CN104841017B - 一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，它包括如下步骤：(a)取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度是80‑150mL/min，灌注的时间是5‑12小时；(b)灭菌，即可。本发明还提供了上述方法制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。本发明制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架抗凝血性能强、细胞相容性好，对种植于其上的细胞的生存、分化和增殖等起到了极为重要的支撑作用，为构建具有临床应用价值的异源性组织工程化生物抗凝支架提供了一种方便廉价的来源和制备方法。
Description
技术领域
本发明属于临床医学、生物医学与再生医学领域，具体涉及一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架及其制备方法。
背景技术
肝脏是人体十分重要的器官，被誉为人体的“解毒工厂、代谢化工厂”，但当其受到病毒、酒精、药物等多种因素严重侵害时，会造成肝细胞大量坏死，导致肝脏功能衰竭。迄今为止，受到供体器官短缺、手术过程繁复等特征制约的肝脏移植是临床上唯一有效的根治肝脏功能衰竭的方法。组织工程肝脏作为肝脏移植的潜在替代治疗手段，正在逐渐受到重视。其中，肝脏支架材料的质量是制备组织工程肝脏的核心要素之一。
去细胞化肝脏生物支架，具有与原肝脏相同的基质成分(如胶原、纤连蛋白、弹力蛋白等)和三维立体微结构，同时含有丰富的细胞因子和生长因子，是一种优秀的天然生物支架材料，与人工合成材料相比具有明显优势，是构建具有临床应用前景的理想肝脏支架材料来源。目前制备去细胞化肝脏生物支架的文献，大多是灌注肝脏直接去细胞化即可，以获得完整的细胞外支架网络。然而，单纯去细胞化的去细胞化肝脏生物支架血液相容性较差，在临床治疗中容易形成血栓。
通过对去细胞化肝脏支架进行灌注抗凝修饰，可以提高去细胞化肝脏生物支架的血液相容性，但是由于去细胞化肝脏支架的三维结构和血管网络非常复杂，要制备得到的抗凝能力强、支架各个部分抗凝效果均一、而且抗凝时间长的去细胞化支架材料非常难，已有的修饰方法复杂、制备成本高，而且抗凝血效果还不理想。
如，公开号为101850136的专利申请公开了层层自组装修饰猪肝去细胞化支架材料，以提高抗凝性能的方法，但是其需要用两种溶液和一种洗涤液分别交替灌注八次，在交替灌注过程中容易在灌注液中混入气泡，特别是对于大器官(如猪肝，猪肾)在高流速灌注时，溶液交替过程中很容易混入气泡，导致灌注修饰过程失败；同时，修饰后肝素含量最多只能达到12μg/mg组织干重，抗凝效果不佳，且修饰后肝素与材料是依靠静电力结合，结合不够牢固，释放速度快，24小时释放量达到50％以上，无法长期抗凝。
另外，Chen-Chi Tsai etal.“Effects of heparin immobilization on thesurface characteristics of a biological tissue"fixed with a naturallyoccurring crosslinkingagent(genipin):an in vitro study”，Biomaterials 22(2001)523-533、孙赳等，“肝素末端结合修饰猪肝去细胞化支架材料的抗凝性能研究”生物医学工程与临床2014年5月第18卷第3期、吴琼等“肝素层层自组装修饰猪肝去细胞化支架材料的抗凝血性能研究”，北京：中国科技论文在线，2014-3-19等许多文献均提供了对肝脏切片进行肝素化修饰的方法，具体是将肝脏切片浸泡在肝素溶液中进行修饰，但是由于去细胞化肝脏支架的三维结构和血管网络非常复杂，简单浸泡根本无法达到目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备过程简单、成本低廉的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架及其制备方法。
本发明提供了一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，它包括如下步骤：
(a)取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度是80-150mL/min，灌注的时间是5-12小时；
(b)灭菌，即可。
去细胞化肝脏生物支架，是通过去细胞化技术建立的完整保留肝脏三维结构和脉管系统的肝脏生物支架。
优选地，步骤a)中，所述去细胞化肝脏生物支架是用1％TritonX-100溶液和1％SDS溶液去细胞化处理得到的去细胞化肝脏生物支架。进一步优选地，所述去细胞化肝脏生物支架按照如下方法制备：取离体肝脏，用1％的Triton X-100溶液以200mL/min流速灌注3h，再用1％SDS溶液以200mL/min流速灌注6h，最后用1％Triton X-100溶液和去离子水灌洗去除残留SDS，获得去细胞化猪肝脏生物支架。
优选地，步骤(a)中，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度为1-3.3g/L。进一步优选地，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度为3.3g/L。
优选地，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中还含有亚硝酸钠、NaBH3CN和NaCl，它们的浓度依次为亚硝酸钠33mg/L、NaBH3CN 10mg/L、NaCl 0.15mol/L。
NaBH3CN：氰基硼氢化钠。
优选地，步骤(a)中，所述灌注为循环灌注。
循环灌注：是从肝门静脉灌流进入的灌流液从肝上下腔流出后，又继续从肝门静脉灌流进入，循环使用。
优选地，步骤(a)中，所述灌注的速度为100mL/min，灌注的时间为5-8小时。进一步优选地，所述灌注的速度为100mL/min，灌注的时间为6小时。
优选地，步骤(a)中，灌注时，环境温度为室温。
室温：指15～25℃。
优选地，步骤(b)中，所述灭菌采用含有抗生素的PBS溶液灌注，所述抗生素为青霉素/链霉素、氟康唑或甲硝唑。其中，所述灌注的速度为100-300mL/min，灌注的时间为6-24小时。优选地，所述灌注的速度为200mL/min，灌注的时间为6小时。所述含有抗生素的PBS溶液是含有青霉素/链霉素的PBS溶液，其中，青霉素的终效价为100U/mL，链霉素的终浓度为100μg/mL。
本发明还提供了前述任意一项方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
本发明方法制备简便、成本低廉，不仅可以用于猪肝脏，而且可以适用于各种与猪肝脏规格相近的大型动物肝脏，如人、猴、狗的肝脏，具有应用的广泛性。
本发明提供的制备具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的方法，抗凝修饰过程中只使用一种灌流液，修饰过程的操作简化，无交替灌流过程，避免了在气泡问题；修饰后肝素含量高，最高能达到20μg/mg组织干重；修饰后去细胞化肝脏生物支架表面均匀肝素化，支架各个部分的抗凝作用均一；并且末端修饰后，肝素与材料是形成共价结合，结合牢固，释放速度缓慢，24小时释放量仅为20％左右，利于长期抗凝。
本发明方法制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，保持了去细胞化肝脏生物支架上特定的微结构，具有抗凝血性能强、免疫原性低等特点，对种植于其上的细胞的生存、分化和增殖等起到了极为重要的支撑作用，能够用于体内组织重建，为构建具有临床应用价值的异源性组织工程化生物抗凝支架提供了一种方便廉价的来源。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1未去细胞化猪肝(图1A)和去细胞化猪肝支架(图1B)的HE染色结果。
图2未去细胞化猪肝(1、3、5、7、9和11泳道)和去细胞化猪肝支架(2、4、6、8、10和12泳道)样品DNA经过聚合酶链式反应扩增出的猪特异性DNA片段电泳结果。
图3未修饰的去细胞化猪肝支架(图3A)和经过肝素化全肝修饰的去细胞化支架(图3C)的甲苯胺蓝染色结果和未修饰的去细胞化猪肝支架(图3B)和经过肝素化全肝修饰的去细胞化支架(图3D)的扫描电镜结果。
图4猪肝支架各部位的肝素定量实验结果。
图5三种肝素化修饰材料中的肝素定量试验结果(图5A)和肝素释放量结果(图5B和图5C)。
图6肝素化修饰的三种凝血检测指标结果。
图7三种肝素化修饰方法在猪体内进行血液灌注实验照片(图7A、图7B和图7C)和HE染色结果(图7D)。
图8大鼠原代肝细胞(图8A和图8B)和人脐带血静脉细胞(图8C和图8D)种植在肝素化修饰材料表面的HE染色结果和免疫组化PCNA染色结果。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂与仪器如下：
实验用巴马香猪由四川大学华西医院实验动物中心提供，3月龄，体重15-25千克；肝素钠(成都市科龙化工试剂厂)；1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride，EDC，日本TOSHIMA公司)；聚二甲基二烯丙基氯化铵(polyelectrolyte polydiallydimethylammonium chloride，PDADMAC，美国SIGEMA-ALDRIH公司)；氰基硼氢化钠(NaBH3CN，成都市科龙化工试剂厂)；
酶标仪(BIOTEK，美国)；CA-50半自动血凝仪(SYSMEX，日本)。
实施例1本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备
1、实验方法
(1)获取去细胞化猪肝脏生物支架
本发明去细胞化肝脏生物支架可以以猪离体肝脏为原材料，采用常规的去细胞化方法处理得到，比如，可以按照如下方法制备：
从体重15-25kg实验用巴马香猪上取出肝脏，行0.1％乙二胺四乙酸(elhylenediamine tetraacetic acid,EDTA)液体灌注至肝脏内血液完全流尽，得猪离体肝脏，-20℃保存。
取猪离体肝脏，4℃解冻，用1％Triton X-100溶液以200mL/min流速灌注3h，1％十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulphate,SDS)溶液以200mL/min流速灌注6h，之后用1％Triton X-100溶液和去离子水灌洗去除残留SDS，获得去细胞化猪肝脏生物支架。
(2)抗凝修饰
a、抗凝修饰
制备肝素钠灌注液：在0℃的条件下配制浓度为1g/L的肝素钠水溶液，调整pH值为2.7；然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0℃的条件下搅拌2小时，调整pH值至7.0；再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0.15mol/L，调整pH至3.5。
室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，循环灌注6小时，流速为100mL/min。
b、灭菌
用PBS配置成含有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的PBS溶液。
完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
2、检测方法
将制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架分割成直径为1cm、厚度为300um的厚片，部分材料用于1％甲苯胺蓝水溶液染色，另部分用2.5％戊二醛固定后，经梯度酒精脱水处理，用扫描电镜观察材料表面形态。
为了检测整肝修饰中猪肝脏生物支架不同部位肝素分布的均一性，随机选取位于不同肝叶的不同部位的支架材料进行肝素含量测定。具体方法如下：将25mg甲苯胺蓝溶于500mL含有0.2％NaCl的0.01N HCl溶液中，配制成甲苯胺蓝染色液。配置不同浓度梯度的肝素溶液，各取2.5mL肝素溶液与2.5mL甲苯胺蓝染色液混合均匀，然后加入5mL己烷。摇晃混合液，使甲苯胺蓝和肝素形成混合物，溶解于有机相中。用酶标仪测定水相中的甲苯胺蓝残余量，测定波长为631nm，计算出肝素浓度的标准曲线。用木瓜蛋白酶消化待测材料，根据标准曲线测定消化液中肝素的含量。
3、检测结果
(1)去细胞化检测结果
结果如图1和图2所示：经过去细胞化过程使猪肝中的细胞成分得到清除，但细胞外基质成分得到保留(图1)；从未去细胞化猪肝(1、3、5、7、9和11泳道)和去细胞化猪肝支架(2、4、6、8、10和12泳道)样品中提取DNA后经过聚合酶链式反应扩增出的猪特异性DNA片段电泳结果(图2)。
实验结果证明，本发明得到的去细胞化肝脏生物支架中无DNA残留。
(2)本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的表面形态检测结果
结果如图3所示：
与未修饰的去细胞化肝脏生物支架相比，本发明抗凝修饰后的去细胞化肝脏生物支架能够被甲苯胺蓝染成蓝色，说明经过本发明抗凝修饰过程后，肝素大量且均匀地分布于支架材料表面(详见图3A、C)。
与未修饰的去细胞化肝脏生物支架相比，本发明抗凝修饰后的去细胞化肝脏生物支架然保留了细胞外基质疏松多孔的结构(详见图3B、D)。
实验结果说明，本发明抗凝修饰方法既可以使得去细胞化肝脏生物支架表面均匀肝素化，又不会改变其本身的多孔结构。
(3)本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的肝素均匀分布检测结果
结果如图4和下表1所示：
表1 不同部位的肝素含量(μg/mg组织干重)
猪肝支架各部位的肝素定量实验显示，各部位的修饰程度的差异小，其表面的肝素分布均匀，肝素含量平均可以达到16.01±0.22μg/mg组织干重。
实验结果说明，本发明方法制得的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，其表面的肝素分布均匀，抗凝效果优异。
本发明方法制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，表面的肝素分布均匀，抗凝效果优异，无DNA残留，具有天然的多孔的结构。
实施例2本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备
1、实验方法
(1)制备去细胞化猪肝脏生物支架：依照实施例1方法，制备获得去细胞化猪肝脏生物支架。
(2)抗凝修饰
a、抗凝修饰
制备肝素钠灌注液：在0℃的条件下配制浓度为3.3g/L的肝素钠水溶液，调整pH值为2.7。然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0℃的条件下搅拌2小时，调整pH值至7.0。再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0.15mol/L，调整pH至3.5。
室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，循环灌注6小时，流速为100mL/min。
b、灭菌
用PBS配置成含有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的PBS溶液。
完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
2、检测方法
依照实施例1中检测方法检测具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架中不同部位的肝素含量。
3、检测结果
检测结果如表2所示：
表2 不同部位的肝素含量(μg/mg组织干重)
本发明方法制得的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，其表面的肝素分布均匀，肝素含量平均可以达到20.67±0.25μg/mg组织干重，抗凝效果好。
实施例3本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备
1、实验方法
(1)制备去细胞化猪肝脏生物支架：依照实施例1方法，制备获得去细胞化猪肝脏生物支架。
(2)抗凝修饰
a、抗凝修饰
制备肝素钠灌注液：在0℃的条件下配制浓度为2g/L的肝素钠水溶液，调整pH值为2.7。然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0℃的条件下搅拌2小时，调整pH值至7.0。再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0.15mol/L，调整pH至3.5。
室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，再循环灌注6小时，流速为100mL/min。
b、灭菌
用PBS配置成含有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的PBS溶液。
完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
2、检测方法
依照实施例1中检测方法检测具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架中不同部位的肝素含量。
3、检测结果
检测结果如表3所示：
表3 不同部位的肝素含量(μg/mg组织干重)
本发明方法制得的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，其表面的肝素分布均匀，肝素含量平均可以达到18.51±0.19μg/mg组织干重，抗凝效果好。
实施例4本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备
1、实验方法
(1)获取去细胞化猪肝脏生物支架
同实施例1。
(2)抗凝修饰
a、抗凝修饰
制备肝素钠灌注液：在0℃的条件下配制浓度为1g/L的肝素钠水溶液，调整pH值为2.7；然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0℃的条件下搅拌2小时，调整pH值至7.0；再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0.15mol/L，调整pH至3.5。
室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，循环灌注6小时，流速为80mL/min。
b、灭菌
用PBS配置成含有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的PBS溶液。
完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
实施例5本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备
1、实验方法
(1)获取去细胞化猪肝脏生物支架
同实施例1。
(2)抗凝修饰
a、抗凝修饰
制备肝素钠灌注液：在0℃的条件下配制浓度为1g/L的肝素钠水溶液，调整pH值为2.7；然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0℃的条件下搅拌2小时，调整pH值至7.0；再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0.15mol/L，调整pH至3.5。
室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，循环灌注6小时，流速为150mL/min。
b、灭菌
用PBS配置成含有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的PBS溶液。
完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
实施例6本发明方法中抗凝修饰灌流时间的选择
在实验中，去细胞化猪肝脏生物支架来自于体重为20kg的巴马香猪。
1、实验方法
(1)制备去细胞化猪肝脏生物支架：依照实施例1方法，制备获得去细胞化猪肝脏生物支架。
(2)抗凝修饰
a、抗凝修饰
制备肝素钠灌注液：在0℃的条件下配制浓度为1g/L的肝素钠水溶液，调整pH值为2.7；然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0在的条件下搅拌2小时，调整pH值至7.0；再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0.15mol/L，调整pH至3.5。
室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，循环灌注5小时、6小时、7小时或者8小时，流速为100mL/min。
b、灭菌
用PBS配置成含有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的PBS溶液。
完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
2、检测方法
依照实施例1中检测方法检测具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架中不同部位的肝素含量。
3、检测结果
检测结果如下表：
表4 不同修饰时间的肝素含量(μg/mg组织干重)
| 时间 | 5h | 6h | 7h | 8h |
| 平均含量 | 13.2±0.18 | 16±0.12 | 16.5±0.08 | 16.6±0.11 |
可以看出，按照本发明方法灌注5-8h，去细胞化肝脏生物支架的肝素含量均在13.2±0.18μg/mg组织干重以上，6h以后的增加幅度不大，因此，综合考虑修饰效果和成本，灌流时间优选为6h。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1本发明方法与传统方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的比较
1、试验材料
(1)本发明方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架：实施例1方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架(记为/h-EPA)。
(2)传统的层-层自组装技术制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架(记为/h-LBL)(参见公开号为101850136的专利申请)：
制备方法如下：用去离子水配制浓度为1g/L的PDADMAC和浓度为1g/L的肝素溶液。从实施例1中得到的去细胞化猪肝支架的门静脉中灌注PDADMAC溶液，流速为100mL/min，灌注时间为30分钟，静置20分钟后灌注无菌PBS去除残留的PDADMAC，流速为100mL/min，灌注时间为10分钟。接着灌注肝素溶液，流速为100mL/min，灌注时间为30分钟，静置20分钟后灌注无菌PBS去除残留的肝素，流速为100mL/min，灌注时间为10分钟。重复PDADMAC溶液-肝素溶液的灌注循环过程共8次。完成修饰后，配制青霉素(100U/mL)/链霉素(100(g/mL)PBS溶液，灌注溶液达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，得到具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
(3)传统的多点附着共价结合技术制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架(记为/h-MPA)(使用的溶液参照Chen-Chi Tsai etal.【Effects of heparinimmobilization on the surface characteristics of a biological tissue"xed witha naturally occurring crosslinkingagent(genipin):an in vitro study】Biomaterials 22(2001)523-533)：
制备方法如下：配制浓度为1M的硫酸羟胺溶液，在37℃恒温的条件下，灌注从实施例1中得到的去细胞化猪肝支架的门静脉，流速为100mL/min，循环灌注12小时，然后灌注无菌PBS去除残留的硫酸羟胺，流速为100mL/min，灌注时间为10分钟。配制肝素-EDC溶液(1g/L肝素+2g/L EDC)，用0.05M HCl调节pH值至1.5，循环灌注6小时，流速为100mL/min。完成修饰后，配制青霉素(100U/mL)/链霉素(100g/mL)PBS溶液，灌注溶液达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，得到具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
2、试验方法
从肝素含量、肝素释放率、体内外凝血程度和材料再细胞化方面，对三种试验材料进行比较。其中：
2.1对肝素的检测：
用实施例1中的肝素测定方法检测三种试验材料中的肝素含量；
肝素释放量检测方法：将肝素修饰后的去细胞化肝脏生物支架分割10mg的小块，放入24孔培养板不同孔中，每孔加入PBS 2.5mL，检测7天内不同时间段肝素释放。
肝素累积释放率测定，对于同一孔样品分别于第0h、4h、8h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d取出所有孔中的溶液，然后再加入PBS 2.5mL，以便肝素继续释放。用实施例1中的肝素测定方法测定取出的PBS溶液中肝素含量，将每次的PBS中肝素含量叠加为总肝素释放量，除以材料中总的肝素含量为肝素累积释放率。
肝素持续释放率测定，在7天时间之内不更换PBS，将相同样品分为多个孔，分别于第0h、4h、8h、24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d取出所有孔中的溶液。用实施例1中的肝素测定方法测定取出的PBS溶液中肝素含量，将每次的PBS中肝素含量叠加为总肝素释放量，除以材料中总的肝素含量为肝素持续释放率。
2.2抗凝性检测：从体外和体内两个方面检测。
体外实验的方法是抽取健康人血液，与三种材料共培养，分别测定血浆凝血酶原时间(PT)、血浆凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)；
体内实验的方法是将修饰后的去细胞化猪肝的肝上下腔静脉与另一只猪的肾动脉相连接，经过1小时的血液灌流后取出材料，切片进行HE染色，观察凝血状态，进行血液相容性分析。
2.3为了检测三种肝素化修饰技术的细胞相容性，我们采用大鼠原代肝细胞或人脐静脉内皮细胞在猪肝材料上种植。具体方法为：对材料进行灭菌，放置于24孔板中。人脐静脉内皮细胞选用EA.hy926细胞株，大鼠原代肝细胞从200-300g成年雄性大鼠中分离，将上述细胞种植在材料中进行贴壁培养。种植24小时后，对细胞和材料共培养物固定，并切片进行HE染色和PCNA免疫组化染色。
3、试验结果
3.1对肝素的检测
3.1.1三种肝素化修饰材料中的肝素检测结果见图5A、表5所示。
表5 不同材料中的肝素含量(n＝6,±SD)
结果显示，本发明方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架(/h-EPA)的肝素含量明显高于传统层-层自组装技术修饰的猪肝支架材料(/h-LBL)和多点附着共价结合技术修饰的猪肝支架材料(/h-MPA)。
3.1.2经过两种体外释放测试7天后，肝素释放率结果显示见图5B、图5C和表6、表7所示。
表6 不同材料的肝素累积释放率(n＝3,平均值)
可以看出，本发明方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，在各个时间段，肝素的释放率都是最低的，如，在第7天时，释放率仅66.8％，比传统方法低了15.5％，可以有效保留肝素，达到长时间抗凝的作用。
表7 不同材料的肝素持续释放率(n＝3,平均值)
可以看出，本发明方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，在各个时间段，肝素的释放率都是最低的，如，在第7天时，释放率仅57.6％，比传统方法低了10.9％-16％，可以有效保留肝素，达到长时间抗凝的作用。
3.2抗凝性检测：
该部分实验的结果见图6、图7和表8-10所示。
表8 不同材料中TT值(n＝6,±SD)
表9 不同材料中PT值(n＝6,±SD)
表10 不同材料中APTT值(n＝6,±SD)
体内实验显示，对照组即为经过肝素化修饰的猪肝支架在20分钟内发生了严重的凝血反应，在材料内部形成了血栓淤积；层-层自组装技术修饰组(/h-LBL)和多点附着共价结合技术修饰组(/h-MPA)直到血液灌流1小时后仍能保持血流循环畅通，但在HE染色切片中发现有部分血管内部存在血栓，血管内部狭窄；本发明方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架(/h-EPA)中则没有明显的血栓形成。
综合体内外抗凝血结果显示，本发明方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架(/h-EPA)的三种凝血检测指标均高于其他两组，本发明方法与传统的两种修饰方法相比制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架抗凝集的能力更强。
3.3细胞相容性检测结果
该部分实验的结果如图8所示：
结果显示，大鼠原代肝细胞在支架上生存情况良好，各组之间没有明显差异，PCNA染色结果说明各组材料上种植的细胞具有一定的增殖。而人脐带血静脉细胞主要贴附在支架表面，形成单细胞层，PCNA染色结果说明内皮细胞在支架材料上能够正常生长。以上结果说明各肝素化修饰方法均具有良好的细胞相容性。
实验结果说明，本发明方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，肝素含量高，肝素在各个部分分布均匀，肝素的释放慢，抗凝血性能好，细胞相容性好。
对比例1
1、实验方法
(1)制备去细胞化猪肝脏生物支架：依照实施例1方法，制备获得去细胞化猪肝脏生物支架。
(2)抗凝修饰
a、抗凝修饰
制备肝素钠灌注液：在0℃的条件下配制浓度为1g/L的肝素钠水溶液，调整pH值为2.7；然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0℃的条件下搅拌2小时，调整pH值至7.0；再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0.15mol/L，调整pH至3.5。
室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，循环灌注6小时，流速为50mL/min。
b、灭菌
用PBS配置成含有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的PBS溶液。
完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
2、检测方法
依照实施例1中检测方法检测具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架中不同部位的肝素含量。
3、检测结果
结果发现，灌流速度为50mL/min，不能使整个肝脏均匀的肝素化，在中间区域平均肝素含量能达到19μg/mg组织干重，但越往边缘区域肝素越少，在肝包膜边缘几乎没有肝素。
对比例2
1、实验方法
(1)制备去细胞化猪肝脏生物支架：依照实施例1方法，制备获得去细胞化猪肝脏生物支架。
(2)抗凝修饰
a、抗凝修饰
制备肝素钠灌注液：在0℃的条件下配制浓度为1g/L的肝素钠水溶液，调整pH值为2.7；然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0℃的条件下搅拌2小时，调整pH值至7.0；再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0.15mol/L，调整pH至3.5。
室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，循环灌注6小时，流速为200mL/min。
b、灭菌
用PBS配置成含有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的PBS溶液。
完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
2、检测方法
依照实施例1中检测方法检测具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架中不同部位的肝素含量。
3、检测结果
结果发现，灌流速度为200mL/min，去细胞化肝脏生物支架的平均肝素含量反而只有12μg/mg组织干重，肝素含量过低。
对比例3
1、实验方法
(1)制备去细胞化猪肝脏生物支架：依照实施例1方法，制备获得去细胞化猪肝脏生物支架。
(2)抗凝修饰
a、抗凝修饰
制备肝素钠灌注液：在0℃的条件下配制浓度为1g/L的肝素钠水溶液，调整pH值为2.7；然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0℃的条件下搅拌2小时，调整pH值至7.0；再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0.15mol/L，调整pH至3.5。
室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，循环灌注3小时或4小时，流速为100mL/min。
b、灭菌
用PBS配置成含有青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的PBS溶液。
完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
2、检测方法
依照实施例1中检测方法检测具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架中不同部位的肝素含量。
3、检测结果
结果发现，灌流时间为3小时或者4小时时，去细胞化肝脏生物支架的平均肝素含量只有5.8μg/mg组织干重和10.3μg/mg组织干重，肝素含量过低。
综上，在本发明特定灌流速度、灌流时间和灌流液的配合下，制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，肝素含量高，最高可以达到20.67±0.25μg/mg组织干重，肝素在各个部分分布均匀，肝素释放慢，体内外抗凝效果显著，而且具有良好的细胞相容性，对种植于其上的细胞的生存、分化和增殖等起到了极为重要的支撑作用，为构建具有临床应用价值的异源性组织工程化生物抗凝支架提供了一种方便廉价的来源和制备方法，而采用本发明范围以外的灌流速度、灌流时间和灌流液则难以达到效果。
Claims (12)
1.一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，其特征在于：它由如下步骤制备：
（a）取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度是80-150mL/min，灌注的时间是5-12小时；
（b）灭菌，即可；
步骤（a）中，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度为1-3.3 g/L；所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中还含有亚硝酸钠、NaBH3CN和NaCl，它们的浓度依次为亚硝酸钠33 mg/L、NaBH3CN10 mg/L、NaCl 0.15mol/L；
步骤（b）中，所述灭菌采用含有抗生素的PBS溶液灌注，所述抗生素为青霉素/链霉素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a）中，所述去细胞化肝脏生物支架是用1 %TritonX-100溶液和1 %SDS溶液去细胞化处理得到的去细胞化肝脏生物支架。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述去细胞化肝脏生物支架按照如下方法制备：
取猪离体肝脏，用1% 的Triton X-100溶液以200 mL/min流速灌注3h，再用1% SDS溶液以200 mL/min流速灌注6h，最后用1% Triton X-100溶液和去离子水灌洗去除残留SDS，获得去细胞化猪肝脏生物支架。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度为3.3g/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（a）中，所述灌注为循环灌注。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（a）中，所述灌注的速度为100mL/min，灌注的时间为5-8小时。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述灌注的速度为100mL/min，灌注的时间为6小时。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（a）中，灌注时，环境温度为室温。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（b）中，所述灌注的速度为100-300mL/min，灌注的时间为6-24小时。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述灌注的速度为200mL/min，灌注的时间为6小时。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述含有抗生素的PBS溶液是含有青霉素/链霉素的PBS溶液，其中，青霉素的终效价为100U/mL，链霉素的终浓度为100μg/mL。
12.权利要求1-11任意一项方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
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