropylthiogalactosid.
Daher kann eine detaillierte Kenntnis und Manipulation bakterieller Protein/DNA-Wechselwirkungen dazu verwendet werden, die Expression in Säugerzellkulturen zu steuern. Genswitching-Techniken sind zum Beispiel im US-Patent Nr. 6,010,887 beschrieben. Der Durchschnittsfachmann erkennt, dass andere Verfahren der Genswitch-Regulation ebenfalls eingesetzt werden können.
Obwohl unmodifizierte Zellen erfindungsgemäß verwendet werden können, sind bei einer bevorzugten Ausführungsform die isolierten Zellen gentechnisch verändert. Die Zellen können derart genetisch verändert sein, dass sie ein oder mehrere biologisch aktive Moleküle, einschließlich Cytokinen, Wachstumsfaktoren und/oder angiogenen Faktoren oder einer Kombination davon, aber nicht darauf beschränkt, sezernieren. Beispiele für solche biologisch aktiven Moleküle sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Spalte 1 von Tabelle 1 nennt geeignete biologisch aktive Moleküle. Spalte 2 zeigt die hauptsächliche Quelle des bestimmten biologisch aktiven Moleküls. Schließlich zeigt Spalte 3 die Zielzellen und/oder die hauptsächliche Wirkung des gegebenen biologisch aktiven Moleküls.
Die Steuerung der Zuführung des sezernierten biologisch aktiven Moleküls kann durch jedes beliebige, dem Fachmann bekannte Verfahren erreicht werden. Zum Beispiel kann die Expression mehrerer Genprodukte durch ein einziges Promotorsystem gesteuert werden. Alternativ kann die Expression mehrerer Genprodukte durch mehrere Promotorsysteme gesteuert werden, wobei jedes Promotorsystem entweder konstitutiv, durch Genswitching oder eine Kombination von beidem reguliert wird. Ferner kann die Steuerung der Sekretion eines bestimmten biologisch aktiven Moleküls durch Nach-oben-Regulation des Wildtypfaktors erzielt werden.
Es gibt eine Reihe bekannter Verfahren zum Einbringen von genetischem Material in Zielzellen. Dazu gehören die Verwendung von Polykatonen, wie DEAE-Dextran (siehe McCutchan, et al., J. Natl. Cancer Inst. 41: 351–57 (1968) und Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1172–74 (1984)); Calciumphospha-Copräzipitation (siehe Graham et al., Virology 52: 456–67 (1973)); Elektroporation (siehe Neumann et al., EMBO J. 7: 841–45 (1982)); Lipofektion (siehe Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–17 (1987)); Retrovirus-Vektoren (siehe Cepko et al., Cell 37: 1053–62 (1984)); und Mikroinjektion (siehe Capecchi et al., Cell 22: 479–88 (1980)).
Außerdem erkennt der Fachmann, das jedes andere, zur Zuführung eines exogenen biologisch aktiven Moleküls in die Zellen geeignete Verfahren ebenfalls eingesetzt werden kann.
Unter Verwendung jedes der vorstehend genannten Transfektionsverfahren kann eine Steuerung der Sekretion einer Anzahl biologisch aktiver Moleküle erreicht werden, indem eine beliebige Anzahl von Zelltypen, die die verschiedenen biologisch aktiven Moleküle sezernieren, vermischt wird.
Die erfindungsgemäßen Zellen sind mitotisch inaktiv. Mit "mitotisch inaktiv" ist gemeint, dass die Zellen nicht aktiv die Mitose durchführen. Mitotisch inaktive Zellen können in ihrem Wachstum durch jede im Stand der Technik bekannte Maßnahme aufgehalten werden. Als nicht beschränkendes Beispiel können die Zellen durch chemische Maßnahmen, wie beispielsweise durch Verabreichung von Mitomycin C, im Wachstum angehalten werden. Zusätzlich kann das Wachstum der Zellen durch Aussetzen gegenüber UV-Licht, Röntgenstrahlen oder γ-Bestrahlung angehalten werden. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass z.B. mitotisch inaktivierte humane Fibroblastenzellen sich terminal differenzieren und dadurch das Muster der Polypeptidexpression und -sekretion verändern (Francz, Eur. J. Cell. Biol. 60: 337–45 (1993)). Als weiteres Beispiel hängt die Keratinozytendifferenzierung gewöhnlich von den Kulturbedingungen (Zusammensetzung der Kulturmedien, Ca²⁺-Konzentration, luftexponierte = angehobene Kultur) ab, kann aber auch durch z.B. Mitomycin C zur Differenzierung induziert werden.
Fibroblasten können durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren isoliert werden. Zum Beispiel können Fibroblasten von Organen, wie Haut, Leber und Pankreas, stammen. Diese Organe können mittels Biopsie (wenn angemessen) oder nach Autopsie erhalten werden. Genauer gesagt, können ausreichende Mengen an Fibroblasten recht leicht aus jedem geeigneten Leichenorgan erhalten werden.
Fibroblasten können durch Zersetzen eines geeigneten Quellenorgans oder -gewebes leicht isoliert werden. Mit "Quellenorgan oder -gewebe" ist das Organ oder Gewebe gemeint, aus dem die Zellen erhalten werden. Das Zersetzen kann unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, leicht erreicht werden. Beispiele für solche Techniken sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf mechanische Zersetzung und/oder Behandlung mit Verdauungsenzymen und/oder Chelatisierungsmitteln, die die Verbindungen zwischen benachbarten Zellen schwächen, wodurch es möglich ist, das Gewebe ohne sichtbare Zellzerstörung in eine Suspension von Einzelzellen zu dispergieren. Genauer gesagt, kann eine enzymatische Dissoziation durch Zerkleinern des Gewebes und Behandeln des zerkleinerten Gewebes mit jedem von einer Reihe von Verdauungsenzymen, entweder allein oder in Kombination, erzielt werden. Geeignete Enzyme sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf Trypsin, Chymotrypsin, Kollagenase, Elastase, Hyaluronidase, Dnase, Pronase, und/oder Dispase. Mechanische Zersetzung kann durch eine Reihe von Verfahren erzielt werden, einschließlich der Verwendung von Mahlwerken, Mixern, Sieben, Homogenisatoren, Druckzellen oder Beschallungsvorrichtungen, aber nicht darauf beschränkt. Siehe Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2. Aufl., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Kap. 9, S. 107–26.
Nachdem das Quellengewebe zu einer Suspension von Einzelzellen reduziert wurde, sollte die Suspension in Subpopulationen fraktioniert werden, aus denen die Fibroblasten und/oder andere Stromazellen und/oder Bestandteile gewonnen werden können. Die Fraktionierung kann unter Verwendung von Standardtechniken zur Zellauftrennung erreicht werden, einschließlich Klonierung und Selektion spezifischer Zelltypen, selektiver Zerstörung ungewünschter Zellen (negative Selektion), Trennung auf Basis von differenzieller Zellagglutinierbarkeit in der gemischten Population, Gefrier-Auftau-Verfahren, differenzieller Anheftungseigenschaften der Zellen in der gemischten Population, Filtration, herkömmlicher und zonaler Zentrifugation, zentrifugaler Elutriation (Gegenstromzentrifugation), Einheitsschwerkrafttrennung, Gegenstromverteilung, Elektrophorese und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung, aber nicht darauf beschränkt. Siehe Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2. Aufl, A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Kap. 11 und 12, S. 137–68. Der Fachmann erkennt, dass (eine) andere geeignete Zellfraktionierungstechnik(en) ebenfalls verwendet werden kann.
Vorzugsweise wird die Isolation von Fibroblasten durch Explantation von Hautstücken gemäß dem Verfahren von Sly und Grubb erzielt. Siehe Sly et al., Methods Enzymol. 58: 444–50 (1979).
Zur Erzeugung einer erfindungsgemäßen Zellpaste werden die Zellstämme oder gentechnisch veränderten Zellstämme vorzugsweise mit einer tragenden biologischen oder synthetischen extrazellulären Matrix oder mit Matrixmaterial (ECM) gemischt. Der Fachmann erkennt, dass der Begriff "ECM" das nicht-zelluläre Material betrifft, das im gesamten Körper mehrzelliger Organismen verteilt ist. Es besteht aus verschiedenen Bestandteilen, wie Glykoproteinen, Proteoglykanen, komplexen Kohlenhydraten und anderen Molekülen. Zu den hauptsächlichen Funktionen der ECM gehören die Bereitstellung von struktureller Unterstützung, Zugfestigkeit oder Abfederung; das Bereitstellen von Substraten und Wegen zur Zelladhäsion und Zellmigration und die Regulation von Zelldifferenzierung und Stoffwechselfunktion, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Die ECM-Proteine umfassen zum Beispiel Kollagene, Elastin, Fibronectin, Laminin, Proteoglykane, Vitronectin, Thrombospondin, Tenascin (Cytoactin), Entactin (Nidogen), Osteonectin (SPARC), Anchorin CII, Chondronectin, Link-Protein, Osteocalcin, Knochern-Sialoprotein, Osteopontin, Epinectin, Hyaluronectin, Amyloid P-Komponente, Fibrillin, Merosin, s-Laminin, Undulin, Epilligrin und Kalinin. Bevorzugte ECM-Proteine für die erfindungsgemäße Verwendung sind u.a. Kollagen, Alginat, Agarose, Fibrin, Fibrinkleber, Laminine, Fibronectine, HSP, Chitosan, Heparin und/oder andere synthetische Polymergerüste.
Die Zelldichte und die Konzentration der extrazellulären Matrix kann für die gewünschte klinische Anwendung variiert werden. Zum Beispiel können bestimmte Wunden größere oder kleinere Zelldichten und/oder Pasten unterschiedlicher Konsistenz erfordern. Die Bestimmung der genauen Zelldichte und Konzentration der ECM liegt innerhalb der routinemäßigen Fähigkeit des Fachmanns. Die Zellsuspension kann von einem Zelltyp stammen oder ein Gemisch verschiedener Zelltypen umfassen. Zum Beispiel kann das Zellgemisch 50% Keratinozyten und 50% Fibroblasten enthalten. Außerdem kann die Suspension mehr als zwei verschiedene Zelltypen umfassen. Die Prozentanteile jedes Zelltyps können je nach der beabsichtigten Verwendung variieren. Die Zellen können auch in vitro vorinduziert oder co-kultiviert werden, um die Heilungsreaktion auf der Wunde zu optimieren. Zum Beispiel können Fibroblasten mit TGF-beta (von 0,1 bis 30 ng/ml Medium) für 1 bis 21 Tage vor dem Aufbringen auf die Wunde vorinkubiert werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Erfindung eine humane allogene Fibroblastenzelllinie, die mit ECM-Materialien unter Bildung einer viskosen Paste für die Adhäsion an der Wunde vermischt wird. Bei dieser Ausführungsform ist diese Zelllinie vorzugsweise nicht gentechnisch verändert. Diese Zelllinie kann durch jede dem Fachmann bekannte Maßnahme mitotisch inaktiviert werden. Vorzugsweise ist die Paste sowohl biologisch abbaubar als auch biologisch verträglich. Die Paste kann auf die Wunde nach Bedarf, beispielsweise einmal wöchentlich, aufgebracht werden. Das Aufbringen der Zellpaste gemäß dieser Ausführungsform erleichtert die Induktion von Granulationsgewebe und die Stimulation des Wundverschlusses. Immortalisierte Fibroblasten- und Keratinozytenzelllinien sind ebenfalls bevorzugte Ausführungsformen. Das bevorzugte Immortalisierungsverfahren ist mittels direkter Zugabe des Gens für TERT in die primären humanen Keratinozyten- und Fibroblastenzellen, so dass das TERT-Gen konstitutiv exprimiert wird. Zusätzlich kann eine transiente Immortalisierung unter Verwendung einer an das TERT-Protein gebundenen Proteindomänen-Transportsequenz (TAT, VP22, MTS usw.) dahingehend zu bevorzugen sein, dass das Gen mit permanent in die immortalisierte Zelle inseriert wird, sondern stattdessen als Fusionsprotein zum Wachstumsmedium hinzugefügt wird. Auf diese Weise könnte die Zelllinie ohne den ständigen Bedarf an einer Neuvalidierung neuer Primärzellquellen kontinuierlich vermehrt, in einer Bank aufbewahrt und hinsichtlich stabiler Eigenschaften (Wachstumsrate, Faktorsekretion usw.) gescreent werden. Die auf diese Weise immortalisierten Zelllinien sind vorzugsweise mitotisch inaktiviert (wie nachstehend beschrieben), bevor sie auf die Wunde oder die Gewebereparaturstelle als Paste, biologisches Matrixgemisch oder angeheftet oder adsorbiert an einen Wundverband aufgebracht werden.
Medikamente, die die erfindungsgemäße Zellpaste umfassen, haben humanklinische und veterinärmedizinische Anwendungen. Die erfindungsgemäße Zellpaste kann zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Menschen und nicht-menschlichen Tieren, einschließlich nicht-menschlicher Primat, Maus, Ratte, Hund, Katze, Schwein, Schaf, Kuh oder Pferd, verwendet werden. Die erfindungsgemäße Zellpaste kann zur Herstellung von Medikamenten zur Geweberegeneration, wie z.B. Medikamenten zur Verwendung bei der Hautwundenbehandlung oder Behandlung von Parodontitis, verwendet werden.
Zum Beispiel kann die erfindungsgemäße Zellpaste in anderen, für die Verabreichung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen eingebracht werden. Solche Zusammensetzungen können die Zellpaste und einen zusätzlichen verträglichen Träger umfassen. Wie hier verwendet, soll "biologisch verträglicher Träger" jedes und alle mit der biologischen Verabreichung verträgliche Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und fungizide Mittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und dergleichen beinhalten. Geeignete Träger sind in der neuesten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences, einem Standardreferenztext auf dem Gebiet, beschrieben. Bevorzugte Beispiele für solche Träger oder Verdünnungsmittel sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf Wasser, Kochsalzlösung, Finger-Lösung, Dextroselösung und 5% Humanserumalbumin. Liposomen und nicht-wässrige Vehikel, wie feste Öle, können ebenfalls verwendet werden. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist im Stand der Technik bekannt. Ausgenommen insofern, als irgendein herkömmliches Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff unverträglich ist, wird deren Verwendung in den Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Ergänzende Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einen Behälter, eine Packung oder einen Spender zusammen mit einer Anleitung für die Verabreichung eingebracht werden.
Das Dosierungsschema wird in Übereinstimmung mit einer Vielzahl an Faktoren ausgewählt, einschließlich Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischem Zustand des Patienten; Typ und Schwere des zu behandelnden Zustands; des Verabreichungswegs und der besonderen eingesetzten Zellen. Ein Durchschnittsarzt oder -veterinär kann leicht die wirksame Menge bestimmen und verschreiben, die erforderlich ist, um das Voranschreiten des Zustands zu verhindern, diesem entgegenzuwirken oder es anzuhalten.
Es folgt nur als Beispiel eine Beschreibung anhand der beigefügten Zeichnungen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
In den Zeichnungen:
ist 1 ein Histogramm, das die Ergebnisse der Sekretion von Wachstumsfaktoren aus der Zell/Fibrin-Pastenmischung zeigt.
ist 2 ein Histogramm, das die Sekretion von Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF), vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) aus Kulturen zeigt, die nur Keratinozyten, nur Fibroblasten oder co-kultivierte Keratinozyten und Fibroblasten in einer Fibrinpaste enthalten. Das Medium wurde nach 3 Tagen Kultur hinsichtlich des Cytokingehalts analysiert. Die Gesamtzellzahl war für jede Bedingung identisch.
ist 3 ein Histogramm, das die Sekretion von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) aus Kulturen zeigt, die nur Keratinozyten, nur Fibroblasten oder co-kultivierte Keratinozyten und Fibroblasten in einer Fibrinpaste enthalten. Das Medium wurde nach 3 Tagen Kultur hinsichtlich des Cytokingehalts analysiert. Die Gesamtzellzahl war für jede Bedingung identisch.
ist 4 ein Histogramm, das die Wirkung der Keratinozytenkonfluenz auf die Sekretion von GM-CSF zeigt.
ist 5 ein Histogramm, das die Sekretion von Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) aus Kulturen zeigt, die co-kultivierte Keratinozyten und Fibroblasten in einer Fibrinpaste enthalten. Die Zellen waren entweder nicht mit Mitomycin C behandelt (wachsende Zellen) oder mit Mitomycin C behandelt (im Wachstum angehaltene Zellen).
Die Zellüberstände wurden nach 3 Tagen Kultur hinsichtlich des Cytokingehalts analysiert. Die Ergebnisse sind in ng GM-CSF/ml Medium ausgedrückt.
BEISPIEL 1: Isolation von Fibroblasten
Die Isolation von Fibroblasten kann wie folgt durchgeführt werden: frische Gewebeproben werden gründlich gewaschen und in Hank's balanced-Salzlösung (HBSS) zerkleinert, um das Serum zu entfernen. Das zerkleinerte Gewebe wird 1–12 Stunden in einer frisch hergestellten Lösung eines dissoziierenden Enzyms, wie Trypsin, inkubiert. Nach einer derartigen Inkubation werden die dissoziierten Zellen suspendiert, mittels Zentrifugation sedimentiert und auf Kulturschalen plattiert. Alle Fibroblasten heften vor anderen Zellen an, daher können geeignete Stromazellen selektiv isoliert und gezüchtet werden. Die isolierten Fibroblasten können bis zur Konfluenz gezüchtet und seriell kultiviert oder in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden (siehe Naughton et al., 1987, J. Med. 18(3 & 4): 219–250). Fibroblasten oder Subpopulationen von Fibroblasten, wie Hautpapillenzellen oder Myofibroblasten, können aus einer Explantatwachstumskultur isoliert werden. Nach der Isolation sind die Stromazellen bereit für die Vermischung mit der ECM-Paste.
BEISPIEL 2: Testen der wirksamen Dosis von Mitomycin C
Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass die wirksamen Konzentrationen von Mitomycin C (MMC) für das Anhalten des Wachstums von Maus-3T3-Zellen 2 μg/ml (Rheinwald und Green, Cell 6: 331–43 (1975)) und für humane Dermisfibroblasten 8 μg/ml beträgt (Limat et al., J. Invest. Dermatol. 92: 758–62 (1989)).
Sowohl bei normalen (CRL 1213) als auch FGF1-transfizierten Ratten-Fibroblasten (175-CRL) sowie normalen humanen Fibroblasten (MDX12 und EDX1) wurde das Wachstum unter Verwendung des folgenden Verfahrens angehalten. Die Fibroblasten wurden in DMEM + 10% FCS, 25 mM Hepes, 1 mM Pyruvat, 2 mM L-Gln, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin in T75-Koblen gezüchtet. Bei Konfluenz wurden die Zellen abgelöst und in einer Dichte von 10⁵ Zellen/cm² ausplattiert, 48 Std. lang weiter inkubiert, dann mit Mitomycin C (MMC) zu 0, 2, 4, 8, 12 μg/ml für 5 Std. behandelt. Die Zellen wurden dann mit PBS gespült und mit 0,05% Trypsin/0,02 EDTA gelöst. Die restlichen Zellen wurden in Dichten von 100 bis 5000 Zellen/cm² jeweils in T25-Kolben plattiert (10 Gefäße für jede Dichte). Diese Zellen wurden bei 37°C mit 2 Mediumwechseln pro Woche inkubiert.
Die Effizienz des Anhaltens des Wachstums der Zellen wurde mittels Zellzählung in einem Hämazytometer in wöchentlichen Abständen in den Gefäßen, die in einer Dichte von 5000 Zellen/cm² plattiert worden waren und Inspektion erscheinender Kolonien in den Gefäßen, die in einer Dichte von 100 Zellen/cm² plattiert worden waren, gemessen. Veränderungen in der Zellmorphologie wurden ebenfalls untersucht. Für die humanen primären Fibroblasten EDX1 und die mit hTERT immortalisierte humane Fibroblastenlinie MDX12 war eine Konzentration von 8 μg/ml MMC in Übereinstimmung mit früheren Daten geeignet (Limat et al., J. Invest. Dermatol. 92: 758–62 (1989)). Für die Ratten-Fibroblastenlinie CRL 123 waren MMC-Konzentrationen über 4 μg/ml toxisch, während 2 μg/ml MMC sich als optimale erwiesen. Für die Ratten-Fibroblastenzelllinie 175-CRL, die mit dem FGF1-Gen transfiziert war, wurde das Zellwachstum bei einer Konzentration von 1 μg/ml MMC wirksam angehalten. Konzentrationen unterhalb von 1 μg/ml waren nicht notwendigerweise wirksam, und höherer Konzentrationen waren mehr und mehr toxisch. Bei (mit der geeigneten Mitomycin-C-Dosis) Mitomycin-C-behandelten Fibroblasten, die aus der kryogenen Aufbewahrung rückgewonnen wurden, betrug die Zellrückgewinnung 50% (in Übereinstimmung mit Limat et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 26: 709–12 (1990)).
BEISPIEL 3: Testen der optimalen Verdünnung von TissuCol (Fibrinkleber) und Standard-Humanplasma
Nachdem die Effizienz des Anhaltens des Wachstums festgestellt worden war, wurde der Bereich optimaler Verdünnungen von TissuCol bestimmt. TissuCol wurde mit PBS ohne Ca²⁺/Mg²⁺ oder direkt mit Kulturmedium in einem Verhältnis von 1:5, 1:10 und 1:20 verdünnt. Das TissuCol wurden dann in 12-Multiwell-Schalen (Oberfläche = 3,8 cm²; 0,25, 0,5, 1 ml pro Vertiefung) gegossen, die Pasten nach 30 min mit 1 ml Kulturmedium überschichtet, und der Zustand der Pasten wurden während mehrerer Tage verfolgt. Auch die Bearbeitbarkeit/Handhabung der Pasten wurde unter Verwendung manueller Manipulationsverfahren überprüft. Es wurde bestimmt, dass optimale Verdünnungen des TissuCol im Bereich zwischen 1:2 und 1:40 lagen. Normales Humanplasma kann ebenfalls als Matrixmaterial für die Herstellung geronnener Zellpasten in der Wundstelle verwendet werden. Gemische aus normalem Humanplasma und kalziumhaltigem Thrombin (1–500 U/ml), was zu einer endgültigen Plasmakonzentration von 50–100% führte, führen zur Bildung von durch Fibrin geronnenem Material mit ausreichenden Verarbeitbarkeits- und Handhabungseigenschaften, dass es in der Lage ist, kommerziell erhältliche Fibrinkleber, wie die konzentrierten Produkte auf Fibrinbasis Tissucol von Baxter und APR von Haemacure, zu ersetzen.
BEISPIEL 4: Testen der optimalen Zelldichte innerhalb der Fibrinpaste
Nachdem die Effizienz des Anhaltens des Wachstums und optimale TissuCol-Konzentrationen festgestellt worden waren, wurde die optimale Zelldichte innerhalb des TissuCol bestimmt. Ratten- und Human-MDX12- sowie EDX1-Fibroblasten wurden in ausgewählten Dichten (10³–10⁵ Zellen pro ml) mit der ausgewählten Verdünnung von TissuCol gemischt und in Vertiefungen in 12-Multiwell-Platten überführt. Es wurden sowohl mitotisch aktive als auch mitotisch inaktivierte Fibroblasten verwendet. Das Verhalten der Fibrinpasten wurden (a) mittels optischer Phasenkontrast-Sichtbarmachung, (b) Test der Lebensfähigkeit (Trypan-Blau und der Zellzahlen in ausgewählten Zeitabständen nach Solubilisierung der Fibrinpasten durch Plasmin oder Trypsin, (c) erneute Plattierung der aus den solubilisierten Fibrinpasten geernteten Fibroblasten in Kulturschalen verfolgt. Es wurde mittels makroskopischer Sichtbarmachung des Zustands der Pasten bestimmt, dass die Arbeitsdichten der Fibroblasten im Inneren der Fibrinpasten zwischen einem Bereich von 10³ und 5 × 10⁶ waren. In Abwesenheit von Antiproteasen (z.B. Trasylol, Aprotinin) im Kulturmedium wurden die Pasten schnell verdaut, wenn sie mitotische Fibroblasten enthielten. In Gegenwart postmitotischer Fibroblasten war der Verdauungsprozess nicht ersichtlich
BEISPIEL 5: In-vivo-Test der Zellpaste
Das In-vivo-Modell der akuten Wundheilung wurden gemäß Raffoul et al. Eur. J. Plast. Surg. (1993) 16: 180–85 durchgeführt. Nach mehrtägiger Akklimatisierung wurde ein quadratischer Ausschnitt mit 3 cm Länge (entsprechend 9 cm²) von Rückenhaut vorgenommen. Fünf Ratten für jede der nachstehenden experimentellen Gruppen wurden durch Aufbringen der angegebenen Zellpaste getestet. Die wunden wurden nach dem Aufbringen unbedeckt gelassen.
Experimente zur akuten Wundheilung wurden auf dem Rücken haarloser Ratten durchgeführt. Die folgenden Gruppen wurden getestet:

1. nur TissuCol (Kontrolle)
2. TissuCol + Ratten-CRL-Fibroblasten (postmitotisch)
3. TissuCol + humane primäre EDX-1-Fibroblasten (postmitotisch)

Es wurden fünf Ratten pro experimenteller Gruppe verwendet. Das Voranschreiten des Heilungsprozesses wurde anhand der Wunderscheinung und durch tägliches Messen der Wundfläche und Vergleichen von % Verschluss mit der ursprünglichen Wundengröße bestimmt. Digitale Fotografien der Wunden wurden ebenfalls aufgenommen. Das Experiment wurde beendet, wenn die erste Gruppe von Ratten vollständig verhielt war. Die Wunde wurde dann ausgeschnitten und das Material für die herkömmliche Histologie verarbeitet. Die histologische Analyse untersuchte Unterschiede in der Dicke des Granulationsgewebes, z.B. Zellularität, Vaskularisierung und Reepithelialisierung. Ein hauptsächlicher Endpunkt für die Bewertung war die Menge an Ganulationsgewebe, die unter Verwendung von herkömmlicher Histologie untersucht wurde. Alle drei Bedingungen führten zur Bildung von Granulationsgewebe und heilten die Wunden ohne Hinweis auf jegliche nachteiligen Ereignisse.
BEISPIEL 6: Wachstumfaktorproduktion in Co-Kulturen von differenzierten Fibroblasten und Keratinozyten, die in TissuCol suspendiert waren, in vitro
Das Ziel der vorliegenden Studie war zu zeigen, dass postmitotische humane Fibroblasten, postmitotische Keratinozyten oder die Kombination von beiden Wachstumsfaktoren sezernier(t/en), wenn sie in Fibrin (TissuCol – Baxter) eingebettet ist/sind.
Humane Fibroblasten (Passage 8 bis 12) wurden aus der kryogenen Aufbewahrung rückgewonnen, in Kulturmedium (DMEM mit 10% fötalem Kälberserum) gewaschen, in 15 ml Kulturmedium pro T75-Kolben plattiert und kultiviert, bis sie 80% Zellkonfluenz erreichten. Dann wurden die Zellen durch Behandlung mit 8 μg/ml Mitomycin C (Sigma, MMC) während 5 Stunden postmitotisch gemacht. Haus eingefrorenen Gefäßen rückgewonnene humane Keratinozyten wurden in T25-Kolben in KGM (Clonetics Corp.) oder Keratinozyten-definiertem SFM (Life Technologies) plattiert.
Keratinozyten wurden auf zwei verschiedene Weisen hergestellt: (1) präkonfluente Keratinozyten: Keratinozyten wurden in Kulturmedium, wie vorstehend definiert, gezüchtet, bis sie eine Konfluenz von 80% erreichten. Dann wurden die Zellen durch Behandlung mit MMC postmitotisch gemacht (siehe oben), (2) postkonfluente Keratinozyten: wurden 3 Tage im postkonfluenten Zustand in Kulturmedium gezüchtet. Dann durch die Zellen durch Behandlung mit MMC postmitotisch gemacht (siehe oben). Nach der Mitomycin-C-Behandlung wurden die Zellen gewaschen und trypsinisiert, wodurch eine Einzelzellsuspension erzeugt wurde. Eine Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml wurde in die Fibrinogenlösung eingemischt. Zur Herstellung der Fibrinpaste ließ man sowohl Spritzen, die das Fibrinogen enthielten, als auch Spritzen, die das Thrombin enthielten (1–500 U/ml), bei RT auftauen. Das Fibrinogen (1 ml) wurde direkt in ein 15-ml-Röhrchen überführt, das 1 ml PBS ohne Ca/Mg (bei 4°C aufbewahrt) enthielt, dann mit 6 ml PBS ohne Ca/Mg weiter verdünnt, was an diesem Punkt eine Verdünnung von 1:8 darstellte. Das Thrombin (1 ml) wurde mit PBS ohne Ca/Mg (1:5) verdünnt.
Postmitotische Fibroblasten oder Keratinozyten wurden mit Trypsin von den Kulturschalen losgelöst. Zur Herstellung einer Paste in einer Vertiefung einer 12-Multiwell-Schale wurden 0,2 ml einer Zellsuspension, die 5 × 10⁶ Zellen/ml enthielt, pipettiert, und 0,05 ml verdünntes Thrombin (1:5) wurde zu der Zellsuspension gegeben. Schließlich wurden 0,25 ml 1:8 verdünntes Fibrinogen in jede Vertiefung pipettiert, und die Platten wurden leicht geschüttelt. Nach 10 min war die Paste verfestigt, und 1 ml Medium wurde auf die Pasten gegeben.
Die verwendeten Medien waren: (1) DMEM + 2% humanes AB-Serum (PAA); (2) KDM (BioWhittaker) mit/ohne BPE, FGF2. Nach 3-tägiger Kultur wurden die Medienüberstände geerntet, und die Pasten wurden bei –80°C eingefroren. Zur Untersuchung der von den Zellen sezernierten Wachstumsfaktoren: wurden die Überstände von geernteten Medien oder extrahierter Paste aufgetaut und unter Verwendung eines ELISA-Verfahrens (R & D Systems) analysiert: FGF2, FGF7, VEGF, TGF-beta, GM-CSF.
Die Ergebnisse, die die Sekretion von Wachstumsfaktoren aus dem Zell/Fibrin-Pastengemisch zeigen, sind in 1 dargestellt.
Zellen wurden innerhalb der Fibrinpaste wie vorstehend beschrieben gezüchtet. Nach 3-tägiger Kultur wurden der Überstand und der Fibrinpastenextrakt hinsichtlich der Wachstumsfaktorproduktion untersucht. Kontrollmedium und Fibrin ohne Zellen enthielt keinerlei Wachstumsfaktoren. Nur Fibroblasten sezernierten hauptsächlich KGF und VEGF in das Medium, außerdem lag bFGF in großer Menge im Fibrinpastenextrakt vor (1000 pg/ml (10⁶ Zellen). Nur Keratinozyten sezernierten hauptsächlich GM-CSF in das Medium. Die Kombination von Fibroblasten und Keratinozyten sezernierte die von jedem Zelltyp separat produzierten Wachstumsfaktoren gewöhnlich in größeren Mengen. Eine synergistische Wirkung wurde für die Sekretion von GM-CSF in das Medium, wie in 3 gezeigt, und in den Extrakten der Zellen und der Fibrinpaste, wie in 4 gezeigt, beobachtet.
Die Wirkung der Keratinozytenkonfluenz auf die Sekretion von GM-CSF ist in 4 dargestellt.
Keratinozyten wurden in Kulturschalen gezüchtet, wie zuvor beschrieben. Sie wurden auf zwei verschiedenen Stadien der Kultur geerntet; (1) Präkonfluenz (Präkonf), bevor die Zellen den Boden der Schale vollständig bedeckten (2) Postkonfluenz (Postkopf) 3 Tage, nachdem die Zellen den Boden der Kulturschale bedeckt haben. Die aus diesen 2 Kulturen erhaltene Suspension von Keratinozyten wurde dann in die Fibrinpaste eingebracht und 3 Tage gezüchtet. Medium und Paste wurden wie vorstehend beschrieben analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass höhere Spiegel von GM-CSF sezerniert werden, wenn die Keratinozyten geerntet werden, bevor sie Konfluenz erreichen.
Schließlich kann bei einer Ausführungsform der Erfindung die Fähigkeit von Keratinozyten und Fibroblasten, die durch Anhalten des Wachstums in Mitomycin C postmitotisch gemacht wurden, zu einer weiteren Differenzierung der Zellen führen. Diese durch Wachstum beeinflusste Differenzierung kann zu einer erhöhten Sekretion von Wachstumsfaktoren und Cytokinen führen, wie in 5 dargestellt.

Claims

Zellpaste für die Geweberegeneration umfassend: a) Zellen, die ein biologisch aktives Molekül oder mehrere biologisch aktive Moleküle sezernieren, wobei die Zellen vermischt sind mit oder aufgebracht werden auf b) eine extrazelluläre Matrix oder Matrixmaterial derart, dass die Vermischung eine viskose Zellpaste bildet, wobei die Zellen allogen oder mitotisch inaktiviert sind und Keratinozyten und einen oder mehrere Fibroblasten umfassen.
Zellpaste nach Anspruch 1, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten differenzierte Fibroblasten und Keratinozyten sind.
Zellpaste nach Anspruch 1, wobei das biologisch aktive Molekül oder mehrere biologisch aktive Moleküle einen angiogenen Faktor, einen Wachstums-/Zytokinfaktor oder eine Kombination von mindestens einem angiogenen Faktor und mindestens einem Wachstums-/Zytokinfaktor umfassen.
Zellpaste nach Anspruch 1, wobei die extrazelluläre Matrix oder das Matrixmaterial ausgewählt ist unter Fibrin, Fibrinkleber, Blutplasma, Fibrinkugeln und anderen synthetischen Polymergerüsten oder Wundabdeckungsmaterialien.
Zellpaste nach Anspruch 1, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten mitotisch inaktiviert sind durch die Zugabe von Mitomycin C oder anderen chemischbasierten mitotischen Inhibitoren, Bestrahlung mit γ-Strahlen, Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Bestrahlung mit UV-Licht.
Zellpaste nach Anspruch 1, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten immortalisiert sind durch die Verwendung von mindestens einem Gen/Polypeptid ausgewählt unter 12S und 13S Produkten der Adenovirus EIA-Gene, hTERT, SV40 small T-Antigen, SV40 large T-Antigen, Papillomaviren E6 und E7, Epstein-Barr Virus (EBV), Epstein-Barr nukleäres Antigen-2 (EBNA2), humanem T-Zell-Leukämievirus-1 (HTLV-1), HTLV-1 tax, Herpesvirus saimiri (HVS), Mutant p53, myc, c-jun, c-ras, c-Ha-ras, h-ras, v-src, c-fgr, myb, c-myc, n-myc und Mdm2.
Zellpaste nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten natürlicherweise ein biologisch aktives Molekül oder mehrere biologisch aktive Moleküle sezernieren.
Zellpaste nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten gentechnisch verändert sind, um das biologisch aktive Molekül oder mehrere biologisch aktive Moleküle zu sezernieren.
Zellpaste nach Anspruch 8, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten gentechnisch verändert sind, um eine exogene Konzentration von mindestens einem angiogenen Faktor und/oder mindestens einem Wachstums-/Zytokinfaktor zu sezernieren.
Zellpaste nach Anspruch 9, wobei die Sekretion mindestens eines angiogenen Faktors und/oder mindestens eines Wachstums-/Zytokinfaktors durch Genswitching kontrolliert ist.
Zellpaste nach Anspruch 9, wobei der angiogene Faktor und/oder der Wachstums-/Zytokinfaktor konstitutiv sezerniert werden.
Verwendung der Zellpaste nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments für die Geweberegeneration.
Verwendung der Zellpaste nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Gewebedefekts oder einer Wunde.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Medikament für die lokale Verabreichung an einem Wundort auf dem Patienten dient, und wenn es so verabreicht wird, temporär die Geweberegeneration durch biologische Interaktion mit dem umgebenden Gewebe induziert.
Verfahren zur Herstellung einer Zellpaste für die Geweberegeneration, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellung einer ersten Zusammensetzung umfassend eine Zelle oder mehrere Zellen, welche ein biologisch aktives Molekül oder mehrere biologisch aktive Moleküle sezerniert/sezernieren, wobei die Zellen allogen und mitotisch inaktiviert und mit Thrombin vermischt sind, und b) Kombination der Zusammensetzung mit einer zweiten Zusammensetzung umfassend eine extrazelluläre Matrix oder Matrixmaterial enthaltend Fibrinogen, wobei die Zellen Keratinozyten und einen oder mehrere Fibroblasten umfassen und die Kombination der ersten und zweiten Zusammensetzung eine viskose Zellpaste bildet, die für die Geweberegeneration geeignet ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten differenzierte Fibroblasten und Keratinozyten sind.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die biologisch aktiven Moleküle einen angiogenen Faktor, einen Wachstums-/Zytokinfaktor oder eine Kombination von mindestens einem angiogenen Faktor und mindestens einem Wachstums-/Zytokinfaktor umfassen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten mitotisch inaktiviert sind durch Zugabe von Mitomycin C oder anderen chemisch-basierten Inhibitoren, durch Bestrahlung mit γ-Strahlen, Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Bestrahlung mit UV-Licht.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten immortalisiert sind unter Verwendung mindestens eines Gens/Polypeptids ausgewählt unter 12S und 13S Produkten der Adenovirus EIA-Gene, hTERT, SV40 small T-Antigen, SV40 large T-Antigen, Papillomaviren E6 und E7, Epstein-Barr Virus (EBV), Epstein-Barr nukleäres Antigen-2 (EBNA2), humanem T-Zell-Leukämie-Virus-1 (HTLV-1), HTLV-1 tax, Herpesvirus saimiri (HVS), Mutant p53, myc, c-jun, c-ras, c-Ha-ras, h-ras, v-src, c-fgr, myb, c-myc, n-myc und Mdm2.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten natürlicherweise das biologisch aktive Molekül oder mehrere biologisch aktive Moleküle sezernieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten gentechnisch verändert sind, um das biologisch aktive Molekül oder mehrere biologisch aktive Moleküle zu sezernieren.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Keratinozyten und Fibroblasten gentechnisch verändert sind, um eine exogene Konzentration von mindestens einem angiogenen Faktor und/oder mindestens einem Wachstums-/Zytokinfaktor zu sezernieren.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Sekretion von mindestens einem angiogenen Faktor und/oder mindestens einem Wachstums-/Zytokinfaktor durch Genswitching kontrolliert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der angiogene Faktor und/oder der Wachstums-/Zytokinfaktor konstitutiv sezerniert werden.