ES2870612T3

ES2870612T3 - Método para producir hidrogeles de colágeno

Info

Publication number: ES2870612T3
Application number: ES17767893T
Authority: ES
Inventors: Andrew Mearns Spragg
Original assignee: JELLAGEN Pty Ltd
Current assignee: JELLAGEN Pty Ltd
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2021-10-27
Anticipated expiration: 2037-09-07
Also published as: KR20230163000A; DK3509649T3; EP3509649A1; WO2018046920A1; GB201615205D0; JP7062667B2; US11369714B2; KR102606472B1; JP2019529538A; EP3509649B1; KR20190055124A; PT3509649T; US20190216972A1

Abstract

Un proceso para producir un hidrogel de colágeno de medusa que comprende fibrillas de colágeno de medusa, comprendiendo dicho proceso: a. mezclar: i. una solución de colágeno de medusa purificado; y ii. un tampón de neutralización acuoso; y b. incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que se formen fibrillas de colágeno, en donde un agente de reticulación se añade durante la etapa de mezcla (a) o a las fibrillas de colágeno obtenidas a partir de la etapa (b).

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir hidrogeles de colágeno

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procesos para fabricar conjuntos de colágeno y productos de los mismos.

Antecedentes de la invención

El colágeno es la proteína más ubicua en el proteoma de mamífero, comprendiendo hasta un 30 % de todas las proteínas (Leitinger y Hohenester, 2007). Forma una gran parte de la matriz extracelular y del tejido conectivo, ofreciendo fuerza y flexibilidad a los tejidos del organismo. Además de su papel en la resistencia mecánica, el colágeno funciona como molécula de señalización, regulando la migración celular (Greenberg, et al., 1981), la diferenciación (Bosnakovski, et al., 2005) y la proliferación (Pozzi, et al., 1998) y funciones en la hemostasia (Farndale, et al., 2004).

El potencial del colágeno como biomaterial se hace evidente por sus valiosas propiedades, tales como baja inmunogenicidad y citotoxicidad y alta resistencia a la tracción. Hasta la fecha, se han sugerido, desarrollado y aplicado una gran cantidad de usos médicos del colágeno. Muchas de estas aplicaciones usan colágeno cuando forman conjuntos en sustratos o armazones no planos. Los armazones de colágeno se pueden usar como matrices de cultivo celular 3D (Song, et al., 2006), armazones de regeneración tisular (Hoyer et al., 2014), escudos corneales (Willoughby y Batterbury, 2002), agentes reparadores de heridas tópicas y vehículos para suministro de fármacos. Un tipo de armazón de colágeno usado comúnmente es el hidrogel de colágeno. Los hidrogeles de colágeno consisten en una red de fibras de colágeno solubles que se impide que se disocien mediante entrelazamiento polimérico y/o reticulación covalente. También se pueden formar a partir de suspensiones coloidales. Las propiedades físicas de los hidrogeles se pueden ajustar dependiendo de la ruta de fabricación. Este tema está cubierto por varias revisiones detalladas (Drury y Mooney, 2003) (Hennink y van Nostrum, 2012) (Hoffman, 2012). Los hidrogeles de colágeno se están convirtiendo rápidamente en un componente esencial de las técnicas modernas de cultivo celular. Permiten el crecimiento de células en una red 3D que recuerda más a su entorno in vivo. La capacidad de cultivo celular in vitro en un entorno in vivo tiene beneficios evidentes para el estudio de la biología celular. Los hidrogeles 3D también se pueden usar como armazones de ingeniería tisular, con una utilidad particular en la reparación del cartílago.

La mayoría de las fuentes comerciales de colágenos se obtienen a partir de tejidos de mamífero. Sin embargo, se sabe bien que el uso de colágenos de mamífero en ingeniería tisular está asociado a un riesgo considerable de transmisión vírica. Además, la purificación de colágeno a partir de fuentes de mamífero está asociada a un gasto considerable, y las moléculas contaminantes arrastradas por los métodos de purificación perjudican la reproducibilidad de la formación de hidrogel de colágeno de mamífero. Esto puede comprometer significativamente la fiabilidad de los hidrogeles de colágeno de mamífero cuando se usan en cultivo celular. Por lo tanto, durante mucho tiempo se ha considerado deseable una fuente alternativa de colágeno.

El colágeno extraído de la piel de salmón se ha propuesto como fuente alternativa de colágeno para su uso en la fabricación de armazones 3d (documento de patente US 8105629). El colágeno de medusa es otra molécula de colágeno alternativa potencial. El colágeno de medusa ya se ha empleado con éxito como armazón de cultivo celular 3D en forma de esponja deshidratada. Se ha encontrado que el colágeno de medusa es una alternativa muy deseable en este intento, que exhibe baja inmunogenicidad, bajos costes de fabricación y no presenta el riesgo de transferencia de virus y transmisión de enfermedades asociadas a colágenos de mamífero. Sin embargo, diferentes matrices son beneficiosas para diferentes aplicaciones clínicas y de investigación; por lo tanto, todavía existe el deseo de obtener hidrogeles de colágeno de medusa. Sin embargo, las limitaciones evolutivas impuestas al colágeno de medusa significan que la proteína ha evolucionado para funcionar de manera óptima a temperaturas menores. Esta termoestabilidad menor ha impedido hasta ahora la fabricación de hidrogeles de colágeno de medusa adecuados para su uso a temperaturas fisiológicas.

El documento de patente WO 2014/106830 desvela un método de fabricación de un hidrogel obtenido a partir de medusa que se puede usar como dispositivo biomédico. La proteína de medusa se añade a una solución tampón de fosfato (pH 7 o 9) antes de añadir el aditivo que puede ser un agente de reticulación.

Por lo tanto, existe la necesidad de métodos mejorados para fabricar hidrogeles de colágeno de medusa adecuados para su uso en cultivo celular y aplicaciones médicas.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el hallazgo completamente inesperado de que, a pesar de las propiedades fisicoquímicas muy diferentes de los colágenos de medusa en comparación con los colágenos de mamífero o de pescado, los colágenos de medusa se pueden usar para formar hidrogeles 3D estables en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, un primer aspecto de la invención es un proceso para producir un hidrogel de colágeno de medusa que comprende fibrillas de colágeno de medusa, comprendiendo dicho proceso: (a) mezclar una solución de colágeno de medusa purificado y un tampón de neutralización acuoso; y (b) incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que se formen fibrillas de colágeno, en donde un agente de reticulación se añade durante la etapa de mezcla (a) o a las fibrillas de colágeno obtenidas a partir de la etapa (b).

Un segundo aspecto de la invención proporciona un hidrogel de colágeno de medusa obtenible a partir del proceso definido en el primer aspecto de la invención. El hidrogel tiene gelificación reversible porque reacciona térmica y mecánicamente.

Un tercer aspecto de la invención proporciona un hidrogel de colágeno de medusa aislado, en donde el hidrogel de colágeno de medusa es estable a una temperatura de 25 °C a 50 °C.

Un cuarto aspecto de la invención utiliza el hidrogel de colágeno de medusa aislado del segundo o el tercer aspectos de la invención en la fabricación de un armazón de cultivo celular 3D.

Un quinto aspecto de la invención utiliza el hidrogel de colágeno de medusa aislado del segundo o el tercer aspectos de la invención en la fabricación de un dispositivo médico.

Un sexto aspecto de la invención proporciona un dispositivo médico que comprende el hidrogel de colágeno de medusa de cualquiera del segundo o el tercer aspectos de la invención.

Un séptimo aspecto de la invención proporciona un armazón de cultivo celular 3D que comprende un hidrogel de colágeno de medusa de cualquiera del segundo o el tercer aspectos de la invención.

Un octavo aspecto de la invención utiliza el armazón de cultivo celular 3D del sexto aspecto de la invención de cultivar células.

Un noveno aspecto de la invención proporciona un kit que comprende una solución de colágeno de medusa purificado, un tampón de neutralización, y un agente de reticulación.

Listado de dibujos

La invención se ilustra mediante las siguientes figuras, en las que:

La Figura 1 muestra la influencia del pH en la formación de fibrillas en el colágeno de medusa.

La Figura 2 muestra la influencia de la concentración de NaCl en la fibrilogénesis del colágeno de medusa (JFC). La Figura 3 muestra el efecto del tiempo y el pH en la termoestabilidad de los hidrogeles de fibrillas de colágeno reticulados con BDDGE o genipina (GP).

La Figura 4 muestra el efecto de la concentración de reticulador en la estabilidad térmica. Todos los geles se formaron a pH 7 durante 120 h. n = 3 para cada concentración. Control = hidrogel de JFC sin reticulador, pH 7 después de 120 h.

Descripción detallada de la invención

La presente invención es la realización de un método que permite el uso de colágeno de medusa (JFC) como alternativa de colágeno de mamífero viable y práctica para la construcción de hidrogeles.

La invención es posible mediante el descubrimiento sorprendente de que los hidrogeles de JFC se pueden formar y estabilizar a temperaturas y pH fisiológicos. Anteriormente, no era posible fabricar tales hidrogeles debido a la baja termoestabilidad del JFC. Las diferentes condiciones ambientales y la distancia evolutiva entre los colágenos de mamífero y de medusa significan que el JFC ha evolucionado para funcionar de manera óptima a temperaturas menores. Además, debido a las propiedades fisicoquímicas únicas del JFC, es probable que los principios termodinámicos que dirigen la agregación del JFC sean significativamente diferentes en comparación con los que controlan la agregación de colágenos de mamífero o pescado. Para formar hidrogeles de colágeno generalmente se requiere la agregación resistente de moléculas de colágeno en fibrillas. Por lo tanto, a la vista de la termoestabilidad reducida y las propiedades de agregación desconocidas del JFC, es completamente sorprendente que el JFC se pueda inducir para formar hidrogeles de colágeno en condiciones similares a las usadas para formar hidrogeles de colágeno de mamífero. Además, aún es más sorprendente, con respecto a la termoestabilidad reducida del JFC, que estos hidrogeles sean suficientemente estables en condiciones fisiológicas para permitir su uso como sustitutos eficaces de hidrogeles de colágeno de mamífero y pescado.

La invención se describe adicionalmente con referencia a las siguientes definiciones usadas en el presente documento.

Una "solución de colágeno de medusa purificado" se refiere a una solución de JFC aislado que es sustancialmente monomérico o, alternativamente, está sustancialmente exenta de fibrillas de colágeno. En este contexto, "sustancialmente exenta" se refiere a una solución de colágeno con menos de un 2 % en peso del colágeno formado por fibrillas. Para mantener una solución de colágeno en estas condiciones, el colágeno aislado se puede almacenar en condiciones que desfavorezcan la formación de fibrillas de colágeno. Esto puede significar que el colágeno se almacena en condiciones ácidas, en donde ácida significa cualquier solución con un pH de 1 a pH 6,5, o alternativamente en condiciones básicas, en donde básica significa cualquier solución con un pH de pH 8 a pH 14. A modo de ejemplo no limitante, el colágeno se puede almacenar en una solución 0,1 M de ácido débil. El ácido débil puede ser ácido acético o ácido clorhídrico. La concentración de colágeno en la solución de colágeno puede estar en el intervalo de 0,1 mg/ml a 30 mg/ml. Preferentemente, la concentración de la solución de colágeno es de 1 mg/ml a 10 mg/ml.

Existen múltiples métodos para "aislar", o "purificar", el colágeno de medusa del medio anatómico. Muchos de estos serán bien conocidos y habituales para la persona con experiencia en la materia. Por ejemplo, el colágeno se puede purificar a partir de medusa mediante extracción ácida, mediante la que diferentes partes anatómicas de la medusa se introducen en un baño con una solución ácida. "Bañar", o "bañado", se refiere al proceso de incubar la medusa en la solución ácida durante un periodo de tiempo suficiente para liberar la molécula de colágeno. Un método alternativo de purificación de colágeno es la extracción enzimática, mediante la que la medusa se incuba con al menos una enzima proteolítica durante un periodo de tiempo suficiente y en condiciones que favorezcan la degradación del medio anatómico para liberar la molécula de colágeno. La temperatura, el pH y el tiempo de incubación exactos del método de extracción de la enzima variarán dependiendo de la enzima proteolítica usada. El experto en la materia conocerá bien las condiciones más adecuadas. A modo de ejemplo no limitante, la enzima pepsina se puede incubar con medusa en condiciones ácidas para liberar la molécula de colágeno. Se prevé que en el método de extracción enzimática se pueda usar cualquier enzima, y los ejemplos mencionados anteriormente no pretenden ser limitantes en modo alguno.

A continuación el colágeno se puede aislar, o purificar, adicionalmente de los contaminantes no deseados del método de extracción ácida o enzimática mediante una serie de diferentes medios. Por ejemplo, los contaminantes insolubles se pueden eliminar mediante centrifugación. Si se requiere una fuente más pura de colágeno, el colágeno aislado se puede someter a filtración en gel, o a un método alternativo de cromatografía que podría permitir la purificación de la molécula de colágeno para otros contaminantes solubles del proceso de extracción. El método exacto de purificación adicional no es particularmente limitante. Con el fin de obtener colágeno de medusa purificado o aislado se podría adaptar cualquier método bien conocido y usado habitualmente por un bioquímico de proteínas. Esta etapa también puede permitir la transferencia del colágeno de medusa al tampón de almacenamiento deseado para obtener la solución de colágeno de medusa purificado deseada. Esto se puede lograr equilibrando primero el aparato de cromatografía con el tampón de almacenamiento deseado antes de la purificación. Para esta finalidad existen muchos métodos alternativos bien conocidos que se podrían usar. Preferentemente, la solución de colágeno usada en la invención tiene una pureza de un 70 % a un 99 %, en donde puro se refiere al % en peso en solución atribuible a la molécula de colágeno. Más preferentemente, la solución de colágeno es pura en al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 %.

La expresión "tampón de neutralización" se refiere a cualquier tampón dentro del que se puede diluir una solución de colágeno de medusa purificado para aumentar o disminuir el pH a un pH de 4 a un pH de 9. La composición del tampón de neutralización no es particularmente limitante, solo en la medida en que debe aumentar o disminuir el pH de la solución de colágeno de medusa purificado para que se pueda desarrollar la formación de fibrillas de colágeno. Además, el tampón debe estar sustancialmente exento de iones, compuestos o moléculas que puedan interferir con cualquier proceso de reticulación. Por lo tanto, es particularmente deseable un tampón sustancialmente exento de aminas sin reaccionar. A modo de ejemplo no limitante únicamente, el tampón de neutralización puede ser solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 1x a 10x, donde 1x o 10x se refieren a la concentración de PBS. El experto en la materia conocerá bien la composición de PBS 1x. La concentración exacta de PBS (es decir, 1x o, ejemplo, 10 x) dependerá completamente del factor de dilución requerido cuando se mezcla con la solución de colágeno de medusa purificado, para que la solución de colágeno de medusa purificado se neutralice sustancialmente de modo que la formación de fibrilla de colágeno se pueda desarrollar. En algunas realizaciones, el tampón de neutralización es hidróxido de sodio.

La expresión "formación de fibrillas", o "fibrilogénesis", se refiere al proceso mediante el cual las moléculas de colágeno experimentan una agregación controlada para formar conjuntos macromoleculares bien estructurados de orden superior. El colágeno in vivo es una proteína predominantemente extracelular cuya agregación en estructuras fibrilares proporciona soporte arquitectónico para los tejidos circundantes y/o componentes de la matriz extracelular. La agregación de colágenos, en particular colágenos de mamífero, es un fenómeno bien conocido. Diferentes isoformas de colágenos de mamífero y marinos se agregan preferentemente en diferentes estructuras macromoleculares. Las estructuras macromoleculares únicas formadas a partir de cada isoforma de colágeno se rigen por las propiedades fisicoquímicas del polipéptido de colágeno y las condiciones bajo las cuales se promueve la fibrilogénesis. Se han explotado in vitro estructuras de colágeno de orden superior, es decir, fibrillas de colágeno obtenidas a partir de mamífero o pescado, para generar hidrogeles de colágeno de mamífero y/o pescado. Por lo tanto, para formar hidrogeles a partir de colágenos de medusa, se prefiere que los colágenos de medusa se ensamblen en estructuras de orden superior. Preferentemente, la estructura de orden superior es una fibrilla.

El término "reticulador" o "agente de reticulación" se refiere a un compuesto químico reactivo que, en ciertas condiciones, puede formar uniones covalentes entre dos moléculas independientes. En el contexto de la presente invención, un agente de reticulación se usa para unir covalentemente dos moléculas de colágeno independientes. Preferentemente, las moléculas de colágeno que se van a reticular están en forma de fibras de colágeno. Preferentemente se produce una reticulación interfibrillas. Generalmente los agentes de reticulación están formados por dos o más grupos funcionales reactivos unidos en conjunto mediante una cadena de hidrocarburo. Los dos o más grupos funcionales no tienen que ser necesariamente iguales. La longitud de la cadena de hidrocarburo también se puede variar para controlar la distancia entre los grupos funcionales. En el contexto de la presente invención no se pretende que la longitud exacta de la cadena de hidrocarburo sea limitante. Además, el tipo de grupo funcional reactivo del agente de reticulación no es particularmente limitante. Se prevé que cualquier agente de reticulación conocido por que su reticulación en las condiciones en las que se forman fibrillas de colágeno podría ser un agente de reticulación adecuado para su uso en la invención. En ciertas aplicaciones, puede ser deseable usar un agente de reticulación que no sea tóxico para las células. En ciertas realizaciones, el agente de reticulación se puede seleccionar entre genipina, 1,4-BD^dGE, o ácido mucoclórico. Preferentemente, el agente de reticulación es cualquiera de genipina o 1,4-BDDGE. La inclusión de agentes de reticulación es particularmente ventajosa porque aumenta la termoestabilidad de los hidrogeles para crear un hidrogel estable a una temperatura de 25 °C a 50 °C. Por lo tanto, un primer aspecto de la invención proporciona un proceso para producir un hidrogel de colágeno de medusa que comprende fibrillas de colágeno de medusa, comprendiendo dicho proceso: (a) mezclar una solución de colágeno de medusa purificado y un tampón de neutralización acuoso; y (b) incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que se formen fibrillas de colágeno, en donde un agente de reticulación se añade durante la etapa de mezcla (a) o a las fibrillas de colágeno obtenidas a partir de la etapa (b).

En una realización preferente, la etapa de mezcla (a) da como resultado una solución de pH de pH 4 a pH 9. Preferentemente, la etapa de mezcla aumenta el pH a pH 7,4.

En otra realización preferente, la etapa (b) se realiza a una temperatura de 4 °C a 25 °C. Aunque las fibrillas se pueden formar fuera de este intervalo de temperatura, este es el intervalo de temperatura óptimo para inducir la formación de fibrillas de colágeno.

En algunas realizaciones, la etapa (b) se puede realizar durante 12 horas. En otra realización preferente, la etapa (b) se realiza de 5 a 60 minutos. El periodo de tiempo exacto dependerá de la temperatura usada en la etapa (b), ya que la temperatura controlará la cinética de formación de fibrillas de colágeno. La persona experta en la materia será capaz de calcular el periodo de tiempo óptimo para realizar la etapa (b) a diferentes temperaturas siguiendo la formación de fibrillas de colágeno a lo largo del tiempo a diferentes temperaturas usando técnicas espectroscópicas. Por ejemplo, la absorción de luz en el espectro UV-vis de longitud de onda 313 nm se puede medir a lo largo del tiempo para monitorizar la formación de fibrillas de colágeno. Un aumento en la absorción indica que la formación de fibrillas se está desarrollando. Cuando el aumento alcanza una meseta, la formación de fibrillas ha concluido, definiendo de ese modo el periodo de tiempo suficiente para realizar la etapa (b).

En otra realización preferente, el tampón de neutralización acuoso está basado en fosfato.

En otra realización preferente, el agente de reticulación se selecciona entre genipina, 1,4-BDDGE o ácido mucoclórico. Preferentemente, cuando el agente de reticulación es genipina, se añade a una concentración final de un 0,001 % a un 5 %, preferentemente a un 0,025 % (p/v); o si el agente de reticulación es 1,4-BDDGE, se añade a una concentración final de un 0,001 % a un 5 %, preferentemente a un 4 % (p/v); o si el agente de reticulación es ácido mucoclórico, se añade a una concentración final de un 0,001 % a un 5 %, preferentemente de un 0,25 % a un 4 % (p/v). Preferentemente, el agente de reticulación es genipina o BDDGE.

En otra realización preferente, la solución de colágeno de medusa purificado se purifica a partir de una fuente de colágeno mediante extracción enzimática. La enzima usada en el método de extracción enzimática se puede seleccionar entre pepsina, o una combinación de la misma. Alternativamente, la solución de colágeno de medusa purificado se purifica a partir de una fuente de colágeno mediante extracción ácida.

En otra realización preferente, el colágeno de medusa se purifica a partir de Rhizostomas pulmo, Rhopilema esculentum, Rhopilema nomadica, Stomolophus meleagris, Aurelia sp., Nemopilema nomurai, o combinaciones de las mismas. Preferentemente, el colágeno se purifica a partir de Rhizostomas pulmo.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un hidrogel de colágeno de medusa obtenible a partir del proceso definido en el primer aspecto de la invención.

Un tercer aspecto de la invención proporciona un hidrogel de colágeno de medusa aislado estable a una temperatura de 25 °C a 50 °C. Preferentemente, el hidrogel es estable hasta al menos 37 °C en condiciones de cultivo celular. Las condiciones de cultivo celular son cualquier condición en la que se podría usar un hidrogel de colágeno de mamífero como matriz 3D para cultivar células. Estable significa que el hidrogel no se desnaturaliza sustancialmente en las condiciones dadas. La desnaturalización sustancial podría ser, por ejemplo, una pérdida de > 25 % del volumen del hidrogel en las 48 h posteriores a la incubación del hidrogel en las condiciones indicadas.

En una realización preferente, la formación de estos hidrogeles es mecánicamente reversible, lo que permite la microencapsulación de células y la retirada del hidrogel después de la formación de la estructura celular 3D. Como se usa en el presente documento, "mecánicamente reversible" se refiere a la rotura mecánica del hidrogel para formar una solución de colágeno. Esto puede resultar ventajoso si se desea retirar el hidrogel en cualquier punto, por ejemplo, después de que se haya cultivado la construcción de una estructura celular 3D.

Un cuarto aspecto de la invención utiliza el hidrogel de colágeno de medusa aislado del segundo o el tercer aspectos de la invención en la fabricación de un armazón de cultivo celular 3D. Un armazón de cultivo celular es un hidrogel de colágeno de medusa adecuado para cultivar células in vitro en una orientación 3D.

Un quinto aspecto de la invención utiliza el hidrogel de colágeno de medusa aislado del segundo o el tercer aspectos de la invención en la fabricación de un dispositivo médico. Preferentemente, el dispositivo médico es un apósito. En el contexto de la presente invención, una herida se refiere a una lesión en el tejido vivo causada por un corte, golpe u otro impacto, que por lo general da como resultado un corte o rotura de la piel. Generalmente un apósito se diseña para cubrir la herida para proporcionar un ambiente estéril durante la cicatrización. Un apósito puede acelerar el proceso de curación, por ejemplo, cuando se aplican agentes médicos al apósito en la superficie que va a entrar en contacto con la piel. El colágeno es uno de esos agentes reparadores y actúa atrayendo células tales como fibroblastos y queratinocitos al sitio de la herida para mejorar la reparación tisular. El hidrogel de colágeno también puede proporcionar soporte estructural para el crecimiento de tejido nuevo.

Un sexto aspecto de la invención proporciona un dispositivo médico que comprende el hidrogel de colágeno de medusa de cualquiera del segundo o el tercer aspectos de la invención. Preferentemente, el dispositivo es un agente de cicatrización de heridas. Alternativamente, el dispositivo médico puede ser un escudo corneal, cartílago, colección de neuronas o un dispositivo ortopédico.

Un octavo aspecto de la invención utiliza el armazón de cultivo celular 3D del sexto aspecto de la invención de cultivar células. El armazón de cultivo celular se puede usar para el cultivo de células primarias de mamífero seleccionadas entre el listado que consiste en hepatocitos, miocitos, cardiocitos, queratinocitos, adipocitos, neuronas, células renales, células epiteliales, células gliales, células secretoras de hormonas, células con función de barrera, células de la matriz extracelular, células contráctiles, células del cristalino, células madre, células madre mesenquimales, células madre obtenidas a partir de sangre, células madre pluripotentes inducidas, o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el armazón de cultivo celular se puede usar en el cultivo de hepatocitos. En algunas realizaciones, el armazón de cultivo celular se puede usar en el cultivo de cardiocitos. En algunas realizaciones, las células primarias son humanas. El uso del armazón 3D para cultivar células puede permitir el crecimiento de estructuras celulares 3D que pueden tener una diversidad de aplicaciones en investigación y médicas. Por ejemplo, el armazón se podría usar para modificar, mediante ingeniería, tejido nuevo para trasplante quirúrgico. Tales tejidos, a modo de ejemplo, pueden ser escudos corneales, hueso, neuronas o cartílago. Otros tejidos que se pueden cultivar usando el hidrogel de colágeno de medusa como armazón serán bien conocidos para la persona con experiencia en la materia.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende una solución de colágeno de medusa purificado, un tampón de neutralización y un agente de reticulación. El kit puede comprender cualquiera de las realizaciones de cada uno de los componentes como se describe en el presente documento.

La invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Extracción de colágeno de medusa

Extracción de colágeno de Rhizostoma pulmo soluble en ácido

El material de medusa (Rhizostoma pulmo) se pasó a través de un filtro de 400 pm y la fracción retenida se congeló para su uso posterior. El tejido congelado se descongeló durante 24 horas con agitación regular. Cuando quedó totalmente descongelado, el tejido se llevó a pH 13 con NaOH al 50 % y se dejó durante un periodo adicional de 24 h. Después de 24 h, se añadió ácido acético concentrado a una concentración de 0,5 M y el pH se ajustó a 3,0 con el uso de HCI. A continuación el tejido se dejó durante 3-5 días para proporcionar una solución viscosa de contenido sólido muy bajo. Todas las etapas se realizaron a 4 °C.

Purificación de colágeno

La solución se centrifugó durante 1 h a 20000 RCF para retirar cualquier materia sólida restante. Después de la centrifugación, se hizo que el colágeno precipitara de la solución mediante la adición de NaCl a una concentración de 1 M y posteriormente se centrifugó durante 20 minutos más para obtener el colágeno precipitado. A continuación, el sedimento se volvió a suspender en ácido acético 0,1 M y el pH se ajustó a pH 3 con HCl concentrado. La solución resultante se centrifugó adicionalmente durante un periodo total de 10 h y a continuación se sometió a diafiltración con ácido acético 0,1 M mediante un sistema Sartorius Vivaflow 200 que incorpora un filtro de membrana de 100 kDa para 6 diavolúmenes hasta obtener una solución de JFC incolora y transparente. De nuevo, todas las etapas se realizaron a 4 °C.

Ejemplo 2: Influencia de las condiciones de la solución en la formación de hidrogel de JFC

Ensayo de fibrilogénesis de la dependencia del pH del JFC soluble en ácido

El JFC soluble en ácido se diluyó a 3 mg/ml y se añadió a solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x en una relación de 9:1. El pH de las muestras se ajustó a pH 3, 5, 6, 7, 8 y 9 usando NaOH 1 M (Figura 1). A continuación, las muestras se añadieron por triplicado a cubetas de UV-vis y se tomaron lecturas regulares de la absorbancia a 313 nm hasta alcanzar una meseta.

La Figura 1 muestra que la fibrilogénesis del JFC se puede producir en solución a un pH de 6 a 9.

Ensayo de fibrilogénesis de la influencia de la concentración de NaCl en el JFC

El JFC soluble en ácido se diluyó a 3 mg/ml y el pH de la solución se ajustó a pH 7,4 usando NaOH 1 M. A continuación se añadió PBS 10x que contenía NaCl 0 M, 0,69 M, 1,38 M y 2,74 M en una relación de 9:1 de JFC con respecto a PBS 10x y el pH se ajustó de nuevo a pH 7,4, si fuera necesario. A continuación, las muestras se añadieron por triplicado a las cubetas de UV-vis y se tomaron lecturas regulares de la absorbancia a 313 nm hasta alcanzar una meseta (Figura 2).

La Figura 2 muestra que la concentración de NaCl no tiene un impacto significativo en la fibrilogénesis del JFC. Formación de hidrogeles de colágeno de medusa - Influencia del pH y la temperatura

El JFC se gelificó añadiendo PBS 10x a una muestra de 3 mg/ml de JFC soluble en ácido en una relación de 9:1 de JFC con respecto a PBS. Para ajustar la solución a pH 3, 5, 6, 7, 8 y 9, se añadió NaOH. A continuación, las muestras de cada pH se dejaron a 4 °C o 19 °C durante 8 h para permitir que el gel se desarrollara.

En las condiciones empleadas, la formación y la gelificación de fibrillas de JFC se producen mejor a 4 °C.

Determinación de la termoestabilidad

La termoestabilidad de los hidrogeles se estudió usando hidrogeles formados en PBS a pH 9 y a 4 °C. La solución de JFC se complementó con NaCl 2,74 M. Los hidrogeles de JFC resultantes se sumergieron en un baño de agua durante 5 min a 18 °C, 20 °C, 22 °C, 24 °C y 26 °C. La temperatura de desnaturalización se determinó como el punto en el que la mitad del gel colapsaba.

La Figura 4 muestra que, en ausencia de un reticulador, el hidrogel tiene una termoestabilidad de aproximadamente 20 °C.

Ejemplo 3: Aumento de la termoestabilidad de los hidrogeles

La capacidad de los reticuladores, genipina, BDDGE y ácido mucoclóri

hidrogeles de colágeno de medusa (JFC) se evaluó con el objetivo de crear un hidrogel de JFC que sea estable durante largos periodos de tiempo a > 37 °C.

Preparación de geles de colágeno de medusa (JFC)

Se diluyeron múltiples alícuotas de 3,5 mg/ml de JFC solubilizado en ácido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x en una relación de 9:1 (JFC:PBS 10x). A continuación, el pH de cada solución se ajustó entre pH 3 y pH 9 mediante la adición de NaOH concentrado. A continuación, los agentes de reticulación, 1,4-BDdGE, genipina o ácido mucoclórico, se añadieron hasta una concentración final de un 1 % a un 4 %, o de un 0,025 % a un 5 %, o de un 0,1 % a un 5 %, respectivamente. A continuación las soluciones se agitaron para permitir la difusión del reticulador y se incubaron de 4 °C a 25 °C de 0,5 h a 24 h para permitir que se completaran la fibrilogénesis y la gelificación se completaran.

Determinación de la estabilidad térmica

Para determinar la termoestabilidad, los geles reticulados se colocaron en una incubadora a 20 °C. La temperatura se incrementó en 1 °C cada hora y la termoestabilidad se registró (Figura 3). La termoestabilidad se definió como la temperatura a la que los geles primero empezaban a contraerse y/o fundirse y en lo sucesivo se denominará T^m. La evolución de la termoestabilidad de los hidrogeles reticulados con hidrogeles de cualquiera de BDDGE al 1 % o genipina al 0,1 % a lo largo del tiempo se investigó en una selección de soluciones de pH (Figura 3). Esto se realizó para determinar si el tiempo o el pH tenían un efecto en la termoestabilidad del hidrogel. La Figura 3 muestra que, independientemente del pH, los hidrogeles reticulados con BDDGE experimentan un aumento de la termoestabilidad de aproximadamente 13 °C durante las 24 h iniciales. A continuación la termoestabilidad alcanza una meseta, hasta 72 h, momento en el que se observa un aumento constante de la termoestabilidad del hidrogel a pH 8 (después de 120 h, termoestabilidad de 45 °C).

Por el contrario, los hidrogeles de JFC reticulados con genipina no mostraron un aumento de la termoestabilidad dependiente del tiempo o dependiente del pH después de 24 h. La termoestabilidad de los hidrogeles reticulados con genipina aumenta a aproximadamente 45 °C después de 24 h independientemente del pH (Figura 3).

Por lo tanto, los hidrogeles reticulados con genipina tienen mayor termoestabilidad que los hidrogeles reticulados con BDDGE, a excepción de los hidrogeles reticulados con BDDGE cuando se incuban a pH 8 durante 120 h.

Estabilidad térmica de los hidrogeles, reticulados a diferentes concentraciones de BDDGE y GP

Se usaron dos concentraciones, tanto de genipina como de BDDGE, para determinar las concentraciones menores de cada reticulador que podrían permitir la formación de un hidrogel estable a 37 °C. Los hidrogeles reticulados se formaron con BDDg E al 1 % y al 4 % (v/v) y genipina al 0,025 %, al 0,05 %, al 0,075 % y al 0,1 % a pH 7 durante 120 h y los efectos sobre la T^mse muestran en la (Figura 4). Como se puede observar, el hidrogel de BDDGE al 1 % tenía exactamente la misma T^mque el hidrogel de BDDGE al 4 %. Ambas concentraciones dieron como resultado un aumento de la T^mde 15 °C, de 20 °C en el hidrogel sin reticular, a 35 °C en los hidrogeles reticulados tanto al 1 % como al 4 %. Ninguna concentración produjo un hidrogel estable a 37 °C, ya que no se incubaron a pH 8,0. Todas las concentraciones de genipina produjeron hidrogeles termoestables a 37 °C, siendo 43 °C la menor T^men el hidrogel reticulado con genipina al 0,025 % (Figura 4). Esto es 23 °C mayor que el control sin reticular. Las tres concentraciones de GP más elevadas, un 0,05 %, un 0,075 % y un 0,1 % tenían una T^mde 45 °C.

Por lo tanto, la reticulación de los hidrogeles con cualquiera de las concentraciones de genipina mencionadas anteriormente producen hidrogeles con una T^msuperior a 37 °C (Figura 4).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para producir un hidrogel de colágeno de medusa que comprende fibrillas de colágeno de medusa, comprendiendo dicho proceso:

a. mezclar:

i. una solución de colágeno de medusa purificado; y

ii. un tampón de neutralización acuoso; y

b. incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que se formen fibrillas de colágeno, en donde un agente de reticulación se añade durante la etapa de mezcla (a) o a las fibrillas de colágeno obtenidas a partir de la etapa (b).

2. El proceso de la reivindicación 1, en donde la etapa de mezcla (a) da como resultado una solución que tiene un pH de pH 4 a pH 9, preferentemente en donde el pH es pH 7,4.

3. El proceso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la etapa (b) se realiza a una temperatura de 4 °C a 25 °C, y/o

en donde el periodo de tiempo suficiente es de hasta 12 horas, preferentemente en donde el periodo de tiempo suficiente es de 5 a 60 minutos, y/o

en donde el tampón de neutralización acuoso está basado en fosfato.

4. El proceso de cualquier reivindicación precedente, en donde el agente de reticulación se selecciona entre genipina, 1,4-BDDGE, o ácido mucoclórico, preferentemente en donde si el agente de reticulación es:

a. genipina, se añade a una concentración final de un 0,001 % a un 5 %, preferentemente a un 0,025 % (p/v); b. 1,4-BDDGE, se añade a una concentración final de un 0,001 % a un 5 %, preferentemente a un 4 % (p/v); o c. ácido mucoclórico, se añade a una concentración final de un 0,001 % a un 5 %, preferentemente de un 0,25 % a un 4 % (p/v);

más preferentemente en donde el agente de reticulación es genipina o BDDGE.

5. El proceso de cualquier reivindicación precedente, en donde la solución de colágeno de medusa purificado se ha purificado a partir de una fuente de colágeno mediante extracción enzimática, preferentemente en donde la enzima es pepsina.

6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la solución de colágeno de medusa purificado se ha purificado partir de una fuente de colágeno mediante extracción ácida y en donde la solución de colágeno de medusa purificado se ha purificado a partir de Rhizostomas pulmo, Rhopilema esculentum, Rhopilema nomadica, Stomolophus meleagris, Aurelia sp., Nemopilema nomurai, o combinaciones de las mismas, preferentemente en donde la solución de colágeno de medusa purificado se ha purificado a partir de Rhizostomas pulmo.

7. Un hidrogel de colágeno de medusa obtenible a partir del proceso definido mediante cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un hidrogel que comprende colágeno de medusa aislado, en donde el hidrogel es estable a una temperatura de 25 °C a 50 °C, preferentemente en donde el hidrogel es estable hasta al menos 37 °C en condiciones de cultivo celular.

9. El uso del hidrogel de colágeno de medusa de las reivindicaciones 7 u 8, en la fabricación de un armazón de cultivo celular 3D.

10. El uso del hidrogel de colágeno de medusa de las reivindicaciones 7 u 8, en la fabricación de un dispositivo médico, preferentemente en donde el dispositivo médico es un apósito.

11. Un dispositivo médico que comprende el hidrogel de colágeno de medusa de las reivindicaciones 7 u 8, preferentemente en donde el dispositivo médico es un apósito.

12. Un armazón de cultivo celular que comprende el hidrogel de colágeno de medusa de las reivindicaciones 7 u 8.

13. El uso del armazón de cultivo celular 3D de la reivindicación 12, para

i) cultivar células, preferentemente en donde las células son células primarias de mamífero seleccionadas entre el listado que consiste en hepatocitos, miocitos, cardiocitos, queratinocitos, adipocitos, neuronas, células renales, células epiteliales, células gliales, células secretoras de hormonas, células con función de barrera, células de la matriz extracelular, células contráctiles, células del cristalino, células madre, células madre mesenquimales, células madre obtenidas a partir de sangre, células madre pluripotentes inducidas, o una combinación de las mismas, más preferentemente en donde las células son hepatocitos o cardiocitos, incluso más preferentemente en donde las células son humanas o

ii) en donde las células se cultivan para formar una estructura de tejido celular 3D para su uso en descubrimiento de fármacos, o

iii) en donde las células se cultivan a partir de escudos corneales, o

iv) en donde las células se cultivan para producir cartílago, o

v) en donde las células se cultivan para formar hueso, o

vi) en donde las células se cultivan para formar neuronas, o

vii) en donde las células se pueden cocultivar.

14. Un kit que comprende una solución de colágeno de medusa purificado, un tampón de neutralización y un agente de reticulación.

15. El kit de la reivindicación 14, en donde la solución de colágeno de medusa purificado está a una concentración en el intervalo de 0,1 mg/ml a 30 mg/ml, y/o

en donde el tampón de neutralización no comprende aminas libres, preferentemente en donde el tampón de neutralización está basado en fosfato, y/o

en donde el agente de reticulación se selecciona entre genipina, 1,4-BDDGE, o ácido mucoclórico.