CN111849864A - 一种三维肿瘤模型脱细胞衍生基质支架的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种三维肿瘤模型脱细胞基质支架的构建方法及其应用，属于细胞生物学及肿瘤组织工程材料领域。以猪源性肾脏组织为主要材料，将其切块后，经脱细胞试剂的作用脱除细胞，之后采用冷冻干燥技术、化学交联技术制备猪肾脱细胞基质多孔支架。采用该方法制备的支架很好的保留了肾的基质、血管以及肾小球结构，且基质的生物活性得到了很好的保存，材料的利用率高且支架获取量可观；接种癌细胞后，细胞在支架的生长良好、立体分布，细胞在各层均有不同程度的渗透。

Description

一种三维肿瘤模型脱细胞衍生基质支架的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞生物学及肿瘤组织工程材料领域，提供一种三维肿瘤模型脱细胞多孔支架的构建方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，已成为一种严重危害人类健康的常见病、多发病。随着肿瘤靶点及抗癌药物的不断发现，选择真实模拟体内肿瘤组织的模型是筛选有效抗癌药物的重要手段。
实体肿瘤在体内以三维模式生长，其发生发展过程是肿瘤细胞与其微环境及机体之间不断相互作用的结果。肿瘤微环境是影响细胞分泌、粘附、增殖分化、侵袭和转移等生物学行为的重要因素。体外3D肿瘤模型能够在体外构建与体内相近的细胞生长系统，较好地提供肿瘤细胞生长的三维空间结构及模拟细胞生长的微环境，体现肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互作用。因此，体外构建的三维肿瘤模型受到了越来越多研究者的青睐，用于肿瘤细胞生物学行为及抗癌药物筛选的研究。
目前，组织工程技术已逐步用于构建体外三维肿瘤模型，研究结果表明肿瘤细胞接种于支架材料后形成的三维结构比二维平面更好模拟体内肿瘤组织，特别是模拟细胞间及细胞-胞外基质间相互作用。其中使用的支架材料多为天然材料和高分子合成材料，高分子合成材料在降解性能及可塑性方面基本能满足支架材料的要求，但是其生物相容性远不如天然材料，而天然材料弊端主要在于机械性能差，多需要与其他材料复合。器官/组织来源的脱细胞基质生物材料因能直接保留天然胞外基质微环境被逐渐应用在生物医学领域。其主要是利用脱细胞技术去除组织/器官中的细胞成分和遗传物质，尽可能的保留原ECM成分、生物活性及机械性能，去细胞后拥有良好的结构脉络网，为细胞提供了理想的生长环境。其中，猪源性肾组织在生理结构及基因组学等方面与人体肾相似。猪肾脱细胞基质不仅包含多种蛋白如胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白及蛋白多糖等，猪肾有复杂且多孔的三维结构为细胞生长及增殖提供了一个更加接近人体环境的三维空间。目前关于制备猪肾脱细胞基质支架多用于构建组织工程肾，为治疗慢性肾功能衰竭的一项有效手段—肾移植提供供体，且其去细胞化的方法大都是采用全器官灌注法进行脱细胞，借助肾组织的脉络循环清除所有的细胞成分。这种方法通常需要沿肾动脉插入留置针以建立灌注通道，在一定的灌注压强下，将脱细胞试剂经蠕动泵贯穿全肾，来达到全器官肾去细胞化的效果，而且需要大量的脱细胞试剂来完成该操作。全器官肾脱细胞支架正是解决器官移植问题，脱细胞针对整个肾脏组织，必须建立一个无菌的灌注系统，接下来的接种细胞再生肾，同样需要在无菌的环境下进行，操作缺乏灵活性。
本发明以猪源性肾脏组织为研究对象，将猪的肾盂及肾纤维囊部位切除，剩下的猪肾切成体积为10～16cm3的块状，用十二烷基磺酸钠(离子型去细胞试剂)去除细胞成分，待细胞除去小块变为透明状基质时放入冷冻干燥机进行干燥，得到多孔的三维肿瘤模型支架。为了改善支架的稳定性和机械性能，在此基础上，通过化学交联法对猪肾脱细胞支架进行交联。该发明获得的猪肾源脱细胞衍生基质支架用于体外构建3D肿瘤模型，表现出良好的生物相容性，支架上细胞呈现的生长模式与人体内实体瘤更加接近，适用于抗癌药物的筛选研究。
发明内容
本发明的内容旨在建立一种以猪肾脱细胞基质支架为平台的三维肿瘤模型，构建方法以及在治疗疾病方面的应用。这种方法制备出来的支架基质保留的十分完整且生物活性也得到很好的保存，操作简单且支架获取量可观。
为了达到以上所说的效果，本发明的技术方案为：
一种三维肿瘤模型脱细胞基质支架的构建方法，所述构建方法以猪源性肾脏组织为主要材料，待脱除细胞后，采用冷冻干燥方法得到多孔支架，包括以下步骤：
(1)从市场取来新鲜的猪肾，将其用清水洗净至水无明显血色，将洗净的猪肾放入－20～－30℃的冰箱冷冻10～14h。
(2)待其冷冻成型后，将猪肾切成两块，并把猪的肾盂及肾纤维囊部位切除，接着将剩下的肾脏切成体积为10～16cm3的小块。
(3)室温下，将切成的肾小块放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗，每隔半小时换一次液，持续3～4次，去除猪肾小块中的血丝以及去除腥味。清洗过程在磁力搅拌器作用下，为了不破坏猪肾小块的结构，采用低速搅拌，搅拌速率为5～15rpm。
(4)室温下，将步骤(3)处理过的肾小块放入质量分数为0.5～1％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液中，为了保证肾小块结构的完整性，在低速磁力搅拌(搅拌速率为5～15rpm)的条件下，搅拌时间为48～72h(适当换液)。
(5)室温下，将步骤(4)中脱细胞后的基质放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗6～10次，每隔20min换次液。
(6)将步骤(5)中的基质放入－20～－30℃的冰箱中冷冻3～5h。将冷冻后的猪肾脱细胞基质冷冻干燥，得到多孔脱细胞基质支架。所述的冷冻干燥的冷阱温度为－45～－55℃，冷冻干燥时间为14～19h。
(7)将步骤(6)得到的脱细胞基质支架置于交联剂中，并在摇床中常温交联36～48h。所述交联剂为以下成分组成的混合溶液，各成分为：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、乙磺酸(MES)、乙醇溶液。其中MES作为缓冲液。所述混合溶液中EDC浓度为50mmol/L、NHS浓度为50mmol/L、MES浓度为50mmol/L、乙醇溶液的体积分数为50～55％。
(8)交联后的脱细胞基质支架采用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5～6次，每隔30min换液。最后，将清洗后的猪肾脱细胞支架冷冻干燥8～12h，成功制备猪肾源脱细胞衍生基质支架。
采用上述方法制备得到的用于构建三维肿瘤模型的猪肾脱细胞基质支架具有肾独特的三维多孔结构，且肾小球结构保留完整，孔径的大小范围在127～238μm；血管结构保留完整，血管孔径在927～1383μm范围内；猪肾脱细胞基质支架各方面性能如下：支架的吸水率为799.44±15.65％，孔隙率为81.09±4.63％，当应变为0.3时的应力为133.25kPa，当应变为0.7时的应力为847.28kPa。
采用上述方法制备得到的猪肾脱细胞基质支架应用于三维肿瘤模型的构建，接种癌细胞后，细胞在支架的生长状况良好，且观察到细胞在各层均有不同程度的渗透，在支架中呈立体分布。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点和有益效果：
(1)本发明制备的三维肿瘤模型的猪肾脱细胞基质支架作为体外3D肿瘤模型，用于抗肿瘤药物的筛选研究。该三维肿瘤模型脱细胞基质支架具有良好的生物相容性，同时肾拥有独特三维多孔结构以及肾小球结构，为细胞的生长增殖提供了良好的三维空间，为进一步研究肿瘤细胞粘附、生长、迁移和侵袭提供模拟细胞生长的微环境。
(2)本发明选取猪肾源性肾脏组织作为体外构建肿瘤模型的支架，猪肾组织具有其特殊的多孔结构，可以为细胞提供良好的生长增殖空间。另外猪肾结构复杂，由26种以上类型的细胞构成，细胞外基质是细胞长期生存的过程中所合成和分泌的一种物质，所以猪肾的基质种类含有26种以上，由于基质对细胞的生长、增殖等有着促进作用，而且相似的基质对于细胞也是有着相类似的作用，因此本身由于其它基质的生物相容性是本发明选取猪肾构建肿瘤模型的关键。猪源性组织易于获取且在生理及组织等方面与人肾相似，可以更加真实的模拟人体的胞外基质及肿瘤生长环境。又因为胶原是猪肾脱细胞基质支架的主要成分之一，经过EDC/NHS化学交联后，显著提高该支架的力学性能，有利于满足肿瘤细胞长期培养形成较大的细胞集落的支撑条件。
(3)本发明将整个猪肾组织先预冻后切块，因冷冻后的肾组织更易切块而且易切成体积相仿的肾小块。本发明并不是直接将全器官猪肾脱细胞，而是将猪肾切成小块进行脱细胞处理，这样增加肾和脱细胞试剂的接触面积，脱细胞效果更好；同时减少了脱细胞试剂的用量；所有的支架全是来自于同一个肾，保证所有检查来源的同一性；支架接种细胞构建的三维肿瘤模型可以在正常培养皿中培养并容易做一系列检测。
附图说明
图1为本发明猪肾小块(对比例1)的SEM图；
图2为本发明猪肾脱细胞基质(对比例1)交联前的SEM图；
图3(a)是本发明猪肾脱细胞基质(对比例2)的HE染色图；
图3(b)是本发明猪肾脱细胞基质(对比例2)的Masson染色图；
图4为本发明猪肾脱细胞基质(实施例1)交联后的SEM图；
图5(a)为本发明猪肾源脱细胞衍生基质支架(实施例2)上接种乳腺癌细胞(MCF-7细胞)后1天，3天，7天，10天，14天和21天的生长状况的激光共聚焦显微镜图片；
图5(b)为本发明猪肾源脱细胞衍生基质支架(实施例2)上接种MCF-7细胞后1天和7天的多层扫描堆叠3D对照图；
图5(c)为本发明猪肾源脱细胞衍生基质支架(实施例2)上接种MCF-7细胞7天后的局部放大(放大倍数200倍)的激光共聚焦电子显微镜图片；
图6(a)为本发明猪肾脱细胞基质支架(实施例3)上接种MCF-7细胞3天时细胞渗透状况的激光共聚焦显微镜图片；
图6(b)为本发明猪肾源脱细胞衍生基质支架(实施例3)上接种MCF-7细胞7天时细胞渗透状况的激光共聚焦显微镜图片；
图6(c)为本发明猪肾源脱细胞衍生基质支架(实施例3)上接种MCF-7细胞14天时细胞渗透状况的激光共聚焦显微镜图片；
图6(d)为本发明猪肾源脱细胞衍生基质支架(实施例3)上接种MCF-7细胞21天时细胞渗透状况的激光共聚焦显微镜图片。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的具体实施方式进一步详细描述。本发明并不限于下述实施例，在不脱离前后所述宗旨的范围内，所有基于本发明基本思想的修改和变动，都属于本发明请求保护的技术范围内。
对比例1猪肾脱细胞三维肿瘤模型支架的制备及脱细胞效率
(1)从市场取来新鲜的猪肾，将其用清水洗净至水无明显血色，将洗净的猪肾放入－20℃的冰箱冷冻10h。
(2)待其冷冻成型后，将猪肾切成两块，并把猪的肾盂及肾纤维囊部位切除，接着将剩下的肾脏切成体积为10cm3的小块。
(3)室温下，将切成的肾小块放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗，每隔半小时换一次液，持续3次，去除猪肾小块中的血丝以及去除腥味。清洗过程在磁力搅拌器作用下，为了不破坏猪肾小块的结构，采用低速搅拌，搅拌速率为5rpm。
(4)室温下，将步骤(3)处理过的肾小块放入质量分数为0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液中，为了保证肾小块结构的完整性，在低速磁力搅拌(搅拌速率为5rpm)的条件下，搅拌时间为48h(适当换液)。
(5)室温下，将步骤(4)中脱细胞后的基质放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗6次，每隔20min换次液。
(6)将步骤(5)中的基质放入－20℃的冰箱中冷冻3h。将预冻后的猪肾脱细胞基质冷冻干燥，得到多孔脱细胞基质支架。所述的冷冻干燥的冷阱温度为－45℃，冷冻干燥时间为14h，得到多孔的猪肾脱细胞基质支架。
本发明对于猪肾脱细胞三维肿瘤模型支架脱细胞效率的检测是从两个方面进行考察。一种方式为通过SEM考察基质细胞的清除效果；另外一种方式是通过HE和Masson染色观察脱细胞效果。从图1、2、3中可以看出脱细胞的效果十分的良好，脱细胞试剂对于基质的破坏并不明显，从HE和Masson的染色说明脱细胞操作并未对猪肾基质的结构造成很大破坏，肾小球结构保留的完整，这是脱细胞效果好坏的一个重要因素。从扫描电镜看出猪肾三维肿瘤模型支架有着多孔的结构，可以为细胞提供良好的生长增殖空间。从以上内容得出脱细胞的效果良好。
对比例2猪肾脱细胞三维肿瘤模型支架的制备及脱细胞效率
(1)从市场取来新鲜的猪肾，将其用清水洗净至水无明显血色，将洗净的猪肾放入－30℃的冰箱冷冻14h。
(2)待其冷冻成型后，将猪肾切成两块，并把猪的肾盂及肾纤维囊部位切除，接着将剩下的肾脏切成体积为16cm3的小块。
(3)室温下，将切成的肾小块放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗，每隔30min换一次液，持续4次，去除猪肾小块中的血丝以及去除腥味。清洗过程在磁力搅拌器作用下，为了不破坏猪肾小块的结构，采用低速搅拌，搅拌速率为15rpm。
(4)室温下，将步骤(3)处理过的肾小块放入质量分数为1％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液中，为了保证肾小块结构的完整性，在低速磁力搅拌(搅拌速率为15rpm)条件下，搅拌时间为72h(适当换液)。
(5)室温下，将步骤(4)脱细胞后的基质放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗10次，每隔20min换次液。
(6)将步骤(5)中的基质放入－30℃的冰箱中冷冻5h。将预冻后的猪肾脱细胞基质冷冻干燥，得到多孔脱细胞基质支架。所述的冷冻干燥的冷阱温度－55℃，冷冻干燥时间为19h，得到多孔的猪肾脱细胞基质支架。
实施案例1猪肾源脱细胞三维肿瘤模型支架的交联与性能测试
(1)从市场取来新鲜的猪肾，将其用清水洗净至水无明显血色，将洗净的猪肾放入－25℃的冰箱冷冻12h。
(2)待其冷冻成型后，将猪肾切成两块，并把猪的肾盂及肾纤维囊部位切除，接着将剩下的肾脏切成体积为13cm3的小块。
(3)室温下，将切成的肾小块放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗，每隔30min换一次液，持续3次，去除猪肾小块中的血丝以及去除腥味。清洗过程在磁力搅拌器作用下，为了不破坏猪肾小块的结构，采用低速搅拌，搅拌速率为8rpm。
(4)室温下，将步骤(3)处理过的肾小块放入质量分数为0.8％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液中，为了保证肾小块结构的完整性，在低速磁力搅拌(搅拌速率为8rpm)的条件下，搅拌时间为58h(适当换液)。
(5)室温下，将步骤(4)中脱细胞后的基质放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗6次，每隔20min换次液。
(6)将步骤(5)中的基质放入－25℃的冰箱中预冻4h。将预冻后的猪肾脱细胞基质冷冻干燥，得到多孔脱细胞基质支架。所述的冷冻干燥的冷阱温度为－50℃，冷冻干燥时间为16h，得到多孔的猪肾脱细胞基质支架。
(7)将步骤(6)得到的脱细胞基质支架置于150ml的交联剂中，并在摇床中常温交联42h。所述交联剂为以下成分组成的混合溶液，各成分为：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、乙磺酸(MES)、乙醇溶液。其中MES作为缓冲液。所述混合溶液中EDC浓度为50mmol/L、NHS浓度为50mmol/L、MES浓度为50mmol/L、乙醇溶液的体积分数为50％。
(8)交联后的脱细胞基质支架采用pH为7.4的PBS缓冲液清洗6次，每隔30min换液。最后，将清洗后的猪肾脱细胞支架冷冻干燥8h，成功制备猪肾源脱细胞衍生基质支架。
图4为猪肾脱细胞基质支架交联后的扫描电镜图片，和图2未交联的支架松散且不规则相比，交联后的支架孔径更加规整且紧凑，由扫描电镜可看出孔径为127～238μm，也可看出支架的多孔结构，为肿瘤细胞的生长提供良好的空间。在应变同为0～0.7时，未交联和交联后的支架有着明显的差异，特别在两支架都达到最大应变0.7(70％)时，未交联的支架的压缩模量为404.97±22.63kPa，而交联后的支架的压缩模量为847.28±58.05kPa，交联后显著增加的支架结构稳定性，为三维肿瘤细胞模型的构建提供了环境。交联使得分子链上的亲水基团数量减少，分子链间更加紧密，支架的吸水率降低，由976.57±17.46％降低到799.44±15.65％。另外，交联对支架的孔隙率也有一定的影响，从交联前的84.14±3.2％，到交联后的81.09±4.63％，但两者并没有显著性差异。
实施案例2猪肾源脱细胞三维肿瘤模型支架的交联与性能测试
(1)从市场取来新鲜的猪肾，将其用清水洗净至水无明显血色，将洗净的猪肾放入－30℃的冰箱冷冻14h。
(2)待其冷冻成型后，将猪肾切成两块，并把猪的肾盂及肾纤维囊部位切除，接着将剩下的肾脏切成体积为16cm3的小块。
(3)室温下，将切成的肾小块放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗，每隔30min换一次液，持续4次，去除猪肾小块中的血丝以及去除腥味。清洗过程在磁力搅拌器作用下，为了不破坏猪肾小块的结构，采用低速搅拌，搅拌速率为15rpm。
(4)室温下，将步骤(3)处理过的肾小块放入质量分数为1％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液中，为了保证肾小块结构的完整性，在低速磁力搅拌(搅拌速率为15rpm)条件下，搅拌时间为72h(适当换液)。
(5)室温下，将步骤(4)脱细胞后的基质放入pH＝7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液中浸泡清洗10次，每隔20min换次液。
(6)将步骤(5)中的基质放入－30℃的冰箱中冷冻5h。将预冻后的猪肾脱细胞基质冷冻干燥，得到多孔脱细胞衍生基质支架。所述的冷冻干燥的冷阱温度－55℃，冷冻干燥时间为19h，得到多孔的猪肾脱细胞基质支架。
(7)将步骤(6)得到的脱细胞基质支架置于200ml的交联剂中，并在摇床中常温交联42h。所述交联剂为以下成分组成的混合溶液，各成分为：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、乙磺酸(MES)、乙醇溶液。其中MES作为缓冲液。所述混合溶液中EDC浓度为50mmol/L、NHS浓度为50mmol/L、MES浓度为50mmol/L、乙醇溶液的体积分数为55％。
(8)交联后的脱细胞基质支架采用pH为7.4的PBS缓冲液清洗6次，每隔30min换液。最后，将清洗后的猪肾脱细胞支架冷冻干燥12h，成功制备猪肾源脱细胞衍生基质支架。
实施例3猪肾源脱细胞衍生基质支架作为肿瘤模型
取交联后的猪肾源脱细胞衍生基质支架将其表面致密的外层用刀片切掉，切成长×宽×高分别为5mm×5mm×2mm的规整支架，是为了控制支架体积这个变量，更好的比较细胞在我们实验不同变量下的生长情况以及肿瘤模型构建情况。将处理后的交联支架放入装满75％酒精的6孔板中浸泡3次后换掉酒精后放入灭菌台内紫外灭菌一夜。换用PBS浸泡3h后，加入DMEM培养基中浸润，超净台内风干。待所有灭菌步骤完成后将培养基吸走，接种MCF-7细胞，持续21天。
将MCF-7细胞接种在猪肾源脱细胞衍生支架构建肿瘤模型，其激光共聚焦显微镜图显示：在第1天，由激光共聚焦的结果看，细胞大多分布在支架的中间位置，且细胞数量较少。随着时间的增加，细胞的数量逐渐增加，到第7天时，细胞已经分布在支架的所有部位，且大都以集落状态存在。在到达第10天时，明显比第七天的细胞更加聚集，且集落现象更加明显。当达到21天时，支架上以长满乳腺癌细胞，到处都是大大小小的集落，充满整个支架。本发明所构建的三维肿瘤模型在这一步已初步构建成功，另外，呈现了多层扫描后堆叠的3D图，可以清楚的看出细胞在支架中立体分布情况。
由猪肾源脱细胞衍生基质支架上生长的激光共聚焦显微镜照片可以看出：待肿瘤模型构建3天后，采用激光共聚焦显微镜多层扫描考察了复合物支架表面及其以下100μm深度细胞在支架的分布。可以看出细胞在各层均有不同程度的渗透，细胞分布在支架孔壁及孔隙中，且生长良好，同时也可以清晰地看出猪肾源脱细胞衍生基质支架的形态。在接种第3天时，细胞基本都生长在支架的表面。在培养7天时，细胞慢慢渗入到支架内部，且随着时间的推移，癌细胞渗透的越深。到达21天时，癌细胞已经渗透在支架内，且形成细胞集落。另外，由明场显微图片的透光率的下降，也充分说明支架上细胞增殖迅速。
以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种三维肿瘤模型脱细胞基质支架的构建方法，其特征在于，所述构建方法以猪源性肾脏组织为主要材料，待脱除细胞后，采用冷冻干燥方法得到的多孔支架具有肾独特的三维多孔结构，且肾小球结构保留完整；包括以下步骤：
(1)从市场取来新鲜的猪肾，将其用清水洗净至水无明显血色，将洗净的猪肾放入－20～－30℃的冰箱冷冻10～14h；
(2)待其冷冻成型后，切除猪的肾盂及肾纤维囊部位，将剩下的肾脏切成多个肾块；
(3)室温下，将步骤(2)的肾块放入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡清洗，每隔半小时换一次液，持续多次，去除猪肾小块中的血丝以及去除腥味；
(4)室温下，将步骤(3)处理过的肾小块放入质量分数为0.5～1％的十二烷基磺酸钠水溶液中，在低速磁力搅拌的条件下，搅拌时间为48～72h；
(5)室温下，将步骤(4)中脱细胞后的基质放入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡清洗6～10次，每隔20min换次液；
(6)将步骤(5)中的基质放入－20～－30℃的冰箱中冷冻3～5h；将冷冻后的猪肾脱细胞基质冷冻干燥，得到多孔脱细胞基质支架；
(7)将步骤(6)得到的脱细胞基质支架置于交联剂中，并在摇床中常温交联36～48h；
(8)交联后的脱细胞基质支架采用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5～6次，每隔30min换液；最后，将清洗后的猪肾脱细胞支架冷冻干燥8～12h，制备猪肾源脱细胞衍生基质支架。
2.根据权利要求1所述的一种三维肿瘤模型脱细胞基质支架的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中清洗过程采用低速搅拌，搅拌速率为5～15rpm。
3.根据权利要求1所述的一种三维肿瘤模型脱细胞基质支架的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中搅拌速率为5～15rpm。
4.根据权利要求1所述的一种三维肿瘤模型脱细胞基质支架的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)的冷冻干燥的冷阱温度为－45～－55℃，冷冻干燥时间为14～19h。
5.根据权利要求1所述的一种三维肿瘤模型脱细胞基质支架的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中交联剂为以下成分组成的混合溶液，各成分为：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，N-羟基琥珀酰亚胺NHS、乙磺酸MES、乙醇溶液，其中MES作为缓冲液；所述混合溶液中EDC浓度为50mmol/L、NHS浓度为50mmol/L、MES浓度为50mmol/L、乙醇溶液的体积分数为50～55％。
6.采用权利要求1-5任一所述的制备方法得到的三维肿瘤模型脱细胞基质支架应用于三维肿瘤模型的构建，接种癌细胞后，细胞在支架的生长状况良好，且观察到细胞在各层均有不同程度的渗透，在支架中呈立体分布。
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