CN101605566A - 生物聚合物上的培养黑素细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及移植物，其中，利用生物聚合物来递送培养的自体黑素细胞。本发明描述了其组合物、制备方法及与安全性和功效相关的性能。本发明的移植物在皮肤重新色素沉着方面具有潜在的用途。

Description

生物聚合物上的培养黑素细胞
与相关专利申请的交叉参考
本申请要求印度临时申请第1697/MUM/2006号(2006年10月13号提交)的权益，其公开的全部内容在此引作参考。
发明领域
本发明涉及合适载体系统上的皮肤黑素细胞递送系统及其制备方法。在一个实施方案中，本发明涉及自体黑素细胞的移植物、其制备方法、运输至医院和它们的治疗(包括白癜风)应用。
发明背景
皮肤及黑素细胞的生理作用
皮肤是机体最大的器官，由被称为表皮的外部上皮组成，通过基底膜与下面的结缔组织(真皮)分开。邻近表皮的真皮部分被称为网状真皮，主要由成纤维细胞产生的胶原纤维、微血管和少数迁移白细胞组成。网状真皮为没有血管的表皮提供所有的营养。表皮中的绝大多数细胞是呈分层排列的角质形成细胞。在真皮表皮交界处是基底层，它是带有少量分散黑素细胞的单层角质形成细胞(每30个角质形成细胞有约1个黑素细胞)，这些黑素细胞通过其发出的树突向附近的角质形成细胞提供黑色素。皮肤颜色决定于不同黑色素类型的绝对量和相对量，其中两种主要的黑色素形式是真黑素(eumelanin)和褐黑素(pheomelanin)。它们受黑皮素(melanocortin)1受体(MC1R)的调节。不同MC1R序列与不同皮肤颜色相关联。黑素细胞刺激激素(MSH)与MC1R的结合导致真黑素的形成，而野灰蛋白(agoutiprotein)与MC1R结合则导致褐黑素的产生。因暴露于紫外线而造成的皮肤晒黑代表了表皮内真黑素含量的增加，其主要目的是增加光保护。这些可以由于黑素细胞数量或其活性的改变所致。
色素沉着症
色素沉着过低和色素沉着过多疾病可因黑素细胞数量改变或者黑素细胞活性减少或增加所致。最常见的色素沉着疾病之一是黄褐斑(melasma)。接触阳光对色素沉着的诱导和维持起着十分重要的作用。如果没有防护，紫外线辐射则可导致细胞的遗传编码或DNA突变。这可以显著改变细胞功能，从而导致与红斑痤疮、皮肤老化、免疫功能损害和癌症相关联的改变。
此外，由红斑痤疮、激光疗法或紫外线暴露导致的炎症可能会影响黑素细胞的功能，从而导致黑色素或色素产量的不正常增加。这可能在视觉上表现为雀斑、不均匀片状着色或日光斑(通常称为老人斑)。医学研究一直重点关注调节黑色素的方法，以控制黑色素的异常产生并解决色素沉着过多病变的表现。
与色素沉着过低相关联的疾病包括例如：(a)白斑病，往往与皮肤炎症性疾病如特应性皮炎相关联；和(b)白癜风。
白癜风
白癜风(vit-ill-eye-go)，也被称为白斑病，是一种色素沉着疾病，其患者皮肤、嘴和鼻子及生殖器官和直肠区(粘膜)内部的组织、以及眼部视网膜中的黑素细胞都被摧毁。其结果是，在机体不同部位的皮肤上出现白斑。生长在受白癜风影响区域的毛发可能变白。
白癜风的影响，在印度为大约每100人中有1人，在美国为大约2000人中有1人。约1％至2％的世界人口即4千万至5千万人有白癜风。全世界所有地区都有发现白癜风。白癜风影响所有种族群体，但对深色皮肤的人群更为不利。这种疾病对男性和女性的影响是同样的。通常的发病年龄是10至30岁，但其病症可以开始于任何年龄。百分之九十五的患有白癜风的人在40周岁之前发病。由白癜风引起的外貌变化可以影响一个人的情感和心理福祉，并可能造成获得或维持工作的困难。有这种疾病的人可能经历情感压力，特别是当白癜风发生在机体的可见区域，如面部、手、手臂、脚或生殖器时。青少年往往特别关注其外貌，他们可能被大范围的白癜风所摧残。有些患有白癜风的人会感觉窘迫、羞愧、沮丧或担心别人会作何反应。
白癜风的治疗目标是恢复皮肤的功能，并改善患者的外貌。目前治疗白癜风往往需要很长的时间，例如，6至18个月。治疗法的选择取决于白斑的数目和它们如何扩散，以及患者对治疗的偏好。
白癜风的发病机理
到目前为止，已经有三个重要的假说来解释白癜风的发病机理。自身免疫假说是源于白癜风与某些自身免疫病相关联这一观察结果。已证明细胞和体液因素二者均造成对黑素细胞的自身免疫破坏。该自身细胞毒性或自我毁灭假说认为，黑色素生物合成过程中产生的某些毒性分子是造成易感个体黑素细胞损害的原因。神经假说假定，从神经末梢释放的神经化学物对黑素细胞是有毒的。有些人报告，晒伤或情绪困扰可能引发白癜风。可能有多种机制导致白癜风。
可用的治疗方法
对于白癜风，没有普遍有效的医药或手术治疗方法；虽然已知有一些办法是有效的。除了在本文后面列出的这些医药和手术治疗方法，人们还必须始终牢记辅助疗法，如用广谱防晒霜以防止白癜风皮肤的光损伤，和通过对白癜风暴露区域的着色或化装对被毁损皮肤进行美容掩饰。
尽管有若干抑制黑色素合成的外用药物，但研究人员关注于直接控制酪氨酸酶产量的突破，以更好地控制色素的变化。协助提高细胞更新率和表皮细胞正常化的外用皮肤护理制剂也可以减少异常色素沉着区的外观，因为新细胞似乎含有较少色素颗粒。然而，已有初步调查报道，用含有异丙肌苷(isoprinosine)、左旋咪唑(levamisole)、甲磺司特(suplatast tosilate)、环孢霉素(cyclosporine)的外用皮肤护理制剂，可使白癜风病变产生重新色素沉着，所有上述药物都是免疫抑制剂/免疫调节剂。
医药治疗
外用类固醇治疗对于皮肤的重新着色(将颜色重转回白斑)是有帮助的，特别是当在疾病早期就开始使用时。在看到任何结果前，患者需要在他们皮肤白斑上施用类固醇外用乳膏至少3个月。医生还不得不密切监测副作用的危险，如皮肤萎缩和皮肤裂纹(皮肤上的条斑或线条)。补骨脂素(psoralen)UVA光化学疗法(PUVA)涉及口服或外用补骨脂素，然后小心地定时接触太阳光或由特殊灯发出的紫外线A(UVA)光。患者通常在医生办公室接受治疗，以便能够被仔细观察任何副作用。患者在其它时间必须尽量减少接触太阳光。然而，该方法耗费时间而且必须注意避免副作用，副作用有时可能严重。补骨脂素是含有能与紫外光反应造成皮肤变黑的化学品的药物。外用PUVA疗法主要有两大潜在副作用：(1)严重灼伤和起泡，和(2)经治疗斑块或白癜风周围正常皮肤重新色素沉着过度或变暗(过色素沉着)。口服补骨脂素的其它已知副作用包括恶心和呕吐、瘙痒、毛发生长异常和皮肤癌风险增加。
脱色涉及对机体的其余皮肤进行褪色，以与已有的白区相匹配，更常用于有大范围白癜风的人。患者在色素区一天两次施用氢醌的单苄基醚药物(莫诺苯宗(monobenzone)或Benoquin)，直到色素区与脱色区相匹配。患者在施用药物后至少2个小时，必须避免与其他人直接的皮肤对皮肤接触。脱色疗法的主要副作用是皮肤炎症(发红和肿胀)。患者也可能会经历发痒、皮肤干燥或覆盖眼白的膜异常变暗。脱色是永久性的，并且无法逆转。此外，经受脱色治疗的人总是对太阳光异常敏感。
手术治疗
已报告了一些治疗脱色皮肤的外科手术对用医药治疗难以取得良好效果的患者有效。手术治疗方法包括皮肤移植。在皮肤移植时，医生移除部分正常的、具色素皮肤(供体部位)，将它们放置到脱色区(受体部位)。手术方法包括：
1.采用热、负压或冷冻处理在患者的正常色素皮肤处制作负压水泡移植物(Sunction Blister graft)。然后切出水泡顶部，移植到脱色皮肤区。水泡移植的风险包括发展为卵石外观、瘢痕以及缺乏重新色素沉着。可是，在瘢痕形成方面，该方法比其他类型的移植的风险更低。
2.穿孔移植物(punch graft)已被用来取代脱色皮肤。穿孔移植物是利用市售打孔机从患者移除的小块正常皮肤。在磨去白癜风皮肤后，将这些移植物放置在该区域上以诱导色素沉着。该技术虽然有效，但会导致卵石外观和瘢痕形成。
3.纹身(tattooing)很适合唇部，特别是皮肤黝黑的人；可是，医生很难使该区域与其周边皮肤的颜色完全匹配。纹身往往随着时间的推移褪色。此外，唇部纹身可能导致单纯疱疹病毒所引起的疱疹疫情。
其它方法
已有若干专利和专利申请提出了治疗白癜风的其他方法，其中包括美国专利号4,866,038、5,700,450、6,039,972、6,660,305和6,673,603，美国公开专利申请号2001/0006813和2002/0106353，和PCT公开说明书WO2004096981A2和WO2005011676A1。其中一些文献提出用于刺激黑色素和/或黑素细胞产生的组合物。另一些文献提出直接注射黑色素到皮肤。其他文献关注于运送细胞的工具。例如，包含角质形成细胞和成纤维细胞的细胞糊剂；用载体基质(如纤维蛋白胶)运送的培养的黑素细胞和角质形成细胞；或用专门的适配器械运送细胞悬液。另一个描述了包含锚定在疏水性合成高分子薄膜上哺乳动物细胞的伤口敷剂。和这些伤口敷剂一起，薄膜被施用于皮肤，细胞需要穿过孔洞迁移。这类运送方式导致只有较少细胞直接与皮肤接触，薄膜多孔性的效率对于细胞迁移很重要。另一份文献提出了一种增加色素沉着的方法，包括将皮肤移植物植入在白癜风斑上，所述皮肤移植物包含通过与有效量甘油二酯接触而被激活的黑素细胞。在该方法中，待用于移植的供体皮肤面积取决于需要被皮肤移植覆盖的脱色皮肤面积，即，为了覆盖大面积的脱色皮肤，需要更大面积的供体皮肤。其它技术包括纯黑素细胞培养物以及黑素细胞和角质形成细胞共培养物。这些技术对局部病灶是有利的。
现在，培养人黑素细胞的最新发展使得能够将从正常皮肤颜色区获得的自体黑素细胞移植到脱色皮肤区。在直接移植黑素细胞程序中，获取患者正常色素皮肤的样本并进行酶促解离。然后，将所得的既有角质形成细胞又有黑素细胞的细胞悬液直接添加到已清创的脱色区。
这些方法的缺点包括：
(a)细胞数量的确定：由于所产生的细胞悬液中包含所有类型的表皮皮肤细胞，因而被施用到脱色部位的黑素细胞的确切数量是不清楚的。
(b)将细胞保留在脱色部位：因为细胞被喷涂或浇注在脱色区上，所以在接下来施用敷剂后这些细胞可能会消失。因此，存留在清创区的细胞数目是不清楚的。
(c)覆盖范围：如果获取的起始活组织切片小于脱色区，则施用到脱色部位的黑素细胞数量将不足以产生令人满意的色素沉着水平。
通过开发体外培养黑素细胞的方法可以克服上述的一些缺点。在黑素细胞于培养皿中增殖后，将细胞从培养皿中分离并移植到患者的清创脱色皮肤斑处。迄今，对黑素细胞移植的所有研究已经在医院或者在附属于研究中心的医学中心进行，并包括将黑素细胞悬浮液递送到皮肤。这种递送方法效率低，细胞不能被正确地递送到创面(wound bed)或被治疗皮肤处施用的纱布所捕获。虽然对发病机理的理解和对白癜风的治疗有了很大进展，但许多市售制品都只是或多或少地有效，并且很少能达到外观均匀的肌肤色调。
基于对时间的要求，本发明提供了新的系统，其可以克服现有细胞递送系统的缺陷，递送功能性黑素细胞到白癜风区，诱导重新色素沉着。本发明提供用于移植的功能性黑素细胞移植物，它可以从集中式(centralized)生产或加工中心被运送给位于不同地方的医生或医院。根据本发明开发的黑素细胞意欲用于递送到皮肤的白癜风部位以诱导重新色素沉着。以往的研究都是在附属研究中心的医院进行。
迄今为止，由于无法安全而可靠地跨距离运送黑素细胞培养物，所以尚不能进行远程的黑素细胞移植。本发明提供预先包装的“现成”组合物的优势，所述组合物可直接从制造机构运送给医院或医生，而不是依赖于医院、附近的研究中心或医生来组装或制备组合物，这可大大降低成本并提高效率和易用性。
因此，仍然需要有一个能够使细胞在集中式机构中加工并运送给各医院的系统。在运送过程中保存细胞的活力是成功移植的关键。本发明的发明人已经开发出一种关注于活组织切片运送的系统：黑素细胞培养物，其在生物聚合物上运输和递送。本发明的递送系统以促进黑素细胞迁移并定植于皮肤的方式提供细胞到脱色皮肤，导致重新色素沉着。
本发明成功地创造了这样一种系统，其将大大降低成本和提高治疗的易用性，患者因此而受益。
并指出，采用由本发明开发的、附带角质形成细胞的自体体外培养黑素细胞移植物，能够实现具有良好愈合的色素沉着，从而减轻色素减退(hypopigmented)病症，如白癜风。在共培养系统中角质形成细胞的存在有助于加快伤口闭合。
发明概述
本公开内容涉及移植物，其包含在透明生物相容性膜上培养的增殖性黑素细胞。通过将膜倒置，将这些细胞直接递送到脱色部位，使细胞与清创位点相对。在一个实施方案中，在移植前的运送条件下，本发明移植物中黑素细胞的活力可以保持至少96小时。本发明可用于治疗色素减退(hypopigmention)疾病如白癜风、白斑病，也可用于高色素沉着(hyperpigmention)病症，如痣。与色素减退部位相似，可对高色素沉着区进行清创。这将导致移除负责非常暗的色素沉着的高活性黑素细胞。在该部位移植正常的黑素细胞将有助于正常的色素沉着。
在一个实施方案中，本发明包括能够诱导皮肤中色素沉着的移植组合物，其包含来源于自体表皮的黑素细胞和生物聚合物膜，其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少75％的细胞保持活力至少72小时。在相关实施方案中，5-37℃的运送条件下，组合物中至少80％的细胞保持活力至少96小时。
在另外的实施方案中，黑素细胞组合物进一步含有角质形成细胞。在一些实施方案中，黑素细胞与角质形成细胞的比率为0.8∶2到1∶1。
在本发明的移植物中，细胞可以是单层的。在一些实施方案中，单层是至少25％、至少50％、至少70％、至少90％以及100％融合的(即从半融合到融合)。
在一个实施方案中，本发明的黑素细胞能够进一步增殖。在相关实施方案中，移植物中至少90％的黑素细胞是活跃增殖性黑素细胞。
本发明的细胞生长于生物相容聚合物(生物聚合物)膜上。合适的生物相容膜包括可生物降解的、天然生物相容性的和合成的生物相容性膜。在一些实施方案中，该生物聚合物膜选自：聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及分子量至少为50,000Da的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)。
因此，在相关实施方案中，本发明包括组合物，其包含亚融合单层黑素细胞(可选地与角质形成细胞共培养)和生物聚合物膜，其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少75％细胞保持活力至少72小时。
本发明的组合物适于治疗色素减退的皮肤疾患。因此，一方面，有足够数量的黑素细胞，以使所产生的组合物对皮肤色素减退症具有治疗效果。
本发明还包括制备适用于治疗色素减退症的、生物聚合物膜上的黑素细胞组合物的方法。一方面，该方法包括：
a)从自体表皮中分离黑素细胞；
b)制备含分离黑素细胞的细胞悬浮液；
c)扩增黑素细胞；
d)可选择地，冷冻保存黑素细胞细胞；
e)可选择地，解冻黑素细胞；
f)将黑素细胞接种到生物聚合物膜上；
g)将生物聚合物膜上的细胞扩增为亚融合单层；和
h)用含运送培养基的运送设备运送该生物聚合物膜；
其中，在运送条件下，组合物中至少75％细胞能保持活力至少72小时。
在相关实施方案中，生物聚合物膜包括聚乳酸(PLA)(以PLDA形式)，黑素细胞以1×104至1×105细胞/cm2的细胞浓度接种到生物聚合物膜上。在进一步实施方案中，运送设备包括聚碳酸酯。在另外的实施方案中，运送培养基包含二氧化碳富集的培养基。在一个实施方案中，运送培养基是KSFN培养基。
本发明还提供了对需要皮肤色素沉着的个体的治疗方法。在一个实施方案中，该个体是人。在进一步的实施方案中，该个体受到色素减退症(如白斑病或白癜风)侵袭。在相关实施方案中，该方法包括施用移植组合物，所述组合物能够诱导皮肤中色素沉着，并且包含来源于自体表皮的黑素细胞和生物聚合物膜，其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少75％细胞能保持活力至少72小时。在相关实施方案中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少80％细胞能保持活力至少96小时；其中，组合物增强该个体皮肤中的表皮再生率。因此，本发明提供了治疗受治疗者白癜风的方法，包括使用生物聚合物膜作为递送系统，并将亚融合单层黑素细胞递送到皮肤。
在其它实施方案中，本发明提供用于治疗白癜风的药盒，其中，该药盒包含：(1)组合物，其包含(a)亚融合单层黑素细胞和(b)生物聚合物膜，其中，单层黑素细胞位于生物聚合物膜上；和(2)运送设备，
其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少75％的黑素细胞能保持活力至少72小时。
附图简述
下列附图是本说明书的部分，包括这些附图以进一步证明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，并结合本文对具体实施方案的详细说明，可更好地理解本发明。
图1：图解本发明的活性(interactive)生物聚合物移植物，其包含PLA片层(sheet)上的培养黑素细胞。
图2：图示说明本发明创面覆盖物的运送容器。运送容器的设计已注册，印度设计专利号为198591，在此引作参考。
图3：图示说明细胞支原体检验的比较结果。如图所示，3A：支原体阳性对照；3B：培养的黑素细胞，显示没有支原体。
图4：图示说明用MEL-5抗体染色法测试黑素细胞的细胞身份，其中，黑素细胞被确定为绿色细胞。细胞核用DAPI染色。
图5：图示说明用PCR技术分析的黑素细胞中MART-1基因表达。
图6：图示说明通过DOPA染色检测的培养黑素细胞的功能性。
图7：图示说明黑素细胞从PLA片层向创伤覆盖面的迁移，通过创伤面红色荧光标记细胞的存在来指示。
图8：表1.体外致瘤性测定的结果，表明培养黑素细胞对于移植的安全性。
图9：图示说明在运送条件下黑素细胞的活力。
图10：在相差显微镜下黑素细胞加上角质形成细胞的共培养物。
图11：通过角蛋白染色法鉴定角质形成细胞。
图12：用PCR鉴定角质形成细胞中MHC-II(HLA-DR)的表达，以防使用异源性角质形成细胞。
图13：体外致瘤性测定的结果，表明培养角质形成细胞对于移植的安全性。
本发明实施方案的详细说明
本发明提供了组合物和递送系统，其包含位于生物相容性支持材料(如聚乳酸)上的活跃生长性表皮细胞(如黑素细胞，或黑素细胞-角质形成细胞混合物)的培养移植物，，该组合物和递送系统适于从集中加工中心被运送到其它位于不同地点医院进行移植。
在一个实施方案中，制备移植物的方法涉及对接种细胞用的支架的优化。支架可以选自天然材料(如胶原蛋白和纤维蛋白)或合成材料(如用于外科缝合的可降解聚酯)。支架采取的形式可从海绵状片层和织物到凝胶到用新材料加工技术制造的带有复杂孔和管道的高度复合结构。支架的空间和组成性质、支架的孔隙度和孔的互连性都要求能允许细胞渗透到支架中，以及允许养分和废物产物转运。
在另一实施方案中，构成分化角质形成细胞培养方法一部分的黑素细胞以4-5层厚的组织形式递送，然后可以通过酶解脱离培养皿，并在清创后被移植到脱色区。
在某些实施方案中，黑素细胞可以在培养容器中直接培养于送送膜上，然后在需要使用时剥离。
在本发明的另一实施方案中，生物聚合物上的体外培养黑素细胞移植物包括对移植细胞的基因修饰以改善色素沉着。
生物相容性聚合物可以是天然的或合成的。一般情况下，合成聚合物比天然材料具备更大优势，因为与天然来源的物质比较，它们能够提供更广泛的性能和更可预见的批量间均匀性。合成聚合物还代表了更可靠的原料来源，没有普遍关注的免疫原性和感染力。聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚氨酯是本发明优选的一些生物相容性聚合物。这些聚合物的优点是，在达到其预期目的后，不需要手术切除它们。基于其独特性能，包括通用降解动力学、非毒性和生物相容性，这些聚合物已经在药学和生物医学有广泛的应用。PGA是高度结晶聚合物，是它们中亲水性最强的。PGA有非常高的熔点(224℃至226℃)，其降解率比PLA高得多。由不同比率的乳酸(LA)和乙醇酸(GA)组成的随机PLGA共聚物表现出不同的降解率，从而可以定制用于需要从数周到数月的特殊降解动力学的具体应用。它们通常比其均聚物更具无定形性，在两种单体含量相同时最容易被水解。聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)是已被核准临床使用的为数不多的合成可降解性聚合物，在组织发育方面已被广泛研究。
嵌段聚氨酯弹性体由于其优异的机械性能和巨大的化学多功能性，已被广泛用作生物材料。致力于开发生物医学聚氨酯的研究主要侧重于长期应用，如血管移植物和起搏器电极绝缘体(pacemakerlead insulator)。聚氨酯聚合物以若干不同的形式并在大范围被应用，无论是生物医学领域和其它等等。该材料通过浇注或其他成型技术制作而形成了基片(substrate)，可与其它基片一起或联合应用以形成均质的多层材料。可形成这种多层均质聚氨酯材料，各层有不同程度的可降解性。
影响生物可降解性聚合物机械性能的因素包括单体的选择、起始物的选择、工艺条件以及添加剂的存在。这些因素进而又影响到聚合物的亲水性、结晶度、熔点和玻璃化转变温度、分子量、分子量分布、端基、序列分布(随机对块状)以及残余单体或添加剂的存在。此外，从事生物可降解材料的高分子科学家必须评估这些变量中每一个对生物可降解性的影响。虽然对这些聚合物特性已有充分理解，但它们仅用来提供细胞可附着于其上但不与细胞相互作用的三维生物相容性结构。在机体中，细胞位于胞外基质(ECM)内，后者为组织提供适当的架构以及影响细胞关键功能(如迁移、增殖和分化)的信号途径。研究继续关注于利用基质分子与特定的生长因子以优化细胞对支架的附着和直接细胞活性。
本递送系统上的培养黑素细胞避免了现有的黑素细胞递送系统所面临的缺陷。
其上培养和转移有皮肤细胞的本发明聚合物的应用提高了在细胞培养及其移植过程中移植物处理的容易性。用于本发明的聚合物是透明的，允许在细胞培养过程中对细胞的显微观察以及将其施用于脱色皮肤后可显现下面的皮肤。
在一个实施方案中，本公开内容提供了用于治疗脱色性皮肤的人表皮黑素细胞的培养和转移。本发明目的是使用生物相容性聚合物，这种使用代替了其已报告性能。设想用于本发明中的、用于伤口愈合或伤口护理组合物的生物可降解性聚合物包括聚酯、聚(氨基酸)、聚酯酰胺、聚氨酯或它们的共聚物。此外，选自PLA、PGLA和聚氨酯的聚合物片层具有以下优点：在培养和施用到伤口面上的过程中易于处理，以及其能紧贴伤口轮廓。PLA、PGA、PGLA和聚氨酯的片层是透明的，允许在培养过程中以及将其施用于伤口后色素沉着过程中细胞的可视性。此外，它拥有的屏障性能，防止伤口的微生物污染。
本发明提供由生物相容性、生物可降解性聚合物如PLA制造的片层作为黑色素的递送系统的应用，以及使用该系统作为工具将增殖性黑素细胞递送给脱色皮肤的能力。
在一个实施方案中，本发明的伤口覆盖物主要包含PLA片层上的培养黑素细胞(图1)，其在一个特别设计的容器中(图2)。PLA粗品利用双交酯(dilactide)通过催化反应来制备，并通过重新溶解在溶剂(如丙酮、氯仿)中然后再用水重新沉淀而纯化。在这一过程中，未转化的双交酯、其他单体和杂质会连同一部分所用催化剂被移除。聚合物薄膜用纯化PLA来制备。
本公开内容期望制造生物相容性和生物可降解性聚合物给设备的设计者和医生，这将有助于加速患者康复。本发明提供了黑素细胞的组合物。
在另一实施方案中，本发明可供用于培养与其他细胞如角质形成细胞一起的黑素细胞，及将其在生物相容性聚合物上的递送。
本发明提供了共培养方法以及其在如白癜风的皮肤病症中移植的应用。将角质形成细胞与黑素细胞共同递送的优势是，其可以提高受影响皮肤的上皮形成速度。本发明的潜在优势或特点如下：
1.黑素细胞移植物帮助色素沉着。
2.聚合物薄膜通过阻止微生物对创面的入侵而帮助愈合。
3.聚合物薄膜粘附到创面并通过封闭神经末梢来缓解疼痛。
4.聚合物薄膜通过防止创面干燥而确保伤口环境潮湿。
5.通过采取严格的工序间控制来最小化传染性疾病的传播。
6.然后可以将递送系统上的培养黑素细胞转移至患者，从而尽量减少由医师处理细胞。由于细胞在薄膜上递送，细胞受到最小的医师处理。
7.用于递送细胞的聚合物薄膜使细胞迁移到创面，从而阻止细胞的损失。
8.该聚合物薄膜在培养过程以及应用中为移植物提供足够强度。不同于在细胞移植中使用的胶原片层和纤维片层，PLA薄膜不脆弱，有足够强度。该特性有利于制造过程即细胞培养时)以及在移植过程中对移植物的处理。
9.透明的生物聚合物确保在细胞培养过程中对细胞的显微评估以及在其被施用后对皮肤的可视性。
10.大面积脱色皮肤可以用取自患者的少量活组织切片细胞所覆盖。
11.移植物的活力在运送条件下可以保持约96小时，从而便于将其递送至远离中央加工设施的各医院。
用于制备本发明的生物聚合物上的培养黑素细胞移植物的大部分原材料是无菌产品。用于患者和/或供体皮肤运送的胎牛血清来源被证明来自无疯牛病(BSE)的国家。用于该生产方法中的所有塑料制品是一次性的，从NUNCTM(美国)和FalconTM(美国)获得。在本发明的生物聚合物上的培养黑素细胞移植物中，PLA膜用作黑素细胞的载体。将PLA浇注成薄膜，并用环氧乙烷(ETO)灭菌。本发明的生物聚合物上的培养黑素细胞移植物在特别设计的聚碳酸酯盘中运送。使用硅氧烷O型圈(silicone O-ring)作为本发明伤口覆盖物运送容器的部分。所有原材料都经过测试，以进一步确保材料无菌。制造本发明伤口覆盖物的过程是在按照cGMP规范的无尘室中进行。
按照本发明，在培养黑素细胞移植物的组合物的制备中涉及：
1.分离黑素细胞
2.培养黑素细胞
3.制备生物聚合物薄膜
4.安全性和有效性研究。
本发明的生物聚合物上的培养黑素细胞移植物用于患者具脱色或色素减退皮肤的病症，如白癜风、白斑病等。
在一个实施方案中，鉴于PLA的生化特性，如生物相容性、受控降解速度、已被证明的无毒性、高强度和受控降解速度，本发明使用PLA作为基片来递送黑素细胞。PLA薄膜是半渗透性的，这使得它们对于液体和细菌是封闭的，但能渗透水汽、氧气和二氧化碳。渗透性很重要，因为发明人发现，二氧化碳富集培养基，如KSFM，出人意料地提高了在此基片上黑素细胞的活力。PLA对创面的粘附有利于细胞向创面迁移。PLA薄膜是透明的，有助于在细胞培养过程中对细胞的显微评估以及在移植后创面的可视性。而且，聚合物薄膜在其应用中也易于移植物处理以及允许移植物被裁剪以适应白癜风病变部位。在其过程中获得的细胞活力反映了活组织切片活力的维持。分离细胞的活力越高，黑素细胞存活和增殖的机会就越高。本发明确保将活组织切片从医院向中央加工设施运送过程中活组织切片的活力。皮肤活组织切片在切取后，当存放在5-37℃时，在运送培养基中在96小时内保持其活力的约80％。充填冷却包的保温箱能在运送条件下维持5-25℃96小时。因此，在72小时运送中，可以从活组织切片分离出活细胞。移植物的活力在运送条件下可以保持约96小时，从而使其能被递送到远离中央加工设施的各医院。
同样，本发明提供从培养-加工中心向移植医院递送时维持细胞活力的运送条件。本发明提供了理想的存储培养基、运送条件和期限，以在运送中确保细胞的活力。在运送中，培养物被密封，以防止污染和培养基泄漏。本发明提供了优化的运送条件，其中，例如，在8-25℃运送时，在二氧化碳富集培养基中，80％的细胞保持其活力96小时。
二氧化碳富集培养基的一个实例是KSFM。[可由Gibco-BRL特殊培养基获得。参见Daley，J.P.，Epstein，D.A.和Hawley-Nelson，P.(1990)
Figure G2007800462085D00171
12，68；Donovan，J.(1998)Focus 20，38]。KSFM培养基包括例如含L-谷氨酰胺的角质形成细胞-SFM(基础培养基)(500ml)；牛垂体提取物(25mg)；和重组表皮生长因子(rEGF)(2.5μg)。黑素细胞培养于支持其增殖的黑素细胞培养基中。细胞在温度维持于37℃的培养箱中培养。但是在运送过程中，温度于96小时期间中维持在8-25℃。当暴露于运送温度时，黑素细胞生长培养基中的黑素细胞不能够保持其活力。可是，当细胞在培养箱中于常规条件(37℃)培养于KSFM培养基中时，细胞保持其活力，但其增殖情况与在生长培养基中不同。一个目标是在运送中既保持活力又维持功能。已观察到，培养于二氧化碳不丰富的KSFM中的黑素细胞保持其活力不超过24小时。但是，在富含二氧化碳的KSFM中运送的黑素细胞能保持其活力96小时。
本发明提供了生物聚合物上的培养黑素细胞移植物，该生物聚合物为大约16平方厘米的圆形薄膜。然而，该尺寸并不限制本发明的范围，因为移植物可以是任何大小或形状。此外，本发明以3×104/cm2的接种密度，用所述培养条件培养35-40天，提供了来自1平方厘米皮肤活组织切片的64平方厘米移植物。因此，本发明能够使从小活组织切片获得的黑素细胞繁殖，以覆盖大面积的白癜风病变。临床使用时，将移植物倒置在创面上，使细胞在经磨削的皮肤上与其紧密地相对。磨削是利用磨削器使表皮从皮肤上被移除的方法。在将片层倒置在经磨削皮肤上时，黑素细胞会迁移并形成再生表皮的一部分。再生上皮细胞中存在功能性黑素细胞，会导致皮肤在接触太阳光或PUVA后产生色素沉着。以共培养移植物存在的角质形成细胞也将迁移到创面上，定殖并重构表皮。角质形成细胞分泌的生长因子帮助诱导接受者角质形成细胞迁移、增殖和重建表皮，从而导致早期创面闭合。
再生上皮细胞中存在功能性黑素细胞，会导致皮肤在接触太阳光或PUVA后产生色素沉着。以共培养移植物存在的角质形成细胞也将迁移到创面上，定殖并重构表皮。由这些细胞分泌的生长因子帮助诱导受体细胞迁移、增殖和重建表皮，从而导致伤口再生。PLA薄膜上的培养黑素细胞可本身被递送，或作为与自体或异源性角质形成细胞一起的共培养物被递送。以下是本发明的示例性实施方案。本领域技术人员会认识到，在实施例中公开的技术代表了由本发明人发现在本发明的实践中运作良好的技术。
然而，根据本公开内容，本领域技术人员应认识到，可在公开的实施方案中作出改变，但仍然可获得相同或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1：制备生物聚合物上的培养黑素细胞移植物
皮肤采集
从需要移植的人(此处被称为患者)，采集穿孔活组织切片(punchbiopsy)。采集患者的血样(5ml)进行传染病检验，以确定患者的ID状况，以确保移植时操作者和患者的安全。将含有DMEM、Iscove培养基(Invirtrogen，USA)、10％胎牛血清(FBS)(Hyclon，USA)、抗细菌-抗真菌溶液(Sigma，USA)和庆大霉素(Invitrogen，USA)的皮肤活组织切片采集管形瓶在含冰包的保温箱中运送到医院。保温箱由EPS(发泡聚苯乙烯)制造，并能保持8-25℃温度72小时。该管形瓶在使用前可在冰箱内最多存放一周。将活组织切片采集到这些运送管形瓶中，并在样品采集48小时内运回到保温箱以作进一步处理。
制备聚合物薄膜
利用溶剂浇注法制备聚合物薄膜。让该薄膜在室温下通过溶剂蒸发来干燥，并用ETO消毒。生物聚合物片层的典型制备例如详述于印度申请号IN 205/MUM/2006中，后者提交于2006年2月14日。更准确地说，本发明使用了PLDA，其由DL-丙交酯和L-丙交酯(重量/重量：50/50)共聚合而制备，其特性粘度为0.85。利用旋转涂覆在不锈钢板上浇注含PLDA约15-25％的丙酮溶液，在37℃放置过夜以干燥。对于细胞培养，将该薄膜切成4.5cm直径的环状，用环氧乙烷(ETO)灭菌。采用标准化方法(IS/ASTM)表征ETO消毒薄膜的物理性能。根据薄膜防止下面的营养基质污染的能力，评估薄膜对微生物如细菌、酵母和真菌的阻隔性能。
细胞培养程序
黑素细胞的分离和扩增包括下列步骤：
1.去除患者皮肤中多余的脂肪，依次在70％酒精、聚维酮碘(Mundipharma，Switzerland)和抗细菌-抗真菌溶液中洗涤以去污染。
2.根据真皮的厚度，将活组织切片在0.2-0.4％分散酶(Sigma，USA)中孵育1-18小时。经过分散酶消化后，表皮脱离下面的真皮；通过用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen，USA)酶消化，黑素细胞从表皮释放。
3.在胰蛋白酶消化后，用大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶活性，并将释放的细胞重悬浮于市售黑素细胞生长培养基254-CF(Cascade Biologies USA)。以4×104细胞/cm2的密度将细胞接种于组织瓶内。每隔一天更换培养基，在细胞达到70-80％融合时传代，测定细胞活力。
4.当细胞达到融合时，将细胞传代。根据需覆盖皮肤的面积，将细胞传代2-3次，以获得足够细胞数。在递送移植物前，用胰蛋白酶消化细胞，并将其接种于在专门设计的容器(设计号198591)中的生物聚合物薄膜(1×104-1×105细胞/cm2移植物)。
5.使细胞粘附和增殖。
图1表现了本发明的生物聚合物移植物，其中，可以看到培养的黑素细胞分布在PLDA薄膜上。
工序间控制：
通过在培养过程中不断监测细胞的无菌性和内毒素水平，确保细胞对接受者的安全性。
此外，为了排除此培养条件会在细胞中产生异常的可能性，对几个批次的黑素细胞进行了体外致瘤性测试以及核型分析。所有实验结果表明，在培养的细胞中没有任何异常。
在接种后第2、3和4天，在胰蛋白酶消化后用台盼蓝法，分析PLDA薄膜上的黑素细胞生长。每个实验进行三次重复。台盼蓝是一种活体染料，用来选择地使死亡组织或细胞呈蓝色。它是一种重氮染料。带完整细胞膜的活细胞或组织不被着色。由于细胞对通过膜的化合物是非常有选择性的，在活细胞中，台盼蓝不被吸收；但它可穿越死亡细胞的细胞膜。因此，死亡细胞在显微镜下被显示为独特的蓝色。由于活细胞被排除在染色外，因而这种染色方法也被称为染料排除法。
在一个实验中，分离和培养来自穿孔活细胞切片(8mm)的正常黑素细胞，这些活细胞切片取自22个供体，年龄在25-63岁，均知情同意。从每一活细胞切片的表皮分离平均1.6×106/cm2活细胞(用台盼蓝排除法)。使用先前提到的培养条件，本发明人能够使所有患者的黑素细胞培养超过3代，不论这些患者的年龄、性别或是否存在白癜风。在某些情况下，能够使细胞培养直至第七代而不改变细胞形态。观察发现，对45岁及以上的供体，其细胞达到融合需较长的持续时间。
在使用前至少一小时，将含有PLA底膜上的黑素细胞的小袋从在室温下稳定的专门改装的运送容器中取出。PLA底膜上的黑素细胞和专门改装的运送容器见本文别处的介绍。在使用时，在无菌条件下打开密封的托盘，小心提起盘上的盖子，通过上箭头所指缺口弃去运输培养基。从盘中轻轻提起含有细胞的移植物，并用生理盐水冲洗。将移植物的带细胞面向上放在戴无菌手套手掌上。将移植物切成病灶大小，用一对镊子将切好的移植物从边上提起并面向下置于病灶上，使细胞与创面部位相对。应注意不要在创面上拖动片层。然后，用第二层敷剂最终覆盖移植物。患者应该被保持固定至少2-3天，创面区不应受到任何机械力或摩擦力。在施用研究装置后3、6和9个月，对患者进行随访。可对患者随访更长的时期，以收集安全性和有效性数据。首要目标是研究在施用产品后与对照组相比治疗部位获得重新色素沉着的百分比。第二个目标是报告接受部位的感染和破裂告、在试验部位色素沉着过度、在治疗部位上白癜风斑治疗后复发。
实施例2：共培养技术
将角质形成细胞施用于皮肤，导致表皮形成速度提高和改善脱色皮肤磨削后所产生伤口的愈合速度。
角质形成细胞要么从进行黑素细胞治疗的患者获得，要么由其他供体获得。图10显示了生物聚合物上的共培养细胞。当使用直接取自患者的培养角质形成细胞时，角质形成细胞将继续存活更长时间，并形成重建表皮的部分。但是，应用异源培养角质形成细胞将会通过刺激机体再生而提高愈合的速度，即使这些细胞只能短暂存活。黑素细胞生长培养基选择性地诱导黑素细胞增殖，但不支持角质形成细胞增殖。角质形成细胞和黑素细胞都存在于表皮中。在酶消化后，表皮与真皮物理上分离(因此在表皮细胞中不会有任何成纤维细胞的污染)。
实施例3：培养黑素细胞生物聚合物的移植物的运输
在印度专利申请号60/MUM/2006中呈示了运送容器的设计实例、其组装和在运输培养细胞中的使用，在此纳入作为参考。容器的设计显示于图2。将无菌PLA薄膜放置在这些运送盘中，并在PBS中浸泡1小时。每个盘中的薄膜用聚碳酸酯环保持适当位置。在运输前，以3-5×104细胞/cm2接种细胞并培养2天。在发送到医院前，用流量计将盘中的培养基置换为二氧化碳富集培养基。将盘上的卡环(clasp)安全关闭，以确保在运输过程中移植物的活力和无菌。然后，将盘放置于维持8-25℃温度96小时的保温箱中，并运送到各医院用于移植。用Temprecord数据记录仪(TemprecordInternational Ltd.USA)验证过用于运输模拟研究的保温箱。进行这项研究是为了确定在EPS BOXES中96小时期间所维持的温度。该数据记录器用来跟踪盒内96小时的温度。
产品表征和测试
实施例4：安全性测试
为确保接受者的安全，在运输模拟前对来自供体的细胞进行以下测试：
1.核型分析：对细胞进行了核型分析，以确定染色体的数目，并检查是否存在异常。在染色体数目或结构异常方面没有发现具临床显著性意义的证据。
2.支原体测试：此测试通过Hoechst染色法进行。使用支原体染色试剂盒，在荧光染色条件下检测细胞，其中，阳性细胞通过在细胞核周围的粒状或丝状荧光来鉴定(图3A)，而阴性细胞根据仅有细胞核被染色而鉴定，如本文所示(图3B)。
3.传染病测试：为了确保患者的安全，用ELISA法对患者血样(在收集活组织切片时采集)进行传染性疾病检测，以检查HIV、HBV、CMV、HBSAg和梅毒。在细胞被发送到医院/接受者前，还用PCR(聚合酶链式反应)技术检测了传染性疾病。
4.无菌性：通过严格的工序间检测如生物负荷量、采用LAL法的内毒素检测和无菌性检测，确保了产品的无菌性。无菌性检测包括对需氧微生物和厌氧微生物的检测。该检测通过将测试样品接种于两个不同的无菌营养培养基来进行，即液体巯基乙酸培养基(FTM)和大豆酪蛋白消化物培养基(SCDM)。结果显示，在14天的孵育期内在接种培养基中没有任何生长，这表明样品无菌。细菌内毒素的存在用凝胶块技术，使用鲎变形细胞溶解物(LAL)试剂来测定。在37℃细菌内毒素存在下孵育一个小时时，LAL试剂形成坚实的凝胶块。进行生物负荷量测试，以确定产品的微生物负荷，其依据呈现在固体培养基平板上的菌落数来确定。测试使用的培养基是大豆酪蛋白消化物琼脂(SCDA)。
实施例5：细胞表征
1.鉴别：利用免疫组织化学分析法，对培养的细胞进行了分析和鉴别。
黑素细胞移植物
为确定黑素细胞培养物的纯度，用MEL-5抗体对细胞进行鉴别。所有细胞对MEL-5抗体试验呈阳性(图4)。MEL-5(Ta99)单克隆抗体检测分化相关的、色素沉着相关的糖蛋白(gp75)(75kD)，其由黑色素瘤细胞、正常黑素细胞和痣表达。该gp75抗原现在被称为酪氨酸酶相关蛋白(TRP-1)。
共培养移植物
为确定移植物中的角质形成细胞的身份和其数量，用特异性结合角质形成细胞的PAN-角蛋白抗体对细胞进行免疫染色来检测细胞。用FITC缀合抗小鼠第二抗体来检测阳性细胞，并用DAPI来鉴别细胞中的细胞核，参见图.11。
程序：将培养的黑素细胞以0.2×104细胞/孔接种于双孔室载玻片中。用4％低聚甲醛(Sigma，USA)固定细胞20分钟，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗两次。在用0.2％Triton X-100(Sigma，USA)透性处理1小时后，用第一Mel-5单克隆抗体(Sigma，USA)染色细胞1小时，用PBS漂洗细胞，用Alexa Fluor 488缀合山羊抗小鼠第二抗体(Molecular Probe，USA)检测阳性细胞。用PBS漂洗细胞，并用DAPI(Sigma，USA)在室温下孵育细胞10分钟。视野中的所有细胞都具蓝色细胞核，而黑素细胞由绿色荧光鉴别。以仅用用作对照的第二抗体检测染色的特异性。
2.MART-1PCR：如图5所示，在所有传代培养的黑素细胞中都有MART-1的表达，表明培养的细胞能因产生MART-1蛋白而具备诱导色素沉着的能力。GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)用作内参。MART-1与Pmel17(黑素体蛋白)形成复合物，并影响其表达、稳定性、转运和加工，这对于第二阶段黑素体形成很重要。因此，对Pmel17的功能而言，MART-1是必不可少的，并在调节哺乳动物色素沉着中发挥重要作用。RT-PCR技术包括以下步骤：按照制造商的方案，用Trizol试剂(Invitrogen，USA)从不同代黑素细胞中提取总RNA。按照制造商的方案，用SuperscriptTM RT-PCR第一链合成系统(Invitrogen，USA)进行逆转录。基因扩增在PCR Supermix(Invitrogen，USA)中进行，每25μL反应体积含1.5μL c-DNA。所用PCR反应条件为：95℃5分钟，然后为95℃45秒、55℃45秒和72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。扩增用依据从Genbank数据库获得的序列设计的下列特异性引物在热循环仪(Biometra，Germany)中进行：
MART-1(240bp)：
5′-GCTCATCGGCTGTTGGTATT-3′(有义)，(SEQ ID NO：1)
5′-ATAAGCAGGTGGAGCATTGG-3′(反义)；(SEQ ID NO：2)
3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(750bp)：
5′-GGG-CTG-CTT-TTA-ACT-CTG-GT-3′(有义)，(SEQ ID NO：3)
5′-GGG-CTG-CTT-TTA-ACT-CTG-GT-3′(反义)；(SEQ ID NO：4)
在2％琼脂糖凝胶上将PCR产物分离，并在紫外灯(Image master，Amersham Biosciences，USA)下观察。
MART-1表达水平在所有代培养黑素细胞中保持不变，表明所测试的所有代培养细胞都能诱导色素沉着。本发明还测试了直至第5代的表达水平。GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)作为指示相等RNA负载量的内参。
3.功能测验：培养的黑素细胞转化DOPA为黑色素的能力代表了细胞的功能特征。功能性黑素细胞通过化学反应产生黑色素，其中酪氨酸酶催化酪氨酸转化为DOPA，后者再进一步转化为黑色素。功能测验如下进行：在培养的黑素细胞被接种到PLA薄膜前，先将其在有室载玻片中培养，并用含10％福尔马林的PBS在-4℃固定3小时。用PBS漂洗细胞，并用含L-DOPA(0.05mg/ml)的PBS在37℃孵育3小时。孵育后，用PBS漂洗这些细胞，并用10％福尔马林缓冲液固定1小时。在L-DOPA存在下，功能性黑素细胞被染色为棕色。(图6)。
4.MHC-II(HLA-DR)表达：MHC-II在免疫应答中有重要作用。MHC标志物的下调往往与癌症相关。图12说明了用PCR在共培养物产品中鉴定角质形成细胞中MHC-II类(HLA-DR)的表达。
5.在运输条件下细胞的活力：运输条件下黑素细胞的活力用MTT法间接评价。简单地说，将MTT(0.5mg/mL)添加到装运后第0、1、2、3和4天的细胞中，每盘三个重复。通过细胞将可溶性MTT转换为不溶性甲
Figure G2007800462085D00251
晶体的能力，间接确定细胞活力。将该晶体溶解，测定作为在测试波长570nm和参照波长650nm的光密度差的吸光度值(Shimadzu UV-VIS Spectrophotometer，Japan)。假定在发送时(也就是第0天)所有细胞都是活的，将发送时的吸光度值假定为100％。每个时间点的活力按照与第0天时吸光度值的百分比来计算。在运输条件下，约80％的细胞保持其活力约96小时。因此推论，细胞可以在运输条件下96小时内被递送到三级医院而其活力没有多少损失。在96小时时观察到活力略有增加，这可能归因于保温箱内的温度在72小时达到约25℃。在此时间点，少数细胞可能已经开始增殖，从而增加了细胞数量。保温箱在运输模拟条件下96小时周期中维持的温度是11-24℃。移植物上的细胞在8-35℃温度可保持其活力至4天(图9)。
实施例6：通过临床前研究测试效用
1.毒性测试：
用小鼠和豚鼠测试时，PLA没有表现出任何毒性。整个移植物也没有表现出在动物中有任何毒性效应。毒性测试用Dulbeccp磷酸缓冲盐溶液(PBS)和PAL片层，在37℃进行72小时(以下简称“测试物质”)。所有毒性研究皆根据OECD于1998年公布的良好实验室规范(GLP)原则进行。
急性皮内毒性研究在雄性和雌性新西兰白兔中使用接触溶液进行。该测试在每只兔一侧的五个位点皮内施用0.2ml测试物质(接触溶液)来进行。相似地，在每只兔另一侧的五个位点注射0.2ml蒸馏水(对照)。在注射后立刻以及注射后24、48和72小时，观察每个注射部位的外观。然后每天观察单个动物的毒性迹象，持续14天。将每个注射部位在每一个时间间隔产生的红斑、水肿组织反应进行分级。72小时后，将每一测试物质和对照的所有红斑等级和水肿等级独立地汇总。将每一总数除以36(6只动物×3个等级×2个等级类别)，以确定每一测试物质相对对照的总体平均得分。如果平均得分在测试物质和对照间的差异为1.0或更低，则满足测试要求。
在经过接触溶液处理的兔中，没有观察到不良临床体征或死亡。
2.致瘤性：
为了确保细胞没有可能导致接受者形成肿瘤的任何异常/转化，在体外进行了致瘤性检验。评价培养细胞在软琼脂中形成菌落的能力，作为可能的转化和细胞在人体内形成肿瘤的潜力的指标。监测培养物是否在28天内形成超过10个细胞数的菌落。被检验的各批次培养细胞没有形成菌落。图8图示说明黑素细胞培养物，图13图示说明与黑素细胞共同培养的角质形成细胞的结果。
3.在动物中移植：
将黑素细胞接种在PLA薄膜上(4×104细胞/cm2)，培养3天。在移植时，用HBSS漂洗细胞，将薄膜倒置在伤口上，如下文所述。
用含80mg/kg氯胺酮、40mg/kg赛拉嗪和0.05mg/kg阿托品的混合物腹膜内麻醉SCID小鼠(4只)。剃光背侧的毛，用70％乙醇清洁皮肤。在无菌条件，在动物的背侧制造1cm2局部厚度的伤口。用盐水冲洗伤口，将接种了黑素细胞的PLA薄膜倒置在伤口上，并用以手术石膏立体支撑的石蜡包埋纱布覆盖。动物被个别关养，并提供食物和水，自由进食。所有动物的处理均依据由印度政府规定的实验动物福利CPCSEA准则。72小时后，处死动物，并切取他们的伤口。将组织固定在福尔马林中，并用石蜡包埋。使用IHC HRP检测试剂盒(Chemicon，USA)，对5微米厚切片进行免疫组化染色以检测黑素细胞迁移。简单地说，用试剂盒的封闭缓冲液封闭切片，然后，要么用人类细胞核单克隆抗体1∶50(Chemicon，USA)，要么用MEL-5单克隆抗体1∶50(Signet，USA)进行孵育。随后，用试剂盒提供的生物素标记羊抗小鼠第二抗体和HRP链霉抗生物素先后孵育样本。以二氨基联苯胺(Sigma，USA)作为底物获得阳性细胞信号。此外，仅用第二抗体对切片进行染色，用作第二抗体非特异性结合的对照。动物在72小时后被处死。
4.细胞从生物聚合物迁移
分别在豚鼠和SCID小鼠的全深度穿孔伤口活检模型中，测试了角质形成细胞和黑素细胞迁移到皮肤中的能力。在SCID小鼠中，评价了黑素细胞从放置在创面上的PLDA薄膜迁移的证据，如第4点提到的。72小时后处死动物，切取伤口并加工进行免疫组织化学检查。
组织化学分析表明，细胞已经迁移到创面，并构成了再生上皮的一部分(图7)。通过MEL-5阳性染色的存在鉴别出黑素细胞(图7A和图7B)。在创面观察到了MEL-5阳性细胞(图7A和图7B中箭头)。通过观察到类似的抗人细胞核抗体染色模式，证实了迁移的人黑素细胞的存在(图7C和图7D)。
用人类细胞在动物身上进行了体内实验。实验的目的是证明细胞从薄膜迁移至创面。
本发明的目的还在于：通过对移植后对自体患者的研究，解决用传统技术治疗色素减退时观察到的下述并发症。
1.浸出
2.颜色不匹配
3.移植物排斥
4.供体部位的瘢痕形成
5.移植后炎症
6.鹅卵石外观
虽然为了清楚理解上述发明，通过举例说明和实施例较详细地描述了上述发明，对本领域普通技术人员来说显而易见的是，在不偏离所附权利要求书的精神或范畴的前提下，根据本发明的教导，可以作出某些变化和修改。根据本公开的内容，本文所公开和要求保护的所有组合物和方法无需过多的实验即可以进行和实施。虽然本发明的组合物和方法已通过优选实施方案加以描述，但对本领域技术人员来说显而易见的是，对本文所述组合物和/或方法以及方法中的步骤或一系列步骤，都是可以有变化的，而不偏离本发明的理念、精神和范畴。更具体地说，显而易见的是，某些化学或生理相关的试剂可替代本文所述的试剂，而能得到相同或相似的结果。对本领域技术人员来说，所有这些类似的替代和修改显然被认为是属于本发明的精神、范畴和理念。

Claims (27)

1.能够诱导皮肤色素沉着的移植组合物，其包含：来源于自体表皮的黑素细胞和生物聚合物膜，其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少75％的细胞保持活力至少72小时。
2.权利要求1的组合物，其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少80％的细胞保持活力至少96小时。
3.权利要求1的组合物，其中，组合物进一步包含角质形成细胞。
4.权利要求3的组合物，其中，组合物中黑素细胞和角质形成细胞在生物聚合物膜上的比率是0.8∶2-1∶1。
5.权利要求1的组合物，其中，细胞以单层存在于生物聚合物膜上。
6.权利要求5的组合物，其中，所述的单层是亚融合单层。
7.权利要求1的组合物，其中，黑素细胞能够进一步增殖。
8.权利要求1的组合物，其中，至少90％的细胞是活跃增殖性黑素细胞。
9.权利要求1的组合物，其中，生物聚合物膜选自：聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及分子量至少为50,000Da的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)。
10.权利要求1的组合物，其中，生物聚合物膜是聚乳酸(PLA)。
11.权利要求1的组合物，其中，有足够数量的活黑素细胞，以使所产生的组合物对皮肤色素减退症具有治疗效果。
12.制备权利要求1组合物的方法，包括以下步骤：
a)从自体表皮中分离黑素细胞；
b)制备含分离黑素细胞的细胞悬浮液；
c)扩增黑素细胞；
d)可选择地，冷冻保存黑素细胞细胞；
e)可选择地，解冻黑素细胞；
f)将黑素细胞接种到生物聚合物膜上；
g)将生物聚合物膜上的细胞扩增为亚融合单层；和
h)用含运送培养基的运送设备运送该生物聚合物膜；其中，在运送条件下，组合物中至少75％的细胞保持活力至少72小时。
13.权利要求12的方法，其中，生物聚合物膜包括聚乳酸(PLA)，黑素细胞以1×104至1×105细胞/cm2的细胞浓度接种到生物聚合物膜上。
14.权利要求12的方法，其中，运送设备包括聚碳酸酯。
15.权利要求12的方法，其中，运送培养基包括二氧化碳富集培养基。
16.权利要求12的方法，其中，运送培养基是KSFN培养基。
17.治疗需要皮肤色素沉着个体的方法，包括向该个体施用权利要求1的组合物，其中，该组合物增强该个体皮肤中表皮再生率。
18.权利要求17的方法，其中，该个体是人。
19.权利要求17的方法，其中，需要皮肤色素沉着的该个体是患有白癜风。
20.组合物，其包含亚融合单层黑素细胞和生物聚合物膜，其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少75％的细胞保持活力至少72小时。
21.组合物，其包含与角质形成细胞共培养的亚融合单层黑素细胞和生物聚合物膜，其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少75％的黑素细胞保持活力至少72小时。
22.权利要求21的组合物，其中，黑素细胞以1∶1的比率与角质形成细胞共培养。
23.组合物，其包含：(1)包含未分化细胞的亚融合单层角质形成细胞，和(2)生物聚合物膜，其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少75％的细胞保持活力至少72小时。
24.在受治疗者中治疗色素减退的方法，其包括用生物聚合物膜作为递送系统，将亚融合单层黑素细胞递送至皮肤。
25.在受治疗者中治疗高色素沉着的方法，其包括用生物聚合物膜作为递送系统，将亚融合单层黑素细胞递送至皮肤。
26.用于治疗白癜风的药盒，其中，该药盒包含：(1)组合物，包含(a)亚融合单层黑素细胞和(b)生物聚合物膜，其中，单层黑素细胞是位于生物聚合物膜上；和(2)运送设备，其中，在5-37℃的运送条件下，组合物中至少75％的黑素细胞保持活力至少72小时。
27.能够诱导皮肤色素沉着的移植组合物，其包含来源于自体表皮的黑素细胞和生物聚合物膜，按照前述权利要求的其方法和药盒，其在本文有实质性描述，实质性体现在实施例和图中。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103908701A (zh) * 2014-03-27 2014-07-09 杭州市第三人民医院 一种基于不对称膜的人体黑素细胞的培养方法
CN104039953A (zh) * 2011-09-30 2014-09-10 株式会社爱茉莉太平洋 适应于角质形成细胞的黑素细胞或其祖细胞、以及其制备方法
CN107164308A (zh) * 2017-06-18 2017-09-15 广东博溪生物科技有限公司 一种黑素细胞均匀生长的培养方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3564357T1 (sl) 2010-02-01 2022-09-30 Rebiotix, Inc. Bakterioterapija Clostridium Difficile colitisa
CN114099553A (zh) * 2013-06-05 2022-03-01 雷柏奥提斯有限公司 菌群恢复疗法（mrt）、组合物和制造方法
US11598674B2 (en) * 2015-12-01 2023-03-07 Maxim Integrated Products, Inc. Systems and methods for logging data in harsh environments
US11033295B2 (en) 2019-05-06 2021-06-15 Tissuemill Technologies Llc Atraumatically formed tissue composition, devices and methods of preparation and treatment
US20230310337A1 (en) * 2020-06-24 2023-10-05 Tevido Biodevices, Inc. Devices and methods for the treatment of skin depigmentation

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR900005903B1 (ko) * 1986-02-03 1990-08-16 유니버시티 페이턴츠 아이엔씨 알파-msh의 동족체의 국소적용으로 메라노싸이트를 자극시키는 방법 및 이에 사용될 수 있는 조성물
US5032508A (en) * 1988-09-08 1991-07-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US5700450A (en) * 1988-03-30 1997-12-23 The Trustees Of Boston University Methods for enhancing melanin synthesis in melanocytes using diacyglycerols and uses thereof
US5712137A (en) * 1990-03-05 1998-01-27 Smith & Nephew Plc Laminate of a culture substrate on a carrier for producing an apertured wound dressing
WO1999009149A1 (en) * 1997-08-01 1999-02-25 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional polymer matrices
CU22695A1 (es) * 1998-07-28 2001-07-31 Ct De Histoterapia Placentaria Formulación para la estimulación de la síntesis del pigmento melánico
DE19958693C2 (de) * 1999-12-06 2002-07-18 Biotissue Technologies Gmbh Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung von Zelltransplantaten
US6673603B2 (en) * 2000-09-01 2004-01-06 Modex Therapeutiques, S.A. Cell paste comprising keratinocytes and fibroblasts
AUPR298901A0 (en) * 2001-02-07 2001-03-08 McComb Foundation, Inc., The Cell suspension preparation technique and device
ZA200602094B (en) * 2006-01-16 2007-11-28 Reliance Life Sciences Pvt Ltd Device for culturing and transporting cells
US20070258958A1 (en) * 2006-02-14 2007-11-08 Reliance Life Sciences Private Limited Interactive wound cover

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104039953A (zh) * 2011-09-30 2014-09-10 株式会社爱茉莉太平洋 适应于角质形成细胞的黑素细胞或其祖细胞、以及其制备方法
CN104039953B (zh) * 2011-09-30 2016-08-17 株式会社爱茉莉太平洋 适应于角质形成细胞的黑素细胞或其祖细胞、以及其制备方法
CN103908701A (zh) * 2014-03-27 2014-07-09 杭州市第三人民医院 一种基于不对称膜的人体黑素细胞的培养方法
CN103908701B (zh) * 2014-03-27 2017-03-08 杭州市第三人民医院 一种基于不对称膜的人体黑素细胞的培养方法
CN107164308A (zh) * 2017-06-18 2017-09-15 广东博溪生物科技有限公司 一种黑素细胞均匀生长的培养方法

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