JP4064435B2 - コラーゲンゲルおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
コラーゲンの変性温度は溶液状態の時に最も低くなる。また、コラーゲンは一般に生物原料から得られるが、生物から得たコラーゲンの変性温度はその生物の生活環境温度と密接に関係していると言われる。水溶液でのコラーゲンの変性温度は、哺乳類では38℃前後であるが、魚類はおおむね哺乳類よりも低く、特に鮭等の寒流系の魚類では20℃を下回る場合もある。
1.コラーゲン溶液に架橋剤を導入し、溶液をゲル化する方法。
2.コラーゲン溶液に架橋を惹起する光線を照射し、溶液をゲル化する方法。
3.コラーゲン溶液に中性緩衝液を加えてコラーゲンの線維化を惹起させ、コラーゲン線維ネットワークから構成されるゲルを得る方法。
1.架橋剤により架橋されたコラーゲン線維からなることを特徴とするコラーゲンゲル。
2.コラーゲンが魚類から得られたものである前記1に記載のコラーゲンゲル。
3.架橋剤が水溶性カルボジイミドである前記1に記載のコラーゲンゲル。
4.コラーゲンの線維化途上に架橋剤により線維同士を架橋することを特徴とする架橋されたコラーゲン線維からなるコラーゲンゲルの製造方法。
5.コラーゲン溶液に対し、線維化を惹起させる溶媒と架橋剤溶液とを混合する前記4に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
6.魚類から得られたコラーゲンを使用する前記4または5に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
7.線維化を惹起させる溶媒が、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびTrisから選ばれる緩衝能を有する塩水溶液である前記5に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
8.架橋剤として水溶性カルボジイミドを線維化を惹起させる溶媒に溶かした溶液を使用する前記5に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
9.コラーゲン溶液のコラーゲン濃度が0.01〜3.0(w/v)%の範囲である前記5に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
10.コラーゲンゲルの製造に用いられる架橋剤の濃度が、コラーゲンゲルにおける架橋剤終濃度として15〜80mMの範囲である前記5に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
11.コラーゲン溶液と、線維化を惹起させる溶媒および架橋剤溶液との混合をコラーゲンの変性温度+5℃以下で行なう前記5に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
12.コラーゲン溶液と、線維化を惹起させる溶媒および架橋剤溶液とを混合した後、コラーゲンの変性温度+5℃以下の温度で少なくとも1時間インキュベートする前記11に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
13.前記4乃至12のいずれか1項に記載の方法で製造されたコラーゲンゲル。
14.前記13のコラーゲンゲル中の溶媒を除去して得られるコラーゲンシート。
15.前記1乃至3および前記13のいずれか1項に記載のコラーゲンゲルからなる細胞担体または医療用材料。
16.前記14に記載のコラーゲンシートからなる細胞担体または医療用材料。
17.前記14に記載のコラーゲンシートからなる創傷被覆材。
18.前記14に記載のコラーゲンシートからなる人工硬膜。
19.前記14に記載のコラーゲンシートからなるドラッグ・デリバリー・システム材料。
本発明に用いられるコラーゲンは、線維化能を有するものであればその型について特に限定されるものではないが、工業的な利用という観点から、収量の多いI型コラーゲンあるいはそれを主成分とするコラーゲンが好ましい。
A.コラーゲン溶液に対し、線維化を惹起させる溶媒を用いた架橋剤の溶液を混合する方法。
B.コラーゲン溶液に対し、線維化を惹起させる溶媒を混合し、それと同時あるいはその後に架橋剤溶液を加える方法。
C.コラーゲン溶液に対し、架橋剤溶液を加え、その後線維化を惹起させる溶媒を混合する方法。
1.コラーゲン線維の観察
以下の操作により、コラーゲンゲル中のコラーゲン線維を観察した。コラーゲンゲルを2.5(w/v)%のグルタルアルデヒド水溶液に24時間浸した後、20、50、75、および99(v/v)%エタノール水溶液に各30分ずつ順次浸し、コラーゲンゲルを脱水した。これを酢酸イソペンチルに15分ずつ2回浸した後、CO2による臨界点乾燥を行なった。乾燥したコラーゲンゲルにイオンコーター(E-1010、日立製)を用いて金を蒸着し、走査型電子顕微鏡(SEM)用試料とした。SEM観察はJEOL製JSM-6500Fを用いて、倍率15,000倍で行なった。
以下の操作により、コラーゲンゲルのゲル強度を求めた。
内径35mmの細胞培養用ポリスチレン製ペトリディッシュ(IWAKI製)に、厚み5〜7mmになるようにコラーゲンゲルを作製した。ゲルに対して内径20mmの円盤プローブを速度50mm/分で押し込み、応力が検知されてから1.3mm押し込んだ時点での応力(g)をレオメーター(CR-200D、サン科学製)を用いて測定した。測定は3個のゲルについて行ない、その応力の平均値(g)をゲル強度とした。
以下の操作によりコラーゲンゲルの融点を測定し、コラーゲンゲルの熱安定性を評価した。すなわち、内径15mmのカラス試験管に高さ40±5mmになるようにゲルを作製し、水浴に設置した。水浴温度を20℃から1℃ずつ段階的(各温度における保持時間、30分)に上昇させ、ゲルが溶解する温度からゲルの熱安定性を評価した。ゲルの溶解は2〜3℃に渡って徐々に起こる場合がある。ゲル体積のおよそ半分が溶解する温度を融点(℃)とした。
(1)細胞培養
ヒト歯周靭帯細胞(hPDL細胞)を以下の操作により得た。抜歯した歯の歯根からhPDL細胞を回収し、血清(Fetal Bovine Selum, GIBCO製)を10%添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM, 日水製)で培養した。2日おきに培地交換し、セミコンフルエントになったところで細胞を0.02%トリプシン−0.25%EDTA溶液で剥がして新しいプレートにそれぞれ5×103cells/cm2になるように継代培養した。
コラーゲンゲル培養には10〜15代の間の継代数のhPDL細胞を使用した。以下の操作によりコラーゲンゲルに接着した細胞を観察し、コラーゲンゲルの細胞接着性を評価した。内径16mmの細胞培養用ポリスチレン製ペトリディッシュ(12穴、NUNC製)にゲル体積750μLになるようにゲルを作製した。ゲル上部にphosphate buffer seline(-)(PBS)を乗せて37℃で40分間インキュベートした後、PBSを除いた。これを4回繰り返し、ゲル中に含まれる塩、未反応架橋剤などを除去した。細胞培養直前に上記と同じ10%血清含有DMEMを乗せて37℃で40分間インキュベートした後、培地を除いて洗浄した。洗浄したコラーゲンゲル上にhPDL細胞を5×103cells/cm2になるように播種し、10%血清含有DMEMを培地として、37℃、5%CO2インキュベーター中で培養した。培地交換は2日ごとに行なった。
(2)細胞増殖アッセイ
増殖活性試験は増殖アッセイキット(CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega製)を使用した。所定日数培養後、増殖アッセイ溶液を1ml添加し、5%CO2インキュベーターで60分間培養した。培養後上清を200μL取って96穴プレート(NUNC製)に移し、プレートリーダーで490nmの吸光度を測定した。あらかじめ作成しておいた細胞数−吸光度検量線から吸光度値を細胞数に変換した。
1.魚皮からの可溶性コラーゲンの製造
(1)鮭皮の脱脂
魚皮として鮭(シロサケ、学名;Oncorhynchus Keta)の皮を用いた。鱗と身をメスで除去した鮭皮をおよそ3cm四方に細断した。これをクロロホルム/メタノールの等容混合溶媒で3回繰り返して脱脂を行ない、メタノールで2回洗浄してクロロホルムを除去したのち、水で3回洗浄してメタノールを除去した。これ以降の工程は、全て4℃で行なった。
(2)コラーゲンの抽出およびペプシン消化
上記脱脂鮭皮130gを4℃の0.5M酢酸5Lに浸漬し、4日間静置した。膨潤した鮭皮を医療用ガーゼでろ過し、ろ液を10,000×gで30分遠心して不溶物を沈殿させ、1.5Lの上清を回収した。上清にペプシン粉末50mgを混合して2日間おだやかに撹拌した。
(3)コラーゲンの精製
上記コラーゲン溶液に対し、終濃度5%になるように塩化ナトリウムを加え、ガラス棒で1分間おだやかに撹拌した後、24時間静置した。塩析により生じた白い不溶物を遠心(上記と同様の条件)して沈殿を回収し、沈殿を0.5M酢酸2Lに加え、おだやかに撹拌して溶解した。溶解まで3日間を要した。
この操作を一回繰り返して、無色透明なコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液を、セルロースチューブを用いて脱イオン水に対して透析した。透析外液のpHが中性を示すまで脱イオン水を繰り返し交換して、得られた中性コラーゲン溶液を凍結乾燥した。白色のスポンジ状コラーゲンが得られた。
(1)0.50%コラーゲン水溶液の調製
上記スポンジ状コラーゲンをシリカゲル入りデシケーターで減圧乾燥し、その精秤値を用いて0.50(w/v)%になるように4℃に予備冷却したpH3.0希塩酸に加え、おだやかに撹拌して溶解した。次に、コラーゲン溶液をポアサイズ10μm、0.65μm、0.45μmのメンブランフィルターで順次ろ過した。ろ液をポリプロピレン製遠沈管(50mL)に20mLずつ小分けした。
(2)架橋剤水溶液の調製
70mMの塩化ナトリウムを含むpH6.8、30mMリン酸ナトリウム緩衝水溶液を溶媒として、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩の100mM水溶液を調製した。得られた架橋剤水溶液をポリプロピレン製遠沈管(50mL)に20mLずつ小分けした。
(3)コラーゲンゲルの作製
以下の操作は全て4℃で行なった。上記の0.50%コラーゲン水溶液(20mL)が入っている遠沈管に、上記の架橋剤溶液(20mL)を加え、蓋をした。遠沈管を振り動かして溶液を混合し、内径35mmの細胞培養用ポリスチレン製ペトリディッシュおよび内径15mmのカラス試験管に流し込み、24時間静置してコラーゲンゲルを得た。
SEMにより観察したコラーゲンゲルのコラーゲン線維構造を図1に、ゲル強度および融点の測定結果を表1に示す。
コラーゲンゲル上での細胞増殖アッセイの結果を図4に示す。
実施例1の架橋剤を除いた以外は、実施例1と同じ方法でコラーゲンゲルを作製した。SEM観察により、実施例1と同様のコラーゲン線維構造がみられた。ゲル強度および融点の測定結果を表1に示す。
実施例1の架橋剤水溶液における架橋剤濃度を20mMに変更した以外は、実施例1と同じ方法でコラーゲンゲルを作製した。SEM観察により、実施例1と同様のコラーゲン線維構造がみられた。ゲル強度および融点の測定結果を表1に示す。
実施例1の架橋剤水溶液の溶媒を脱イオン水に変更した以外は、実施例1と同じ方法でコラーゲンゲルを作製した。SEMにより観察したコラーゲンゲルのコラーゲン線維構造を図2に、ゲル強度および融点の測定結果を表1に示す。
1.コラーゲンゲルの作製
0.3%豚皮由来アテロコラーゲン水溶液(Cellmatrix TypeI-P、pH3希塩酸溶媒、新田ゼラチン製)30mlを遠沈管に入れ、4℃に保った。同じく4℃に保った210mMの塩化ナトリウムを含むpH6.8、90mMリン酸ナトリウム緩衝水溶液6mlを、コラーゲン水溶液の入っている遠沈管に加え、蓋をした。遠沈管を振り動かして溶液を混合し、内径35mmの細胞培養用ポリスチレン製ペトリディッシュおよび内径15mmのカラス試験管に流し込み、37℃インキュベーターに24時間静置してコラーゲンゲルを得た。
2.コラーゲンゲルの線維構造および物性
SEMにより観察したコラーゲンゲルのコラーゲン線維構造を図3に、ゲル強度および融点の測定結果を表1に示す。
3.コラーゲンゲル上での細胞増殖アッセイ
コラーゲンゲル上での細胞増殖アッセイの結果を図4に示す。
Claims (17)
- 線維化をしていないコラーゲン溶液に対し、線維化を惹起させる溶媒であるリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびTrisから選ばれる緩衝能を有する塩水溶液と架橋剤とを同時期に接触させることにより、コラーゲンの線維化途上に架橋剤により線維同士を架橋することを特徴とする架橋されたコラーゲン線維からなるコラーゲンゲルの製造方法。
- コラーゲン溶液に対し、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびTrisから選ばれる緩衝能を有する塩水溶液を線維化を惹起させる溶媒として用いた架橋剤の溶液を混合する請求項1に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
- コラーゲン溶液に対し、線維化を惹起させる溶媒であるリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびTrisから選ばれる緩衝能を有する塩水溶液を混合し、それと同時に架橋剤溶液を加える請求項1に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
- コラーゲン溶液に対し、架橋剤溶液を加え、その後、線維化を惹起させる溶媒であるリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびTrisから選ばれる緩衝能を有する塩水溶液を混合する請求項1に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
- 魚類から得られたコラーゲンを使用する請求項1乃至4のいずれかに記載のコラーゲンゲルの製造方法。
- 前記の架橋剤の溶液が、水溶性カルボジイミドを前記塩水溶液に溶かした溶液である請求項2に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
- コラーゲン溶液のコラーゲン濃度が0.01〜3.0(w/v)%の範囲である請求項2乃至6のいずれかに記載のコラーゲンゲルの製造方法。
- コラーゲンゲルの製造に用いられる架橋剤の濃度が、コラーゲンゲルにおける架橋剤終濃度として15〜80mMの範囲である請求項2乃至7のいずれかに記載のコラーゲンゲルの製造方法。
- コラーゲン溶液と、前記塩水溶液を用いた架橋剤の溶液、前記塩水溶液または架橋剤溶液との混合をコラーゲンの変性温度+5℃以下で行なう請求項2乃至8のいずれかに記載のコラーゲンゲルの製造方法。
- コラーゲン溶液と、前記塩水溶液を用いた架橋剤の溶液、前記塩水溶液または架橋剤溶液とを混合した後、コラーゲンの変性温度+5℃以下の温度で少なくとも1時間インキュベートする請求項9に記載のコラーゲンゲルの製造方法。
- 請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法で製造されたコラーゲンゲル。
- 請求項11のコラーゲンゲル中の溶媒を除去して得られるコラーゲンシート。
- 請求項11に記載のコラーゲンゲルからなる細胞担体または医療用材料。
- 請求項12に記載のコラーゲンシートからなる細胞担体または医療用材料。
- 請求項12に記載のコラーゲンシートからなる創傷被覆材。
- 請求項12に記載のコラーゲンシートからなる人工硬膜。
- 請求項12に記載のコラーゲンシートからなるドラッグ・デリバリー・システム材料。
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