CN104144715B - 胶原蛋白结构体及胶原蛋白结构体的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种胶原蛋白结构体，其特征在于：由平均直径为1～5μm的胶原纤维构成，含水量为0～15(w/w)％，胶原蛋白密度为50～800mg/cm3。将胶原蛋白酸性溶液调节至中性以生成胶原纤维，之后通过过滤等形成胶原蛋白浓度为12～50(w/v)％的粗胶原纤维。将该粗胶原纤维模制成规定形状，之后进行干燥即可制得。由于该胶原蛋白结构体是以胶原蛋白分子缔合形成的胶原纤维为材料，所以细胞浸润性优异，并且胶原蛋白密度与机体内的胶原蛋白组织等价，所以将其填充在机体的缺损部时组织再生力优异，可适用于再生医疗用人工材料等。
Description
技术领域
本发明涉及包含胶原纤维的胶原蛋白结构体、以及所述胶原蛋白结构体的制造方法。
背景技术
胶原蛋白是形成鱼或猪、牛等的生皮、肌腱、骨等的主要蛋白质。由于胶原蛋白在动物间的同源性高，所以其抗原性低，机体亲和性或组织适应性优异，作为医用材料的原材料具有优异的特性。在机体组织发生任何异常的情况下，作为可以稳定供给移植组织、且可以避免免疫排斥反应的人工材料等，人们正在开发以胶原蛋白为原料的各种构件。
例如，有一种细胞侵入性医用材料，所述材料是在由合成树脂等构成的载体上结合或包覆了螺旋结构含量为0～80％的变性胶原蛋白(专利文献1)。虽然胶原蛋白的组织亲和性优异，但在机体内胶原蛋白会被胶原蛋白酶分解。为了避免这种分解，使用进行了交联处理、并提高了体内残留性的胶原蛋白。专利文献1中记载的细胞侵入性医用材料在埋入机体内或覆盖于创伤面时对机体内的分解酶具有抵抗性，在一定期间可保持必要的机械强度，并且与细胞、组织的亲和性良好，增殖了的细胞容易进入其内部。
另外，还有如下技术：在用醋酸调节胶原蛋白稀释溶液的pH后添加戊二醛，并进行冷冻干燥，将所形成的交联胶原蛋白海绵用作人工皮肤(专利文献2)。已知若将胶原蛋白海绵埋植在烧伤等患处，则通过其多孔质的结构提供适合成纤维细胞增殖的无数个孔，帮助成纤维细胞增殖，由此促进患处的痊愈，但现有的胶原蛋白海绵是使胶原蛋白溶液发泡来调制的，所以步骤复杂。在上述专利文献2中，不必将胶原蛋白溶液发泡，即可调制胶原蛋白海绵。
另外，还有由胶原蛋白的微孔性水凝胶构成的胶原蛋白海绵(专利文献3)。在专利文献3中，其特征在于：将预先调制的胶原蛋白海绵用亲水性有机溶剂的水溶液湿润，之后进行冷冻干燥处理以使其干燥。胶原蛋白海绵可用作人工皮肤或创伤包覆材料等，但现有的胶原蛋白海绵是在溶液中湿润来进行保存的，胶原蛋白容易发生变质。另一方面，干燥后保存时会发生挛缩。专利文献3正是鉴于这一点而提出的。在实施例中，将浓度为0.3％的来自猪的肌腱的缺端胶原在冰冷下搅匀，放入方形模板内冷冻后进行真空冷冻干燥，再进行真空热干燥以使其交联，然后浸在戊二醛溶液中使其交联。将如此调制的胶原蛋白海绵用亲水性有机溶剂的水溶液润湿，接着在不易发生挛缩的大约-80℃以下的温度下冷冻干燥，则能够明显减少干燥体的裂纹。
另外，还有一种边使胶原蛋白溶液浓缩边模制成管状或面状以制造胶原蛋白结构体的技术(专利文献4)。所述技术是使胶原蛋白溶液经由透过性构件与聚乙二醇等浓缩剂接触，浓缩至50～100mg/ml的胶原蛋白浓度，再将该浓缩溶液模制成环状，从而形成环状的胶原蛋白结构体。
另外，还有一种胶原蛋白凝胶，所述胶原蛋白凝胶是使具有缓冲能力的盐水溶液和交联剂同时与未进行纤维化的胶原蛋白溶液接触以使胶原纤维之间交联而形成的(专利文献5)。胶原蛋白凝胶作为细胞载体、医疗用材料等有效，但其热稳定性差，有时凝胶强度不充分。在使蛋白质交联剂与胶原蛋白凝胶接触的现有的交联方法中，是在胶原纤维表面进行交联，交联剂并没有渗透到凝胶的中心部，所以凝胶的热稳定性没有充分提高。根据专利文献5，通过在胶原蛋白的纤维化过程中在纤维间发生交联反应，可以通过交联以及纤维化来提高胶原蛋白凝胶的机械强度和热稳定性。
另外，还有一种胶原蛋白材料，所述材料是由用非纤维化胶原蛋白层夹持胶原蛋白超微细纤维性无纺布状多层体而得到的层叠体构成的(专利文献6)。将胶原蛋白与尼龙等合成高分子材料组合得到的医用材料有可能引起来源于合成高分子材料的肉芽形成或炎症等，在利用戊二醛或环氧化物等进行的胶原蛋白的交联中，是鉴于交联剂的毒性问题等问题而提出的。
此外，还有密度为约0.01～0.3g/cm3的胶原蛋白移植片(专利文献7)。所述移植片是在去端肽胶原的酸性水溶液中添加碱使胶原蛋白沉淀，将沉淀物溶解形成分散液，在流延成所期望的厚度后进行瞬时冷冻而形成胶原蛋白基质，再压缩该基质使厚度为约1～20mm。至少有80％的孔的直径为35～282μm。
而且，还有一种高密度培养组织的制造方法，所述的制造方法是循环培养含有胶原蛋白和动物细胞的细胞培养液，使胶原蛋白和动物细胞高密度地聚集(专利文献8、专利文献9)。根据专利文献8、专利文献9中记载的方法，通过简单的操作，可以迅速制成胶原蛋白和动物细胞高密度聚集的人工组织。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特公平06-022579号公报
专利文献2：日本专利第4681214号公报
专利文献3：日本特公平07-000100号公报
专利文献4：日本专利第3221690号公报
专利文献5：日本专利第4064435号公报
专利文献6：日本专利第4251665号公报
专利文献7：日本专利第2820209号公报
专利文献8：日本专利第4671365号公报
专利文献9：日本特开2010-172247号公报
发明内容
发明所要解决的课题
机体中的胶原蛋白在细胞外以纤维状存在，以每单位湿重量计，以如下的高浓度构成各种组织：皮肤中25％、肌腱中32％、软骨中16％、骨中23％、象牙质中18％。机体内的胶原蛋白具有3条多肽链进行螺旋缠绕的结构，形成长约300nm、粗达1.5nm的原胶原，该原胶原一点一点地错位缔合，形成被称作胶原蛋白细纤维的更粗更长的纤维。骨基质或软骨基质由该胶原蛋白细纤维构成。另外，所述的多个胶原蛋白细纤维进一步缔合，形成被称作胶原纤维的强大的纤维。其粗度为数μm至数十μm左右，构成皮肤的真皮或肌腱等。这样，通过胶原蛋白分子的缔合形成适合于组织的胶原纤维结构，由此发挥着各种功能。
但是，上述专利文献1～3以及专利文献6、专利文献7中制造的胶原蛋白制品，都是使用浓度比机体内的胶原蛋白浓度低的胶原蛋白溶液来调制的，制品内的胶原蛋白浓度低、或者没有形成粗而长的胶原纤维，无法成为组织等价物。例如，在专利文献1的实施例1中，边搅拌0.3w/v％的缺端胶原溶液边添加0.3w/v％的变性缺端胶原溶液，并将该溶液进行急速冷冻和冷冻干燥。在胶原蛋白溶液中，胶原蛋白分子稀稀拉拉地溶解，所以没有形成粗而长的胶原纤维，将其冷冻干燥而形成的干燥物并不是由胶原纤维构成的干燥物。
另外，在专利文献2的实施例3中，向浓度为3mg/ml的胶原蛋白中添加戊二醛，使最终的戊二醛浓度达到0.05mM，再使得到的50g含戊二醛的胶原蛋白稀释溶液流入冷冻干燥用的不锈钢制模具(11cm×8.5cm)内，将不锈钢制模具冷却至-40℃以使胶原蛋白发泡液冻结，在真空减压下(0.01mmHg)、于30℃下冷冻干燥24小时。在胶原蛋白发泡溶液内，胶原蛋白分子稀稀拉拉地溶解，所以和专利文献1一样，认为没有形成粗而长的胶原纤维。
此外，专利文献3的实施例1是将浓度为0.3％、pH3.0的来自猪的肌腱的缺端胶原在冰冷下搅匀，将其放入方形模板中冷冻，之后进行真空冷冻干燥，与专利文献1一样，没有形成粗而长的胶原纤维。
另外，专利文献6的实施例1是将1重量％的胶原蛋白溶液注入盘中形成胶原蛋白溶液层，再将其在-20℃下冷冻24小时，接下来在-80℃下进行24小时的冷冻干燥和压缩加工，形成非纤维化胶原蛋白层。该非纤维化胶原蛋白层也不是由胶原纤维构成的。需要说明的是，专利文献7也是为了制造胶原蛋白基质而将胶原蛋白溶液在-20℃下真空吸引24小时，又在真空中干燥约8小时以除去残留的水分。在胶原蛋白溶液中，胶原蛋白分子稀稀拉拉地溶解，所以没有形成粗而长的胶原纤维，得到的胶原蛋白基质也不是由胶原纤维构成的。
另一方面，由于胶原蛋白会通过微量的水分而溶胀，所以干燥体的制造并不容易。而且，将胶原蛋白溶液通过冷冻干燥来得到干燥胶原蛋白时，处理时间长而且干燥能量很大，还不易模制成所期望的形状。因此，希望开发一种胶原蛋白结构体的制造方法，所述胶原蛋白结构体是胶原蛋白浓度高的人工材料，其还能够模制成除膜或片以外的厚物，并且能够容易地进行制造。
另外，上述专利文献4和专利文献5中记载的制品均为水合物。维持三重螺旋结构的未变性的胶原蛋白，其保湿性优异、并且与各种细胞的粘合性优异，但溶解于溶液中的胶原蛋白的热变性温度低，即使在常温下也会变性，需要冷蔵保存。由于专利文献4和专利文献5的制品均为水合物，所以热稳定性差，并且有可能通过细菌感染等而发生变性。而且，由于其含水量为90(w/w)％以上，所以保存时或运输时的成本也高。因此，希望开发机体亲和性、热稳定性优异且含水量低的胶原蛋白结构体。
将人工组织或人工骨等医用人工材料用于再生医疗时，在真皮、骨、关节软骨、肌腱等的缺损部位使用这些再生医疗材料以保持空间，并向其中导入细胞以促进再生。为了使这种再生变得圆滑，要求医疗材料的机体亲和性优异、能够防止细胞流出、并且细胞能够适度增殖。上述专利文献1记载的细胞侵入性医用材料虽然是以聚酯、聚氨酯、氯乙烯这样的合成树脂为载体，但只要其可以仅由机体材料构成，就可以避免由合成树脂引起的炎症等的发生。另外，上述专利文献8或专利文献9记载的方法在能够对动物细胞进行三维培养方面优异，但考虑到保存或运输的简便性，希望开发干燥的胶原蛋白结构体。
鉴于上述现状，本发明的目的在于：提供一种含水量低、且能够在医疗用途等广泛的范围内使用的胶原蛋白结构体。
另外，本发明的目的还在于：提供可以简便调制的胶原蛋白结构体的制造方法。
解决课题的方法
本发明人发现：在胶原蛋白酸性溶液中加入中性缓冲液以生成胶原纤维，并温和地搅拌时，缔合得到促进，析出粗而长的胶原纤维；若过滤该溶液，则可以得到胶原纤维浓度为12～50(w/v)％的粗胶原纤维；如果分离收集所述粗胶原纤维，并模制成规定形状，则通过冷冻干燥等可以将其干燥，此外，若将所述粗胶原纤维分散在亲水性有机溶剂中，则可以有效地将胶原纤维脱水，分离收集胶原纤维后模制成规定的形状并进行风干，能够制造胶原蛋白结构体，完成了本发明。
即，本发明提供胶原蛋白结构体，其特征在于：由平均直径为1～5μm的胶原纤维构成，含水量为0～15(w/w)％，胶原蛋白密度为50～800mg/cm3。
此外，本发明还提供所述胶原蛋白结构体，该结构体还包含选白细胞趋化因子、生长因子、细胞增殖因子、凝血因子和抗凝血因子的一种以上的因子。
另外，本发明还提供所述胶原蛋白结构体，该结构体被用作医疗用人工材料、疾病治疗用构件、化妆用材料或细胞培养材料。
此外，本发明还提供胶原蛋白结构体的制造方法，该方法的特征在于，进行以下步骤：
胶原纤维生成步骤：将胶原蛋白酸性溶液调节至中性，以生成胶原纤维；
粗胶原纤维形成步骤：从含有所述胶原纤维的溶液中分离收集所述胶原纤维，以形成胶原蛋白浓度为12～50(w/v)％的粗胶原纤维；
模制步骤：将所述粗胶原纤维模制成规定形状；以及
干燥步骤：将所述模制步骤中得到的模制物干燥。
另外，本发明还提供所述胶原蛋白结构体的制造方法，该方法的特征在于，在所述粗胶原纤维形成步骤后，接着进行胶原纤维脱水步骤：将所述粗胶原纤维分散在亲水性有机溶剂中，之后从所述亲水性有机溶剂中分离收集所述胶原纤维以进行脱水；
又接着进行模制步骤：将所述的脱水后的胶原纤维模制。
另外，本发明还提供所述胶原蛋白结构体的制造方法，该方法的特征在于：在所述胶原纤维脱水步骤后，接着进行处理步骤：对所述脱水后的胶原纤维进行交联处理和/或药物处理；
又接着进行干燥步骤：干燥所述处理后的胶原纤维。
发明效果
根据本发明，将胶原蛋白浓度为12～50(w/v)％的粗胶原纤维以规定形状进行干燥、调制，所以其与机体内的胶原蛋白组织等价，又由于以多个胶原蛋白缔合形成的胶原纤维为原料，所以机械强度也优异。
由于本发明的胶原蛋白结构体的含水量为0～15(w/w)％，所以热稳定性优异，并且可以有效避免由细菌等引起的变质。
根据本发明的胶原蛋白结构体的制造方法，通过风干可以使其干燥，所以还可以容易地制造薄片状物以外的立体物。
附图说明
图1是显示实施例1中制造的薄片状胶原蛋白结构体的图。
图2是显示实施例1中形成的粗胶原纤维的实体显微镜图像的图。
图3是显示实施例1中调制的胶原蛋白结构体的表面的扫描型电子显微镜图像(SEM)的图。
图4是显示实施例1中调制的胶原蛋白结构体的截面的扫描型电子显微镜图像(SEM)的图。
图5是显示实施例1中调制的胶原蛋白结构体、以及使用差示扫描量热计(DSC)以2℃/分钟的升温速度测定制备所述胶原蛋白结构体时使用的胶原蛋白溶液的变性温度的结果的图。
图6是显示通过DMEM/10％的FBS使实施例1中得到的胶原蛋白结构体溶胀，之后以1.0×104细胞/cm2的细胞数接种HFF，20小时后用钙黄绿素AM将细胞染色时的荧光显微镜的图。
图7是显示实施例2中调制的块状胶原蛋白结构体的图。
图8是显示比较例1中制造的、由胶原蛋白浓度为0.2(w/v)％的胶原蛋白溶液调制的凝胶状物干燥后的干燥物的扫描型电子显微镜(SEM)的图。
图9是显示通过DMEM/10％的FBS来驯化比较例1中得到的胶原蛋白凝胶，再以1.0×104细胞/cm2的细胞数接种HFF，20小时后用钙黄绿素AM将细胞染色时的荧光显微镜的图。
图10是显示比较例3中制造的、将1(w/v)％的胶原蛋白溶液冷冻干燥而形成的胶原蛋白海绵的扫描型电子显微镜(SEM)的图。
具体实施方式
第一本发明为胶原蛋白结构体，其特征在于：包含平均直径为1～5μm的胶原纤维，含水量为0～15(w/w)％，胶原蛋白密度为50～800mg/cm3。第二本发明为所述胶原蛋白结构体，该结构体被用作医疗用人工材料、疾病治疗用构件、化妆用材料或细胞培养材料。以下，详细说明本发明。
(1)胶原蛋白结构体
在本说明书中，“胶原蛋白”是指构成真皮、韧带、肌腱、骨、软骨等的一种蛋白。将胶原蛋白的三条肽链螺旋缠绕的产物称作“胶原蛋白分子”。在本发明中，“胶原纤维”是指胶原细纤维缔合的产物，而所述胶原细纤维是指多个胶原蛋白分子缔合的产物。
一直以来，已知胶原蛋白有I～XXIX型，但作为本发明中使用的胶原蛋白，可以是任意一种，还可以是新发现的胶原蛋白。机体内所含的胶原蛋白大部分都不溶于水，在本发明中，可以广泛地以能够形成胶原纤维的胶原蛋白作为对象，例如，可以使用将动物的皮或骨等的原料中所含的胶原蛋白通过添加蛋白酶等酶进行增溶后“增溶胶原蛋白”。需要说明的是，在机体内，动物的皮或骨等的原料可以是微溶于中性盐溶液或酸性溶液的“可溶性胶原蛋白”。所述“增溶胶原蛋白”或“可溶性胶原蛋白”在进行化学处理时其构成氨基酸可以被修饰。
而且，构成胶原纤维的胶原蛋白分子可以是胶原蛋白衍生物。在本发明中，“胶原蛋白衍生物”是指使用其他官能团对构成所述胶原蛋白分子的氨基酸进行了修饰的产物。例如，有酰基化胶原蛋白或酯化胶原蛋白等。作为酰基化胶原蛋白，有琥珀酰化胶原蛋白、邻苯二甲酰化胶原蛋白、马来酰化胶原蛋白等。例如，有将通过酶处理提取的缺端胶原溶液调节至pH9～12，之后添加琥珀酸、邻苯二甲酸酐、马来酸酐等酸酐而形成的琥珀酰化胶原蛋白、邻苯二甲酰化胶原蛋白、马来酰化胶原蛋白等酰基化胶原蛋白等。另外，作为酯化胶原蛋白，除了将增溶胶原蛋白进行酯化而得到的酯化胶原蛋白外，还有将不溶性胶原蛋白进行酯化后通过酶反应等进行了增溶的酯化胶原蛋白等。
在本发明中，“胶原蛋白结构体”是指具有规定的形状的固态物。因此，不包括粉状物、颗粒状物等流动体。规定的形状包括膜状或片状、圆柱、圆锥、多棱柱、多角锥、球等的块状等。只要能够维持规定的形状即可，可以是不定形。需要说明的是，“膜状”是指不足200μm的薄膜状，“片状”是指200μm以上的膜状。另外，“块状”是指平面状物在高度方向形成了厚度的块状。
本发明的胶原蛋白结构体由干燥状态下的平均直径为1～5μm的胶原纤维构成。如上所述，在胶原蛋白溶液中具有三重螺旋结构的胶原蛋白分子稀稀拉拉地溶解，通过风干等将这种胶原蛋白溶液模制成膜状时，由胶原蛋白分子或其缔合体形成膜。由于胶原蛋白分子或其缔合体细而短，所以胶原蛋白分子间或所述缔合体间的间隙窄，细胞无法通过该间隙。即使在这样的膜上培养细胞，细胞也是分布在膜表面，而无法浸润到内部。而且，由于上述膜由细而短的胶原蛋白分子等构成，所以机械强度低。但在本发明中，由于胶原蛋白结构体是由具有三重螺旋结构的胶原蛋白分子缔合得到的胶原细纤维进一步缔合而形成的平均直径为1～5μm的粗胶原纤维构成的，所以胶原纤维间的间隙大，细胞可以自由通过。由此，若将本发明的胶原蛋白结构体填充到机体中，则细胞浸润至胶原蛋白结构体的内部。而且，这种胶原蛋白的纤维结构与机体内的肌腱或韧带等结缔组织中的胶原蛋白的纤维结构类似。因此，可以高度维持胶原蛋白自身的机械强度。
构成本发明的胶原蛋白结构体的胶原纤维在干燥状态下的平均直径为1～5μm，更优选为2～3μm。在该范围内，可以得到细胞浸润性优异的胶原蛋白结构体。需要说明的是，在将胶原蛋白分子缔合而形成的胶原纤维中，当为平均直径1～5μm的胶原纤维时，若不进行之后的物理切断等处理，则平均纤维长度一般是1～10mm。需要说明的是，在本发明中，上述的胶原纤维的平均直径和平均纤维长度是指，对于干燥状态、即含水量为0～15(w/w)％的胶原蛋白结构体，按照后述的实施例中记载的方法进行测定而得到的值。
本发明的胶原蛋白结构体的含水量为0～15(w/w)％，更优选为0～10(w/w)％。由于该结构体是含水量低的干燥物，所以热稳定性优异，并且可以避免因细菌感染等引起的变质。而且，由于其与粉末等不同，是膜状、片状、以及块状等模制物，所以通过模制成机体的缺损部的形状，向机体内的添加或填充也变得容易。需要说明的是，本发明中的含水量是指，按照后述的实施例中记载的方法测定的值。
本发明的胶原蛋白结构体，当其含水量为0～15(w/w)％时，胶原蛋白密度为50～800mg/cm3，更优选为110～600mg/cm3，特别优选为120～400mg/cm3。胶原蛋白在机体内以不溶性胶原蛋白的形式存在，在皮肤组织中以高达25(w/v)％的浓度形成结缔组织，而在肌腱组织中以高达32(w/v)％的浓度形成结缔组织。为了从动物组织中提取胶原蛋白，需要将胶原蛋白增溶，该增溶胶原蛋白的粘性高。因此，难以调制高浓度的胶原蛋白溶液，不存在密度高的胶原蛋白结构体。但是，根据本发明，胶原蛋白密度为50～800mg/cm3，可以提供与机体内的胶原蛋白密度均等的胶原蛋白结构体。该胶原蛋白结构体可用作组织等价物。需要说明的是，在本发明中，胶原蛋白密度是指按照后述的实施例所示的方法测定的值。
本发明的胶原蛋白结构体的空隙率为20～90％，更优选为30～80％，特别优选为40～70％。由于其是多孔体，所以浸在溶剂中时在溶剂中迅速溶胀。需要说明的是，在本发明中，空隙率是指按照后述的实施例所示的方法测定的值。
本发明的胶原蛋白结构体是由胶原纤维形成的多孔体，平均孔径为1～50μm，更优选为5～30μm。本发明的胶原蛋白结构体是将上述的胶原纤维象无纺布那样折叠而构成的。因此，上述孔成为可与其他孔连通的孔。因此，当细胞侵入孔中时，细胞经由连通孔可以侵入胶原蛋白结构体内部。在本发明中，“平均孔径”是指按照后述实施例中记载的方法测定的值。
本发明的胶原蛋白结构体还可以包含选自细胞趋化因子、生长因子、细胞增殖因子、凝血因子和抗凝血因子的一种以上的因子。通过添加这样的成分，可以对胶原蛋白结构体赋予创伤治愈、肿瘤细胞增殖抑制、免疫调节、骨形成、造血的调节、止血、抗凝血等效能。
例如，作为趋化因子，有促红细胞生成素、白介素1(IL-1)等细胞因子、白介素8(IL-8)、NAP-2、MIP-2等趋化因子。
作为生长因子，有上皮生长因子(Epidermalgrowthfactor：EGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowthfactor：IGF)、转化生长因子(Transforminggrowthfactor：TGF)、神经生长因子(Nervegrowthfactor：NGF)、来自血小板的生长因子(Platelet-derivedgrowthfactor：PDGF)等。
作为增殖因子，有来自脑的神经营养因子(Brain-derivedneurotrophicfactor：BDNF)、血管内皮细胞增殖因子(Vesicularendothelialgrowthfactor：VEGF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colonystimulatingfactor：G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage-colonystimulatingfactor：GM-CSF)、促红细胞生成素(Erythropoietin：EPO)、血小板生成素(Thrombopoietin：TPO)、碱性成纤维细胞增殖因子(basicfibroblastgrowthfactor：bFGF或FGF2)、肝细胞增殖因子(Hepatocytegrowthfactor：HGF)等。
作为凝血因子，有纤维蛋白原·纤维蛋白(因子I)、凝血酶原·凝血酶(因子II)、组织因子(因子III、促凝血酶原激酶)等，作为抗凝血因子，有肝素、抗凝血酶III等。
这种添加物可以是通过渗入等与胶原蛋白结构体结合的添加物，也可以是通过结合媒介与胶原蛋白结构体结合的添加物，可以根据用途来适当选择。例如，使上述成分溶解液渗入胶原蛋白结构体中，吸附上述成分后进行干燥而形成的胶原蛋白结构体，若将其填充在创伤部，则缓慢释放上述成分，因此可用作药物传递系统等的一个构件。
作为结合媒介，可以例示胶原蛋白结合结构域的多肽链。例如，可以例示血管性血友病因子的胶原蛋白结合结构域、或胶原蛋白酶的胶原蛋白结合结构域。若使胶原蛋白结合结构域的多肽链预先与上述成分结合，则上述成分可以经由所述的结合媒介与胶原纤维稳定结合。
本发明的胶原蛋白结构体可以是将胶原纤维内交联而得到的结构体、或者将胶原纤维间交联而形成的结构体。由于胶原蛋白是机体构成物，所以其在机体内会被胶原蛋白酶等分解。因此，在想要避免生物分解性的部位或用途、例如作为骨材料等使用时，导入交联体结构。通过导入交联结构，可以抑制生物分解性，提高机械强度。可以只向胶原蛋白结构体表面导入这种交联结构，也可以将这种交联结构导入到胶原蛋白结构体内部。
本发明的胶原蛋白结构体被模制成膜状、片状、块状。所述块状除了包括柱状、球状、推状外，还可以模制成任意的形状。特别是，还可以模制成机体组织的特定形状。例如，可以例示构成膝关节的半月体、鼓膜、指、鼻、耳等机体形状、规定的软骨形状等。通过将本发明的胶原蛋白结构体埋入皮下、或者将其作为人工骨填充在骨折部，使附近的细胞增殖；或者，通过作为人工皮肤来涂布，可以构成外界与机体的边界以防止细菌等的侵入，促进再生功能。需要说明的是，在本发明的胶原蛋白结构体上还可以层叠其他的层。
需要说明的是，如果对现有的胶原蛋白海绵进行压缩加工，则形成胶原蛋白密度高的片状物。但是，这种胶原蛋白海绵并不是由胶原纤维构成的，因此，无法确保由胶原纤维带来的强度。本发明的胶原蛋白结构体是未经压缩加工而模制成规定形状的结构体，其细胞浸润性优异，并且即使将其含水使用时，也能确保胶由原纤维产生的强度。
(2)用途
本发明的胶原蛋白结构体可用作医疗用人工材料、疾病治疗用构件、化妆用材料、细胞培养材料等。
作为医疗用人工材料，其对真皮、骨、关节软骨、肌腱、韧带、血管等的缺损部位适应，可以促进空间的保持或细胞的导入等。作为这样的医疗用人工材料，可以以再生医疗作为对象。另外，渗入了止血剂的膜状胶原蛋白结构体可以包覆在出血部位，用作止血用构件。
作为疾病治疗构件，例如可用于眼睛的创伤、重度烧伤、皮肤移植片的供给部位、褥疮性溃疡、糖尿病性溃疡、外科手术的切开创伤或瘢痕瘤形成性创伤等。
作为化妆材料，可以将膜状或片状的胶原蛋白结构体剪成脸的形状，使化妆水等渗入其中，从而用作面膜材料。
作为细胞培养材料，如果将其用作细胞的三维培养基材，则可以对细胞进行继代培养。另外，由于其细胞侵入性或定着性优异，所以还可以用作药物透过性试验用的基材等。作为成为对象的细胞，还可用于ES细胞或iPS细胞等细胞。
另外，作为医疗用人工材料的应用，可用作药物传递系统的载体。使各种成分与胶原蛋白结构体结合，之后涂布、填充到机体中，则药物随时间释放，起到DDS的作用。
(3)胶原蛋白结构体的制造方法
对上述胶原蛋白结构体的制造方法没有限定。但可以通过以下步骤来制造：胶原纤维生成步骤，将胶原蛋白酸性溶液调节至中性，以生成胶原纤维；粗胶原纤维形成步骤，从含有所述胶原纤维的溶液中分离收集所述胶原纤维，形成胶原蛋白浓度为12～50(w/v)％的粗胶原纤维；模制步骤，将所述粗胶原纤维模制成规定形状；以及干燥步骤，将所述模制步骤中得到的模制物干燥。在所述粗胶原纤维形成步骤后，接着进行胶原纤维脱水步骤，即，将所述粗胶原纤维分散在亲水性有机溶剂中，之后从所述亲水性有机溶剂中分离收集所述胶原纤维进行脱水，之后再进行模制和干燥，来制造胶原蛋白结构体。另外，在所述胶原纤维脱水步骤后，接着进行对所述已脱水的胶原纤维进行交联处理和/或药物处理的处理步骤，再接着进行将所述已处理的胶原纤维干燥的干燥步骤，从而可以制造交联胶原蛋白结构体。
本发明中使用的胶原蛋白，可以由牛、猪、鸟、鱼等动物的皮肤或其他含有胶原蛋白的组织获取。通常，在动物的结缔组织中含有大量的胶原蛋白，但若通过热处理来进行提取，则胶原蛋白发生热变性，其所特有的三重螺旋结构被破坏，形成明胶。在本发明中，所以具有三重螺旋结构的胶原蛋白。作为这种胶原蛋白的提取方法，有以动物的骨、皮等作为材料，通过酸处理、酶处理进行的增溶法等。作为胶原蛋白的提取原料，优选有牛、猪、鸡、鸵鸟、马、鱼类等的真皮或肌腱。若使用来自胎儿等的年轻动物的组织，则收率提高，因此优选。
另外，作为进行酶处理而形成的胶原蛋白溶液，例如可以使用将牛皮的真皮层细碎、脱脂而得到的组织。将该组织悬浮于蒸馏水中使胶原蛋白终浓度达到0.5～5(w/v)％，之后加入盐酸，调节至pH3.0。加入相对于胶原蛋白重量为百分之一的量的酸性蛋白酶，在25℃下进行72小时的增溶处理。酶反应停止后，将上述酶增溶胶原蛋白液盐析，将已回收的盐析沉淀分散在蒸馏水中，使胶原蛋白浓度达到1～5(w/v)％，再加入盐酸进行均匀溶解，可以形成胶原蛋白溶液。
上述的胶原蛋白酸性溶液的pH优选为1.0～6.0，更优选为3.0～4.0。若pH超过上述范围，则胶原蛋白的纤维化有时会变得困难。
本发明中，将上述胶原蛋白酸性溶液调节至中性。无论是通过酶处理来调制胶原蛋白溶液，还是通过酸处理来调制胶原蛋白溶液，由于都是将胶原蛋白分子溶解于溶液中，所以液性为酸性。在这种胶原蛋白酸性溶液中添加碱性或中性缓冲液。作为碱性溶液，可以使用氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液等。另外，作为中性缓冲液，可以广泛使用由磷酸和磷酸钠构成的pH7.0～9.5的磷酸缓冲液、HEPES[2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸]缓冲液(pH6.8-8.2)、枸橼酸-磷酸缓冲液(pH2.6～7.0)、50mM的Tris缓冲液(pH7.4)、50mM的磷酸(pH7.4)等在pH7.0附近具有缓冲作用的缓冲液。需要说明的是，中性只要是pH6.0～9.0即可。
上述的碱性溶液或中性缓冲液中，在不改变pH的范围内可以含有其他的盐等。作为这样的盐，可以例示氯化钠、氯化钾等。通过添加这种盐，使胶原蛋白溶液达到与人的体液等渗时，可以形成与机体内的胶原蛋白一样具有约67nm的错位的胶原纤维。因此，所添加的盐的量优选为中性处理后的胶原蛋白溶液的渗透压能够与人的体液等渗的量。
在本发明中，中性处理后的胶原蛋白溶液的胶原蛋白浓度为0.01～5(w/v)％，更优选0.1～5(w/v)％，特别优选为0.3～5(w/v)％。若胶原蛋白浓度低于0.01(w/v)％，则之后的浓缩不易进行。另一方面，由于胶原蛋白的粘性高，所以难以调制浓度高于5(w/v)％的胶原蛋白溶液。
在本发明中，将上述中性处理后的胶原蛋白溶液在温度4～45℃、更优选30～37℃的范围内静置。在该范围内，溶解于所述胶原蛋白溶液中的胶原蛋白分子通过上述中性处理在溶液中缔合，形成凝胶状物。
在本发明中，接着缓慢搅拌含有上述的凝胶状物的溶液。通过缓慢搅拌，促进了构成凝胶状物的胶原蛋白分子相互间的缔合，在保持胶原纤维结构的同时释放出纤维间的水分，粗且纤维长度长的胶原纤维在所述溶液中析出。因此，搅拌的程度只要是能够促进胶原蛋白分子的缔合的程度即可。若进行激烈的搅拌，则生成的胶原纤维被物理性地截断，形成细而短的胶原纤维。通过缓慢搅拌而析出的胶原纤维在溶液中的平均直径为1～100μm，纤维长度为1～10mm。需要说明的是，在本发明中，从胶原蛋白溶液中析出的胶原纤维的平均直径或平均纤维长度是指，在实体显微镜图像中观察到的纤维中，随机选择的20根纤维的直径或长度的平均值。
将已析出该胶原纤维的溶液过滤或者离心分离时，可以分离收集所述胶原纤维。在本发明中，将从胶原蛋白溶液中分离收集的胶原纤维称作“粗胶原纤维”。因此，粗胶原纤维以胶原纤维和水分作为主要成分。粗胶原纤维中所含的胶原纤维的浓度不足12(w/v)％时，再次进行离心分离或过滤等，浓缩至胶原蛋白浓度为12～50(w/v)％、更优选15～40(w/v)％、特别优选18～30(w/v)％。
通过过滤来分离收集上述胶原蛋白浓度的粗胶原纤维时，优选使用孔径大小为1μm～1mm、更优选10μm～100μm的滤纸。孔径大小在上述范围内时，可以有效处理大量的胶原纤维。
另一方面，也可以将所述胶原蛋白溶液离心分离，来分离收集粗胶原纤维。例如，以10000～20000rpm的转速离心10分钟～1小时。需要说明的是，为了调整成上述范围的胶原蛋白浓度，可以多次进行离心分离。
在本发明中，将分离收集的粗胶原纤维模制成规定形状。模制后的粗胶原纤维的形状除了膜状、片状之外，还可以模制成各种立体结构。将胶原蛋白结构体用于组织充填时，可以模制成能够与机体内的充填部嵌合的形状。
例如，将已析出胶原纤维的胶原蛋白溶液过滤来分离收集粗胶原纤维时，例如，如果在形成于漏斗中间部的多孔滤纸载置部配设滤纸来过滤胶原蛋白溶液，则在滤纸上可以将粗胶原纤维堆积成片状或块状。也可以事先将所述滤纸载置部变形成规定形状作为模型来使用，在滤纸载置部堆积粗胶原纤维，以形成规定形状。上述是连续进行粗胶原纤维形成步骤和模制步骤的方案之一例。另外，也可以将重叠在滤纸上的粗胶原纤维填充在规定形状的模型中进行模制。
在通过离心分离形成粗胶原纤维的情况下，也同样可以应用上述的模制方法。例如，进行离心分离时，使用离心管作为模型，在离心分离的同时可以将粗胶原纤维模制成规定的形状。这是连续进行粗胶原纤维形成步骤和模制步骤的方案之一例。需要说明的是，离心分离后可以将粗胶原纤维填充在规定形状的模具中进行模制。
接着，将已模制的粗胶原纤维干燥。在本发明的制造方法中，为了模制胶原蛋白浓度为12～50(w/v)％的粗胶原纤维，可以将已模制的粗胶原纤维通过冷冻干燥或风干、温热干燥、真空吸引等进行脱水和干燥，来制造胶原蛋白结构体。需要说明的是，预先得到圆柱或棱柱等形状的胶原蛋白结构体，通过切削该结构体等方法可以进一步进行造型。干燥的程度达到含水量为0～15(w/w)％。这是由于与胶原蛋白溶液相比，干燥品的保存稳定性优异。
本发明的胶原蛋白结构体在上述干燥后，可以将其压缩模制。构成本发明的胶原蛋白结构体的胶原纤维的平均直径为1～5μm，其长度一般是1～10mm。如此粗且长的胶原纤维象无纺布那样堆积，可以确保细胞浸润性和强度，因此即使进行压缩模制，也不会降低细胞浸润性或强度，可以提高胶原蛋白浓度。这种压缩模制可以在于燥后进行的以外的步骤、例如将粗胶原纤维模制成规定形状时等来进行。
本发明中，在分离收集粗胶原纤维之前，可以在粗胶原纤维中添加其3～2000质量份、优选5～1000质量份、更优选10～100质量份、特别优选10～30质量份的亲水性有机溶剂，调制分散有粗胶原纤维的亲水性有机溶剂，接着进行过滤来分离收集粗胶原纤维，再将粗胶原纤维脱水。本发明中使用的粗胶原纤维的胶原蛋白浓度为12～50(w/v)％，与现有的胶原蛋白溶液相比，其胶原蛋白浓度高。因此，例如可以将其分散在100％乙醇等高浓度的亲水性有机溶剂中，由此可以有效地将亲水性高的粗胶原纤维脱水。分散有粗胶原纤维的亲水性有机溶剂与胶原蛋白溶液相比流动性高，可以提高溶液的过滤效率和粗胶原纤维模制后的干燥效率。由于过滤操作时的堵塞得到抑制，所以可以制造具有厚度的块状胶原蛋白结构体。
一直以来，已知利用乙醇等进行胶原蛋白的脱水，一般是边逐渐提高醇浓度边进行脱水。但在本发明中，由于粗胶原纤维的胶原蛋白浓度高达12～50(w/v)％，所以即使是使用乙醇的情况下，也可以使用100％的乙醇。因此，可以利用亲水性有机溶剂简便且有效地进行脱水。
作为分散粗胶原纤维的亲水性有机溶剂，只要是能够与水混和的含碳溶剂即可，例如可以列举醇、酮、醚、酯、极性非质子性溶剂等。作为醇，有甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等碳原子数为1～6的一元醇或乙二醇、丙二醇等多元醇等。作为酮，有丙酮、丁酮等。作为醚，有二乙醚、甲基乙基醚、乙二醇单甲醚、二甘醇单丁醚等二醇醚、或四氢呋喃、二恶烷等环状醚等。而且，作为酯，有乙酸乙酯、乳酸乙酯等，作为极性非质子性溶剂，有二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶等。其中，优选列举能够与水以任意比例混和的有机溶剂，例如丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等。其中，可以优选使用乙醇、丙酮、二甲醚或它们的混合溶液。
需要说明的是，使用的亲水性有机溶剂的温度优选为15℃以下。这是由于该温度不会使胶原纤维变性，并能够维持胶原蛋白分子的三重螺旋结构。
分散有粗胶原纤维的亲水性有机溶剂，可以通过过滤等将粗胶原纤维和亲水性有机溶剂分离，其结果，可以将粗胶原纤维脱水。过滤含有粗胶原纤维的亲水性有机溶剂时，在形成于漏斗中间部的多孔滤纸载置部配设滤纸，过滤分散有所述的粗胶原纤维的亲水性有机溶剂时，粗胶原纤维在滤纸上堆积成片状。由此，可以连续进行粗胶原纤维的脱水和粗胶原纤维的模制。还可以增加堆积量以模制成块状。需要说明的是，也可以通过规定的模型来模制脱水后的粗胶原纤维。
由于胶原蛋白的亲水性高，所以不易进行干燥，特别是不易进行立体物的干燥。但在本发明中，由于是使用上述胶原蛋白浓度的粗胶原纤维，并使用亲水性有机溶剂将粗胶原蛋白纤维脱水，所以能够制造胶原蛋白密度高且能够维持立体形状的胶原蛋白结构体。
模制后的粗胶原纤维，虽然还取决于其形状或大小，但除冷冻干燥之外，还可以通过风干来进行干燥。通过风干进行干燥时廉价，还可以防止胶原纤维的热变性。
本发明的胶原蛋白结构体还可以具有交联结构。通过导入交联结构，可以抑制埋设于机体后的分解。交联方法可以根据用途适当选择。例如，可以通过使甲醛或戊二醛等醛类、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖等与胶原纤维或胶原蛋白结构体接触来导入交联结构。另外，还可以添加碳化二亚胺类、环氧化物类和咪唑类交联剂来进行交联。另外，通过照射紫外线或γ射线、电子射线等也可以进行交联。需要说明的是，若将胶原蛋白自然干燥，则有时可以形成一部分交联结构。
本发明的胶原蛋白结构体，无论是否进行交联，都可以结合选自细胞趋化因子、生长因子、细胞增殖因子、凝血因子和抗凝血因子的一种以上的因子。因子的结合除了化学结合外，还可以是吸附、担载等物理结合。
结合因子的步骤可以在制造胶原蛋白结构体的任意一个步骤中进行。例如，可以在粗胶原纤维的干燥步骤之前的任意一个步骤中，在胶原纤维上结合选自细胞趋化因子、生长因子、细胞增殖因子、凝血因子和抗凝血因子的一种以上的因子。在哪个阶段结合因子，这可以根据所添加的成分的化学特性等适当选择。例如，可以在粗胶原纤维中添加上述因子并均匀搅拌，进行物理结合，之后将粗胶原纤维模制成规定形状并进行干燥，来制造胶原蛋白结构体。另外，还可以将粗胶原纤维分散在亲水性有机溶剂中，过滤该溶剂以进行脱水，在脱水后的粗胶原纤维中混合上述成分后进行干燥，制造胶原蛋白结构体。
还可以在制造含水量为0～15(w/w)％的胶原蛋白结构体后，使上述因子的水溶液渗入胶原蛋白结构体中，之后再次进行干燥，使含水量达到0～15(w/w)％。
将上述因子与胶原蛋白结构体进行化学结合时，可以使用预先形成了与胶原蛋白的结合媒介的因子。作为这种结合媒介，有血管性血友病因子的胶原蛋白结合结构域或胶原蛋白酶的胶原蛋白结合结构域的多肽链。例如，先使胶原蛋白结合结构域的多肽链与上述因子结合，再使具有这种结合媒介的因子的溶液渗入胶原蛋白结构体中，则所述因子经由所述的结合媒介进行结合。胶原蛋白结合结构域的氨基酸序列与以胶原蛋白为底物的胶原蛋白酶一样，可以特异性地与胶原蛋白结合。
本发明的胶原蛋白结构体的特征在于：胶原蛋白密度高，并且被模制成所期望的形状。作为形状，除膜状、片状外，根据用途还可以选择块状等。以前存在膜状或片状等薄层状的模制品，还存在胶原蛋白海绵或管状胶原蛋白结构体，但不存在胶原蛋白浓度高、且为块状物的胶原蛋白结构体。这是由于难以提高干燥前的胶原蛋白浓度。在本发明中，特别是通过将粗胶原纤维分散在亲水性有机溶剂中以将粗胶原纤维脱水，可以简便地形成粗胶原纤维的大的堆积物，并且还可以通过风干等容易地进行干燥。需要说明的是，还可以将大的堆积物填充在规定形状的模型中模制，来制造复杂形状的胶原蛋白结构体。
实施例
接下来，列举实施例，以具体说明本发明，但这些实施例对本发明没有任何限制。
(实施例1)
(1)胶原蛋白结构体的调制
使用绞肉机等将猪皮的真皮层绞碎，脱脂后充分清洗，以所得的组织作为原料。将所述原料悬浮于混合有终浓度为5mg/ml的胃蛋白酶、50mM的醋酸的增溶水溶液中，使胶原蛋白终浓度达到4.5(w/v)％，在4℃下进行一夜的增溶处理。在如上操作而得到的酶增溶胶原蛋白液中加入氯化钠使其终浓度达到5(w/v)％，进行盐析，通过离心分离回收盐析物。回收的盐析物分散在蒸馏水中使胶原蛋白浓度达到3(w/v)％，加入盐酸调节至pH3.0，均匀溶解，作为胶原蛋白溶液。
向2.5ml该胶原蛋白溶液(温度为4℃)中添加47.5ml温度为4℃的磷酸缓冲生理盐水(pH7.5)作为中性缓冲液，在温度37℃下静置24小时。
通过静置，胶原蛋白分子发生缔合，形成凝胶状物，若将其缓慢搅拌，则促进缔合，形成胶原纤维，将该胶原纤维分散在溶液中。将分散了的纤维注入孔径为80μm的尼龙筛上进行过滤，在筛上回收粗胶原纤维。该粗胶原纤维的胶原蛋白浓度为20(w/v)％。
接着，将筛上的胶原纤维冷冻干燥，得到厚度为0.2mm的片状胶原蛋白结构体。胶原蛋白结构体的外观见图1。
(2)含水量
利用下述方法测定的上述胶原蛋白结构体的含水量为9.4(w/w)％。
(i)含水量的测定方法
测定胶原蛋白结构体的质量(w1)。然后，在120℃下加热2小时使水分蒸发，之后测定胶原蛋白结构体的质量(w2)。以加热前后的质量变化(w1-w2)作为水分量，以所述水分量相对于胶原蛋白结构体质量(w1)的百分比(％)作为含水量。
(3)粗胶原纤维的平均直径和平均纤维长度
使用实体显微镜观察尼龙筛上的粗胶原纤维。实体显微镜图像见图2。通过实体显微镜随机选出20根粗胶原纤维，测定直径和纤维长度，算出20根纤维的平均值。平均直径为1.15μm，平均纤维长度为4.09mm。需要说明的是，纤维长度最短是1.9mm，最长是8.75mm。
(4)扫描型电子显微镜图像(表面)
利用扫描型电子显微镜(SEM)观察所得的胶原蛋白结构体表面的纤维结构。结果见图3。
(5)构成胶原蛋白结构体的胶原纤维的平均直径、孔径
对于上述胶原蛋白结构体，按照下述方法测定其在干燥状态下的纤维的平均直径、平均孔径。结果见表1。胶原蛋白结构体的平均孔径为18.47μm，具有直径为5～7μm的足以使细胞浸润的间隙。
(i)胶原纤维的平均直径
在扫描型电子显微镜(SEM)下观察到的胶原纤维中，随机选出20根纤维，测定它们的直径。算出20根纤维的直径的平均值，作为平均直径。
(ii)胶原纤维的平均孔径
在扫描型电子显微镜图像(SEM)中观察到的纤维中，随机选出20处纤维孔，测定它们的直径。算出这20处孔径的平均值，作为平均孔径。
(6)扫描型电子显微镜图像(截面)
利用扫描型电子显微镜(SEM)观察胶原蛋白结构体的截面的纤维结构。结果见图4。
(7)变性温度
使用差示扫描量热计(DSC)，以2℃/分钟的升温速度测定所得的胶原蛋白结构体和作为对照的胶原蛋白溶液的变性温度。结果见图5和表2。在胶原蛋白结构体中，在115.03℃下观察到变性温度的峰，但胶原蛋白溶液的变性温度是42.75℃，判明胶原蛋白结构体的热稳定性比胶原蛋白溶液的热稳定性优异。
(8)胶原蛋白密度和空隙率
利用下述方法测定胶原蛋白密度和空隙率时，胶原蛋白密度为200mg/cm3，空隙率为40.9％。
(i)胶原蛋白密度的测定方法
将胶原蛋白结构体准确地裁成边长为1cm的正方形，制作试验片。利用厚度计测定所述试验片的准确厚度，算出体积。然后，将试验片溶解于5ml5mM的醋酸溶液中，利用微量滴定法测定胶原蛋白浓度。由试验片的体积和胶原蛋白浓度算出每单位体积的胶原蛋白量，作为胶原蛋白密度。
(ii)空隙率
利用使用了Pascal140和440(CARLOERBAINTRUMENTS公司制)的水银压入法进行测定。
(8)细胞浸润性
通过DMEM/10％的FBS使所得的胶原蛋白结构体溶胀，以1.0×104细胞/cm2的细胞数接种HFF，20小时后用钙黄绿素AM将细胞染色，在荧光显微镜下观察。结果见图6。
(实施例2)
(1)胶原蛋白结构体的调制
使用绞肉机等将猪皮的真皮层绞碎，脱脂后充分清洗，以所得的组织作为原料。将所述原料悬浮于混合有终浓度为5mg/ml的胃蛋白酶、50mM的醋酸的增溶水溶液中，使胶原蛋白终浓度达到4.5(w/v)％，在4℃下进行一夜的增溶处理。在如上操作得到的酶增溶胶原蛋白液中加入氯化钠使其终浓度达到5(w/v)％，进行盐析，通过离心分离回收盐析物。回收的盐析物分散在蒸馏水中使胶原蛋白浓度达到3(w/v)％，加入盐酸，调节至pH3.0，均匀溶解，调制胶原蛋白溶液。向5ml该胶原蛋白溶液(温度为4℃)中添加95ml温度为4℃的磷酸缓冲生理盐水(pH7.5)作为中性缓冲液，在温度37℃下静置24小时。通过静置，胶原蛋白分子发生缔合，形成了凝胶状物。
若将其温和地搅拌，则促进缔合，形成胶原纤维，将该胶原纤维分散在溶液中使其沉淀。通过17,500rpm、20分钟的离心分离回收沉淀，得到粗胶原纤维。该粗胶原纤维的胶原蛋白浓度为20(w/v)％。
接着，将得到的0.75g粗胶原纤维投入到10g温度为20℃的乙醇中，温和地搅拌10分钟使其分散。过滤所得的分散液，分离收集粗胶原纤维。将分离收集的粗胶原纤维填充在直径为10mm、高为10mm的柱状模型中，在室温下风干，得到胶原蛋白结构体。该结构体见图7。
(2)含水量、胶原蛋白密度、空隙率、胶原纤维的平均直径
对于得到的胶原蛋白结构体，与实施例1同样地测定含水量、胶原蛋白密度、空隙率、胶原纤维的平均直径时，该胶原蛋白结构体的含水量为6.7(w/w)％，胶原蛋白密度为127mg/cm3，空隙率为76.6％。另外，胶原纤维的平均直径为1.59μm。
(比较例1)
(1)凝胶冷冻干燥物的调制
向实施例1中得到的胶原蛋白溶液中添加蒸馏水，稀释至0.4(w/v)％的浓度，然后在4℃的条件下混和等量的两倍浓缩磷酸缓冲生理盐水(pH7.5)，平稳地注入细胞培养用板中，在温度37℃下静置24小时，制作凝胶状物。
不必从上述凝胶状物中分离胶原纤维，直接将凝胶状物冷冻干燥。
(2)含水量和胶原蛋白密度
进行与实施例1相同的操作，测定含水量和胶原蛋白密度时，该冷冻干燥物的含水量为10～15(w/w)％，胶原蛋白密度为2.0mg/cm3。
(3)胶原纤维的平均直径、孔径
进行与实施例1相同的操作，测定构成冷冻干燥物的胶原纤维的平均直径、孔径。构成该膜的胶原纤维的平均直径为0.17μm。需要说明的是，由于胶原纤维彼此相互接触，所以无法测定纤维长度。结果见表1。
(4)凝胶状物的扫描型电子显微镜
利用扫描型电子显微镜(SEM)观察冷冻干燥前的凝胶状物。结果见图8。
(5)细胞浸润性
通过DMEM/10％的FBS馴化冷冻干燥前的凝胶状物，之后进行与实施例1相同的操作，以1.0×104细胞/cm2的细胞数接种HFF，20小时后用钙黄绿素AM将细胞染色，在荧光显微镜下观察。结果见图9。在实施例1的图6中，焦点一致的细胞和焦点不一致的细胞同时存在，观察到了细胞进行三维配置的状态，但在图9中，由于细胞的焦点一致，所以在单一面上观察到细胞以平面状态存在。
(比较例2)
向实施例1中得到的胶原蛋白溶液中加入5倍浓缩磷酸缓冲生理盐水(pH7.5)进行调整，使胶原蛋白浓度达到0.075(w/v)％，在37℃下强力(600rpm)搅拌一夜，同时形成胶原纤维。使用匀浆器搅拌该含有胶原纤维的溶液，进行物理剪切、或者抑制胶原蛋白分子的长度方向的连接。该溶液中所含的胶原蛋白缔合体的平均直径为1.13μm，长度为213μm。
接着，通过17,500rpm、20分钟的离心分离回收胶原蛋白缔合体，反复进行离心分离，直至胶原蛋白浓度达到30(w/v)％。向得到的沉淀物中投入20倍量的乙醇使其分散，之后注入到孔径为80μm的尼龙筛上进行过滤，在筛上回收粗胶原蛋白缔合体。得到的沉淀物没有形成薄片，而是呈粉末状。
(比较例3)
向实施例1中得到的胶原蛋白溶液中添加蒸馏水，稀释至0.8(w/v)％的浓度，不必进行中和，而是直接进行冷冻干燥，制作胶原蛋白海绵。该胶原蛋白海绵是由多孔膜形成的，并不是由胶原纤维构成的。图10显示胶原蛋白海绵的电子显微镜图像。需要说明的是，胶原蛋白密度为8mg/cm3。
[表1]
| 实施例1 | 比较例1 | |
| 纤维的平均直径 | 2.53μm | 0.17μm |
| 平均孔径 | 18.47μm | 1.15μm |
[表2]
本发明基于2012年1月12日申请的日本国专利申请2012-003883号。以日本国专利申请2012-003883号的说明书、权利要求的范围、附图整体为参照而纳入本说明书中。
产业实用性
本发明的胶原蛋白结构体是胶原蛋白密度高的干燥体，其热稳定性高，并且作为组织等价物可用于再生医疗等，具有实用性。
Claims (6)
1.一种胶原蛋白结构体，其特征在于：由将胶原蛋白酸性溶液调节至中性、并搅拌使胶原蛋白分子的缔合得到促进从而生成的平均直径为1～5μm的胶原纤维构成，含水量为0～15w/w％，胶原蛋白密度为50～800mg/cm3。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白结构体，该胶原蛋白结构体还包含选自细胞趋化因子、生长因子、细胞增殖因子、凝血因子和抗凝血因子的一种以上的因子。
3.根据权利要求1或2所述的胶原蛋白结构体，该胶原蛋白结构体被用作医疗用人工材料、疾病治疗用构件、化妆用材料或细胞培养材料。
4.一种胶原蛋白结构体的制造方法，其特征在于，进行以下步骤：
胶原纤维生成步骤：将胶原蛋白酸性溶液调节至中性，并搅拌使胶原蛋白分子的缔合得到促进从而生成平均直径为1～100μm的胶原纤维；
粗胶原纤维形成步骤：通过离心分离或过滤从含有所述胶原纤维的溶液中分离收集所述胶原纤维，以形成胶原蛋白浓度为12～50w/v％的粗胶原纤维；
模制步骤：将所述粗胶原纤维模制成规定形状；以及
干燥步骤：将所述模制步骤中得到的模制物干燥。
5.根据权利要求4所述的胶原蛋白结构体的制造方法，其特征在于：
在所述粗胶原纤维形成步骤后，接着进行胶原纤维脱水步骤：将所述粗胶原纤维分散在亲水性有机溶剂中，之后从所述亲水性有机溶剂中分离收集所述胶原纤维以进行脱水；
又接着进行模制步骤：将所述的脱水后的胶原纤维模制。
6.根据权利要求5所述的胶原蛋白结构体的制造方法，其特征在于：
在所述胶原纤维脱水步骤后，接着进行处理步骤：对所述已脱水的胶原纤维进行交联处理和/或药物处理；
又接着进行干燥步骤：干燥所述已处理的胶原纤维。
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