CN103908701B - 一种基于不对称膜的人体黑素细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于不对称膜的人体黑素细胞的培养方法,本发明利用组织工程技术构建具有良好生物相容性的不对称膜,进行了黑素细胞或其与成纤维细胞、角质形成细胞的(共)培养和转移,适用于色素脱失症(如白癜风)和皮肤颜色的调节。本发明涉及不对称膜的制备、细胞‑不对称膜复合材料的构建。由于膜材料中引入不对称结构,促进了细胞培养及活性的保持。
Description
技术领域
本发明属生物医学领域,尤其涉及一种基于不对称的生物膜材料的黑素细胞培养方法。
发明背景
白癜风是一种常见的皮肤色素脱失性皮疾病,在人群中发病率达0.5-2%,病因是人体皮肤中黑素细胞的功能丧失。白癜风表现为局部或泛发型白斑,白斑处因缺乏黑色素,容易被阳光灼伤甚至引发癌变,同时也会给患者带来社交忧虑引起心理疾病。
目前治疗白癜风主要有三类疗法:药物疗法、光化学疗法、外科手术疗法。药物疗法和光化学疗法疗效一般且副作用大,因此人们更多的关注外科手术疗法。外科手术疗法利用组织工程技术,将人体黑素细胞体外培养,培养一段时间后转移至患处,达到治疗疾病的效果。常用的黑素细胞悬液移植疗法,因其流动性强在关节处治愈率低。构建生物相容性支架,将黑素细胞培养在支架上形成细胞皮片达到培养和转移一体化,能有效改善悬液移植疗法的不足之处。
利用组织工程技术、通过细胞负载与转移,为治疗白癜风提供新的途径。CN102648987A公开了一种将透明质酸钠-壳聚糖类复合材料制备成具有光滑面和海绵面的不对称面材料,促进上皮细胞、内皮细胞生长,但该材料未用于黑素细胞的培养。CN 1785444A公开了一种胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架材料,能诱导缺损处细胞迁移、增殖和分化,但该材料不支持黑素细胞、成纤维细胞的生长。CN 1422668A公开了一种医用微孔壳聚糖不对称膜材料,能防止术后伤口粘连,但仅仅起到伤口敷料作用。CN 103007364公开了一种脂肪族聚酯双层不对称引导组织再生膜材料,其制备过程存在有机溶剂的残留。现有不对称膜的相关公开专利主要用于伤口敷料,未涉及在黑素细胞培养中的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种基于不对称的生物膜材料的黑素细胞的培养方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种基于不对称膜材料的黑素细胞的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备不对称的生物膜材料:将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后,配成质量浓度为1-10%的水溶液;将水溶液注入细胞培养板,鼓风条件下于30-70ºC下烘0.1-5小时,使溶液表面水分挥发,形成1-10微米的致密膜;然后加入氢氧化钠-碳酸钠水溶液,浸泡24小时,使致密膜下层溶液发生相分离,形成多孔结构,所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中,氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成,且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1;用去离子水清洗至溶液pH为中性,-60~-40ºC冷冻干燥8-24小时,得到不对称膜;然后用交联剂对不对称膜在20-50ºC交联处理0.5-24小时,交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂,再在鼓风条件下于30-120ºC下烘2-48小时。
(2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前,用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时,随后再用PBS洗净残留酒精,并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后,在细胞培养板里注入细胞培养液,置于细胞培养箱中于37ºC、体积浓度为5% 的CO2、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上,同时加入1-10毫升的细胞培养液,置于细胞培养箱于37ºC、体积浓度为5% 的CO2、饱和湿度条件下培养,每两天更换一次细胞培养液,培养时间为1-10天,即获得细胞-不对称膜的复合材料。
一种基于不对称膜的黑素细胞的培养方法,包括以下步骤:
(1)制备不对称的生物膜材料:1:50-50:1的重量比例混合后,配成质量浓度为1-10%的水溶液;将溶液注入细胞培养板,-60- -40ºC冷冻干燥8-24小时,得到多孔支架;再将上述溶液注入细胞培养板,将多孔支架完全铺展置于溶液上,鼓风条件下于30-70ºC烘0.1-5小时,使水分完全挥发,形成不对称膜;然后用交联剂对不对称膜在20-50ºC交联处理0.5-24小时,交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂;然后0.01-0.3摩尔/升的氢氧化钠、碳酸钠或重量比例为3:1-1:3的氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时,用去离子水清洗至溶液pH为中性;再在鼓风条件下于30-120ºC下烘2-48小时。
(2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前,用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时,随后再用PBS洗净残留酒精,并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后,在细胞培养板里注入细胞培养液,置于细胞培养箱中于37ºC、体积浓度为5%CO2、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上,同时加入1-10毫升的细胞培养液,置于细胞培养箱于37ºC、体积浓度为5%CO2、饱和湿度条件下培养,每两天更换一次细胞培养液,培养时间为1-10天,即获得细胞-不对称膜的复合材料。
3、根据权利要求1和2所述的基于不对称膜的人体黑素细胞培养方法,其特征在于,所述的生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙二醇等。
所述的生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙二醇等。
所述的交联剂包括用于物理交联的硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠及用于化学交联的戊二醛、乙二醛、水杨醛或香草醛等。
所述细胞培养液含100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、 10-50000微克IBMX、0.1-100毫升Glutamine和100-500000微克Gentamicin等成分。
本发明的有益效果是:通过对所得的生物相容性不对称膜进行表征,膜表面平整(图1),适合细胞生长;多孔结构(图2)有益于细胞培养过程中的营养液储存与更新,促进了细胞的生长及活性的保持。载体材料的具有良好的机械性能,包括抗拉强度、抗撕强度、断裂伸长率和弹性模量等,在制备、负载、转移和移植过程不发生破碎和断裂,符合转移和移植的要求。细胞-不对称膜复合材料的构建过程中,细胞在生物相容性不对称膜材料上的形态良好,增殖趋势明显且保持良好活性(图4)。本发明中生物相容性不对称膜材料制备方法简单、操作容易、抗破损、撕裂和转移等性能优良,通过调节细胞的接种密度、培养时间和方法,保持细胞活性,同时满足不同个体对皮肤颜色的需求,适合色素脱失症和皮肤颜色的调节。
附图说明
图1不对称膜致密层SEM扫描电镜照片;
图2不对称膜疏松多孔层SEM扫描电镜照片;
图3不对称膜截面SEM扫描电镜照片;
图4用不对称膜培养的黑素细胞照片。
具体实施方式
本发明属生物医学领域,利用组织工程技术构建具有良好生物相容性不对称膜材料,用于黑素细胞或其与成纤维细胞、角质形成细胞的(共)培养,实现细胞的体外培养。具体涉及具有生物相容性不对称膜材料的制备、细胞-不对称膜复合材料的构建及其应用,满足色素脱失症(如白癜风)和皮肤颜色调节的要求。
本发明选用生物相容性良好的不对称膜材料,负载材料制备条件温和,易于细胞的培养及细胞活性的保持,生物安全。同时,本发明可在细胞培养板上直接构建载体材料,避免对载体材料再打孔、剪裁等繁琐的后处理及二次污染问题。经交联处理的载体材料,具有优越的机械性能,满足可直接从细胞培养板中取出用于细胞转移和移植的要求。此外,本发明通过调节细胞的接种密度、培养时间和培养方法,保持细胞活性,实现对不同个体皮肤颜色的调控,使黑素细胞的功效性在移植中得到成功的表达,具有实际的可操作性,为大面积色素脱失症和皮肤颜色的调节提供了极大的便利。
本发明的基于组织工程材料的细胞培养方法,包括以下步骤:
(1)制备不对称的生物膜材料:将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后,配成质量浓度为1-10%的水溶液;将水溶液注入细胞培养板,鼓风条件下于30-70ºC下烘0.1-5小时,使溶液表面水分挥发,形成1-10微米的致密膜;然后加入氢氧化钠-碳酸钠水溶液,浸泡24小时,使致密膜下层溶液发生相分离,形成多孔结构,所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中,氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成,且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1;用去离子水清洗至溶液pH为中性,-60~-40ºC冷冻干燥8-24小时,得到不对称膜;然后用交联剂对不对称膜在20-50ºC交联处理0.5-24小时,交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂,再在鼓风条件下于30-120ºC下烘2-48小时。
(2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前,用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时,随后再用PBS洗净残留酒精,并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后,在细胞培养板里注入细胞培养液,置于细胞培养箱中于37ºC、体积浓度为5% 的CO2、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上,同时加入1-10毫升的细胞培养液,置于细胞培养箱于37ºC、体积浓度为5% 的CO2、饱和湿度条件下培养,每两天更换一次细胞培养液,培养时间为1-10天,即获得细胞-不对称膜的复合材料。
本发明还提供了另一种基于不对称膜的黑素细胞的培养方法,包括以下步骤:
(1)制备不对称的生物膜材料:1:50-50:1的重量比例混合后,配成质量浓度为1-10%的水溶液;将溶液注入细胞培养板,-60- -40ºC冷冻干燥8-24小时,得到多孔支架;再将上述溶液注入细胞培养板,将多孔支架完全铺展置于溶液上,鼓风条件下于30-70ºC烘0.1-5小时,使水分完全挥发,形成不对称膜;然后用交联剂对不对称膜在20-50ºC交联处理0.5-24小时,交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂;然后0.01-0.3摩尔/升的氢氧化钠、碳酸钠或重量比例为3:1-1:3的氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时,用去离子水清洗至溶液pH为中性;再在鼓风条件下于30-120ºC下烘2-48小时。
(2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前,用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时,随后再用PBS洗净残留酒精,并置于紫外灯下照射3-24小时。完成消毒灭菌后,在细胞培养板里注入细胞培养液,置于细胞培养箱中于37ºC、体积浓度为5%的CO2、饱和湿度条件进行孵化。将按1-40: 0-200: 0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上,同时加入1-10毫升的细胞培养液,置于细胞培养箱于37ºC、体积浓度为5%的CO2、饱和湿度条件下培养,每两天更换一次细胞培养液,培养时间为1-10天,即获得细胞-不对称膜的复合材料。
所述的生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙二醇等。
生物相容性材料包括壳聚糖、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙二醇等。
交联剂包括用于物理交联的硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠及用于化学交联的戊二醛、乙二醛、水杨醛或香草醛等。
细胞培养液含100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS (胎牛血清)、10-50000纳克CT(霍乱毒素)、 10-50000微克IBMX(异丁酰甲基黄嘌呤)、0.1-100毫升Glutamine(谷氨酰胺)和100-500000微克Gentamicin(庆大霉素)等成分。
下面根据实施例详细描述本发明,本发明的目的和效果将变得更加明显。
实施例1. 壳聚糖不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用1M的乙酸溶液溶解,配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液;
b、将2.5ml壳聚糖溶液注入细胞培养板,将细胞培养板置于鼓风烘箱中,于65ºC下干燥0.5小时;
c、加入氢氧化钠、碳酸钠和水以重量比例为2:1:47的氢氧化钠-碳酸钠水溶液,浸泡24小时,使致密膜下层溶液发生相分离,形成多孔结构;
d、用去离子水清洗至溶液pH为中性;
e、-55ºC冷冻干燥12小时,得到不对称膜;
f、将干燥的壳聚糖不对称膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡30min,随后用大量纯净水冲洗;
g、将覆盖壳聚不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中,37ºC条件下干燥24小时;
h、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
实施例2. 壳聚糖-明胶基复合不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用1M的乙酸溶液溶解,配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液;
b、将明胶用纯净水溶解,配成浓度为1%的明胶溶液;
c、将壳聚糖与明胶以20:1的重量比例混合,搅拌均匀,得到壳聚糖-明胶混合溶液;
d、将2.5 ml混合溶液注入细胞培养板,将细胞培养板置于鼓风烘箱中,于35ºC条件下干燥4小时;
e、加入氢氧化钠、碳酸钠和水以重量比例为2:1:47的氢氧化钠-碳酸钠水溶液,浸泡24小时,使致密膜下层溶液发生相分离,形成多孔结构;
f、用去离子水清洗至溶液pH为中性;
g、-45ºC冷冻干燥24小时,得到不对称膜;
h、将干燥的壳聚糖-明胶不对称膜置于0.5M的柠檬酸钠溶液中浸泡2h,随后用大量纯净水冲洗;
i、将覆盖壳聚糖-明胶不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中,80ºC条件下干燥24 小时;
j、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
实施例3. 壳聚糖-聚乙二醇基复合不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用1M的乙酸溶液溶解,配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液;
b、将聚乙二醇用纯净水溶解,配成浓度为1%的聚乙二醇溶液;
c、将壳聚糖与聚乙二醇以20:1的重量比例混合,搅拌均匀,得到壳聚糖-聚乙二醇混合溶液;
d、将2.5 ml混合溶液注入细胞培养板,将细胞培养板置于鼓风烘箱中,于35ºC条件下干燥4小时;
e、加入氢氧化钠、碳酸钠和水以重量比例为2:1:47的氢氧化钠-碳酸钠水溶液,浸泡24小时,使致密膜下层溶液发生相分离,形成多孔结构;
f、用去离子水清洗至溶液pH为中性;
g、-45ºC冷冻干燥24小时,得到不对称膜;
h、将干燥的壳聚糖-聚乙二醇不对称膜置于0.5M的柠檬酸钠溶液中浸泡2h,随后用大量纯净水冲洗;
i、将覆盖壳聚糖-聚乙二醇不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中,80ºC条件下干燥24 小时;
j、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
实施例4. 壳聚糖不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用1M的乙酸溶液溶解,配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液;
b、将2.5ml溶液注入细胞培养板, -45ºC冷冻干燥18小时,得到多孔支架;
c、将上述溶液注入细胞培养板,将多孔支架完全铺展置于溶液上,鼓风条件下于60ºC烘0. 5小时,使水分完全挥发,形成不对称膜;
d、将干燥的壳聚糖不对称膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡30 min,随后用大量纯净水冲洗;
e、用0.1 M的NaOH溶液浸泡壳聚糖不对称膜30 min以除去膜上残留的乙酸,再用大量纯净水冲至PH=7.2-7.4;
f、将覆盖壳聚糖不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中,50ºC干燥36小时;
g、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
实施例5. 壳聚糖-明胶不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用1M的乙酸溶液溶解,配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液;
b、将明胶用1M的乙酸溶液溶解,配成浓度为1 %的明胶溶液;
c、将壳聚糖与明胶以5:1的重量比例混合,搅拌均匀,得到壳聚糖-明胶混合溶液;
e、将2.5ml溶液注入细胞培养板, -45ºC冷冻干燥18小时,得到多孔支架;
f、将上述溶液注入细胞培养板,将多孔支架完全铺展置于溶液上,鼓风条件下于60ºC烘0. 5小时,使水分完全挥发,形成不对称膜;
g、将干燥的壳聚糖-明胶不对称膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡2 小时,随后用大量纯净水冲洗;
h、用0.1 M的Na2CO3溶液浸泡壳聚糖-明胶不对称膜30 min以除去膜上残留的乙酸,再用大量纯净水冲至PH=7.2-7.4;
i、将覆盖壳聚糖-明胶不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中,50ºC干燥36小时;
j、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
实施例6. 壳聚糖-聚乙二醇不对称膜材料的制备
a、将壳聚糖用1M的乙酸溶液溶解,配成浓度为1.5 %的壳聚糖溶液;
b、将聚乙二醇用1M的乙酸溶液溶解,配成浓度为1 %的聚乙二醇溶液;
c、将壳聚糖与明胶以10:1的重量比例混合,搅拌均匀,得到壳聚糖-聚乙二醇混合溶液;
d、将2.5ml溶液注入细胞培养板, -45ºC冷冻干燥18小时,得到多孔支架;
e、将上述溶液注入细胞培养板,将多孔支架完全铺展置于溶液上,鼓风条件下于60ºC烘0. 5小时,使水分完全挥发,形成不对称膜;
f、将干燥的壳聚糖-聚乙二醇不对称膜置于0.5M的Na2SO4溶液中浸泡30 min,随后用大量纯净水冲洗;
g、用0.1 M的Na2CO3溶液浸泡壳聚糖-聚乙二醇不对称膜30 min以除去膜上残留的乙酸,再用大量纯净水冲至PH=7.2-7.4;
h、将覆盖壳聚糖-聚乙二醇不对称膜的细胞培养板置于鼓风烘箱中,50ºC干燥36小时;
i、得到可用于细胞培养的不对称膜材料。
实施例7. 黑素细胞-壳聚糖不对称膜复合材料的构建
a、将实例1所述的壳聚糖不对称膜置于75 %的医用消毒酒精中浸泡12小时后用PBS冲洗干净;
b、将覆盖壳聚糖不对称膜的细胞培养板置于紫外灯下照射6小时;
c、在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液,置于细胞培养箱于37ºC、体积分数为5%的CO2、饱和湿度下孵化4小时;
d、将黑素细胞以个细胞/cm2的密度接种在壳聚糖不对称膜上,置于细胞培养箱于37ºC、5%(体积)CO2、饱和湿度下培养;
e、每两天换一次细胞培养液,培养时间为6天;
f、得到黑素细胞-壳聚糖不对称复合材料,可进一步用于的移植。
实施例8. 黑素细胞/成纤维细胞-壳聚糖-明胶不对称膜复合材料的构建
a、将实例2所述的壳聚糖-明胶复合不对称膜置于75%的医用消毒酒精中浸泡12小时后用PBS冲洗干净;
b、将覆盖壳聚糖-透明质酸复合膜的细胞培养板置于紫外灯下照射10小时;
c、在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液,置于细胞培养箱于37ºC、体积分数为5%的CO2、饱和湿度下孵化4小时;
d、将黑素细胞和成纤维细胞以比例为1:2,密度为个细胞/cm2接种在壳聚糖-明胶不对称膜上,置于细胞培养箱于37ºC、5%(体积)CO2、饱和湿度下培养;
e、每两天换一次细胞培养液,培养时间为5天;
f、得到黑素细胞-壳聚糖-明胶不对称膜复合材料,可进一步用于的移植。
实施例9. 黑素细胞/成纤维细胞/角质形成细胞-壳聚糖-聚乙二醇不对称膜复合材料的构建
a、将实例3所述的壳聚糖-聚乙二醇不对称膜置于体积分数为75%的酒精中浸泡12小时后,用PBS冲洗干净;
b、将覆盖壳聚糖-聚乙二醇不对称膜的细胞培养板置于紫外灯下照射12小时;
c、在细胞培养板里注入3毫升细胞培养液,置于细胞培养箱于37ºC、5%(体积)CO2、饱和湿度下孵化4小时;
d、将黑素细胞、成纤维细胞、角质形成细胞比例以1:2:1,密度为个细胞/cm2接种在壳聚糖-聚乙二醇不对称膜上,置于细胞培养箱于37ºC、体积分数为5%的CO2、饱和湿度下培养;
e、每两天换一次细胞培养液,培养时间为8天;
f、得到黑素细胞-壳聚糖-聚乙二醇不对称膜复合材料,可进一步用于的移植。
Claims (5)
1.一种基于不对称膜的黑素细胞的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备不对称的生物膜材料:将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后,配成质量浓度为1-10%的水溶液;将水溶液注入细胞培养板,鼓风条件下于30-70℃下烘0.1-5小时,使溶液表面水分挥发,形成1-10微米的致密膜;然后加入氢氧化钠-碳酸钠水溶液,浸泡24小时,使致密膜下层溶液发生相分离,形成多孔结构,所述氢氧化钠-碳酸钠水溶液中,氢氧化钠和碳酸钠的总质量与水的质量配比为1-10:90-99混合组成,且氢氧化钠与碳酸钠的质量配比为1:3-3:1;用去离子水清洗至溶液pH为中性,-60~-40℃冷冻干燥8-24小时,得到不对称膜;然后用交联剂对不对称膜在20-50℃交联处理0.5-24小时,交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂,再在鼓风条件下于30-120℃下烘2-48小时;
(2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前,用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时,随后再用PBS洗净残留酒精,并置于紫外灯下照射3-24小时;完成消毒灭菌后,在细胞培养板里注入细胞培养液,置于细胞培养箱中于37℃、体积浓度为5%的CO2、饱和湿度条件进行孵化;将按1-40:0-200:0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以5×103-5×105个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上,同时加入1-10毫升的细胞培养液,置于细胞培养箱于37℃、体积浓度为5%的CO2、饱和湿度条件下培养,每两天更换一次细胞培养液,培养时间为1-10天,即获得细胞-不对称膜的复合材料。
2.一种基于不对称膜的黑素细胞的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备不对称的生物膜材料:将一种或两种生物相容性材料按1:50-50:1的重量比例混合后,配成质量浓度为1-10%的水溶液;将溶液注入细胞培养板,-60--40℃冷冻干燥8-24小时,得到多孔支架;再将上述溶液注入细胞培养板,将多孔支架完全铺展置于溶液上,鼓风条件下于30-70℃烘0.1-5小时,使水分完全挥发,形成不对称膜;然后用交联剂对不对称膜在20-50℃交联处理0.5-24小时,交联处理后用纯净水冲洗除净残留的交联剂;然后0.01-0.3摩尔/升的氢氧化钠、碳酸钠或重量比例为3:1-1:3的氢氧化钠-碳酸钠水溶液浸泡24小时,用去离子水清洗至溶液pH为中性;再在鼓风条件下于30-120℃下烘2-48小时;
(2)构建细胞-不对称膜复合材料:不对称膜用于接种细胞前,用体积浓度为75%的酒精浸泡12小时,随后再用PBS洗净残留酒精,并置于紫外灯下照射3-24小时;完成消毒灭菌后,在细胞培养板里注入细胞培养液,置于细胞培养箱中于37℃、体积浓度为5%CO2、饱和湿度条件进行孵化;将按1-40:0-200:0-100的细胞个数比例共培养的黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞以5×103-5×105个细胞/cm2的密度接种在孵化过的不对称膜上,同时加入1-10毫升的细胞培养液,置于细胞培养箱于37℃、体积浓度为5%CO2、饱和湿度条件下培养,每两天更换一次细胞培养液,培养时间为1-10天,即获得细胞-不对称膜的复合材料。
3.根据权利要求1或2所述的基于不对称膜的人体黑素细胞培养方法,其特征在于,所述的生物相容性材料包括明胶、胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、聚乙二醇。
4.根据权利要求1或2所述的基于不对称膜的人体黑素细胞培养方法,其特征在于,所述的交联剂包括用于物理交联的硫酸钠、柠檬酸钠或三聚磷酸钠及用于化学交联的戊二醛、乙二醛、水杨醛或香草醛。
5.根据权利要求1或2所述的基于不对称膜的人体黑素细胞培养方法,其特征在于,所述细胞培养液由100毫升F12培养基、0.1-100毫升FBS、10-50000纳克CT、10-50000微克IBMX、0.1-100毫升Glutamine和100-500000微克Gentamicin成分混合组成。
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