CN107412865A - 高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架及制备方法 - Google Patents

高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架及制备方法，涉及再生医学的技术领域，制备方法如下：(1)取去细胞化肾脏生物支架，用戊二醛溶液进行灌注后，再用肝素交联溶液进行灌注；(2)无菌保存。肝素修饰过程中只使用一种灌流液，制备过程简单、成本低廉。本发明提供的一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架，具有生物力学强度高，交联改性使支架的血液相容性高，同时支架表面的抗凝性能更完整、均一等优点，对种植于其上的细胞的生长分化增殖等起到了支撑作用，能够用于体内组织重建，为构建具有临床应用价值的异源性组织工程化生物抗凝支架提供了一种方便廉价的来源。

Description

高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架及制备 方法
技术领域
本发明涉及临床医学、生物医学与再生医学领域，尤其是涉及一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架及制备方法。
背景技术
人类器官组织在整个生命过程中均有可能出现不可逆损伤。肾脏是人体的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水份及其他有用物质，如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、钠离子、钾离子、碳酸氢钠等，以调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。肾脏同时还有内分泌功能，生成肾素、促红细胞生成素、活性维生素D3、前列腺素、激肽等，又为机体部分内分泌激素的降解场所和肾外激素的靶器官。肾脏的这些功能，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。但患有慢性肾功能衰竭或尿毒症时，肾单位严重损毁，使机体在排泄代谢废物和调节水、电解质及酸碱平衡等方面发生紊乱。目前整个医学界更偏向通过行器官组织的移植来恢复其原有功能，然而供体供不应求的现象成为了器官移植进一步发展的瓶颈，我们急需一种新的方法以缓解供体匮乏的现状，即组织工程学。组织细胞工程学研究中的支架材料分两大类，即人工合成材料和天然材料。合成材料虽具有良好强度，但组织相容性差，降解产物主要为乳酸，易造成局部无菌性炎症，影响种子细胞和症状因子的活性和增殖。因此去细胞化生物支架最具应用潜力，因其有人工合成材料所不具备的独特优势，包括：低免疫原性；细胞外基质保留完整，能促进细胞在支架内黏附和增殖；血管脉络系统结构存留完整；为细胞的迁移、增殖和分化提供合适的3D环境；去细胞化支架在体内降解产物安全无毒，无刺激性。
利用去细胞化肾支架移入人体内修复肾损伤具备较强的应用潜力，其中，肾脏支架材料的质量是制备组织工程肝素的关键之一，目前提高生物支架的生物力学性能的方法主要是浸泡于能提高生物力学性能的溶液中，这样虽然提高了支架外表面的生物力学性能，但是对支架内部的改性并不显著。此外，目前制备去细胞化肾脏生物支架的方法，大多是灌注肾脏直接去细胞化，以获得完整的细胞外支架网络。然而，单纯去细胞化获得的生物支架血液相容性较差，在临床治疗中容易形成血栓。因而，目前采用抗凝交联改性的方法制备各种器官的生物支架，抗凝交联改性方法主要是通过将支架组织浸泡于抗凝液内进行震荡交联，该交联方案靠渗透进行交联的弊端在于组织内部交联不均一、不完整，所以更适用于组织薄，单一简单的组织，但遇到具有复杂脉管三维结构的器官，如肾脏器官，简单的浸泡震荡根本无法达到目的。
因此，开发一种制备过程简单、成本低廉，生物力学强度高，组织相容性高，同时使支架表面的抗凝性能更完整、均一的去细胞化肾支架，也日益成为研发的重点。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架的制备方法，以克服现有技术中存在的制备过程复杂，成本过高的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架，以克服现有技术中存在的生物力学性能差，抗凝性能不均一的技术问题。
本发明提供的一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架的制备方法如下：
(1)取去细胞化肾脏生物支架，用戊二醛进行灌注后，再用肝素交联溶液进行灌注；
(2)无菌保存。
进一步的，所述用戊二醛进行灌注的方法为：用0.2％－1.2％W/V的戊二醛溶液以2mL/min的速度灌注1200－1600mL；优选地，用0.625％W/V的戊二醛溶液以2mL/min的速度灌注1440mL。
进一步的，所述用肝素交联溶液进行灌注的方法为：
用0.8－5g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注100－400mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水；优选地，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
进一步的，所述肝素交联溶液由下述方法制得：将240－1500mg肝素钠、400－800mg EDC和200－500mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应5－15min；优选地，制备所述肝素交联溶液的方法为将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
进一步的，所述MES溶液由下述方法制得：将6－12g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；优选地，制备所述MES溶液的方法为将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0。
进一步的，所述用肝素交联溶液进行灌注的温度为25－45℃，优选地，所述用肝素交联溶液进行灌注的温度为37℃。
进一步的，所述无菌保存为将步骤(1)中制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl的浓度为0.9％W/V。
进一步的，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1。
进一步的，所述无菌保存的温度为4℃。
进一步的，本发明还提供了前述任一项的制备方法制备的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架。
本发明提供的一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架的制备方法，肝素修饰过程中只使用一种灌流液，制备过程简单、成本低廉。
本发明提供的一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架，具有生物力学强度高，交联改性使支架的血液相容性高，同时支架表面的抗凝性能更完整、均一等优点，对种植于其上的细胞的生长分化增殖等起到了支撑作用，能够用于体内组织重建，为构建具有临床应用价值的异源性组织工程化生物抗凝支架提供了一种方便廉价的来源。
附图说明
图1A为实施例1－2提供的组织相容性HE染色结果；
图1B为实施例1－4提供的组织相容性HE染色结果；
图1C为实施例1－5提供的组织相容性HE染色结果；
图1D为实施例1－6提供的组织相容性HE染色结果；
图2A为对比例1提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的HE染色结果；
图2B为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的HE染色结果；
图3A为对比例2提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的扫描电镜结果；
图3B为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的扫描电镜结果；
图4A为对比例3提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的甲苯胺蓝染色结果；
图4B为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的甲苯胺蓝染色结果；
图5A为对比例4提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的血小板粘附实验结果；
图5B为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的血小板粘附实验结果；
图6A为对比例5提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养4h的实验结果；
图6B为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养4h的实验结果；
图6C为对比例5提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养16h的实验结果；
图6D为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养16h的实验结果；
图7A为对比例6提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋4D的HE染色实验结果；
图7B为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋4D的HE染色实验结果；
图7C为对比例6提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋1W的HE染色实验结果；
图7D为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋1W的HE染色实验结果；
图7E为对比例6提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋2W的HE染色实验结果；
图7F为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋2W的HE染色实验结果；
图7G为对比例6提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋8W的HE染色实验结果；
图7H为实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋8W的HE染色实验结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明人出人意料的发现，将去细胞化肾脏生物支架，用戊二醛进行灌注后，再用肝素交联溶液进行灌注，可以得到生物力学强度高，血液相容性高，表面的抗凝性能更完整、均一的一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架。
(1)用戊二醛溶液进行灌注
本发明中，戊二醛溶液为戊二醛水溶液，所述戊二醛水溶液的浓度为0.2％－1.2％W/V，优选浓度为0.625％W/V；
本发明中，戊二醛溶液的灌注速度为2mL/min；
本发明中，戊二醛溶液的灌注体积为1200－1600mL，优选体积为1440mL。
(2)用肝素交联溶液进行灌注
本发明中，肝素交联溶液由下述方法制得：将240－1500mg肝素钠、400－800mgEDC和200－500mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应5－15min；优选地，肝素交联溶液由下述方法制得：600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min；
本发明中，MES溶液由下述方法制得：将6－12g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；优选地，MES溶液由下述方法制得：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；
本发明中，肝素交联溶液的浓度为0.8－5g/L，优选浓度为2g/L；
本发明中，肝素交联溶液的灌注速度为1mL/min；
本发明中，肝素交联溶液的灌注体积为100－400mL，优选体积为240mL；
本发明中，肝素交联溶液的灌注温度为25－45℃，优选地，所述肝素交联溶液的灌注温度为37℃；
本发明中，肝素交联溶液灌注结束后继续灌注去离子水，去离子水的灌注速度为2mL/min，灌注体积为1500mL；
(3)无菌保存
本发明中，将制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液为NaCl水溶液，所述NaCl水溶液的浓度为0.9％W/V；
本发明中，青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1；
本发明中，无菌保存的温度为4℃；
在优化的条件下，本发明方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架，生物力学强度高，肝素含量高，支架表面的抗凝性能更完整、均一。
本发明的方法可以在传统的市售设备或装置中进行，本领域普通技术人员可以根据本发明方法的条件自行设计所用的设备或装置。所用试剂均为市售，也可以自制。
实施例：
(一)本发明所用的实验试剂与仪器：
SD大鼠，由温州医科大学茶山校区动物中心提供，雄性，体重250±20g，自由进食并在标准条件下饲养；
肝素钠(上海博蕴生物科技有限公司)，1－(3－二甲氨基丙基)－3乙基碳二亚胺(1－ethyl－3－3－dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride，EDC，上海博蕴生物科技有限公司)，2－(N－Morpholino)ethanesulfonic Acid(MES，美国Sigma公司)，SDS(sodium lauryl sulfate，上海博蕴生物科技有限公司)，Triton－X100(上海博蕴生物科技有限公司)，NHS(N－羟基琥珀酰亚胺，美国Sigma公司)，甲苯胺蓝(美国Sigma公司)，25％戊二醛(国药集团化学试剂有限公司)；
酶标仪(上海安亭科学仪器厂)，扫面电子显微镜(S－3000N型，日本日立公司)，荧光显微镜图像采集系统(上海安亭科学仪器厂)。
(二)实验
实施例一
取去细胞化肾脏生物支架，本发明去细胞化肾脏生物支架可以以大鼠离体肾脏为原料，采用去细胞化方法处理得到，比如，可以按照如下方法制备：
取SD雄性大鼠(250g)，0.6mL/100g予以5％水合氯醛腹腔内注射麻醉，腹部备皮固定于动物架，开腹后结扎肠系膜上动脉及左肾动脉上方的腹主动脉，经下方腹主动脉置入2号留置针并固定，剪破上、下腔静脉促使血液尽快流出，连接蠕动泵，立即以8mL/min的速度予以0.01％肝素溶液，去血30min，接着依次以5mL/min的速度灌入去细胞溶液1％Triton－X100 300mL，之后以5mL/min的速度灌入0.8％SDS 500mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500ml去离子水，获得去细胞化大鼠肾脏生物支架。
在去细胞化肾脏生物支架制备结束后，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
配置MES溶液：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；
配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL上述MES溶液中，37℃预反应10min。
在37℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
将上述方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1，4℃保存。
(1)戊二醛水溶液浓度
实施例1－1
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将0.2％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
实施例1－2
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
实施例1－3
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将1.2％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
上述实施例1－1至1－3的去细胞化肾脏生物支架，在戊二醛水溶液灌注结束后，配置MES溶液：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
在37℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
将上述方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1，4℃保存。
为了检测不同浓度戊二醛水溶液灌注，对去细胞化肾脏生物支架生物力学性能的影响，对实施例1－1至1－3的生物支架进行最大抗张强度和最大伸长断裂率的检测，具体方法为：将各组灌注戊二醛水溶液后的组织块取出，将组织修剪成类哑铃型；通过游标卡尺测量中间部分的矩形部分长(a)和宽(b)，测三点取平均值，PBS保持样本湿润；预实验检测时取一哑铃状肾支架，测力机器双侧夹头夹紧组织，两夹头之间距离I0等于3mm，荷载拉力为1N，拉伸速度设定为1mm/min，计算机记录获得拉力－位移曲线，直至组织被拉断停止测定；每个样本组织重复进行修样和测量，测力机器双侧夹头夹紧组织后，按预实验设定的荷载拉力及拉伸速度开始测定三组样本组织。数据分析：设样品初长度为I0，初始横截面积为A(即长X宽)，样品受力F拉伸后长度为I，应力等于F/A，应变等于(I－I0)/I0，实验数据均用均数±标准差表示，用t检验和方差分析(AVONA)利用SPSS12.0进行分析。
实施例1－1至1－3的实验条件和实验结果列于表1中。
表1戊二醛水溶液浓度
由表1结果得出，当灌注的戊二醛水溶液浓度为0.625％W/V和1.2％W/V时，最大抗张强度和最大伸长断裂率较0.2％W/V时均有显著提升，为了进一步确定戊二醛水溶液优选浓度，进行如下实验：
实施例1－4
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将浓度为0.8％W/V的戊二醛水溶液以2mL/min的速度灌注1440mL。
实施例1－5
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将浓度为1.0％W/V的戊二醛水溶液以2mL/min的速度灌注1440mL。
实施例1－6
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将浓度为1.2％W/V的戊二醛水溶液以2mL/min的速度灌注1440mL。
上述实施例1－4至1－6的去细胞化肾脏生物支架，在戊二醛水溶液灌注结束后，配置MES溶液：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
在37℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
将上述方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1，4℃保存。
为了进一步确定戊二醛水溶液的优选浓度，进行组织相容性检测，实施例1－2，1－4至1－6的组织相容性的检测方法为：将灌注了浓度为0.625％W/V、0.8％W/V、1.0％W/V和1.2％W/V的戊二醛水溶液的去细胞化肾脏生物支架，分别进行皮下包埋，包埋两周后，HE染色观察组织相容性，结果如图所示：其中图1A为0.625％W/V戊二醛水溶液灌注，图1B为0.8％W/V戊二醛水溶液灌注，图1C为1.0％W/V戊二醛水溶液灌注，图1D为1.2％W/V戊二醛水溶液灌注，可见图1A有血管生成及炎细胞浸润，图1B图1C和图1D均无血管生成。
(2)戊二醛水溶液灌注体积
实施例2－1
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1200mL。
实施例2－2
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
实施例2－3
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1600mL。
上述实施例2－1至2－3的去细胞化肾脏生物支架，在戊二醛水溶液灌注结束后，配置MES溶液：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
在37℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
将上述方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1，4℃保存。
实施例2－1至2－3的最大抗张强度和最大伸长断裂率的检测方法，依照实施例1－1至1－3。
实施例2－1至2－3的实验条件和实验结果列于表2中。
表2戊二醛水溶液灌注体积
(3)MES水溶液制备方法
取实施例一制备的去细胞化肾脏支架，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
实施例3－1
配置MES水溶液：将6g MES溶于400mL纯水，调节pH值为6.0；配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
实施例3－2
配置MES水溶液：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
实施例3－3
配置MES水溶液：将12g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
上述实施例3－1至3－3的高强度的去细胞化肾脏生物支架，在MES水溶液和肝素交联溶液配置完成后，在37℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
将上述方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1，4℃保存。
为了检测不同MES水溶液的制备方法对肝素含量的影响，具体实验方法如下：将25mg甲苯胺蓝溶于500mL含有0.2％W/VNaCl的0.01N HCl溶液中，配制成甲苯胺蓝染色液。配置不同浓度梯度的肝素交联溶液，各取2.5mL肝素交联溶液与2.5mL甲苯胺蓝染色液混合均匀，然后加入5mL己烷。摇晃混合液，使甲苯胺蓝和肝素形成混合物，溶解于有机相中。用酶标仪测定水相中的甲苯胺蓝残余量，测定波长为631nm，计算出肝素浓度的标准曲线。用木瓜蛋白酶消化待测材料，根据标准曲线测定消化液中肝素的含量。
实施例3－1至3－3的实验结果列于表3中。
表3MES水溶液制备方法(μg/mg组织干重)
实施例 3－1 3－2 3－3
含量 2.41±0.33 3.32±0.21 2.73±0.19
(4)肝素交联溶液浓度
取实施例一制备的去细胞化肾脏支架，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
配置MES水溶液：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0。
实施例4－1
配置肝素交联溶液：将240mg肝素钠、400mg EDC和200mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
实施例4－2
配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
实施例4－3
配置肝素交联溶液：将1500mg肝素钠、800mg EDC和500mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
上述实施例4－1至4－3的高强度的去细胞化肾脏生物支架，在肝素交联溶液配置完成后，在37℃条件下，以1mL/min的速度分别灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
将上述方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1，4℃保存。
为了检测不同肝素交联溶液浓度对肝素含量的影响，依照实施例3－1至3－3中的检测方法进行肝素含量的测定。
实施例4－1至4－3的实验结果列于表4中。
表4肝素交联溶液的制备方法(μg/mg组织干重)
实施例 4－1 4－2 4－3
浓度(W/V) 0.8 2 5
含量 2.71±0.32 3.44±0.29 3.12±0.23
(5)肝素交联溶液制备的预反应温度
取实施例一制备的去细胞化肾脏支架，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
配置MES水溶液：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0。
实施例5－1
配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应5min。
实施例5－2
配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应10min。
实施例5－3
配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL MES溶液中，37℃预反应15min。
上述实施例5－1至5－3的高强度的去细胞化肾脏生物支架，在肝素交联溶液配置完成后，在37℃条件下，以1mL/min的速度分别灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
将上述方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1，4℃保存。
为了检测肝素交联溶液制备时不同的预反应温度对肝素含量的影响，依照实施例3－1至3－3中的检测方法进行肝素含量的测定。
实施例5－1至5－3的实验结果列于表5中。
表5不同的预反应温度(μg/mg组织干重)
实施例 5－1 5－2 5－3
含量 2.99±0.12 3.48±0.19 3.17±0.23
(6)肝素交联溶液灌注体积
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
配置MES溶液：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；
配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL上述MES溶液中，37℃预反应10min。
实施例6－1
在37℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注100mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
实施例6－2
在37℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
实施例6－3
在37℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注400mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
将上述方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1，4℃保存。
为了检测不同肝素交联溶液灌注体积对肝素含量的影响，依照实施例3－1至3－3中的检测方法进行肝素含量的测定。
实施例6－1至6－3的实验结果列于表6中。
表6肝素交联溶液灌注体积(μg/mg组织干重)
实施例 6－1 6－2 6－3
含量 2.12±0.22 3.51±0.24 3.31±0.63
(7)肝素交联溶液的灌注温度
取实施例一制备的去细胞化肾脏生物支架，将0.625％W/V的戊二醛水溶液，以2mL/min的速度灌注1440mL。
配置MES溶液：将9.79g MES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；
配置肝素交联溶液：将600mg肝素钠、600mg EDC和360mg NHS混合于300mL上述MES溶液中，37℃预反应10min。
实施例7－1
在25℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
实施例7－2
在37℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
实施例7－3
在45℃条件下，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
将上述方法制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1，4℃保存。
为了检测不同肝素交联溶液的灌注温度对肝素含量的影响，依照实施例3－1至3－3中的检测方法进行肝素含量的测定。
实施例7－1至7－3的实验结果列于表7中。
表7肝素交联溶液的灌注温度(μg/mg组织干重)
实施例 7－1 7－2 7－3
含量 1.96±0.34 3.47±0.14 1.28±0.23
以下用对比例的方式说明本发明的有益效果：
为了比较利用本发明实施例一所示的一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架的制备方法制备的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架(交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架)与单纯经过浓度为0.625％W/V的戊二醛水溶液以2mL/min的速度灌注1440mL的大鼠去细胞化肾脏生物支架(未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架)的构造，表面形态与肝素附着程度，表面肝素分布情况，表面血小板粘附情况，细胞相容性和组织相容性，以及本发明制备的去细胞化大鼠肾脏生物支架与传统方法制备的去细胞化大鼠肾脏生物支架的肝素含量及分布均一程度对比，进行如下实验：
对比例1
本发明制备的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架与未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架的构造对比：
将肾脏制成5um的石蜡切片，进行HE染色，显微镜下进行观察。
结果如图所示，图2A为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的HE染色结果，图2B为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的HE染色结果。
通过图2A和图2B的HE染色结果对比可明确，肝素交联后的去细胞肾支架可完全保持原有构造，肾小球等完整。
对比例2
本发明制备的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架与未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架的表面形态与肝素附着程度对比：
将去细胞化肾脏支架切取成0.5cmx0.3cm大小组织块，冰冻切片机切面，0.5％戊二醛浸泡大于12h；将组织块依次进行75％酒精，80％酒精，90％酒精，95％酒精及100％酒精依次进行脱水3次(5min/次)；将组织块放入干燥槽内，编号后放入临界点干燥器中利用CO2干燥；将干燥后组织块固定于铜板上，编号后放入真空喷镀仪中给样本喷金；在电子扫描电镜下进行样本观察，根据实际需要采集图像。
结果如图所示，图3A为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的扫描电镜结果，图3B为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的扫描电镜结果。
通过图3A和图3B的扫描电镜结果可明确，与未交联肝素的去细胞化肝脏生物支架相比，本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架依然保留了细胞外基质疏松多孔的结构，肝素大量且均匀地分布于支架材料表面。实验结果说明，本发明实施例一提供的交联肝素的方法既可以使得去细胞化肝脏生物支架表面均匀肝素化，又不会改变其本身的多孔结构。
对比例3
本发明制备的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架与未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架的表面肝素分布情况对比：
将切片进行甲苯胺蓝染色，显微镜下观察拍片观察。
结果如图所示，图4A为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的甲苯胺蓝染色结果，图4B为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的甲苯胺蓝染色结果。
通过图4A和图4B的甲苯胺蓝染色可明确，肝素已均一分部于支架，所以可见肝素修饰后的去细胞肾支架呈蓝色，包括血管及肾小球均质蓝染。
对比例4
本发明制备的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架与未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架的表面血小板粘附情况对比：
取250g SD雄鼠一只，真空抽取静脉血10mL，低温离心机1220转/min离心5min，取上清液制备为实验用血浆，将去细胞肾支架切取成0.5cmx0.3cm大小组织块，冰冻切片机进行组织块切面，进行血小板粘附试验。
结果如图所示，图5A为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的血小板粘附实验结果，图5B为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架的血小板粘附实验结果。
通过图5A和图5B的血小板粘附实验可明确，未进行肝素修饰的去细胞肾支架表面可见广泛的血小板附着，而进行肝素修饰后的去细胞肾支架表面无明显血小板附着，主要为药物颗粒附着，实验结果表明本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架抗凝性能良好。
对比例5
本发明制备的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架与未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架的细胞相容性对比：
A组将本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养4h，B组将本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养4h，C组将本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养16h，D组将本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养16h，光学显微镜下观察实验结果。
结果如图所示，图6A为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养4h的实验结果；图6B为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养4h的实验结果；图6C为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养16h的实验结果；图6D为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与MSc细胞共培养16h的实验结果。
通过图6A、6B、6C及6D的结果可见，支架与细胞共培养，可见随时间变化，MSc细胞能在交联肝素后的去细胞化肾支架表面良好增殖及生长，说明其具备良好的细胞相容性。
对比例6
本发明制备的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架与未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏生物支架的组织相容性对比：
分别将本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架与未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架进行皮下包埋实验，在包埋后的4D，1W，2W和8W时，制成5um的石蜡切片，进行HE染色，分别显微镜下观察实验结果。
结果如图所示，图7A为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋4D的HE染色实验结果；图7B为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋4D的HE染色实验结果；图7C为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋1W的HE染色实验结果；图7D为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋1W的HE染色实验结果；图7E为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋2W的HE染色实验结果；图7F为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋2W的HE染色实验结果；图7G为本对比例提供的未交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋8W的HE染色实验结果；图7H为本发明实施例一提供的交联肝素的去细胞化大鼠肾脏支架皮下包埋8W的HE染色实验结果。
通过图7A至图7H的结果可见，随时间变化，支架内炎症反应逐渐减轻，包埋支架边缘形成新生血管并逐渐增多变粗，最后布满整个支架，支架正逐步降解，说明交联肝素后的去细胞肾支架具备良好的组织相容性。
本发明制备的去细胞化大鼠肾脏生物支架与传统方法制备的去细胞化大鼠肾脏生物支架的肝素含量及分布均一程度对比：
对比例7
传统的层－层自组装技术(layer－by－layer shlf－assembly，LBL)制备的具有抗凝血性能的去细胞化大鼠肾脏生物支架。
用去离子水配制浓度为1g/L的PDADMAC溶液和浓度为2g/L的肝素溶液。从本发明实施例一中得到的去细胞化大鼠肾脏支架置于6孔板内，将6孔板置于定规摇床上，每孔加入PDADMAC溶液1mL，摇动10min后，静置20min。吸除PDADMAC溶液，加入去离子水1mL摇动洗涤10min。吸除去离子水后加入肝素溶液1mL，摇动10min，静置20min。吸除肝素溶液加入去离子水，摇动10min，吸除去离子水。重复上述步骤8次，最后吸尽孔板内液体，去离子水洗2次，－20℃保存。
对比例8
传统的多点连接修饰(multi－point attachment，MPA)制备的具有抗凝血性能的去细胞化大鼠肾脏生物支架。
将本发明实施例一中得到的去细胞化大鼠肾脏支架置于6孔板内，将6孔板置于定规摇床上，加入1mol/L的硫酸羟胺盐溶液37℃摇动12h。吸除硫酸羟胺盐溶液，用去离子水洗3次，加入肝素钠－EDC溶液(1.67g EDC，0.835g肝素钠，0.05mol/L盐酸200mL，调节pH至1.5)，摇动48h。吸除肝素钠－EDC溶液，去离子水漂洗2次，－20℃保存。
对比例9
末端连接修饰(end－point attachment，EPA)制备的具有抗凝血性能的去细胞化大鼠肾脏生物支架。
用0℃去离子水配置300mL浓度为2g/L肝素钠溶液，加入10mg亚硝酸钠，用1mol/L盐酸调节pH至2.7，搅拌2h使肝素钠解聚。用1mol/L NaOH调节pH至7.0。聚肝素钠溶液中加入氰基硼氢化钠(10mg/L)及NaCl(0.15mol/L)，用1mol/L盐酸调节pH至3.5.向装有发明实施例一中得到的去细胞化大鼠肾脏支架的6孔板中加入1mL上述溶液，37℃静置2h。吸除溶液，去离子水洗2次，－20℃保存。
为了检测四组不同方法肝素修饰过程中大鼠肾脏生物支架不同部位肝素分布的均一性，随机选取位于肾脏不同部位的支架材料进行肝素含量测定。具体方法如实施例3－1至3－3。
本发明实施例一的大鼠肾脏支架不同部位肝素含量的结果列于表8中。
表8本发明实施例一的大鼠肾脏支架不同部位肝素含量(μg/mg组织干重)
部位 A1 A2 A3 A4 A5
含量 3.47±0.33 3.29±0.21 3.44±0.22 3.31±0.19 3.38±0.24
对比例7的大鼠肾脏支架不同部位肝素含量的结果列于表9中。
表9对比例7大鼠肾脏支架不同部位肝素含量(μg/mg组织干重)
部位 B1 B2 B3 B4 B5
含量 2.42±0.13 3.11±0.31 2.09±0.22 1.31±0.39 3.38±0.27
对比例8的大鼠肾脏支架不同部位肝素含量的结果列于表10中。
表10对比例8大鼠肾脏支架不同部位肝素含量(μg/mg组织干重)
部位 C1 C2 C3 C4 C5
含量 1.72±0.43 3.66±0.21 2.17±0.12 1.99±0.19 2.38±0.21
对比例9的大鼠肾脏支架不同部位肝素含量的结果列于表11中。
表11对比例9大鼠肾脏支架不同部位肝素含量(μg/mg组织干重)
部位 D1 D2 D3 D4 D5
含量 2.12±0.11 3.01±0.21 1.09±0.29 1.42±0.29 2.37±0.22
大鼠肾脏支架各部位的肝素定量实验显示，本发明实施例一的大鼠肾脏支架各部位的肝素含量差异小，其表面的肝素分布均匀，肝素含量平均可以达到3.39±0.24μg/mg组织干重；对比例7的大鼠肾脏支架各部位的肝素含量差异大，其表面的肝素分布不均匀，且肝素含量平均仅为2.46±0.26μg/mg组织干重；对比例8的大鼠肾脏支架各部位的肝素含量差异大，其表面的肝素分布不均匀，且肝素含量平均仅为2.38±0.23μg/mg组织干重；对比例9的大鼠肾脏支架各部位的肝素含量差异大，其表面的肝素分布不均匀，且肝素含量平均仅为2.00±0.22μg/mg组织干重。实验结果说明，本发明实施例一方法制得的具有抗凝血性能的去细胞化肾脏生物支架，其表面的肝素含量高，且肝素分布完整、均一。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架的制备方法，其特征在于：
(1)取去细胞化肾脏生物支架，用戊二醛溶液进行灌注后，再用肝素交联溶液进行灌注；
(2)无菌保存。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述用戊二醛进行灌注的方法为：用0.2％－1.2％W/V的戊二醛溶液以2mL/min的速度灌注1200－1600mL；优选地，用0.625％W/V的戊二醛溶液以2mL/min的速度灌注1440mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述用肝素交联溶液进行灌注的方法为：
用0.8－5g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注100－400mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水；优选地，用2g/L的肝素交联溶液以1mL/min的速度灌注240mL，结束后继续以2mL/min的速度灌入1500mL去离子水。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肝素交联溶液由下述方法制得：将240－1500mg肝素钠、400－800mgEDC和200－500mgNHS混合于300mLMES溶液中，37℃预反应5－15min；优选地，肝素交联溶液由下述方法制得：600mg肝素钠、600mgEDC和360mgNHS混合于300mLMES溶液中，37℃预反应10min。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述MES溶液由下述方法制得：将6－12gMES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0；优选地，MES溶液由下述方法制得：将9.79gMES溶于900mL纯水，调节pH值为6.0。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述用肝素交联溶液进行灌注的温度为25－45℃，优选地，所述用肝素交联溶液进行灌注的温度为37℃。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无菌保存为将步骤(1)中制得的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架浸泡在含有青霉素－链霉素的NaCl溶液中，所述NaCl溶液的浓度为0.9％W/V。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述青霉素－链霉素的合计含量为105IU/L，所述青霉素－链霉素的含量比为2：1。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无菌保存的温度为4℃。
10.权利要求1－9任一项所述的制备方法制备的高强度的具有抗凝血功能的去细胞化肾脏生物支架。
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