JP7062667B2

JP7062667B2 - コラーゲンヒドロゲルの製造方法

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Publication number: JP7062667B2
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Description

本発明は、コラーゲン会合体の製造方法及びその生成物に関する。

コラーゲンは、哺乳類のプロテオームにおいて、最も偏在的なタンパク質であり、全てのタンパク質の最大３０％を構成する（Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒ及びＨｏｈｅｎｅｓｔｅｒ、２００７）。コラーゲンは、細胞外マトリックス及び結合組織の大部分を形成し、身体の組織に強さ及び柔軟性を与える。力学的強度における役割のほかに、コラーゲンは、細胞の遊走（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９８１）、分化（Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉら、２００５）及び増殖（Ｐｏｚｚｉら、１９９８）を制御する、シグナル伝達分子として機能し、止血（Ｆａｒｎｄａｌｅら、２００４）において機能する。

生体材料としてのコラーゲンの可能性は、低い免疫原性及び細胞毒性ならびに高い引張り強さなどの、有用な特性によって明らかになる。今日まで、コラーゲンの多くの医学的使用が、示唆され、開発され、適用されてきた。これらの用途の多くは、会合して、非平面の基質又は足場を構築するときのコラーゲンを使用する。コラーゲン足場は、３Ｄ細胞培養マトリックス（Ｓｏｎｇら、２００６）、組織再生足場（Ｈｏｙｅｒら、２０１４）、角膜シールド（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ及びＢａｔｔｅｒｂｕｒｙ、２００２）、外用創傷修復剤、及び薬物送達のための担体として使用できる。

一般的に使用されるコラーゲン足場の１つの種類は、コラーゲンヒドロゲルである。コラーゲンヒドロゲルは、ポリマーの絡み合い及び／又は共有結合性架橋によって解離を妨げられている、可溶性コラーゲン線維のネットワークからなる。コラーゲンヒドロゲルはまた、コロイド懸濁液からも形成させることができる。ヒドロゲルの物理特性は、生産ルートに応じて、調整できる。この主題は、いくつかの詳細なレビューによって取り上げられている（Ｄｒｕｒｙ及びＭｏｏｎｅｙ、２００３）（Ｈｅｎｎｉｎｋ及びｖａｎＮｏｓｔｒｕｍ、２０１２）（Ｈｏｆｆｍａｎ、２０１２）。

コラーゲンヒドロゲルは、現代の細胞培養技術の本質的な成分に、急速になりつつある。コラーゲンヒドロゲルは、インビボ環境をより強く暗示する３Ｄ格子中での細胞の成長を可能にする。インビボ環境におけるインビトロでの細胞を培養する能力は、細胞生物学の研究にとって明白な利点を有する。３Ｄヒドロゲルはまた、軟膏修復において特に役に立つ、組織工学の足場としても使用できる。

コラーゲンのほとんどの市販の供給源は、哺乳類の組織に由来する。それにもかかわらず、組織工学における哺乳類のコラーゲンの使用は、ウイルス感染の考慮すべきリスクを伴うことが、よく知られている。さらに、哺乳類の供給源からのコラーゲンの精製は、かなりの費用を伴い、精製方法から持ち越される汚染物質分子は、哺乳類のコラーゲンヒドロゲルの形成の再現性を損なう。このことは、細胞培養において使用される場合、哺乳類のコラーゲンヒドロゲルの信頼性を、著しく傷つけ得る。
したがって、コラーゲンの代替の供給源が望ましいと、ずっと考えられてきた。

米国特許第８１０５６２９号明細書

サケの皮膚から抽出されるコラーゲンが、３Ｄ足場の生産に使用するためのコラーゲンの代替の供給源として提唱された（米国特許第８１０５６２９号）。クラゲコラーゲンは、別の有望な代替のコラーゲン分子である。クラゲコラーゲンはすでに、脱水されたスポンジの形態で３Ｄ細胞培養足場として使用するのに成功している。クラゲコラーゲンは、低い免疫原性、低い生産コストを示すことから、この試みにおいて非常に望ましい代替物であることが見出されており、さらにクラゲコラーゲンには、哺乳類のコラーゲンに伴うウイルス移動及び疾患流行のリスクがない。それにもかかわらず、様々な臨床及び研究適用のために様々なマトリックスが有益であることから、クラゲコラーゲンヒドロゲルを得ることがいまだ求められている。
しかし、クラゲコラーゲンに課せられた進化上の制約は、タンパク質が、より低い温度で最適に機能するように進化したことである。このより低い熱安定性のために、生理的温度での使用に適切なクラゲコラーゲンヒドロゲルの生産がこれまで不可能であった。
そのため、細胞培養及び医療用途における使用に適切な、改善されたクラゲコラーゲンヒドロゲルの製造方法が求められていた。

本発明は、クラゲコラーゲンの物理化学特性が、哺乳類又は魚類のコラーゲンと比較して大いに異なっているにもかかわらず、クラゲコラーゲンが、生理的条件下で安定な３Ｄヒドロゲルを形成するのに使用できるという全く予期せぬ発見に基づいている。

したがって、本発明の第１の態様は、クラゲコラーゲン原線維を含むクラゲコラーゲンヒドロゲルを生成する方法であって、（ａ）精製されたクラゲコラーゲンの溶液及び水性中和緩衝液を混合する工程、及び（ｂ）コラーゲン原線維の形成を可能にするのに十分な長さの時間、混合物をインキュベートする工程を含み、架橋剤が、混合工程（ａ）の間に加えられるか、又は工程（ｂ）から得られたコラーゲン原線維に加えられるかのいずれかである、方法に関する。

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様によって定義された方法から得ることができるクラゲコラーゲンヒドロゲルを提供する。ヒドロゲルは、熱及び力に対して敏感に反応することによって、可逆的にゲル化する。

本発明の第３の態様は、単離されたクラゲコラーゲンヒドロゲルを提供し、クラゲコラーゲンヒドロゲルは、２５℃から５０℃の温度で安定である。

本発明の第４の態様は、３Ｄ細胞培養足場の生産において、本発明の第２又は第３の態様の単離されたクラゲコラーゲンヒドロゲルを使用する。

本発明の第５の態様は、医療用デバイスの生産において、本発明の第２又は第３の態様の単離されたクラゲコラーゲンヒドロゲルを使用する。

本発明の第６の態様は、本発明の第２又は第３の態様のいずれかのクラゲコラーゲンヒドロゲルを含む医療用デバイスを提供する。

本発明の第７の態様は、本発明の第２又は第３の態様のいずれかのクラゲコラーゲンヒドロゲルを含む３Ｄ細胞培養足場を提供する。

本発明の第８の態様は、細胞を培養する本発明の第６の態様の３Ｄ細胞培養足場を使用する。

本発明の第９の態様は、精製されたクラゲコラーゲンの溶液、中和緩衝液、及び架橋剤を含むキットを提供する。

本発明を、以下の図面によって説明する。

図１はクラゲコラーゲンにおける原線維形成に対するｐＨの影響を示す図である。図２はクラゲコラーゲン（ＪＦＣ）原線維発生に対するＮａＣｌ濃度の影響を示す図である。図３はＢＤＤＧＥ又はゲニピン（ＧＰ）架橋コラーゲン原線維ヒドロゲルの熱安定性に対する、時間及びｐＨの効果を示す図である。図４は、熱安定性におけるクロスリンカー濃度の効果を示す図である。全てのゲルを、１２０時間、ｐＨ７で形成した。それぞれの濃度についてｎ＝３。対照＝１２０時間後、ｐＨ７、クロスリンカーなしのＪＦＣヒドロゲル。

本発明は、有効で実用的な哺乳類コラーゲンの代替物として、クラゲコラーゲン(ＪＦＣ)を使用することを可能にする方法の実現であり、ヒドロゲルを構成するものである。

本発明は、ＪＦＣヒドロゲルが、生理的温度及びｐＨで形成され、安定し得るという、驚くべき発見によって可能になる。以前、かかるヒドロゲルを生産することは、ＪＦＣの熱安定性が低いことが原因で、不可能であった。異なる環境条件及び哺乳類とクラゲのコラーゲン間の進化距離は、ＪＦＣが進化して、より低い温度で最適に機能したことを意味する。さらに、ＪＦＣの独特の物理化学特性のせいで、ＪＦＣの凝集を支配する熱力学的原則は、哺乳類又は魚類のコラーゲンの凝集を制御する原則と比べて、著しく異なる可能性が高い。コラーゲンヒドロゲルを形成するために、コラーゲン分子が強固に凝集して原線維になることが、一般的に要求される。したがって、ＪＦＣの熱安定性の低下及び未知の凝集特性の観点から、ＪＦＣを、哺乳類のコラーゲンヒドロゲルを形成するのに使用されるのと同様の条件下で、誘導して、コラーゲンヒドロゲルを形成できることは、全く驚きである。さらに、ＪＦＣの熱安定性の低下に関して、これらのヒドロゲルが、生理的条件下で、哺乳類及び魚類のコラーゲンヒドロゲルの効果的代用物としての使用を可能にするほど十分安定であることは、さらなる驚きである。

本発明は、本明細書に使用される以下の定義を参照して、さらに説明される。

「精製されたクラゲコラーゲンの溶液」は、実質的に単量体である、又は代替方法として、コラーゲン原線維が実質的にない、単離されたＪＦＣの溶液のことである。この文脈において、「実質的にない」は、コラーゲンの２ｗｔ％未満が原線維から成る、コラーゲンの溶液のことである。これらの条件下でコラーゲン溶液を維持するために、単離されたコラーゲンは、コラーゲン原線維形成を嫌う条件下で貯蔵できる。これは、コラーゲンが、酸性条件下で貯蔵されることを意味してよく、酸性は、ｐＨ１からｐＨ６．５のｐＨを有するあらゆる溶液を意味する、又は代替方法として、塩基性条件下で貯蔵されることを意味してよく、塩基性は、ｐＨ８からｐＨ１４のｐＨを有するあらゆる溶液を意味する。非限定的例として、コラーゲンは、弱酸の０．１Ｍ溶液中で貯蔵されてもよい。弱酸は、酢酸又は塩酸であってもよい。コラーゲン溶液中のコラーゲンの濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌの範囲内であってもよい。好ましくは、コラーゲン溶液の濃度は、１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌである。

解剖学的環境からクラゲコラーゲンを「単離する」又は「精製する」、複数の方法がある。これらの多くは、当業者にとって周知であり、ルーティンであろう。例えば、コラーゲンは、酸抽出によってクラゲから精製でき、この抽出によって、クラゲの様々な解剖学的部分が、酸性溶液に浸される。「浸すこと」又は「浸される」は、コラーゲン分子を遊離するために、十分な長さの時間、酸溶液中でクラゲをインキュベートする方法のことである。コラーゲン精製の代替方法は、酵素抽出であり、この抽出によって、クラゲは、コラーゲン分子を遊離するために、十分な長さの時間及び解剖学的環境の分解を好む条件下で、少なくとも１種のタンパク質分解酵素でインキュベートされる。酵素抽出方法の正確な温度、ｐＨ及びインキュベート時間は、使用されるタンパク質分解酵素に応じて、変動することになる。最も適切な条件は、当業者にとって周知であろう。非限定的例として、酵素ペプシンは、コラーゲン分子を遊離するために、酸性条件下、クラゲでインキュベートできる。いずれの酵素も、酵素抽出方法において使用できることが予想され、上記の例は、一切、限定することを意図するものではない。

次に、コラーゲンは、複数の異なる手段によって、酸又は酵素抽出方法の不要な汚染物質から、さらに単離又は精製できる。例えば、不溶性汚染物質は、遠心分離によって除去できる。コラーゲンのより純粋な供給源が必要とされる場合、単離されたコラーゲンを、抽出方法のその他の可溶性汚染物質のために、ゲル濾過に供してもよいし、又はコラーゲン分子の精製を可能にし得る代替のクロマトグラフィー法に供してもよい。さらなる精製の的確な方法は、特に限定されない。タンパク質生化学者に周知の慣例的に使用されるあらゆる方法が、精製された又は単離されたクラゲコラーゲンを得る目的のために適応させることができる。この工程はまた、精製されたクラゲコラーゲンの望ましい溶液を得るために、望ましい貯蔵緩衝液中へのクラゲコラーゲンの移動も可能にする。これは、精製の前に、望ましい貯蔵緩衝液でクロマトグラフィー装置を最初に平衡化することによって達成できる。この方法のために使用できる、多くの代替の、よく知られた方法が、存在する。好ましくは、本発明において使用されるコラーゲン溶液は、７０％から９９％純粋であり、純粋は、溶液中のコラーゲン分子に起因する重量％のことである。より好ましくは、コラーゲン溶液は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％純粋である。

用語「中和緩衝液」は、精製されたクラゲコラーゲンの溶液を、ｐＨ４からｐＨ９のｐＨに、ｐＨを上昇又は低下させるために希釈できる、任意の緩衝液のことである。コラーゲン原線維形成が進行できるために、精製されたクラゲコラーゲンの溶液のｐＨを、上昇又は低下されねばならない限りにおいてのみ、中和緩衝液の組成物は、特に限定されない。さらに、緩衝液は、いずれの架橋方法にも干渉し得る、イオン、化合物、又は分子が、実質的にあってはならない。したがって、未反応のアミンが実質的にない緩衝液が、特に望ましい。非限定的例としてのみ、中和緩衝液は、１×から１０×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からできていてよく、１×又は１０×は、ＰＢＳの濃度のことである。１×ＰＢＳの組成物は、当業者にとって周知であろう。精製されたクラゲコラーゲンの溶液が実質的に中和され、その結果コラーゲン原線維形成が進行できるために、ＰＢＳの正確な濃度（すなわち、１×又は例えば１０×）は、完全に、精製されたクラゲコラーゲンの溶液と混合する場合に必要とされる希釈係数によって決まることになる。いくつかの実施形態において、中和緩衝液は、水酸化ナトリウムである。

用語「原線維形成」又は「原線維発生」は、コラーゲン分子が、制御された凝集を起こして、より高次の、構造がしっかりした巨大分子の会合体を形成する過程のことである。インビボのコラーゲンは主に、細胞外タンパク質であり、それが凝集して原線維構造になって、周囲の組織及び／又は細胞外マトリックスの成分のための構築支持材を提供する。コラーゲン、特に哺乳類のコラーゲンの凝集は、よく知られた現象である。哺乳類及び海洋性コラーゲンの様々なアイソフォームは、優先的に凝集して、様々な巨大分子構造になる。それぞれのコラーゲンアイソフォームから形成される、独特の巨大分子構造は、コラーゲンポリペプチドの物理化学特性及び原線維発生が助長される条件によって、支配される。高次コラーゲン構造、すなわち哺乳類又は魚類から得られるコラーゲン原線維は、哺乳類及び／又は魚類のコラーゲンヒドロゲルを産生するために、インビトロで利用された。したがって、クラゲコラーゲンからヒドロゲルを形成するために、クラゲコラーゲンは、会合して高次構造になるのが好ましい。好ましくは、高次構造は、原線維である。

用語「クロスリンカー」又は「架橋剤」は、ある条件下で、２つの独立した分子間の共有結合を形成できる、反応性化合物のことである。本発明の文脈において、架橋剤は、２つの独立したコラーゲン分子を共有結合させるために使用される。好ましくは、架橋されるコラーゲン分子は、コラーゲン線維の形態である。好ましくは、原線維間の架橋が起こる。架橋剤は典型的に、炭化水素鎖によって一緒に結合した２つ以上の反応性官能基からなる。２つ以上の官能基は、必ずしも同じである必要はない。炭化水素鎖の長さはまた、変動させて、官能基の間の距離を制御できる。本発明の文脈における炭化水素鎖の正確な長さは、限定することを意図されない。さらに、架橋剤の反応性官能基の種類は、特に限定されない。コラーゲン原線維が形成される条件下で架橋することが知られている、いずれの架橋剤も、本発明における使用のための適切な架橋剤であると予想される。ある適用において、細胞にとって非毒性である架橋剤を使用することが、望ましい場合がある。ある実施形態において、架橋剤は、ゲニピン、１，４－ＢＤＤＧＥ、又はムコクロロ酸から選択されてもよい。好ましくは、架橋剤は、ゲニピン又は１，４－ＢＤＤＧＥのいずれかである。架橋剤の包含は、２５℃から５０℃の温度で安定なヒドロゲルを作るためにヒドロゲルの熱安定性を上昇させることにとって、特に好都合である。

したがって、本発明の第１の態様は、クラゲコラーゲン原線維を含むクラゲコラーゲンヒドロゲルを生成する方法であって、（ａ）精製されたクラゲコラーゲンの溶液及び水性中和緩衝液を混合する工程、及び（ｂ）コラーゲン原線維の形成を可能にするのに十分な長さの時間、混合物をインキュベートする工程を含み、架橋剤が、混合工程（ａ）の間に加えられるか、又は工程（ｂ）から得られたコラーゲン原線維に加えられるかのいずれかである、方法を提供する。

好ましい実施形態において、混合工程（ａ）は、ｐＨ４からｐＨ９のｐＨの溶液をもたらす。好ましくは、混合工程は、ｐＨ７．４にｐＨを上げる。

別の好ましい実施形態において、工程（ｂ）は、４℃から２５℃の温度で実施される。原線維は、この温度範囲外で形成できるが、これは、コラーゲン原線維形成を誘導するための最適な温度範囲である。

いくつかの実施形態において、工程（ｂ）は、１２時間以下で実施されてもよい。別の好ましい実施形態において、工程（ｂ）は、５から６０分間で実施される。温度は、コラーゲン原線維形成の速度を制御することになるので、正確な時間は、工程（ｂ）において使用される温度によって決まることになる。当業者は、分光学的技術を使用して、様々な温度で時間経過とともにコラーゲン原線維の形成を観察することによって、様々な温度で工程（ｂ）を実施するための最適な時間を計算することができるであろう。例えば、コラーゲン原線維形成をモニターするために、波長３１３ｎｍの光のＵＶ－ｖｉｓ吸収を、時間経過とともに測定できる。吸収の上昇は、原線維形成が進行していることを示す。上昇が定常に達するとき、原線維形成が終了し、そのようにして、工程（ｂ）を実施するための十分な長さの時間を定義した。

別の好ましい実施形態において、水性中和緩衝液は、リン酸をベースとする。

別の好ましい実施形態において、架橋剤は、ゲニピン、１，４－ＢＤＤＧＥ又はムコクロロ酸から選択される。好ましくは、架橋剤が、ゲニピンの場合、最終濃度０．００１％から５％、好ましくは０．０２５％（ｗ／ｖ）で加えられ、又は架橋剤が、１，４－ＢＤＤＧＥの場合、最終濃度０．００１％から５％、好ましくは４％（ｗ／ｖ）で加えられ、又は架橋剤が、ムコクロロ酸の場合、最終濃度０．００１％から５％、好ましくは、０．２５％から４％（ｗ／ｖ）で加えられる。好ましくは、架橋剤は、ゲニピン又はＢＤＤＧＥである。

別の好ましい実施形態において、精製されたクラゲコラーゲンの溶液は、酵素抽出によって、コラーゲンの供給源から精製される。酵素抽出方法において使用される酵素は、ペプシン、又はその組合せから選択されてもよい。代替方法として、精製されたクラゲコラーゲンの溶液は、酵抽出によって、コラーゲンの供給源から精製される。

別の好ましい実施形態において、クラゲコラーゲンは、コクカイビゼンクラゲ（Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａｓｐｕｌｍｏ）、ビゼンクラゲ（Ｒｈｏｐｉｌｅｍａｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ロピレマ・ノマディカ（Ｒｈｏｐｉｌｅｍａｎｏｍａｄｉｃａ）、スナクラゲ（Ｓｔｏｍｏｌｏｐｈｕｓｍｅｌｅａｇｒｉｓ）、ミズクラゲ（Ａｕｒｅｌｉａｓｐ．）、エチゼンクラゲ（Ｎｅｍｏｐｉｌｅｍａｎｏｍｕｒａｉ）、又はそれらの組合せから精製される。好ましくは、コラーゲンは、コクカイビゼンクラゲ（Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａｓｐｕｌｍｏ）から精製される。

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様によって定義された方法から得ることができるクラゲコラーゲンヒドロゲルを提供する。

本発明の第３の態様は、２５℃から５０℃の温度で安定な単離されたクラゲコラーゲンヒドロゲルを提供する。好ましくは、ヒドロゲルは、細胞培養条件において、少なくとも３７℃以下で安定である。細胞培養条件は、哺乳類のコラーゲンヒドロゲルが、細胞を培養するための３Ｄマトリックスとして使用できる、任意の条件である。安定であるとは、ヒドロゲルが、所与の条件下で、実質的に変性しないことを意味する。実質的な変性では、例えば、前述の条件下で、ヒドロゲルをインキュベートする４８時間以内に、ヒドロゲルの体積の＞２５％の損失があり得る。

好ましい実施形態において、これらのヒドロゲルの形成は、力学的に可逆的であり、細胞のマイクロカプセル化及び３Ｄ細胞構造のヒドロゲル後形成物（ｐｏｓｔ－ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の除去を可能にする。本明細書に使用されるとき、「力学的に可逆的」は、ヒドロゲルを力によって破壊して、コラーゲンの溶液を形成することである。これは、任意の時点、例えば、３Ｄ細胞構造の作成物が培養された後で、ヒドロゲルを除去することが望ましい場合、好都合であり得る。

本発明の第４の態様は、３Ｄ細胞培養足場の生産において、本発明の第２又は第３の態様の単離されたクラゲコラーゲンヒドロゲルを使用する。細胞培養足場は、３Ｄ配向性で、インビトロで細胞を培養するのに適切なクラゲコラーゲンヒドロゲルである。

本発明の第５の態様は、医療用デバイスの生産において、本発明の第２又は第３の態様の単離されたクラゲコラーゲンヒドロゲルを使用する。好ましくは、医療用デバイスは、創傷被覆材である。本発明の文脈における創傷は、切ること、打つこと、又はその他の衝撃によって引き起こされる、生体組織に対する傷害のことであり、典型的には、皮膚が切られる又は破損されるという結果になる。創傷被覆材は典型的に、創傷を覆って、治癒の間、無菌環境になるように設計される。創傷被覆材は、例えば、薬剤が、創傷被覆材の皮膚に接触する表面に塗布される場合、治癒過程を促進し得る。コラーゲンは、１つのかかる修復剤であり、組織修復を強化するために、創傷の部位へ線維芽細胞及びケラチノサイトなどの細胞を引き付けるように働く。コラーゲンヒドロゲルはまた、新しい組織成長のための構造的支持材を提供できる。

本発明の第６の態様は、本発明の第２又は第３の態様のいずれかのクラゲコラーゲンヒドロゲルを含む医療用デバイスを提供する。好ましくは、デバイスは、創傷治癒剤である。代替方法として、医療用デバイスは、角膜シールド、軟膏、ニューロンの一群、又は整形外科デバイスであってもよい。

本発明の第８の態様は、細胞を培養する本発明の第６の態様の３Ｄ細胞培養足場を使用する。細胞培養足場は、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、ニューロン、腎細胞、上皮細胞、グリア細胞、ホルモン分泌細胞、バリア機能細胞、細胞外マトリックス細胞、収縮性細胞、水晶体細胞、幹細胞、間葉系幹細胞、血液由来の幹細胞、人工多能性幹細胞、又はそれらの組合せからなる群から選択される、初代哺乳類細胞の培養のために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞培養足場は、肝細胞の培養において使用されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞培養足場は、心筋細胞の培養において使用されてもよい。いくつかの実施形態において、初代細胞は、ヒトの細胞である。細胞を培養するための３Ｄ足場の使用は、種々の研究及び医療用途を有し得る、３Ｄ細胞構造の成長を可能にすることができる。例えば、足場は、外科的移植術のための新しい組織を設計するために使用され得る。例として、かかる組織は、角膜シールド、骨、ニューロン又は軟膏であってもよい。足場としてクラゲコラーゲンヒドロゲルを使用して成長させることができるその他の組織は、当業者にとって周知であろう。

本発明の別の態様において、精製されたクラゲコラーゲンの溶液、中和緩衝液及び架橋剤を含むキットが提供される。キットは、本明細書に記載された成分のそれぞれの任意の実施形態を含んでよい。

本発明を、以下の非限定的実施例を参照して、さらに説明する。

［実施例１］
クラゲコラーゲンの抽出
コクカイビゼンクラゲ（Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａｐｕｌｍｏ）からの酸可溶性コラーゲンの抽出
クラゲ（コクカイビゼンクラゲ：Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａｐｕｌｍｏ）材料を、４００μｍフィルターを通し、保持物を、後で使用するために凍結した。凍結された組織を、通常の攪拌によって、２４時間かけて解凍した。完全に解凍したらすぐに、組織を、５０％ＮａＯＨでｐＨ１３にし、さらに２４時間、放置した。２４時間後、濃酢酸を、濃度０．５Ｍまで加え、ｐＨを、ＨＣｌを使用して、３．０に調整した。次に、組織を、３～５日間、放置して、非常に低い固体含有量の粘性溶液を得た。全ての工程を、４℃で実行した。

コラーゲン精製
溶液を、２００００ＲＣＦで１時間、遠心分離して、全ての残っている固体物質を除去した。遠心分離後、濃度１ＭまでＮａＣｌを添加することによって、コラーゲンを、溶液から沈殿させ、引き続き、さらに２０分間、遠心分離して、沈殿させたコラーゲンを得た。次に、ペレットを、０．１Ｍ酢酸中で再懸濁し、濃ＨＣｌによって、ｐＨをｐＨ３に調整した。結果として生じる溶液を、合計１０時間、さらに遠心分離し、次に、無色透明のＪＦＣ溶液が得られるまで、１００ｋＤａ濾過膜を組み込んだＳａｒｔｏｒｉｕｓＶｉｖａｆｌｏｗ２００システムによって、０．１Ｍ酢酸で６倍量の透析容量で透析濾過した。この場合も先と同様に、全ての工程を、４℃で実行した。

［実施例２］
ＪＦＣヒドロゲル形成に対する溶液条件の影響
ＪＦＣの原線維発生アッセイ－酸可溶性のｐＨ依存
酸可溶性ＪＦＣを、３ｍｇ／ｍｌに希釈し、１０×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えて、９：１の比率にした。試料のｐＨを、１ＭのＮａＯＨを使用して、ｐＨ３、５、６、７、８、及び９に調整した（図１）。次に、試料を、ＵＶ－ｖｉｓキュベットに加えて３通り作り、定常に到達するまで、３１３ｎｍで、通常の吸光度測定を行った。

図１は、ＪＦＣの原線維発生が、ｐＨ６からｐＨ９のｐＨの溶液中で、起き得ることを示す。

ＪＦＣの原線維発生アッセイ－ＮａＣｌ濃度の影響
酸可溶性ＪＦＣを、３ｍｇ／ｍｌに希釈し、溶液のｐＨを、１ＭのＮａＯＨを使用して、ｐＨ７．４に調整した。次に、０Ｍ、０．６９Ｍ、１．３８Ｍ及び２．７４ＭのＮａＣｌを含有する１０×ＰＢＳを加えて、ＪＦＣ対１０×ＰＢＳ比、９：１にし、必要であれば、ｐＨを、再びｐＨ７．４に調整した。次に、試料を、ＵＶ－ｖｉｓキュベットに加えて３通り作り、定常に到達するまで、３１３ｎｍで、通常の吸光度測定を行った（図２）。

図２は、ＮａＣｌの濃度が、ＪＦＣ原線維発生に対して有意に影響しないことを示す。

クラゲコラーゲンヒドロゲルの形成－ｐＨ及び温度の影響
酸可溶性ＪＦＣの試料３ｍｇ／ｍｌに、１０×ＰＢＳを加えて、ＪＦＣ対ＰＢＳ比、９：１にすることによって、ＪＦＣを、ゲル状にした。ＮａＯＨを加えて、溶液をｐＨ３、５、６、７、８、及び９に調整した。次に、それぞれのｐＨの試料を、８時間、４℃又は１９℃のいずれかで放置して、ゲルを成長させた。

使用された条件下で、ＪＦＣ原線維形成及びゲル化が、４℃で最もよく起こる。

熱安定性の判定
ヒドロゲルの熱安定性を、ｐＨ９及び４℃で、ＰＢＳ中に形成されるヒドロゲルを使用して研究した。ＪＦＣ溶液に、２．７４ＭのＮａＣｌを補充した。結果として生じるＪＦＣヒドロゲルを、１８℃、２０℃、２２℃、２４℃、及び２６℃のいずれかで、５分間、水浴槽に浸漬した。変性温度を、ゲルの半分が崩壊する時点として、判定した。

図４は、クロスリンカーの不在で、ヒドロゲルが、およそ２０℃の熱安定性を有することを示す。

［実施例３］
ヒドロゲルの熱安定性を上昇させること
クラゲコラーゲン（ＪＦＣ）ヒドロゲルの熱安定性を上昇させるクロスリンカーである、ゲニピン、ＢＤＤＧＥ、及びムコクロロ酸の能力を、＞３７℃で長期間安定なＪＦＣヒドロゲルを作る目的で、評価した。

クラゲコラーゲン（ＪＦＣ）ゲルの調製
酸で可溶化されたＪＦＣ３．５ｍｇ／ｍｌの複数のアリコートを、１０×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、９：１（ＪＦＣ：１０×ＰＢＳ）の比率で希釈した。次に、それぞれの溶液を、濃ＮａＯＨを加えることによって、ｐＨ３からｐＨ９の間にｐＨ調整した。次に、架橋剤１，４－ＢＤＤＧＥ、ゲニピン又はムコクロロ酸を加えて、それぞれ、最終濃度１％から４％まで、又は０．０２５％から５％まで、又は０．１％から５％にした。次に、溶液を、攪拌して、クロスリンカーを拡散させ、０．５時間から２４時間、４℃から２５℃でインキュベートして、原線維発生及びゲル化を完成させた。

熱安定性の判定
熱安定性を判定するために、架橋ゲルを、２０℃のインキュベーターに入れた。温度を、１時間ごとに１℃上昇させて、熱安定性を記録した（図３）。熱安定性を、ゲルが最初に収縮及び／又は融解し始めた温度と定義した、以下、Ｔ_ｍと呼ぶ。

時間が経つにつれた、１％ＢＤＤＧＥ又は０．１％ゲニピンヒドロゲルのいずれかと架橋されたヒドロゲルの熱安定性の進化を、ある範囲のｐＨ溶液において調査した（図３）。これは、時間又はｐＨが、ヒドロゲル熱安定性に対する効果を有するかどうかを判定するために実施された。図３は、ｐＨと無関係に、ＢＤＤＧＥ架橋ヒドロゲルが、最初の２４時間の間に、熱安定性における上昇、およそ１３℃を経験することを示す。次に、熱安定性は、７２時間までずっと、定常であり、７２時間の時点で、ヒドロゲルの熱安定性における着実な上昇が、ｐＨ８で観察される（１２０時間後、熱安定性４５℃）。

対照的に、ゲニピンで架橋されたＪＦＣヒドロゲルは、２４時間後、熱安定性において、時間依存性又はｐＨ依存性の上昇を示さない。ゲニピン架橋ヒドロゲルの熱安定性は、ｐＨと無関係に２４時間後およそ４５℃に上昇する（図３）。

したがって、１２０時間、ｐＨ８でインキュベートされた場合のＢＤＤＧＥで架橋されたヒドロゲルを除いて、ゲニピン架橋ヒドロゲルは、ＢＤＤＧＥ架橋ヒドロゲルより高い熱安定性を有する。

様々な濃度のＢＤＤＧＥ及びＧＰで架橋されたヒドロゲルの熱安定性
ゲニピン及びＢＤＤＧＥの両方の２つの濃度を、使用して、３７℃で安定なヒドロゲルを形成させ得る、それぞれのクロスリンカーの可能な最低濃度を判定した。架橋ヒドロゲルを、１２０時間、ｐＨ７で、１％及び４％ＢＤＤＧＥ（ｖ／ｖ）ならびに０．０２５％、０．０５％、０．０７５％及び０．１％ゲニピンで形成し、Ｔ_ｍに対する効果を、（図４）に示す。図で分かる通り、１％ＢＤＤＧＥヒドロゲルは、４％ＢＤＤＧＥヒドロゲルと全く同じＴ_ｍを有した。両方の濃度は、非架橋ヒドロゲルにおける２０℃から、１％及び４％架橋ヒドロゲル両方における３５℃まで、Ｔ_ｍの上昇１５℃をもたらした。ｐＨ８でインキュベートされなかったので、いずれの濃度も、３７℃で安定なヒドロゲルを生成しなかった。ゲニピン濃度の全ては、３７℃で熱安定性のヒドロゲルを生成し、最低Ｔ_ｍは、０．０２５％ゲニピン架橋ヒドロゲルにおける４３℃であった（図４）。これは、非架橋対照より２３℃高い。３つのより高い濃度、０．０５％、０．０７５％及び０．１％ＧＰは全て、Ｔ_ｍ４５℃を有した。

したがって、ゲニピンの上記の濃度のいずれかと架橋するヒドロゲルは、３７℃を超えるＴ_ｍを有するヒドロゲルを生成する（図４）。

Claims

クラゲコラーゲン原線維を含むクラゲコラーゲンヒドロゲルの製造方法であって、前記製造方法は、
ａ．ｉ．精製されたクラゲコラーゲンの溶液、及び
ｉｉ．水性中和緩衝液を混合する工程と、
ｂ．前記混合物を、コラーゲン原線維の形成を可能にするのに十分な長さの時間、インキュベートする工程と、を含み、
架橋剤が、混合工程（ａ）の間に加えられるか、又は工程（ｂ）から得られた前記コラーゲン原線維に加えられるかのいずれかであるコラーゲンヒドロゲルの製造方法。
前記混合工程（ａ）が、ｐＨ４からｐＨ９のｐＨを有する溶液をもたらす、場合によりｐＨは７．４である、請求項１に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法。
工程（ｂ）が、４℃から２５℃の温度で実施される、請求項１又は２に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法。
前記十分な長さの時間が、１２時間以下であり、好ましくは、前記十分な長さの時間が、５から６０分である、請求項１から３のいずれか一項に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法。
前記水性中和緩衝液が、リン酸をベースとする、請求項１から４のいずれか一項に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法。
前記架橋剤が、ゲニピン、１，４－ＢＤＤＧＥ、又はムコクロロ酸から選択されるものであり、
前記架橋剤が、
ａ．ゲニピンの場合、最終濃度０．００１％から５％、好ましくは０．０２５％（ｗ／ｖ）で加えられ、
ｂ．１，４－ＢＤＤＧＥの場合、最終濃度０．００１％から５％、好ましくは４％（ｗ／ｖ）で加えられ、
ｃ．ムコクロロ酸の場合、最終濃度０．００１％から５％、好ましくは、０．２５％から４％（ｗ／ｖ）で加えられ、
場合により、前記架橋剤がゲニピン又は１，４－ＢＤＤＧＥである、請求項１から５のいずれか一項に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法。
前記精製されたクラゲコラーゲンの溶液が、酵素抽出によってコラーゲンの供給源から精製されたものであり、場合により前記酵素がペプシンである、請求項１から６のいずれか一項に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法。
前記精製されたクラゲコラーゲンの溶液が、酸抽出によってコラーゲンの供給源から精製された、請求項１から７のいずれか一項に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法。
前記精製されたクラゲコラーゲンの溶液が、コクカイビゼンクラゲ（Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａｓｐｕｌｍｏ）、ビゼンクラゲ（Ｒｈｏｐｉｌｅｍａｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ロピレマ・ノマディカ（Ｒｈｏｐｉｌｅｍａｎｏｍａｄｉｃａ）、スナクラゲ（Ｓｔｏｍｏｌｏｐｈｕｓｍｅｌｅａｇｒｉｓ）、ミズクラゲ（Ａｕｒｅｌｉａｓｐ．）、エチゼンクラゲ（Ｎｅｍｏｐｉｌｅｍａｎｏｍｕｒａｉ）、又はそれらの組合せから精製されたものであり、場合により前記精製されたクラゲコラーゲンの溶液が、コクカイビゼンクラゲ（Ｒｈｉｚｏｓｔｏｍａｓｐｕｌｍｏ）から精製された、請求項１から８のいずれか一項に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法。
請求項１から９のいずれか一項に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法から得ることができるものであり、前記コラーゲンヒドロゲルは２５℃から５０℃の温度で安定であるクラゲコラーゲンヒドロゲル。
２５℃から５０℃の温度で安定な単離されたものであり、前記コラーゲンヒドロゲルは中和緩衝液及び架橋剤を含み、前記コラーゲンヒドロゲルはクラゲコラーゲン原線維を含むクラゲコラーゲンヒドロゲル。
３Ｄ細胞培養足場の生産における、請求項１０又は請求項１１に記載の前記クラゲコラーゲンヒドロゲルの使用。
医療用デバイスの生産において、請求項１０又は請求項１１に記載の前記クラゲコラーゲンヒドロゲルの使用であって、場合により前記医療用デバイスが、創傷被覆材である、使用。
薬物送達のための担体としての、請求項１０又は請求項１１に記載の前記クラゲコラーゲンヒドロゲルの使用。
請求項１０又は請求項１１に記載の前記クラゲコラーゲン足場を含む医療用デバイスであって、場合により前記医療用デバイスが創傷被覆材である、医療用デバイス。
請求項１０又は請求項１１に記載のクラゲコラーゲンヒドロゲルを含む細胞培養足場。
請求項１０又は請求項１１に記載の前記クラゲコラーゲンヒドロゲルを含む薬物送達のための担体。
細胞を培養するための、請求項１６に記載の細胞培養足場の使用であって、場合により前記細胞がヒトの細胞である細胞培養足場の使用。
前記細胞が、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、ニューロン、腎細胞、上皮細胞、グリア細胞、ホルモン分泌細胞、バリア機能細胞、細胞外マトリックス細胞、収縮性細胞、水晶体細胞、幹細胞、間葉系幹細胞、血液由来の幹細胞、人工多能性幹細胞、又はそれらの組合せからなる群から選択される、初代哺乳類細胞であって、
場合により前記細胞が肝細胞又は心筋細胞である、請求項１８に記載の使用。
（ｉ）前記細胞が、培養されて、創薬における使用のための３Ｄ細胞組織構造を形成する、
（ｉｉ）前記細胞が、培養されて、角膜シールドを形成する、
（ｉｉｉ）前記細胞が、培養されて、軟膏を生成する、
（ｉｖ）前記細胞が、培養されて、骨を形成する、
（ｖ）前記細胞が、培養されて、ニューロンを形成する、
（ｖｉ）前記細胞が、共培養できる、
請求項１８に記載の使用。
請求項１に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法に使用するためのキットであって、
前記キットは、精製されたクラゲコラーゲンの溶液、中和緩衝液及び架橋剤を含み、場合により前記精製されたクラゲコラーゲンの溶液が、０．１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度であるキット。
請求項２１に記載のコラーゲンヒドロゲルの製造方法に使用するためのキットであって、
前記中和緩衝液が、遊離アミンを含まず、好ましくは、前記中和緩衝液が、リン酸をベースとするものであり、場合により前記架橋剤が、ゲニピン、１，４－ＢＤＤＧＥ、又はムコクロロ酸から選択されるキット。