KR20190024721A

KR20190024721A - 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재

Info

Publication number: KR20190024721A
Application number: KR1020180097973A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 전은영
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2017-08-29
Filing date: 2018-08-22
Publication date: 2019-03-08
Also published as: KR102194155B1

Abstract

본 발명은 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재, 조직 재생용 조성물, 세포 지지체, 약물 전달용 담체 및 온도 감응성 생체 소재의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질은 체온 범위에서 즉각적으로 하이드로겔화 될 수 있으며, 기존의 온도 감응성 폴리머의 가장 큰 단점인 상전이 시 발생하는 극적인 부피 축소, 수분 손실 및 그에 따른 다공성 부족 문제를 해소하고, 홍합 접착 단백질 본래의 생체 적합성 및 조직 접착능이 우수한 바, 연조직 결함 부위 재생 등에 유용한 생체 소재로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재 {Thermo-responsive biomaterial comprising thermo-responsive protein conjugated-mussel adhesive protein}

본 발명은 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재, 조직 재생용 조성물, 세포 지지체, 약물 전달용 담체 및 온도 감응성 생체 소재의 제조방법에 관한 것이다.

조직공학(tissue engineering)은 손상된 조직이나 장기를 정상조직으로 대체하거나 재생시키기 위하여 체내에 이식이 가능한 인공조직을 만들어 인체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 응용학문으로, 예컨대 유방 절제술, 화상, 사고 및 종양 제거술에 의한 다량의 연조직 결함 발생시 이를 재건하기 위한 학문을 말한다. American Society of Plastic Surgeons의 보고에 따르면, 2015년 기준 연간 행해진 조직 재건 수술 중 종양 제거술이 1위이며 그 수치는 4,500만 건에 이르는 것으로 알려졌다. 현재 이렇게 발생된 연조직 결함 부위 재생을 위한 방법으로, 자가 지방이식, 영구적인 구조체 삽입 및 비영구적인 구조체 주입 등이 있는데, 각각 빠른 지방 재흡수, 괴사 등과 같은 부작용 및 재건 시술 필요 등의 대표적인 한계를 갖고 있다. 따라서, 단순히 결함 조직을 충진하는 것뿐만 아니라, 줄기 세포 탑재 및 분화 등을 통한 연조직 재생을 유도함으로써, 궁극적으로 기존 본래의 조직들과 통합될 수 있는 생체 재생 소재를 개발하는 것이 필요하다.

생체 재생 소재 개발에 널리 활용되고 있는 하이드로겔(hydrogel)은 물 또는 체액 내에서 가교된 격자 안으로 많은 양의 물 또는 체액을 흡수하여 팽윤되며 물 속에서도 흩어지지 않고, 삼차원적인 구조를 유지하는 재료를 의미한다. 팽윤된 이후에도, 열역학적으로 안정하게 존재하여 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적 및 물리화학적 특성을 갖는다. 이러한 하이드로겔은 대게 생체 적합성, 높은 다공성 및 산소 투과도를 보이며, 생체 연조직과 비슷한 물리적 특성을 나타낼 수 있다. 천연 및 합성 고분자 기반의 하이드로겔의 초기 응용분야는 렌즈 및 상처 드레싱 정도였지만, 현재에는 지혈제, 조직 접착제, 약물 전달용 담체, 조직 충진재, 세포 및 성장인자를 포함하는 조직 재생제 등의 조직 공학 분야로 그 폭이 넓어지고 있다.

이러한 하이드로겔을 제조하기 위해 다양한 가교 방법이 사용되는데, 대부분의 가교방법은 화학적 가교제를 사용하는 것이다. 예컨대 글루타알데하이드를 이용한 단백질 가교 방법이 알려져 있다. 그러나 글루타알데히드를 비롯한 대부분의 화학적 가교방법은 단백질 구조에 커다란 변화를 주고 세포 및 조직 독성을 갖기 때문에 세포와 함께 사용될 수 없다. 따라서, 화학적 가교방법은 세포 독성을 피하기 위해, 가교가 이미 형성된 지지체에 세포를 코팅하거나 주입해주기 때문에, 일정하게 세포가 분배된 지지체를 바로 얻을 수 없다는 단점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 온도 변화에 따른 상전이를 유도하는 방법이 연구되고 있다. 이는 온도 감응성 폴리머를 이용하는 것으로 온도 감응성 폴리머는 주로 양쪽 친매성 (amphiphilic nature)을 갖고 온도 증가에 따라 용액-고체 상전이가 일어나는 특성을 나타낸다. 그러나, 온도 감응성 폴리머를 이용하는 방법 역시 세포를 탑재하는 조직 공학용 소재로의 응용은 제한되었는데, 이는 온도 감응성 폴리머의 소수성 상호작용에 의한 상전이 시 일어나는 극적인 부피 축소, 수분 손실 및 그에 따른 다공성 부족 등의 문제로 세포 탑재는 쉬우나 세포 생존이 어려운 환경 때문이다. 또한, 생활성, 생체 친화성 및 생체 접착성 등의 부족 등의 한계도 갖고 있다.

또한, 생체 내로 물질 주입 시 빠르게 겔화가 이루어진다 하더라도, 장기간 동안 조직 충진 및 조직 재생제로서의 역할을 하기 위해서는 처음에 목표한 연조직 결함 부위 내에 접착하여 유지되어야 함에도 불구하고 온도 감응성 폴리머는 생체 접착능을 나타내지 않아, 조직 재생에 사용되기에 불충분한 특성을 나타내는 문제점이 있다.

따라서 조직 재생과 같은 목적의 생체 소재로 활용할 수 있는 기계적 물성 및 생체 접착능을 두루 갖춘 새로운 생체 소재에 대한 필요성이 있다.

본 발명자들은 온도감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질이 생체 조건에서 상전이가 일어나는 온도감응성이 우수할 뿐만 아니라, 기존 온도 감응성 폴리머의 문제점인 생체 접착능 및 생체 친화성이 개선되고, 상전이 시 발생하는 극적인 부피 축소, 수분 손실 및 그에 따른 다공성 부족 문제를 해결할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재, 조직 재생용 조성물, 세포 지지체, 약물 전달용 담체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재를 제공한다.

또한 본 발명은 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 세포 지지체를 제공한다.

또한 본 발명은 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 약물 전달용 담체를 제공한다.

또한 본 발명은 온도감응성 폴리머와 홍합 접착 단백질을 반응시켜 아마이드 결합을 형성시키는 단계; 를 포함하는 온도 감응성 생체 소재의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질은 체온 범위에서 즉각적으로 하이드로겔화 될 수 있으며, 기존의 온도 감응성 폴리머의 가장 큰 단점인 상전이 시 발생하는 극적인 부피 축소, 수분 손실 및 그에 따른 다공성 부족 문제를 해소하고, 홍합 접착 단백질 본래의 생체 적합성 및 조직 접착능이 우수한 바, 연조직 결함 부위 재생 등에 유용한 생체 소재로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 fp-151과 온도 감응성 폴리머 PNIPAM 이 접합된 MAP-PNIPAM 접합체를 전기 영동 실험을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 MAP-PNIPAM 접합체의 반응 몰 수에 따른 상전이능의 변화를 빛 투과도를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 MAP-PNIPAM 접합체의 반응 몰 수 및 접합체의 단백질 농도에 따른 상전이 능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 MAP-PNIPAM 접합체의 반응 몰수 및 온도에 따른 저장 탄성률의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5은 MAP-PNIPAM 접합체의 생체 온도에서의 하이드로겔 형성을 확인하기 위한 주입 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 MAP-PNIPAM 접합체의 반응 몰수 및 폴리머 농도에 따른 수분 보유 능력을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 PNIPAM 하이드로겔 및 MAP-PNIPAM 접합체의 다공성 구조를 주사 전자 현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 MAP-PNIPAM 접합체의 조직 접착 능력을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 콜라겐 하이드로겔 및 MAP-PNIPAM 접합체 하이드로겔에서의 줄기세포 생존능을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 MAP-PNIPAM 접합체 용액과 중간엽 줄기세포 용액을 렛트에 주입 시, 주입 용이성 및 체온 조건에서의 즉각적인 하이드로겔화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 줄기세포를 포함하는 MAP-PNIPAM 접합체 또는 알지네이트 생체 주입 후, 14일과 21일 째의 조직을 H&E 염색하여 부피유지능 및 염증반응을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 줄기세포를 포함하는 MAP-PNIPAM 접합체 또는 알지네이트 생체 주입 후, 14일과 21일 째의 조직을 CD31 염색하여 신혈관 생성 효과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 줄기세포를 포함하는 MAP-PNIPAM 접합체 또는 알지네이트 생체 주입 후, 21일 째의 조직을 광학 현미경 또는 형광 염색하여 줄기세포의 분화를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 MAP-플루로닉 접합체를 전기 영동 실험을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (lane 1: maker, lane 2-4: fp-1의 아민기와 플루로닉-127의 카복시기의 농도를 각각 0.5:1, 1: 1 및 2:1로 반응시킨 MAP-플루로닉 접합체, lane 5: 반응하지 않은 fp-1).
도 15는 fp-1의 아민기와 플루로닉-127의 카복시기의 농도를 2:1로 반응시킨 MAP-Pluronic 접합체의 상온에서의 상태(좌) 및 37℃에서의 상태 (우) 를 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재를 제공한다.

상기 온도 감응성 생체 소재는 기존의 온도 감응성 폴리머의 장점인 체온 근처에서의 즉각적인 상전이를 통한 생체 주입 용이성 및 세포 도입의 용이성을 나타내며, 홍합접착 단백질 도입을 통해 향상된 수분 보유 능력, 생체 접착 능력, 다공성 및 세포 생존 등의 장점을 모두 나타내는 우수한 장점이 있다.

본 발명에 있어, 용어 “생체 소재”란 인체에 직접적으로 삽입되는 모든 재료를 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 온도 감응성 폴리머는 온도 변화에 따라 상전이 온도에서 즉각적인 상전이가 가능한 폴리머를 의미하며, 양쪽 친매성 (amphiphilic nature)을 갖고 온도 증가에 따라 용액-고체 상전이가 일어나는 폴리머를 의미한다. 특히 본 발명의 온도 감응성 폴리머는 바람직하게는 그 상전이 온도가 체온 근처인 폴리머를 포함할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 온도 감응성 폴리머는 체온 근처에서 즉각적인 상전이가 가능한 polyacrylates 계, polyesters 계, 플루로닉계의 폴리머를 제한없이 포함할 수 있으며, 바람직하게는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리메타크릴산, 폴리(2-하이드로메타크릴산), 폴리(N,N′디에틸아미노에틸)아크릴레이트, 폴리락틱-co-글라이콜레이트(poly(lacticco-glycolic acid), 폴리푸마르산 및 플루로닉-127로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 온도 감응성 생체 소재는 온도 감응성 폴리머를 포함함으로써, 상온에서는 수용액 상태로 존재하고, 30 내지 50℃, 바람직하게는 30 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 35 내지 38℃인 체온 부근에서 강해진 소수성 상호작용에 의해 겔 상태를 형성할 수 있다. 따라서 본 발명의 생체 소재는 30 내지 50℃ 에서 겔 화 되는 것을 특징으로 하는 생체 소재일 수 있다.

이와 같이 체온 근처에서 신속하게 겔화 되는 경우, 더욱 유용하게 조직 공학 응용에 사용될 수 있다. 본 발명의 온도 감응성 생체 소재는 상온에서는 수용액으로 존재하고 체온 근처에서는 즉각적인 상전이로 인해 겔화가 되기 때문에, 별도의 가교제 처리없이 수분이 많은 체내환경에서도 구조체를 유지할 수 있다. 또한 세포 및 조직 독성을 피할 수 있어, 세포 및 줄기세포, 성장인자 등과 같은 활성인자 탑재가 용이하고, 온도에 따른 즉각적인 상전이로, 비침습식 (minimal invasive) 방법인 주사기를 이용해 손쉽게 체내에 주입이 가능할 수 있다.

본 발명에 있어서, "홍합 접착 단백질" 은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp-2 (서열번호 5), fp-3 (서열번호 6), fp-4 (서열번호 7), fp-5 (서열번호 8), 및 fp-6 (서열번호 9)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 2종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 국제공개번호 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 홍합 접착 단백질은 fp-151(서열번호 10), fp-131(서열번호 12), fp-353(서열번호 13), fp-153(서열번호 14), fp-351(서열번호 15) 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 바람직하게는 fp-151(서열번호 10) 일 수 있다.

또한 본 발명의 생체 소재는 하이드로겔 형태일 수 있다.

용어 “하이드로겔”은 친수성 고분자 네트워크로 이루어진 삼차원 구조체를 의미하며, 높은 수분 함량, 다공성 구조, 부드러운 물성 및 생체 적합성과 같은 특성을 나타낸다. 본 발명의 생체 소재는 30 내지 50℃ 에서 상전이를 통해 즉각적으로 하이드로겔 형태로 변화될 수 있다. 따라서 본 발명의 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질은 온도 감응성 폴리머에 의하여 체내에서 하이드로겔로 즉각적인 상전이가 가능한 동시에, 홍합 접착 단백질에 의한 높은 수분 함량, 다공성 구조, 생체 적합성을 동시에 지닐 수 있다.

본 발명에 따른 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질은 목적에 따라 손쉽게 그 물성을 조절할 수 있으며, 수분 보유 능력, 부피 유지 능력이 우수한 생체 소재를 제조 하기 위해서는 이에 제한되는 것은 아니나, 전체 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질의 농도를 바람직하게는 40 wt% 내지 55 wt% 로 조절하여 사용할 수 있으며, 결합체 내의 단백질 함유량을 12 wt% 내지 20 wt% 로 조절하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재는 조직을 접착하는 용도로 사용될 수 있으며, 본 발명은 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 조직 접착용 온도 감응성 생체소재 및 조직 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명의 온도 감응성 생체 소재는 주입 부위에 염증을 유발하지 않아 생체 적합성이 우수하고, 생체 내 국소적으로 적용되어 예컨대 원하는 연조직 결함 부위에 접착되어 오래 유지될 수 있으며, 주입부위에서 부피를 유지하고 높은 수준의 신혈관 생성을 유도하므로 조직 접착 또는 재생에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명에 있어, 조직은 피부, 연골, 골, 혈관, 뇌, 간, 심장, 인대, 근육, 척수, 혈액, 골수, 폐, 치아, 신경, 각막, 망막, 식도, 척추, 신장, 췌장 및 요도로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 상기 조직이 연조직일 경우, 연조직은 근육, 지방, 혈관, 신경, 힘줄, 인대, 관절 막, 피부, 진피, 심장막, 근막, 연골, 경질막, 심내막, 점막 조직 태반 막, 골막, 방광, 소장 또는 대장, 요도 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 조직 재생용 조성물은 바람직하게는 연조직 재생용 조성물일 수 있고, 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질 자체의 접합능을 이용하여 생체 조직의 접합을 유도하여 조직을 재생시키거나, 조직 재생을 위한 약물, 세포 치료제 등을 담지한 후 조직에 투여되어 인체 온도에서 즉각적으로 겔화함으로써 해당 부위에서 의도하는 효과를 오래 지속시켜 조직이 원활하게 재생되도록 할 수 있다.

조직 재생을 위하여 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질은 조성물 내 20 내지 50wt% 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 40wt% 농도로 포함될 수 있다. 전체 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질의 농도가 높을수록, 그리고 전체 단백질 함유량이 높을수록 조직 접착능은 향상될 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 조성물은 다양한 형태로 적용될 수 있으며, 특히 주사제 조성물 형태로 인체 내로 직접 주사될 수 있다. 본 발명의 조직 재생용 조성물은 온도 감응성 폴리머가 접합되어 상온에서는 수용액 상태, 체내에서는 겔 상태로 변화할 수 있으므로, 주사제로 적용시 막힘없이 주사 바늘을 통과하여 체내 국소 부위로 쉽게 주입이 가능하고 체내로 주입되면 겔화되어 원하는 효과를 장기간 지속할 수 있게 할 수 있다. 본 발명의 조성물이 주사 바늘을 통해 주입되는 경우 예컨대 15 내지 26G, 15 내지 21 G, 바람직하게는 18G 의 주사바늘을 이용하여 생체 내로 주입될 수 있다.

또한 본 발명의 조직 재생용 조성물은 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질에 더하여 줄기세포를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조직 재생용 조성물에 줄기세포가 추가적으로 포함되는 경우, 상기 줄기세포는 본 발명의 온도 감응성 폴리머와 혼합된 상태로 생체 국소부위로 주입될 수 있고, 주입부위에서 생체 독성없이 분화가 유도되어, 목적하는 세포 치료제로서의 치료 효과를 달성할 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 줄기세포는 지방 조직, 골수, 제대 조직, 와튼 젤리, 양수, 태반, 말초 혈액, 나팔관, 각막 기질, 폐, 근육, 피부, 뼈, 치아 조직 및 태아 간에서 유래한 줄기세포를 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명의 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질은 화학적 가교제 처리 없이 즉각적으로 하이드로겔화가 가능하기 때문에 세포 독성이 없어 세포 지지체로 활용이 가능하다.

상기 "세포 지지체" 세포의 체외 배양 및 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체이다. 지지체의 물리 화학적 특성은 세포를 부착하고 전달할 수 있으며, 세포성장을 유도분화하고 촉진시킬 수 있으며, 생체적합성이며 생분해성인 것이 바람직하다.

본 발명의 세포 지지체에 적용가능한 "세포"는 모든 생물의 기능적, 구조적 기본 단위로서, 가슴샘상피세포, 상피세포, 피부세포, 내피세포, 혈관세포, 골세포, 골아세포, 연골세포, 섬유아세포, 근육세포, 지방세포, 신경세포, 면역세포, 혈액세포, 결합조직세포를 비롯한 다양한 성체세포 외에도 줄기세포 및 조혈모세포와 같이 다양한 세포로 분화할 수 있는 세포도 포함하는 폭넓은 의미로 사용하였으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따르면 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 세포와 단순 혼합하는 방식으로 손쉽게 세포가 담지된 세포 지지체를 제조할 수 있으며, 체온 근처 온도에서의 즉각적인 하이드로겔화 및 견고한 겔 형태 유지를 위해, 전체 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질의 농도를 최종적으로 30 wt% 내지 50 wt%, 바람직하게는 40 wt% 내지 45 wt%로 조절할 수 있다. 또한, 충분한 세포 양 확보 및 연조직으로의 분화를 위한 최종 세포 농도는 10⁵cells/ml 내지 10⁷ cells/ml, 바람직하게는 10⁶ells/ml 내지 10⁷ cells/ml 일 수 있다.

본 발명의 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질은 온도 감응성 폴리머에 의하여 상온에서는 수용액 상태로 존재하고 체온 부근에서는 강해진 소수성 상호작용에 의해 겔 상태로 변화될 수 있다. 따라서 상온 상태에서 약물을 담지한 후, 체내로 들어가 겔 상태가 되는 경우 수축됨과 동시에 담지하고 있던 약물을 방출할 수 있어 약물 방출 거동을 조절할 수 있는 약물 전달용 담체로 활용될 수 있다.

보다 구체적으로 상기 아마이드 결합은 카복시기와 같은 기능기를 갖는 온도 감응성 폴리머와 아민기를 갖는 홍합 접착 단백질을 EDC/NHS기반의 아마이드 결합 형성 방법을 통해 유도할 수 있다. 또한 단백질 내의 자가 결합을 방지하기 위해 폴리머 기능기의 활성화 단계 후, 반응하지 않은 EDC의 반응성을 2-mercaptoethanol과 같은 탈활성제 첨가를 통해 억제할 수 있다. 또한 아마이드 결합이 형성된 후, 형성된 단백질-폴리머 결합체를 분리하기 위하여 투석을 통해 반응하지 않은 폴리머 및 EDC/NHS 를 분리하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

상기 온도 감응성 폴리머와 홍합 접착 단백질을 반응시켜 아마이드 결합을 형성시키는 단계는 구체적으로 온도 감응성 폴리머의 카복시 그룹 활성화를 위해 pH를 5 내지 6 으로 조절하는 단계; 반응하지 않은 EDC의 반응성을 제거하기 위해 탈활성화제를 첨가하는 단계; pH7 내지 pH8에서 폴리머의 카복시 그룹과 홍합 접착 단백질의 아마이드 결합 형성을 유도하는 단계; 를 순차적으로 수행하는 것을 포함할 수 있다. 아마이드 결합을 형성하기 위한 반응 시간은 약 10시간 내지 20시간, 바람직하게는 약 15시간 내지 약 20시간, 더욱 바람직하게는 약 16시간 일 수 있으나, 접합되는 온도 감응성 폴리머와 홍합 접착 단백질의 반응양에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

이상 본 명세서에 기재된 수치값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합접착 단백질의 생산

1.1 재조합 홍합접착 단백질 fp -151의 생산

홍합 접착 단백질 fp-151은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 성공적으로 발현하여 아세트산을 이용한 단순한 정제 분리과정을 통해 생산한 것이다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007). 구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-5의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 fp-151을 제조하였다. 상기 홍합접착 단백질의 구체적 제조는 국제특허공개 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 나타낸 바와 동일하며, 제조된 fp-151을 서열번호 10 에 나타내었다.

1.2 온도 감응성 폴리머가 접합된 재조합 홍합접착 단백질의 제조

온도 감응성 폴리머가 접합된 재조합 홍합접착 단백질의 제조를 위하여, 온도 감응성 폴리머 중 PNIPAM (폴리(N-이소프로필아크릴아마이드; poly(N-isopropylacrylamide)를 선택하여 이후 실험에 사용하였다.

상기 실시예 1-1의 fp-151 의 아민기 그룹(-NH₂)과 PNIPAM 의 카복시 그룹(-COOH) 간의 반응을 유도하여 안정한 결합인 아마이드 결합(amide bond)을 형성하였다.

보다 구체적으로 아마이드 결합 형성을 위해 EDC 및 NHS를 첨가하였으며, 폴리머의 카복시 그룹 활성화를 위하여 pH를 5.5로 조정하는 단계, 반응하지 않은 EDC의 반응성을 없애기 위해 2-mercaptoethanol과 같은 탈활성제를 첨가하는 단계 및 pH 7.4에서 활성화된 폴리머의 카복시 그룹과 단백질의 아민기 그룹간의 아마이드 결합 형성을 유도하는 단계를 순차적으로 수행하였다. 약 16시간 반응 후, 단백질-폴리머 접합체를 투석을 통해 수득하였다. 상기와 같이 제조된 온도 감응성 폴리머가 접합된 재조합 홍합 단백질은 MAP-PNIPAM 접합체 (conjugate) 로 명명하였다. 반응시, 단백질의 아민기의 농도와 폴리머의 카복시 반응 농도에 따라, 3:1, 2:1 그리고 1:1로 명명하였다. 구체적으로, 폴리머의 카복시 농도를 16 mM로 고정하고, 단백질의 아민기 농도를 48, 32 그리고 16 mM로 다르게 하여 반응시켰다. 투석 후, 단백질의 반응 정도 및 MAP-PNIPAM 접합체를 전기 영동 실험을 통해 확인하였고, 이를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 반응시키지 않은 단백질의 경우 예상 분자량인 22.6 kDa 부근에서 선명한 단백질 밴드가 확인된 반면, 카복시 그룹이 달린 폴리머와 반응시킨 단백질의 경우, 단백질의 아민기 및 폴리머의 카복시 기의 반응 몰수 조절에 따른 폴리머와 단백질 결합 정도에 따라, 단백질 분자량이 증가하고, 분자량 범위도 넓게 분포함을 확인할 수 있었다.

실시예 2. MAP- PNIPAM 접합체의 온도 감응성 및 상전이 확인

2.1. 저농도 단백질- 폴리머 접합체의 온도 감응성 상전이 확인 실험

온도 감응성 폴리머인 PNIPAM은 상전이 온도에서의 빛 투과도 (light transmittance) 감소라는 상전이 특징을 나타낸다. 상기 실시예 1.2 통해 생산된 MAP-PNIPAM 접합체 역시 온도 감응성 성질을 그대로 유지하는지 여부를 확인하기 위하여 온도 감응성 상전이를 확인하였다. MAP-PNIPAM 접합체를 저농도로 증류수에 녹여 빛 투과도를 이용한 온도 감응성 상전이 확인 실험을 진행하였다. 구체적으로, 저농도의 온도 감응성 단백질 기반 소재를 제조하기 위해서, 동결 건조된 3:1, 2:1, 1:1 MAP-PNIPAM 접합체를 각각 증류수에 녹여 단백질 기준 최종 농도 0.8, 1.2 및 2.0 mg/ml를 포함하는 샘플 용액들을 준비하였다. 이 후 600 nm 파장대에서 온도 범위 25℃에서 45℃까지 1.8℃분 속도로 온도를 증가시키며 용액의 빛 투과도 감소 여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 동일한 단백질 농도 (2 mg/ml)를 포함한 접합체 용액 중 폴리머가 가장 많이 결합한 1:1 MAP-PNIPAM 접합체가 상전이 온도가 가장 낮은 것을 확인하였으며, 이를 통해 단백질의 아민기 및 폴리머의 카복시기의 반응 몰수 조절을 통해 폴리머가 단백질에 결합된 정도가 많을수록 단백질에 의한 친수성 효과가 낮아져서, 상전이 온도가 낮아짐을 확인하였다.

또한 동일한 MAP-PNIPAM 접합체라도, 접합체 단백질의 농도가 증가할수록 PNIPAM의 상전이 농도 증가에 의하여 상전이 온도가 낮아지는지 여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 접합체의 단백질 농도가 0.8 에서 2 mg/ml로 증가할수록, 즉, 전체 접합체 농도가 증가할수록 PNIPAM의 상전이가 쉽게 일어나기 때문에 상전이 온도가 낮아짐을 확인하였다.

2.2. 고농도 단백질- 폴리머 접합체의 온도 감응성 상전이 확인 실험

온도 감응성 폴리머인 PNIPAM의 상전이 특징인 상전이 온도에서의 기계적 물성 증가를 이용하여, 상기 실시예 1.2 통해 생산된 온도 감응성 단백질-폴리머 접합체 MAP-PNIPAM의 온도 감응성 상전이를 확인하고자 했다. MAP-PNIPAM 를 고농도로 증류수에 녹여 유동계를 이용한 온도 감응성 상전이 확인 실험을 진행하였다.

구체적으로 고농도의 온도 감응성 단백질 기반 소재를 제조하기 위해서, 동결 건조된 MAP-PNIPAM를 증류수에 녹여 폴리머 기준 최종 농도 36.8 mg/ml를 포함하는 샘플 용액들을 준비하였다. 이를 20 mm 평판에 도포하여 일정 변형률 15%, 일정 각 진동수 1 rad/s에서 온도 범위 15℃에서 45℃까지 5℃분 속도로 온도를 증가시키며 용액의 상변화에 따른 저장 탄성률(storage modulus) 변화 실험을 진행하였으며, 그 결과를 표 1 및 도 4에 나타내었다.

[표 1]

표 1 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 동일한 폴리머 농도 (36.8 mg/ml)를 포함한 접합체 용액들에서 폴리머가 단백질에 결합된 정도가 높을수록, 빠르게 상전이가 일어남을 저장 탄성률 증가 기울기를 통해 알 수 있었다. 또한, 상전이 온도는 저장 탄성률의 최대값에서 최저값 사이의 중간값으로 구할 수 있는데, 폴리머가 단백질에 결합된 정도가 높을수록, 상전이 온도는 낮아짐을 확인하였다.

실시예 3. 단백질- 폴리머 접합체의 상변화 및 주입 용이성 확인

상기 실시예 1.2 를 통해 생산된 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질 접합체 MAP-PNIPAM 의 온도 감응성 상전이를 추가적으로 확인하기 위하여 37 ℃의 생리 식염수로 용액을 주입하는 실험을 수행하였다. 구체적으로, 고농도의 온도 감응성 단백질 기반 소재를 제조하기 위해서, 동결 건조된 MAP-PNIPAM 접합체를 25 ℃의 증류수에 녹여 최종 농도 50 wt%의 접합체 용액을 준비하였다. 이를 26G 주사기를 통해 37 ℃의 생리 식염수 내로 직접 주입하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 제조된 고농도의 MAP-PNIPAM 접합체 용액은 주사기 바늘 막힘 없이 37 ℃의 생리 식염수로 주입되었으며, 생리 식염수 내에서 온도 증가에 의해 즉각적으로 빠르게 하이드로겔을 형성하였다. 이와 같은 결과를 통해 본 발명의 MAP-PNIPAM 접합체는 온도 감응성 상전이능을 가지고 있으며, 온도 감응성 단백질 기반 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 온도 감응성 폴리머 -단백질 접합체 기반 하이드로겔 내의 수분 보유 능력

대표적인 온도 감응성 폴리머인 PNIPAM의 경우, 상전이가 일어나면서 극적인 부피 축소 및 이에 따른 수분 손실이 발생하여 세포 지지체 도는 담체로 조직공학 등의 응용분야에 쉽게 적용하기 어려운 기술적 한계점을 가지고 있었다. 따라서 기존의 폴리머와 비교하여, 본 발명의 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합접착 단백질 기반의 하이드로겔 내의 수분 보유 능력을 평가하여, 홍합접착 단백질의 영향을 확인하기 위한 수분 보유 능력 평가를 진행하였다.

구체적으로, 세포 및 동물 실험에 사용될 고농도의 온도 감응성 단백질 기반 소재를 제조하기 위해서, 동결 건조된 실시예 2.1의 MAP-PNIPAM 접합체를 증류수에 녹여 폴리머 기준 최종 농도 22.1 및 36.8 mg/ml를 포함하는 샘플 용액들을 준비하였다. 이를 37 ℃에서 48시간 동안 보관한 후, 빠져나오는 물의 양을 측정하여, 처음 부피와의 차이를 계산하여 수분 보유 능력을 평가하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 단백질과 폴리머 간의 화학적 결합 없이, 단순히 섞은 용액은 simple mixing이라 명명하여 대조군으로 사용하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 약 90%의 물이 빠져나오는 기존의 폴리머 겔에 비해, 단백질이 도입된 단백질-폴리머 하이드로겔인 MAP-PNIPAM 접합체에서 훨씬 월등한 수분 보유 능력을 확인하였다. 또한, 3:1 MAP-PNIPAM 접합체에서 가장 높은 수분 보유량을 확인함으로써 동일한 폴리머 농도 (36.8 mg/ml)를 포함한 접합체 용액들에서, 단백질 함유량이 높을수록, 즉 폴리머가 단백질에 결합된 정도가 낮을수록, 단백질에 의한 친수성 효과 증가로 수분 보유 능력이 향상됨을 확인하였다. 또한 전체 접합체 농도가 높을수록, 즉 전체 단백질 함유량이 높을수록, 수분 보유 능력이 향상됨을 확인하였다.

실시예 5. 온도 감응성 폴리머 -단백질 접합체 기반의 하이드로겔의 미세구조 분석

온도 감응성 폴리머인 PNIPAM은 상전이가 일어나면서 극적인 부피 축소에 따른 다공성 부족이 발생하여 조직공학 등의 응용분야에 쉽게 적용하기 어려운 기술적 한계점을 가지고 있었다. 기존의 폴리머와 비교하여, 홍합접착 단백질 접합에 의하여 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합접착 단백질 기반의 하이드로겔 내의 미세구조가 달라지는지 여부를 확인하기 위한 주사 전자 현미경 분석을 진행하였다.

구체적으로, 세포 및 동물 실험에 사용될 고농도의 온도 감응성 단백질 기반 소재를 제조하기 위해서, 동결 건조된 실시예 2.1의 MAP-PNIPAM 접합체를 증류수에 녹여 폴리머 기준 최종 농도 36.8 mg/ml를 포함하는 샘플 용액을 준비하였다. 이를 37 ℃에서 24시간 동안 보관하여 상전이를 유도한 후, 질소 냉각한 뒤 동결건조하여 전자 현미경 분석을 진행하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 5 μm 이하의 조밀하고 무너진 듯한 구멍을 보였던 기존의 폴리머 겔에 비해, MAP-PNIPAM 접합체는 더 큰 크기의 구멍을 갖는 다공성 구조를 갖는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 MAP-PNIPAM 접합체는 홍합접착 단백질 결합에 의하여 기존 온도 감응성 폴리머인 PNIPAM의 다공성 부족 문제점을 해소할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. 온도 감응성 단백질- 폴리머 접합체 기반 하이드로겔의 조직 접착력 평가

PNIPAM은 체온과 비슷한 상전이 온도를 가지기 때문에 체내에 편리하게 주입 가능하다는 장점이 있으나, 생체 접착 능력이 거의 없기 때문에 결함 조직 내에 주입된 기능성 물질이 고정되지 못할 가능성이 크다. 실시예 2에서 제조된 MAP-PNIPAM 접합체가 기존의 폴리머와 비교하여 생체 접착 능력이 우수한지 확인하기 위하여 돼지 피부를 이용한 조직 접착력 평가를 수행하였다.

구체적으로, 세포 및 동물 실험에 사용될 고농도의 온도 감응성 단백질 기반 소재를 제조하기 위해서, 동결 건조된 MAP-PNIPAM 접합체를 증류수에 녹여 최종 농도 22.1 및 36.8 mg/ml를 포함하는 샘플 용액들을 준비하였다. 8 mm 직경의 돼지 피부를 유동계 위, 아래 평판에 양면 테이프로 고정 후, 아래 평판에 고정된 돼지 피부에 MAP-PNIPAM 접합체 용액을 도포하였다. 그 후, 위 평판의 돼지 피부가 맞닿게 한 후, 평판 사이의 용액이 하이드로겔이 되도록 용액 온도 기준 37 ℃에서 5분간 기다린 후, 0.3 mm/분 속도로 잡아당기면서 최대 힘을 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 기존의 폴리머인 PNIPAM 단독 겔에 비해 단백질이 도입된 MAP-PNIPAM 접합체 하이드로겔에서 약 8배 가까이 높은 조직 접착 능력을 확인하였다. 또한, 전체 접합체 농도가 높을수록, 즉 전체 단백질 함유량이 높을수록, 조직 접착 능력이 향상됨을 확인하였다. 이와 같은 결과는 홍합접착 단백질 결합을 통해 기존 폴리머의 조직 접착 능력을 개선할 수 있으며 이를 통해 기존 폴리머 겔이 쉽게 씻겨 나가는 문제점을 개선하여 조직의 재생에 유용하게 사용할 수 있음을 나타내는 결과이다.

실시예 7. 온도 감응성 단백질- 폴리머 접합체 기반 하이드로겔을 이용한 세포 배양 및 생체 주입

7.1 MAP- PNIPAM 접합체 하이드로겔을 이용한 세포 배양

본 발명의 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합접착 단백질 기반의 하이드로겔은 온도 감응성 폴리머의 온도 감응성을 보유함과 동시에 홍합접착 단백질 부착으로 인한 수분 보유능, 다공성, 조직 접착 능력이 개선되므로, 이를 조직 재생 소재로 활용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 세포 도입 및 세포 생존 확인을 위한 실험을 진행하였다.

구체적으로, 미리 배양된 랫트 유래의 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose derived mesenchymal stem cell, ASC) 용액을 실시예 2.1에서 제조된 MAP-PNIPAM 접합체의 용액과 섞어 최종 세포 농도 10⁶ cells/ml 및 접합체 용액 농도 40 wt%이 되도록 하였다. 이를 37 ℃ 인큐베이터에 5분간 두어 하이드로겔이 되도록 한 후, 배지를 넣어 배양하였다. 세포 배양 5일째에 하이드로겔 내의 세포의 핵 및 엑틴 형광 염색을 통해 세포의 생존을 확인하였다. 이때, 콜라겐 겔을 양성 조절 비교군으로 사용하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, MAP-PNIPAM 접합체 하이드로겔에서 콜라겐 하이드로겔과 비슷한 수준으로 세포가 생존할 수 있음을 확인하였다.

7.2 MAP- PNIPAM 접합체를 이용한 줄기세포 주입

상기 7.1 을 통해 MAP-PNIPAM 접합체 하이드로겔에서 줄기세포가 생존할 수 있음을 확인하였는 바, 이를 직접 생체 내 주입하는 경우 원하는 부위에서 겔화를 달성할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 랫트 실험을 수행하였다.

구체적으로, 미리 배양된 랫트 유래의 중간배엽 줄기세포 용액을 실시예 2.1의 MAP-PNIPAM 접합체 용액과 섞어 최종 세포 농도 10⁶cells/ml 및 접합체 용액 농도 40 wt%이 되도록 제조하였다. 이를 18G 주사기에 넣고, 랫트 등쪽 피하지방에 약 200g 주입하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, MAP-PNIPAM 접합체 용액과 중간엽 줄기세포 용액을 혼합하여 18G 바늘을 통해 주입하는 경우 주사기 바늘의 막힘 및 빠져나옴 없이 원활하게 주입되었으며, 주사기를 찔러 넣은 부위에서 체온에 의해 즉각적으로 하이드로겔화 됨을 확인하였다.

7.3. 생체 주입 후, MAP- PNIPAM 접합체의 생체 적합성, 부피 유지 능력 및 신혈관 형성 확인

상기 7.1과 7.2를 통해 MAP-PNIPAM 접합체 하이드로겔에서 줄기세포가 생존할 수 있고, 주사기 바늘을 통해 손쉽게 체내 주입하여 즉각적인 하이드로겔화가 달성됨을 확인하였는 바, 생체 주입 후의 줄기세포를 포함한 MAP-PNIPAM 하이드로겔의 생체 적합, 부피 유지 능력 및 신혈관 형성 효과를 확인하였다.

구체적으로, 실시예 7.1에 따라 MAP-PNIPAM 접합체 용액과 중간엽 줄기세포를 생체 주입하고 14일과 21일 째의 조직을 회수하여, 포르말린 용액에서 고정 후, 조직 절편을 이용하여 H&E 염색과 CD31 염색을 진행하였으며, 그 결과를 각각 도 11과 도 12에 나타내었다. 비교군으로는 알지네이트와 지방 줄기세포를 혼합하여 투여하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, MAP-PNIPAM 하이드로겔의 경우, 경미한 수준의 염증 반응과 높은 부피 유지 능력을 보이는 것을 확인하였으나, 비교군으로 사용한 알지네이트 하이드로겔의 경우, 상대적으로 더 높은 수준의 염증 반응이 나타나는 것을 확인하였다.

또한, 도 12에 나타난 바와 같이, 비교군인 알지네이트 하이드로겔 내에서는 신혈관 형성이 관찰되지 않고 석회화 (calcification)만 확인되는 것과 달리, MAP-PNIPAM 하이드로겔의 경우 높은 수준의 신혈관 생성이 관찰되었다.

이와 같은 결과는, 본 발명의 MAP-PNIPAM 하이드로겔이 생체 주입시 높은 생체 적합성 및 높은 부피 유지능력을 가지고 있을 뿐 아니라, 신혈관 생성을 유도할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다.

7.4. 생체 주입 후, MAP- PNIPAM 접합체 내의 줄기세포의 지방세포로의 분화 확인

MAP-PNIPAM 접합체 하이드로겔과 지방 줄기세포를 혼합하여 주입하는 경우, 실제 지방 조직을 재생하여 연조직 결함 치료에 이용할 수 있는지 확인하기 위하여, 주입된 지방 줄기세포의 지방 세포로의 분화 (adipogenesis) 를 확인하였다.

구체적으로, 실시예 7.1 에 따라 MAP-PNIPAM 접합체 및 지방줄기세포를 주입한 21일째의 조직을 회수하여, 포르말린 용액에서 고정 후, 조직 절편을 이용하여 조직 내의 지방 형성을 광학 현미경으로 확인하였고, 나아가 지방세포로의 분화의 중요 마커인 collagen IV와 peroxisome-proliferator activated receptor (PPARγ를 형광항체법 (immunofluorescence staining)으로 염색하여 형광 현미경을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 13에 함께 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 비교군으로 사용한 알지네이트 하이드로겔 내의 지방줄기세포의 경우, 지방세포로의 분화가 거의 관찰되지 않은 것과 달리, MAP-PNIPAM 하이드로겔 내의 지방 줄기세포의 경우, 더 많은 양의 지방 생성과 더 높은 수준의 collagen IV와 PPARγ 형광 검출을 통해 지방으로의 분화가 효과적으로 일어나는 것을 관찰하였다.

실시예 8. 플루로닉 ( Pluronic )-127 이 접합된 홍합 접착 단백질 접합체

8.1 MAP- 플루로닉 접합체의 제조

온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질 접합체가 체온 근처의 온도에서 상전이를 일으켜 우수한 접착 효과가 있음을 확인하였으므로, 온도 감응성 폴리머와 홍합 접착 단백질의 종류를 달리한 접합체를 추가적으로 제조하여 동일한 효과가 나타나는지 여부를 확인하였다.

온도 감응성 폴리머로 플루로닉-127 을 이용하고, 홍합 접착 단백질로 서열번호 1의 fp-1을 이용하였으며, fp-1 의 아민기 그룹과 플루로닉-127 의 카복시 그룹 간의 반응을 유도하여 안정한 결합인 아마이드 결합(amide bond)을 형성하였다. 보다 구체적으로 아마이드 결합 형성을 위해 EDC 및 NHS를 첨가하였으며, 폴리머의 카복시 그룹 활성화를 위하여 pH를 5.5로 조정하는 단계, 반응하지 않은 EDC의 반응성을 없애기 위해 2-mercaptoethanol과 같은 탈활성제를 첨가하는 단계 및 pH 7.4에서 활성화된 폴리머의 카복시 그룹과 단백질의 아민기 그룹간의 아마이드 결합 형성을 유도하는 단계를 순차적으로 수행하였다. 약 16시간 반응 후, 단백질-폴리머 접합체를 투석을 통해 수득하였다. 상기와 같이 제조된 온도 감응성 폴리머가 접합된 재조합 홍합 단백질은 MAP-플루로닉 접합체 (conjugate) 로 명명하였다. 반응 시, 단백질의 아민기의 농도와 폴리머의 카복시 반응 농도에 따라, 각 접합체를 0.5:1, 1:1 그리고 2:1로 명명하였다. 구체적으로, 폴리머의 카복시 농도를 16 mM로 고정하고, 단백질의 아민기 농도를 8, 16 그리고 32 mM로 다르게 하여 반응시켰다

투석 후, 단백질의 반응 정도 및 MAP-Pluronic-127 접합체를 전기 영동 실험을 통해 확인하였고, 이를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 단백질의 아민기 및 폴리머의 카복시 기의 반응 몰수 조절에 따른 폴리머와 단백질 결합 정도에 따라, 단백질 분자량이 증가하고, 분자량 범위도 넓게 분포함을 확인할 수 있었다.

8.2 MAP- 플루로닉 접합체의 상 전이 확인

상기 실시예 8.1을 통해 제조된 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질 접합체인 MAP-플루로닉 접합체의 온도 감응성 상전이를 확인하기 위하여, 제조된 MAP-플루로닉 접합체 0.5:1, 1:1 및 2:1 의 농도를 35wt(%)로 조절하고 분당 온도를 0.5℃ 씩 증가시키면서 상태의 변화를 측정하였다. 4, 25, 37℃ 에서 측정된 상전이의 결과를 표 2 및 도 15에 나타내었다.

[표 2]

표 2 에서 확인한 바와 같이, MAP-플루로닉 접합체는 전체 접합체 농도를 35 wt(%) 일 때 상전이가 일어나기에 충분한 온도 감응성 폴리머를 포함하므로, 온도에 따라 용액-겔 상태의 상전이가 이루어짐을 확인하였다. 또한 동일한 MAP-플루로닉 접합체라도, 폴리머가 단백질에 결합된 정도가 많을수록 단백질에 의한 친수성 효과가 낮아져서, 상전이 온도가 낮다는 것을 확인하였다.

도 15 는 35wt(%) 의 MAP-플루로닉 접합체 2:1을 수용액 상태로 튜브에 넣고 분당 0.5℃ 씩 증가시키면서 수용액이 든 튜브를 수직으로 움직인 결과이며, 25℃, 상온 (좌측) 에서는 접합체가 수용액 상태이고 체온 범위인 37℃ (우측) 에서는 튜브 바닥에 겔이 부착된 상태인 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질 접합체는 체온 범위에서 즉각적으로 하이드로겔화 될 수 있으며, 상전이 시 수분 보유력, 다공성능이 유지되고 세포 독성이 없고 조직 접착능이 우수한 바, 연조직 결함 부위 재생 등에 유용한 생체 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Thermo-responsive biomaterial comprising thermo-responsive protein conjugated-mussel adhesive protein <130> P1-50p-1 <150> KR 2017-0109641 <151> 2017-08-29 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 800 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 165 170 175 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 180 185 190 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 195 200 205 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 210 215 220 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 225 230 235 240 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 245 250 255 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 260 265 270 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 275 280 285 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 290 295 300 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 305 310 315 320 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 325 330 335 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 340 345 350 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 355 360 365 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 370 375 380 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 385 390 395 400 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 405 410 415 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 420 425 430 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 435 440 445 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 450 455 460 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 465 470 475 480 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 485 490 495 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 500 505 510 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 515 520 525 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 530 535 540 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 545 550 555 560 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 565 570 575 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 580 585 590 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 595 600 605 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 610 615 620 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 625 630 635 640 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 645 650 655 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 660 665 670 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 675 680 685 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 690 695 700 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 705 710 715 720 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 725 730 735 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 740 745 750 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 755 760 765 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 770 775 780 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 785 790 795 800 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment sequence derived from fp-1 <400> 2 Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Pro Arg Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Pro Arg 1 5 10 15 Pro Arg Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser 20 25 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant <400> 3 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 115 120 <210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant-RGD <400> 4 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro 115 120 125 <210> 5 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-2 <400> 5 Leu Phe Ser Phe Phe Leu Leu Leu Thr Cys Thr Gln Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Thr Asn Arg Pro Asp Tyr Asn Asp Asp Glu Glu Asp Asp Tyr Lys Pro 20 25 30 Pro Val Tyr Lys Pro Ser Pro Ser Lys Tyr Arg Pro Val Asn Pro Cys 35 40 45 Leu Lys Lys Pro Cys Lys Tyr Asn Gly Val Cys Lys Pro Arg Gly Gly 50 55 60 Ser Tyr Lys Cys Phe Cys Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Cys Asn 65 70 75 80 Leu Lys Asn Ala Cys Lys Pro Asn Gln Cys Lys Asn Lys Ser Arg Cys 85 90 95 Val Pro Val Gly Lys Thr Phe Lys Cys Val Cys Arg Asn Gly Asn Phe 100 105 110 Gly Arg Leu Cys Glu Lys Asn Val Cys Ser Pro Asn Pro Cys Lys Asn 115 120 125 Asn Gly Lys Cys Ser Pro Leu Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Thr Cys 130 135 140 Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Val His Ala Cys Lys Pro 145 150 155 160 Asn Pro Cys Lys Asn Lys Gly Arg Cys Phe Pro Asp Gly Lys Thr Gly 165 170 175 Tyr Lys Cys Arg Cys Val Asp Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gln Glu 180 185 190 Asn Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Ser Ala 195 200 205 Asp Lys Phe Gly Asp Tyr Ser Cys Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Phe Gly 210 215 220 Pro Glu Cys Glu Arg Tyr Val Cys Ala Pro Asn Pro Cys Lys Asn Gly 225 230 235 240 Gly Ile Cys Ser Ser Asp Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Cys Arg Cys Lys 245 250 255 Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Lys Val Asn Val Cys Lys Pro Thr 260 265 270 Pro Cys Lys Asn Ser Gly Arg Cys Val Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Asn 275 280 285 Cys Ile Cys Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gly Glu Asn Val 290 295 300 Cys Lys Pro Asn Pro Cys Gln Asn Arg Gly Arg Cys Tyr Pro Asp Asn 305 310 315 320 Ser Asp Asp Gly Phe Lys Cys Arg Cys Val Gly Gly Tyr Lys Gly Pro 325 330 335 Thr Cys Glu Asp Lys Pro Asn Pro Cys Asn Thr Lys Pro Cys Lys Asn 340 345 350 Gly Gly Lys Cys Asn Tyr Asn Gly Lys Ile Tyr Thr Cys Lys Cys Ala 355 360 365 Tyr Gly Trp Arg Gly Arg His Cys Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Pro Asn 370 375 380 Pro Cys Val Val Ser Lys Pro Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Ile Trp 385 390 395 400 Asn Gly Lys Ala Tyr Arg Cys Lys Cys Ala Tyr Gly Tyr Gly Gly Arg 405 410 415 His Cys Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Lys Asn Pro Cys Ala Ser Arg Pro 420 425 430 Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Thr Asp Lys Gly Asn Gly Tyr Val Cys 435 440 445 Lys Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Gly Arg Tyr Cys Ser Leu Lys Ser Pro 450 455 460 Pro Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Tyr 465 470 <210> 6 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-3 <400> 6 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 7 <211> 750 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-4 <400> 7 Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Glu Pro Ser Gly Tyr Ala Asn Ile Gly His 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Tyr Glu Arg Ala Ile Ser Phe His Arg His Ser His Val 20 25 30 His Gly His His Leu Leu His Arg His Val His Arg His Ser Val Leu 35 40 45 His Gly His Val His Met His Arg Val Ser His Arg Ile Met His Arg 50 55 60 His Arg Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Asn 65 70 75 80 His Val His Arg His Ser Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg 85 90 95 Val Leu His Arg His Val His Arg His Asn Val Leu His Gly His Val 100 105 110 His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu 115 120 125 His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Arg 130 135 140 His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys 145 150 155 160 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr His Arg 165 170 175 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Leu 180 185 190 His Lys His Gln Val Leu His Gly His Ile His Thr His Arg Val Leu 195 200 205 His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Thr 210 215 220 His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys 225 230 235 240 His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Met His Arg 245 250 255 Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg Val Leu His Lys His Val 260 265 270 His Lys His His Val Val His Lys His Val His Ser His Arg Val Leu 275 280 285 His Lys His Val His Lys His Arg Val Glu His Gln His Val His Lys 290 295 300 His His Val Leu His Arg His Val His Ser His His Val Val His Ser 305 310 315 320 His Val His Lys His Arg Val Val His Ser His Val His Lys His Asn 325 330 335 Val Val His Ser His Val His Arg His Gln Ile Leu His Arg His Val 340 345 350 His Arg His Gln Val Val His Arg His Val His Arg His Leu Ile Ala 355 360 365 His Arg His Ile His Ser His Gln Ala Ala Val His Arg His Val His 370 375 380 Thr His Phe Glu Gly Asn Phe Asn Asp Asp Gly Thr Asp Val Asn Leu 385 390 395 400 Arg Ile Arg His Gly Ile Ile Tyr Phe Gly Gly Asn Thr Tyr Arg Leu 405 410 415 Ser Gly Gly Arg Arg Arg Phe Met Thr Leu Trp Gln Glu Cys Leu Glu 420 425 430 Ser Tyr Gly Asp Ser Asp Glu Cys Phe Val Gln Leu Leu Glu Gly Asn 435 440 445 Gln His Leu Phe Thr Val Val Gln Gly His His Ser Thr Ser Phe Arg 450 455 460 Ser Asp Leu Ser Asn Asp Leu His Pro Asp Asn Asn Ile Glu Gln Ile 465 470 475 480 Ala Asn Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln Ser Thr Asp Gly Asp Ile 485 490 495 Asn Asp Phe Ala Asp Thr His Tyr Asn Asp Val Ala Pro Ile Ala Asp 500 505 510 Val His Val Asp Asn Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asn His Val Lys Asn 515 520 525 Ile Ala Gln Thr Ala His His His Val Asn Asp Val Ala Gln Ile Ala 530 535 540 Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Gln Thr Ala Tyr Asp His Val Asn 545 550 555 560 Asn Ile Gly Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln Thr 565 570 575 Ala Asp Asp His Val Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val 580 585 590 Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Asp 595 600 605 Thr Ala Asn Ser His Ile Val Arg Val Gln Gly Val Ala Lys Asn His 610 615 620 Leu Tyr Gly Ile Asn Lys Ala Ile Gly Lys His Ile Gln His Leu Lys 625 630 635 640 Asp Val Ser Asn Arg His Ile Glu Lys Leu Asn Asn His Ala Thr Lys 645 650 655 Asn Leu Leu Gln Ser Ala Leu Gln His Lys Gln Gln Thr Ile Glu Arg 660 665 670 Glu Ile Gln His Lys Arg His Leu Ser Glu Lys Glu Asp Ile Asn Leu 675 680 685 Gln His Glu Asn Ala Met Lys Ser Lys Val Ser Tyr Asp Gly Pro Val 690 695 700 Phe Asn Glu Lys Val Ser Val Val Ser Asn Gln Gly Ser Tyr Asn Glu 705 710 715 720 Lys Val Pro Val Leu Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gly Lys Val Ser 725 730 735 Ala Leu Ser Asp Gln Gly Ser Tyr Asn Glu Gly Tyr Ala Tyr 740 745 750 <210> 8 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-5 <400> 8 Lys His His His His His His Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly 20 25 30 Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys 35 40 45 Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys 50 55 60 Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Ser Ser <210> 9 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-6 <400> 9 Ile Ala Ala Leu Cys Gly Ile Val Lys Ser Ile Asp Ser Asp Asp Ser 1 5 10 15 Asp Tyr Asp Tyr Lys Gly Arg Gly Tyr Cys Thr Asn Lys Gly Cys Arg 20 25 30 Ser Gly Tyr Asn Tyr Phe Gly Asn Lys Gly Tyr Cys Lys Tyr Gly Glu 35 40 45 Lys Ser Tyr Thr Tyr Asn Cys Asn Ser Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro 50 55 60 Arg Asn Pro Tyr Gly Lys Leu Lys Tyr Tyr Cys Thr Asn Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Cys Pro Asn Asn Tyr Tyr Phe Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Leu 85 90 95 Glu His His His His His His 100 <210> 10 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151 <400> 10 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ser Ser 50 55 60 Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly 85 90 95 Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser 100 105 110 Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly 115 120 125 Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala Lys Pro Ser Tyr 130 135 140 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 145 150 155 160 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 165 170 175 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 180 185 190 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 195 200 <210> 11 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151-RGD <400> 11 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro 195 200 <210> 12 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-131 <400> 12 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala Asp 50 55 60 Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn 65 70 75 80 Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn 85 90 95 Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 13 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-353 <400> 13 Pro Trp Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Pro Trp Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr 50 55 60 Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys 85 90 95 Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr 100 105 110 His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 145 150 155 160 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser 165 170 175 <210> 14 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-153 <400> 14 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 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Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Pro Trp Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr 50 55 60 Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys 85 90 95 Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr 100 105 110 His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 130 135 140 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 165 170 175 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 180 185

Claims

온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재.
제1항에 있어서, 상기 온도 감응성 폴리머는 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리메타크릴산, 폴리(2-하이드로메타크릴산), 폴리(N,N′디에틸아미노에틸)아크릴레이트, 폴리락틱-co-글라이콜레이트(poly(lacticco-glycolic acid), 폴리푸마르산 및 플루로닉-127으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 온도 감응성 생체 소재.
제1항에 있어서, 상기 생체 소재는 30 내지 50℃ 에서 겔 화되는 것을 특징으로 하는, 온도 감응성 생체 소재.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 fp-1(서열번호 1), fp-2(서열번호 5), fp-3(서열번호 6), fp-4(서열번호 7), fp-5(서열번호 8), fp-6(서열번호 9), fp-151(서열번호 10), fp-131(서열번호 12), fp-353(서열번호13), fp-153(서열번호 14) 및 fp-351(서열번호 15) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 온도 감응성 생체 소재.
제1항에 있어서, 상기 생체 소재는 하이드로겔 형태인 것을 특징으로 하는, 온도 감응성 생체 소재.
제1항에 있어서, 상기 생체 소재는 조직 접착용인, 온도 감응성 생체 소재.
온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 조직 재생용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조직은 피부, 연골, 골, 혈관, 뇌, 간, 심장, 인대, 근육, 척수, 혈액, 골수, 폐, 치아, 신경, 각막, 망막, 식도, 척추, 신장, 췌장 또는 요도로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질은 20 내지 50wt% 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 주사제 주성물인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물.
제7항에 있어서, 줄기세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 조성물.
온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 세포 지지체.
온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 약물 전달용 담체.
온도감응성 폴리머와 홍합 접착 단백질을 반응시켜 아마이드 결합을 형성시키는 단계; 를 포함하는 온도 감응성 생체 소재의 제조방법.