CN101792735B - 含色素的人工皮肤检测模型及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种含色素的人工皮肤检测模型及其制备方法，本发明把角质形成细胞和黑色素细胞复合接种于生物可降解材料支撑膜表面，经培养构建的具有活性的表皮层结构，包括基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层结构，在表皮层与其下方的生物可降解材料之间形成基底膜结构。与已有产品相比，本发明具有以下优点：含有黑色素细胞可以更好的模拟天然皮肤色素成分，更加准确地反映化妆品的美白和防晒功效；用生物可降解材料支撑膜作为真皮层，可以营养角质形成细胞，所具有的强度可控制表皮层的收缩，提高检测模型的稳定性；本发明的原料成本低、制作周期短，可大量生产，所制备的人工皮肤检测模型可以直接应用于化妆品的功效检测，以及织物、化妆品和化学品的皮肤刺激性检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程中组织工程技术领域，具体涉及一种含色素的人工皮肤检测模型及其制备方法。
背景技术
现代生活中化妆品的使用越来越多，而化妆品检测技术直接关系着化妆品的靓肤效果和使用安全，因此在化妆品研制中检测技术非常重要。此前，化妆品多是采用动物活体实验，由于存在有诸多的问题，根据欧盟化妆品指令(76/768/EEC)，从2009年开始，全面禁止销售只通过动物实验开发的化妆品。全球化妆品行业已开始采用敏感度更高更准确的检测方式，即人工皮肤检测模型。
人工皮肤检测模型在化妆品安全性和功能效果检测方面的应用已被人们所接受。2000年，欧盟正式批准EpiDerm(MatTek Corporation，Ashland，MA，USA)和EPISKIN(EPISKIN SNC，Lyon，France)为欧盟范围内活体兔皮肤的替代物，随后美国也批准EpiDerm成为皮肤腐蚀性的检测工具；而皮肤刺激性检测工具目前只有EPISKIN一种。
人体正常、健康的肤色是黑色素合成与代谢平衡的结果，黑色素是由黑色素细胞合成分泌的。而人工皮肤检测模型EpiDerm只有表皮层，不含有黑色素细胞，不能检测出化妆品的美白和防晒效果，同时缺乏真皮层的支持，机械强度差。表皮层位于皮肤的最外层，由基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层构成，是抵御各种刺激的主要屏障，通过表皮层就能反映皮肤对刺激品 的效应，因此皮肤检测模型需要分化良好的表皮层。而EPISKIN同样不含有黑色素细胞，亦不能检测出化妆品的美白和防晒效果，其真皮层为胶原凝胶，机械强度较差。胶原凝胶应该为角质形成细胞提供发育成熟的信号，使角质形成细胞不断成熟、分化，直至形成类似人体的表皮层结构。中国专利“可调节色素分泌的组织工程皮肤及其构建方法”(申请号：03134539.5)制备的是一种组织工程皮肤，主要用于临床治疗，而不是标准化的化妆品皮肤检测模型，其中含有真皮成纤维细胞使制作成本增大，生物支撑材料为胶原凝胶，并不能给予角质形成细胞和黑色素细胞充足的营养从而形成检测模型需要的表皮层结构，机械强度较差。
通过以上说明，黑色素细胞在皮肤检测模型中有着极其重要的作用。另外，皮肤检测模型中真皮层生物支撑材料对表皮层的成熟、分化和防皱缩方面具有重要的作用。目前，急需一种标准可靠、成本较低的检测化妆品美白效果的含色素人工皮肤检测模型。
经检索，未见有含色素的人工皮肤检测模型及其应用的报道。
发明内容
针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种含色素的人工皮肤检测模型及其制备方法，使其具有分化层次更好的复层表皮结构，同时成本较低，成为用于检测化妆品美白效果的标准化皮肤检测模型。
本发明的含色素人工皮肤检测模型，其特征在于：所述的含色素人工皮肤检测模型是把角质形成细胞和黑色素细胞复合接种于生物可降解材料支撑膜表面，经培养构建的具有活性的表皮层结构，包括基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层结构，在表皮层与其下方的生物可降解材料之间形成基底膜结构。所述的生物可降解材料可以是生物衍生类材料或生物重组合类材料；所述的生物衍生类材料可选择脱细胞真皮、脱细胞粘膜、脱细胞羊膜、脱细胞小肠粘膜下层和脱细胞硬脑膜中的任一种；所述的生物重组合类材料是在细胞外基质复合物中，加有透明质酸、壳聚糖和硫酸软骨素的任一种或是几种的混合。所述的角质形成细胞，为皮肤角质形成细胞或可向皮肤角质形成细胞分化的干细胞。所述的黑色素细胞，为皮肤黑色素细胞或可向皮肤黑色素细胞分化的干细胞。
本发明含色素人工皮肤检测模型的制备方法，包括培养基的配制、生物可降解材料支撑膜的制备和人工皮肤检测模型的三维培养；具体步骤如下：
步骤一.配制培养基：将同体积的MCDB153商用培养液与K-SFM商用培养液混合为基础液；再按500ml基础液的标准加入碱性成纤维细胞生长因子50～750ng，胰岛素2～50ng，表皮细胞生长因子2～10μg，氢化可的松10～500μg，血管内皮素0.5～3μg，腺嘌呤10～20mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，制成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基：
培养基a：基础培养基中含有5～50μg/ml浓度的牛垂体提取液；
培养基b：基础培养基中含有0.1～1mM浓度的氯化钙；
培养基c：基础培养基中含有0.2～2mM浓度的氯化钙；
培养基d：基础培养基中含有0.3～3mM浓度的氯化钙；
步骤二.制备生物可降解材料支撑膜：可以选择生物衍生类材料或是生物重组合类材料中的任一种，制备直径为1.5～6cm、厚度为1～3mm的圆形膜状生物可降解材料支撑膜；其制备方法分别如下：
①选择生物衍生类材料制备支撑膜：把去表皮层和皮下脂肪层后的新鲜动物(猪、牛、羊等)皮肤，取1～3mm厚、直径为1.5～6cm大小的真皮层，用去离子水清洗；在4℃用去离子水浸泡使真皮层溶胀后，取出置于-80℃ 冷冻30min以上，是根据厚度增加延长冷冻时间，至组织完全冻透后取出于37℃中融化，反复2次以上；再用0.1％～0.5％(w/v)的胰蛋白酶消化液消化4～24h(浓度低则消化时间长)；然后用含有终浓度为0.5％～5％(w/v)的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、0.5％～5％(w/v)的脱氧胆酸钠和0.5％～5％(w/v)的十二烷基硫酸钠的混合去垢剂清洗；再采用80～400U/ml浓度的DNA酶消化液消化1～5h去除残留的DNA(浓度低则消化时间长)，最后用1M的NaOH溶液浸泡后，分别用PBS(磷酸盐缓冲液)和纯水洗净，经冷冻干燥灭菌后，得到生物衍生类材料支撑膜；其制作也可采用其他方法；
②选择生物重组合类材料制备支撑膜：在4℃条件下，按质量比将壳聚糖1～2∶透明质酸1～3∶硫酸软骨素1∶细胞外基质复合物7～10混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为4～20mg/ml的基质溶液，冰浴下紫外线照射后，按50ml基质溶液加入10ml的浓度为110mg/ml的DF12培养液，调pH至7.2～7.4，制成凝胶溶液；将凝胶溶液加至φ1.5～6cm的培养皿中，用化学交联剂(如戊二醛、或EDC)交联凝固后，将该材料置于-80℃低压冷冻干燥成海绵状材料，其终厚度为1～3mm，消毒备用；得到生物重组合类材料支撑膜；其制作也可参考中国专利申请200810017603.7进行；
步骤三.将体外培养的角质形成细胞和黑色素细胞以培养基a为溶液制成单细胞混合悬液，黑色素细胞与角质形成细胞的数量比为1～25∶25，再将细胞悬液按1×104～5×104个细胞/cm2的密度接种于培养皿内的生物可降解材料支撑膜表面；加入培养基a使液面淹没生物可降解材料支撑膜表面，培养1～3天，每天换液，形成含色素皮肤的雏形；
步骤四.皮肤检测模型的培养：把含色素皮肤的雏形置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养基b使液面与生物可降解材料支撑膜表面平齐，培 养3天后更换为培养基c，液面略低于生物材料支撑膜表面，培养2～3天后更换为培养基d，液面略高于培养支架表面培养35天，培养期间每天换液；完成含色素人工皮肤检测模型的制备。所形成的含色素人工皮肤检测模型表皮层分化层次清晰，基底层细胞与生物材料支撑膜结合紧密。
本发明所制备的含色素人工皮肤检测模型中的角质形成细胞，在生物可降解材料表面呈复层化生长，所形成的表皮层结构有基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，同时黑色素细胞位于基底层；在培养过程中，表皮层下方生物可降解材料支撑膜内所含的细胞外基质成分随着细胞的吞噬和降解能促进角质形成细胞的增殖和分化，并可防止表皮层的收缩，最终形成结构层次分明的表皮层。作为化妆品功效的检测工具，不同于临床使用的组织工程皮肤，本发明的检测模型不仅具有检测化妆品的功效，同时具有制作简单、成本低、产品标准规范的优点。
本发明的含色素人工皮肤检测模型，由于收缩率小、表皮层分化结构好、含有黑色素细胞成分，能够合成和分泌黑色素，颜色与正常皮肤相似；所以在化妆品检测中的主要功能有：①用于化妆品美白以及是否会引起色斑沉着的检测；②化妆品是否会引起皮炎的检测；③用于织物或化学品对皮肤刺激的检测；④用于化妆品防晒功能的检测。本发明的检测模型可准确用于化妆品的功效以及织物、化学品和化妆品的刺激性检测。
与已有的皮肤检测产品相比，本发明检测模型具有以下优点：含有黑色素细胞可以更好的模拟天然皮肤色素成分，更加准确地反映化妆品的美白和防晒功效；用生物可降解材料支撑膜作为真皮层，可以营养角质形成细胞，所具有的强度可以控制表皮层的收缩，提高检测模型的稳定性；本发明的原料成本低、制作周期短，可大量生产，所制备的人工皮肤检测模 型可以直接应用于化妆品的功效检测，以及织物、化妆品和化学品的皮肤刺激性检测。
具体实施方式
以下结合实例对本发明技术方案做进一步的详细说明。
其中，所用角质形成细胞和黑色素细胞的获得和扩大培养，可参照文献：Liu Y，Suwa F，Wang X，Takemura A，Fang YR，Li Y，Zhao Y，Jin Y.2007.Reconstruction of a tissue-engineered skin containing melanocytes.Cell Biol Int，31：985-90.
实施例1、
步骤一.配制培养基。将相同体积的MCDB153商用培养液与K-SFM商用培养液混合为基础液；再按500ml基础液的标准加入碱性成纤维细胞生长因子250ng，胰岛素10ng，表皮细胞生长因子5μg，氢化可的松250μg，血管内皮素2.5μg，腺嘌呤15mg，转铁蛋白5mg，维生素C 10mg，制成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基：
培养基a：基础培养基中含有25μg/ml浓度的牛垂体提取液；
培养基b：基础培养基中含有0.5mM浓度的氯化钙；
培养基c：基础培养基中含有1.5mM浓度的氯化钙；
培养基d：基础培养基中含有2.5mM浓度的氯化钙；
步骤二.制备生物可降解材料支撑膜(选用生物重组合材料)：在4℃条件下，按质量比将壳聚糖1份、透明质酸1份、硫酸软骨素1份和细胞外基质复合物9份混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为12mg/ml基质溶液，按50ml基质溶液加入10ml的浓度为110mg/ml的DF12培养液，调节pH至7.3，制成凝胶溶液；将其加至φ5cm的培养皿中厚1mm，用5mmol/L的 EDC进行交联，凝固后置于-80℃ 24h，真空冷冻干燥成海绵状材料，60Co消毒备用；得到生物重组合材料支撑膜；
步骤三.将体外培养的角质形成细胞和黑色素细胞以培养基a为溶液制成单细胞悬液，按黑色素细胞1∶角质形成细胞15的比例混合，将混合细胞悬液按1×104个/cm2的密度接种于生物重组合材料支撑膜表面；加入培养基a使液面淹没支撑膜表面，培养3天，每天换液，形成皮肤雏形；
步骤四.皮肤检测模型的成熟：取培养支架置于另一培养器皿中，把制备的含色素皮肤雏形放在培养支架表面，加入培养基b，液面与生物可降解材料支撑膜上表面平齐，培养3天后更换为培养基c，液面略低于支撑膜表面，培养3天后更换为培养基d，液面略高于培养支架上表面，培养4天，培养期间每天换液；完成含色素的人工皮肤检测模型的制备。
制备的含色素人工皮肤检测模型，表皮层分化层次清晰，基底层细胞与支撑膜材料结合紧密，皮肤颜色呈肉色，主要用于化妆品防晒效果检测。
实施例2、
步骤一.配制培养基：将同体积的MCDB153商用培养液与K-SFM商用培养液混合为基础液；再按500ml基础液的标准加入碱性成纤维细胞生长因子500ng，胰岛素40ng，表皮细胞生长因子10μg，氢化可的松400μg，血管内皮素3μg，腺嘌呤20mg，转铁蛋白10mg，维生素C 30mg，制成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基：
培养基a：基础培养基中含有50μg/ml浓度的牛垂体提取液；
培养基b：基础培养基中含有0.5mM浓度的氯化钙；
培养基c：基础培养基中含有1mM浓度的氯化钙；
培养基d：基础培养基中含有2mM浓度的氯化钙；
步骤二.制备生物可降解材料支撑膜(选用生物衍生类材料)：取新鲜的牛皮肤，剥离表皮层和皮下脂肪层，取约3mm厚、直径为3cm大小的真皮层，用去离子水清洗；4℃去离子水浸泡使真皮层充分溶胀后，置于-80℃冷冻30min以上，至组织完全冻透后取出在37℃中融化，再反复2次；然后用0.5％的胰蛋白酶消化液消化皮片10h，随后用终浓度为3％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、2％的脱氧胆酸钠、1％的十二烷基硫酸钠的混合去垢剂清洗2天；再采用400U/ml的DNA酶消化液消化3h去除残留的DNA，用1M的NaOH溶液浸泡材料1h后，分别用PBS和纯水洗净材料后，经冷冻干燥、灭菌；得到生物衍生类材料支撑膜。
步骤三.将体外培养的角质形成细胞和黑色素细胞以培养基a为溶液制成单细胞悬液，混合比例为黑色素细胞1∶角质形成细胞5；将细胞悬液按5×104个/cm2的密度接种于培养皿中生物衍生类材料支撑膜上；加入培养基a使液面淹没支撑膜表面，每天换液培养3天，形成含色素的皮肤雏形。
步骤四.皮肤检测模型的成熟：取培养支架置于另一培养器皿中，把制备的皮肤雏形放在培养支架表面，加入培养基b，液面与生物可降解材料支撑膜上表面平齐，培养3天后更换为培养基c，液面略低于支撑膜上表面，培养3天后更换为培养基d，液面略高于培养支架上表面，培养5天，培养期间每天换液；则完成含色素的人工皮肤检测模型的制备。
所制备的含色素的人工皮肤检测模型，表皮层较厚且分化层次清晰，基底层细胞与支撑材料膜结合紧密，皮肤颜色呈灰色，主要用于化妆品美白功效检测。
Claims (3)
1.一种含色素的人工皮肤检测模型，采用有皮肤角质形成细胞和黑色素细胞，其特征在于：所述的含色素人工皮肤检测模型是把角质形成细胞和黑色素细胞复合接种于生物可降解材料支撑膜表面，经培养构建的具有活性的表皮层结构，包括基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层结构，在表皮层与其下方的生物可降解材料之间形成基底膜结构。
2.根据权利要求1所述的人工皮肤检测模型，其特征在于：所述的生物可降解材料为生物衍生类材料或是生物重组合类材料；所述的生物衍生类材料为脱细胞真皮、脱细胞粘膜、脱细胞羊膜、脱细胞小肠粘膜下层和脱细胞硬脑膜中的任一种；所述的生物重组合类材料是在细胞外基质复合物中，加有透明质酸、壳聚糖和硫酸软骨素的任一种或是几种的混合。
3.制备权利要求1所述的含色素的人工皮肤检测模型的方法，包括培养基的配制、生物可降解材料支撑膜的制备和人工皮肤检测模型的三维培养；其特征在于，具体步骤如下：
步骤一.配制培养基：将同体积的MCDB153商用培养液与K-SFM商用培养液混合为基础液；再按500ml基础液的标准加入碱性成纤维细胞生长因子50～750ng，胰岛素2～50ng，表皮细胞生长因子2～10μg，氢化可的松10～500μg，血管内皮素0.5～3μg，腺嘌呤10～20mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C 5～30mg，制成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基：
培养基a：基础培养基中含有5～50μg/ml浓度的牛垂体提取液；
培养基b：基础培养基中含有0.1～1m M浓度的氯化钙；
培养基 c ：基础培养基中含有 0.2 ～ 2m M 浓度的氯化钙；
培养基 d ：基础培养基中含有 0.3 ～ 3m M 浓度的氯化钙；
步骤二 . 制备生物可降解材料支撑膜：选择生物衍生类材料或生物重组合类材料中的任一种，制备直径为 1.5 ～ 6cm 、厚度为 1 ～ 3mm 的圆形膜状生物可降解材料支撑膜；
①采用生物衍生类材料制备生物可降解材料支撑膜的方法为：把去表皮层和皮下脂肪层后的新鲜动物皮肤，取 1 ～ 3mm 厚、直径为 1.5 ～ 6cm 大小的真皮层，用去离子水清洗；在 4 ℃用去离子水浸泡使真皮层溶胀后，取出置于 -80 ℃冷冻 30min 以上，至组织完全冻透后取出于 37 ℃中融化，反复 2 次以上；再用 w/v 为 0.1 ％～ 0.5 ％的胰蛋白酶消化液消化 4 ～ 24h ；然后用含有终浓度 w/v 为 0.5 ％～ 5 ％的 TritonX-100 、 0.5 ％～ 5 ％的脱氧胆酸钠和 0.5 ％～ 5 ％的十二烷基硫酸钠的混合去垢剂清洗；再采用 80 ～ 400U/ml 浓度的 DNA 酶消化液消化 1 ～ 5h ，最后用 1M 的 NaOH 溶液浸泡后，分别用 PBS 和纯水洗净，经冷冻干燥灭菌，得到生物衍生类材料支撑膜；
②采用生物重组合类材料制备生物可降解材料支撑膜的方法为：在 4 ℃条件下，按质量比将壳聚糖 1 ～ 2 ∶透明质酸 1 ～ 3 ∶硫酸软骨素 1 ∶细胞外基质复合物 7 ～ 10 混合，用 0.5M 的醋酸将其配制成浓度为 4 ～ 20mg/ml 的基质溶液，冰浴下紫外线照射后，按 50ml 基质溶液加入 10ml 的浓度为 110mg/ml 的 DF12 培养液，调 pH 至 7.2 ～ 7.4 ，制成凝胶溶液；将凝胶溶液加至φ 1.5 ～ 6cm 的培养皿中，用化学交联剂交联凝固后，将该材料置于 -80 ℃低压冷冻干燥成海绵状材料，其终厚度为 1 ～ 3mm ，得到生物重组合类材料支撑膜；
步骤三 . 将体外培养的角质形成细胞和黑色素细胞以培养基 a 为溶液制成单细胞混合悬液，黑色素细胞与角质形成细胞的数量比为 1 ～ 25 ∶ 25 ，再将细胞悬液按 1 × 104 ～ 5 × 104 个细胞 /cm2 的密度接种于培养皿内的生物可降解材料支撑膜表面；加入培养基 a 使液面淹没生物可降解材料支撑膜表面，培养 1 ～ 3 天，每天换液，形成含色素皮肤的雏形；
步骤四 . 皮肤检测模型的培养：把含色素皮肤的雏形置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养基 b 使液面与生物可降解材料支撑膜表面平齐，培养 3 天后更换为培养基 c ，液面略低于生物材料支撑膜表面，培养 2 ～ 3 天后更换为培养基 d ，液面略高于培养支架表面培养 3 ～ 5 天，培养期间每天换液；完成含色素人工皮肤检测模型的制备。
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