KR101382083B1 - 상호침투성 망상구조, 및 관련 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상호침투성 중합체 망상구조 (IPN), 및 관련 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 하이드로겔 물질은 둘 이상의 중합체 망상구조로 이루어진 상호침투성 망상구조를 포함하며, 이중 하나 이상의 중합체 망상구조가 생중합체를 기초로 한다. 또한, 제1 중합체 망상구조를 제2 중합체 망상구조와 배합하는 것을 포함하며, 제1 중합체 망상구조 또는 제2 중합체 망상구조는 생중합체를 기재로 하는 것인, 하이드로겔 물질의 제조 방법이 제공된다. 본 출원은 또한 IPN 하이드로겔 물질로부터 제조된 장치 및 그의 용도를 개시한다.
하이드로겔 물질, 상호침투성 중합체 망상구조 (ＩＰＮ), 생중합체.

Description

상호침투성 망상구조, 및 관련 방법 및 조성물 {Interpenetrating Networks, and Related Methods and Compositions}
본 발명은 상호침투성(interpenetrating) 중합체 망상구조(network)를 포함하는 하이드로겔 물질에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 상호침투성 중합체 망상구조를 포함하며 망상구조 성분이 적어도 생중합체를 기재로 하는 것인 하이드로겔 물질 및 그의 용도, 및 하이드로겔 물질로부터 제조된 장치에 관한 것이다.
조직 공학(tissue engineering)은 조직 및 기관 기능을 대체하거나 회복시키는 데 목적이 있는 다수의 기술을 포괄하며 급속도로 성장하고 있는 분야이다. 조직 공학의 주요 목적은 정상 조직 기능을 회복시키기 위해 기존 조직으로 통합될 수 있는 물질을 사용함으로써 결함이 있는 조직을 재생시키는 것이다. 따라서, 조직 공학에서는 세포 과다-성장, 내부-성장 또는 캡슐화 및 많은 경우에서 신경 재생을 지지할 수 있는 물질이 필요하다.
미국 특허 제5,716,633호는 콘택트 렌즈 주형 중 38 ℃에서 자유 라디칼 개시제로서 암모늄 퍼술페이트 및 나트륨 메타비술페이트를 사용해서 콜라겐 (약 0.12-0.14％(w/w)) 및 2-히드록실에틸 메타크릴레이트 (HEMA)로부터 제조된, 상피 세포 성장을 촉진시키는 콜라겐-하이드로겔을 기재한다. 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트를 가교제로 사용해서 HEMA만을 가교시켰다. 이 특허에서, 콜라겐 농도는 매우 낮으며, 콜라겐은 가교되지 않는다. 그러한 시스템에서, 콜라겐은 주변 수성 매체 중으로 스며나올 수 있다.
미국 특허 제4,388,428호는 60Co 조사를 통해 콜라겐 및 에틸렌성 불포화 화합물 및 가교제, 예를 들어 N-이소프로필아크릴아미드 및 N,N-메틸렌비스아크릴아미드로 이루어진, 콘택트 렌즈 물질로서의 생물학적으로 안정화된 하이드로겔을 기재한다. 콜라겐과 합성 중합체 사이에는 몇몇 결합이 존재한다. 최종 콜라겐 함량은 약 7％ (w/w)이다. 이러한 겔 시스템에서는, 에틸렌성 불포화 화합물만이 효과적으로 가교되며, 콜라겐은 총 투여량 1.0 Mrd의 감마선 조사에 의해서 약간만 가교된다.
미국 특허 제4,452,929호는 최종 콜라겐-에틸렌성 불포화 화합물 하이드로겔 중 약 1.5％의 콜라겐 농도를 갖는 수성 코팅 조성물을 기재한다.
비-생분해성이며 이식되는 경우에 각막 세포 및 신경을 재생시키는 시력 증진성 안과적 물질의 예가 보고되었다. 그러나, 이러한 특성에도 불구하고, 이들 물질은, 특히 개발도상 국가에서와 같이 최적 미만의 조건하에, 수술 동안 용이하게 취급하기 위한 탄성 및 최적 인성이 여전히 결여되어 있다.
따라서, 안과적 장치에 사용될 수 있으며 수술 동안의 취급을 위해 필요한 탄성 및 인성을 갖는 물질이 필요한 실정이다.
상기 배경 정보는 본 출원인에 의해 본 발명과 관련될 수 있는 것으로 고려된 공지된 정보로서 제공된다. 이는 상기 정보 중 어떤 것이 본 발명에 대해 불리한 선행 기술을 구성한다는 것을 반드시 인정하기 위한 것은 아니며 그렇게 이해되지도 않는다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 상호침투성 중합체 망상구조 (IPN), 및 관련 방법 및 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 한 측면에 따라, 둘 이상의 중합체 망상구조로 이루어진 상호침투성 망상구조를 포함하며, 이중 하나 이상의 중합체 망상구조가 생중합체를 기재로 하는 것인, 하이드로겔 물질이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 제1 중합체 망상구조를 제2 중합체 망상구조와 배합하는 것을 포함하며, 제1 중합체 망상구조 또는 제2 중합체 망상구조는 생중합체를 기재로 하는 것인, 본 발명에 따른 하이드로겔 물질의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, (i) 둘 이상의 중합체 망상구조로 이루어진 상호침투성 중합체 망상구조 (이중 하나 이상의 중합체 망상구조가 생중합체를 기초로 함) 및 (ii) 이들의 제조를 위한 지침을 포함하는, 본 발명에 따른 하이드로겔 물질의 제조를 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 이식물 (예, 각막 이식물), 각막 온레이(onlay), 신경 재생관(nerve conduit), 혈관, 약물 전달 장치 및 카테터, 치료용 렌즈, 안내(intraocular) 렌즈를 포함하지만 이에 한정되지 않는, IPN 하이드로겔 물질로부터 제조된 장치, 및 이들의 제조 방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 한 실시양태에 따른 NiColl20/MPC IPN 하이드로겔의 사진이다.
도 2는 본 발명의 특정 실시양태에 따른 두 가지 IPN의 기계적 특성 (강도, 신장 및 인성)을 도식적으로 나타낸다.
도 3은 IPN-I 및 IPN-II에 대한 광학 특성 (광 투과율(％))을 대조군-I, 대조군-II, 인간 및 토끼 각막과 비교해서 도식적으로 나타낸다.
도 4는 (a) IPN-I 및 (b) IPN-II 하이드로겔 상의 인간 상피 세포의 성장을 도식적으로 나타낸다.
도 5는 IPN-II (EP10-11) 하이드로겔의 표면 상의 신경 성장을 나타낸다.
도 6은 콜라겐-합성 공중합체 IPN의 사진이다.
도 7은 표층각막이식술(lamellar keratoplasty)(부분적 두께 이식)에 의한 유카탄(Yucatan) 미니-피그(mini-pig)의 각막에 이식된 상기 중합체 (EP10-11)의 사진이다.
도 8은 상피 선조 세포 (EPC)를 근육 시험 시스템으로 전달하는 콘드로이틴 술페이트-기초의 물질, 및 표지된 EPC (녹색 표지)를 혈관신생(angiogenesis)을 통해 혈관으로 혼입시키는 것을 나타낸다. (A) 래트 허혈성 사지(hindlimb)로부터의 골격근내 EPC의 주사 부위 (화살표), (B) 주사된 매트릭스로부터 조직으로 이동하는 EPC (화살표)의 확대 영상, (C) EPC는 혈관 구조 (화살표)내에서 관찰되었다.
도 9는 HPN-3 내지 HPN-5 물질의 기계적 특성 (강도, 신장 및 인성)을 대조군-1, 대조군-2, HPN-1 (IPN-I), 및 HPN-2 (IPN-II)와 비교해서 도식적으로 나타낸다.
도 10은 HPN-3 내지 HPN-7에 대한 광학 특성 (광 투과율(％))을 HPN-1 (IPN-I), HPN-2 (IPN-II), 및 인간 및 토끼 각막에 대한 것과 비교해서 도식적으로 나타낸다.
도 11은 시딩(seeding) 후 제6일에 (a) 배양 디쉬(Culture dish) 대조군 표면, (a) HPN-3, (b) HPN-4, 및 (c) HPN-5 하이드로겔 상의 인간 상피 세포의 성장을 나타낸다.
도 12는 상이한 콜라겐 대 DMA 비율 (kPa 단위)(± 표준 편차)을 갖는 최대 강도 하이드로겔을 도식적으로 나타낸다.
도 13은 각각의 콜라겐 대 DMA 비율 (± 표준 편차)에 대한 하이드로겔의 파단 변형율(％)을 도식적으로 나타낸다.
도 14는 콜라겐 대 DMA 비율 (kPa 단위)(± 표준 편차)에 대한 모듈러스를 도식적으로 나타낸다.
도 15는 콜라겐-DMA 하이드로겔의 백색광 투과율을 도식적으로 나타낸다.
도 16은 콜라겐-DMA (3:1 w/w) 하이드로겔 상의 상피 세포 시험관내 성장으로서 세포 전면배양을 보여주는 제3일째의 광학 영상을 나타낸다.
도 17은 알기네이트 (평균 직경 300 마이크로미터)의 마이크로스피어의 스캐닝 일렉트론 마이크로그래프(Scanning Electron Micrograph) 영상이다.
도 18은 콜라겐 및 IPN 하이드로겔의 시험관내 생분해를 도식적으로 나타낸다.
도 19는 IPN (우측 컬럼)과, 가교된 재조합 인간 콜라겐 (중앙부 컬럼)의 비교를 나타낸다. 좌측 컬럼은 비처리 대조군을 나타낸다.
도 19는 수술 후 6개월의 시점에서 전형적인 이식물의 생체내 공초점(confocal) 영상을 전형적인 비처리, 반대쪽(contralateral), 대조군 각막과 비교하여 나타낸다. (EDC/NHS) 가교된 재조합 인간 콜라겐 및 의학 등급의 돼지 콜라겐-MPC IPN은 신경이 스트로마 및 상피하 신경 망상구조 (화살표)로 재성장함을 나타낸다.
도 20은 내피 부착 증식에서 알기네이트를 혈장 처리된 콜라겐/키토산 IPN으로 이식한 효과를 나타낸다. 그룹 A: 고주파 전력(Radio Frequency power) (RFP)=0w; 그룹 B: RFP=40w; 그룹 C: RFP=100w. 청색 막대: 0％ 알기네이트; 녹색 막대: 1％ 알기네이트; 오렌지색 막대: 5％.
정의: 달리 정의하지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "하이드로겔"은 수용액 또는 수성 용액 중에서 용해되지 않고 팽창하며 그의 구조 내에 상당한 부분의 수용액 또는 수성 용액을 유지시키는 능력을 나타내는 가교-결합된 중합체 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "중합체"는 함께 연결된 개별 단량체로 구성된 분자를 지칭한다. 본 발명의 문맥상, 중합체는 "말단-대-말단"으로 연결되어 선형 분자를 형성하는 단량체를 포함할 수 있거나, 또는 함께 연결되어 분지형 구조를 형성하는 단량체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생중합체"는 천연 중합체를 지칭한다. 천연 중합체에는 단백질 및 탄수화물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 또한, 용어 "생중합체"는 본 발명의 합성 중합체로의 가교-결합을 촉진하도록 변형된 천연 중합체의 유도된 형태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "합성 중합체"는 자연적으로 생성되지 않으며 화학적 또는 재조합 합성에 의해 생성되는 중합체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "상호침투성 망상구조" 또는 "IPN"은 중합체 각각이 망상구조를 형성하는 둘 이상의 중합체의 조합인 상호침투성 중합체 망상구조를 지칭한다. 망상구조 간에 얽힘 및 상호작용이 존재한다. 용매 중에서 팽창시 중합체는 용매에 용해되지 않을 것이다.
본원에서 사용되는 "광학적으로 투명한"은 백색광의 85% 이상의 투과율을 지칭한다. 특정 실시양태에서, "광학적으로 투명한"은 건강한 각막, 예를 들어 백색광의 90% 초과의 투과율 및 3% 미만의 산란도를 갖는 각막과 동등한 광학적 투명도를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "각막 온레이"는 인간 또는 동물의 상피 또는 상피 세포 층 및 눈의 바우맨 막(Bowman's membrane) 사이에 위치하도록 크기 및 형상에 맞게 배열된 안과적 이식물 또는 장치이다. 비교하면, "콘택트 렌즈"는 눈의 상피 상에 위치하도록 배열된다. 각막 온레이는 전체 바우맨 막 상에 존재할 수 있거나, 또는 바우맨 막으로 연장되는 한 부분 이상을 포함할 수 있다. 이러한 부분은 장치의 작은 부분, 예컨대 장치의 면적 또는 부피의 50% 미만을 구성한다.
본원에서 사용되는 "각막 인레이"는 눈의 스트로마에 위치하도록 배열된 장치 또는 이식물이다. 각막 인레이는 스트로마 중에 플랩 또는 포켓을 형성함으로써 스트로마에 위치할 수 있다. 각막 인레이는 눈의 바우맨 막 아래에 위치한다.
본원에서 사용되는 "전체-두께 각막 이식물"은 눈 방수의 앞에 위치한 건강하지 않은 눈의 각막의 전체 또는 일부를 대체하도록 배열된 장치를 지칭한다.
IPN 하이드로겔 물질
본 발명의 IPN 하이드로겔 물질은 다양한 용도 (임상적, 치료학적, 예방학적 또는 화장 용도를 포함하나 이에 제한되지 않음)에서 사용되기에 적합한 IPN을 포함한다. IPN 하이드로겔 물질은 필요한 대상체에서 조직 및/또는 기관 기능의 대체, 회복 및/또는 증강에 사용될 수 있다.
본 발명의 IPN 하이드로겔 물질은 세포독성이 낮거나 없으며, 세포 및/또는 신경 성장, 및/또는 성형성을 촉진하는 능력을 특징으로 한다. 또한, 상기 물질은 봉합, 및 설치후 마모 및 인열을 포함할 수 있는 취급, 이식 등을 허용하는 충분한 기계적 및 구조적 특성을 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에 따라, IPN 하이드로겔 물질로부터 제조된 장치는 주형을 사용하여 제조된다. 이러한 장치에는 목적하는 크기 및 형상으로 형성된 성형된 안과적 온레이 및 이식물이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 비제한적 특정 실시예에 따라, IPN 물질은 안과적 장치에 사용되며, 여기서 상기 물질은 각 장치에 맞는 하나 이상의 하기 이점을 제공할 수 있다: (i) 목적하는 굴절 지수, (ii) 목적하는 광학적 투명도 (가시광에 대해, 비교되는 두께의 건강한 인간 각막 물질과 동등하거나 보다 양호한 광학적 투과율 및 광 산란도), (iii) 목적하는 시력, 예컨대 시력을 향상시키는 시각, (iv) 향상된 편안함, (v) 향상된 각막 및 상피 건강, 및 (vi) 치료학적 이점, 예를 들어, 눈의 질병, 질환 또는 외상적 손상의 치료에서의 치료학적 이점. 본 실시양태에 따라, 본 발명의 물질은 투명하게 또는 광학적으로 투명하게 제조될 수 있다. 또한, 물질은 시력 교정 굴곡을 포함하도록 성형될 수 있다.
본 발명의 물질은 부분적으로 안과적 장치에 사용하기에 적합한데, 이는 (i) 허용가능한 시력을 갖는 매트릭스를 형성하도록 형상을 이룰 수 있으며 (예컨대 성형가능하며), (ii) 장치를 통해 및/또는 장치 상에 신경 성장을 촉진하는데 효과적이고, (iii) 광학적으로 투명하게 또는 시각적으로 투명하게 제조될 수 있기 때문이다. 장치가 각막 온레이인 경우, 장치는 장치의 앞 표면 상에서 재상피화를 촉진하는데 효과적이다.
본 발명의 IPN 물질은 그의 특정 적용에 필요한 기체 또는 영양소 확산을 허용하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 각막 온레이의 경우, 온레이를 형성하는 물질은 바우맨 막 및 상피 간의 기체 및 영양소 교환을 제공하거나 허용하여, 살아있는 완전 기능성 상피를 유지한다. 이러한 영양소에는 글루코스, 및 세포, 예컨대 상피 세포의 생존, 성장 및 분화를 촉진하거나 또는 향상시키는 인자 또는 약제가 포함된다. 교환은 건강한 인간 각막의 것과 대적할만하거나 보다 양호해야 한다. 영양소 및/또는 약물에 대한 물질의 투과성은 통상적인 기술을 사용하여 모니터링될 수 있다. 또한, 물질을 통한 영양소 및/또는 약물의 이동은 물질의 광학적 특성을 유의하게 변화시켜서는 안된다. 온레이 또는 볼록렌즈는 완전한 생적합성이 있어서, 온레이에 신속한 상피 부착을 가능하게 하고, 신경 신경분포 및 민감성, 예를 들어 터치 민감성의 회복을 허용한다.
본 발명의 IPN 하이드로겔 물질은 둘 이상의 중합체 망상구조의 조합을 포함한다. 중합체 망상구조 중 하나 이상은 생중합체로부터 형성된다. 제 2 중합체 망상구조는 합성 중합체 또는 제 2 생중합체로부터 형성된다. 물질은 순차적 IPN에 의해 형성된 제 3 또는 그 이상의 중합체 망상구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, IPN 물질은 제 3 단량체에서 가교-결합제와 팽창하여 경화 후 추가의 망상구조를 형성할 수 있다. 제 3 단량체는 제 1 또는 제 2 단량체와 동일할 수 있다.
생중합체
생중합체는 천연 중합체 및 그의 유도체, 예컨대 단백질 및 탄수화물이다. 본 발명에 따라, 물질은 망상구조 형태의 생중합체 또는 그의 유도된 형태를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 생중합체의 예로는 콜라겐 (제I형, 제II형, 제III형, 제IV형, 제V형 및 제VI형 포함), 변성된 콜라겐 (또는 젤라틴), 재조합 콜라겐, 피브린-피브리노겐, 엘라스틴, 당단백질, 다당류 (예컨대, 알기네이트, 키토산, N-카르복시메틸 키토산, O-카르복시메틸 키토산, N,O-카르복시메틸 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트 및 글리코사미노글리칸 (또는 프로테오글리칸)이 포함되나 이에 제한되지 않음), 산화된 다당류 (예컨대, 산화된 콘드로이틴 술페이트, 산화된 알기네이트 및 산화된 히알루론산이 포함되나 이에 제한되지 않음)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용하기에 적합한 생중합체는 다양한 상업적 공급원으로부터 구입가능하거나, 표준 기술에 의해 천연 공급원으로부터 제조될 수 있다.
생중합체 또는 그의 유도체는 하기 특성들 중 하나 이상을 기준으로 선택된다: (1) 생중합체가 생적합성이 있고, 임의로 세포 부착 및 성장을 촉진시키고/거나 신경 성장을 촉진시키는 점; (2) 생중합체가 다양한 가교제 (예를 들어, EDC/NHS 화학약품(chemistry)이 포함되나 이에 제한되지 않음)에 의해 가교-결합될 수 있는 반응성 기를 포함하여 IPN의 하나의 구성성분을 형성하는 점; (3) 생중합체가 가교-결합되어 하이드로겔, 즉 킬레이팅 이온을 통해 망상구조의 하나의 구성성분을 형성하거나, 또는 pH 또는 온도에 의해 물리적으로 가교-결합된 하이드로겔을 형성할 수 있는 점 (한 예로서, 알기네이트는 Ca2+를 알기네이트 수성 용액으로 첨가함으로써 가교-결합되어 하이드로겔을 형성한다); (4) 유도된 생중합체, 예를 들어 산화된 다당류 (산화된 콘드로이틴 술페이트는 알데히드 기를 함유함)가 다른 생중합체, 예컨대 콜라겐을 가교결합하여 IPN의 하나의 구성성분을 형성하도록 선택될 수 있는 점; (5) 생중합체가 안과적 장치 사용을 위해 합성 중합체와 투명한 IPN을 형성할 수 있는 점. 그러나, 불투명한 IPN이 또한 다른 용도로, 예컨대 공막 패치 또는 다른 조직 공학 분야에서 사용될 수 있다.
합성 중합체
합성 중합체를 형성하는 단량체는 다양한 알킬 아크릴아미드, 수용성 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 아크릴산 및 그의 유도체, 알킬 아실레이트, 메틸아크릴산 및 그의 유도체, 알킬 메타크릴레이트, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 비닐 피롤리돈, 당단량체 (본원에서 유도된 단당류 또는 유도된 올리고사카라이드, 예를 들어, 글리코실옥시에틸 메타크릴레이트 및 2-메타크릴옥시에틸 글루코시드인 중합체가능한 단량체를 지칭함)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 얻어진 중합체는 생적합성이 있고 생물학적으로 안전하며 생중합체와 혼화성이 있어야 한다.
출발 단량체는 친수성이며, 통상적으로 중합체가능한 이중 결합을 함유하고, 몇몇의 경우, 예컨대 생중합체로서 단백질, 예컨대 콜라겐이 다른 구성성분으로서 사용되여 IPN을 형성하는 경우 중합은 약 37℃ 미만, 또는 단백질의 변성 온도 미만에서 일어나야 한다.
생활성제
본 발명의 IPN 하이드로겔 물질은 하나 이상의 생활성제를 포함하도록 제조될 수 있다. 적절한 생활성제 또는 생활성제들의 조합의 선택은 물질의 적용을 기초로 한다. 물질에 혼입될 수 있는 생활성제의 비제한적 예로는 예를 들어, 성장 인자, 레티노이드, 효소, 세포 부착 인자, 세포외 매트릭스 당단백질 (예컨대, 라미닌, 피브로넥틴, 테나신 등), 호르몬, 골생성 인자, 사이토카인, 항체, 항원, 및 다른 생물학적 활성 단백질, 특정 제약 화합물, 뿐만 아니라 생물학적 활성 단백질로부터 유도된 펩티드, 단편 또는 모티프가 포함된다. 또한, 생활성제에는 항박테리아제 및 항바이러스제가 포함된다.
IPN 기재 하이드로겔 물질의 제조 방법
상기 논의된 바와 같이, IPN은 상호침투성 중합체 망상구조이다. 반응물을 하나의 용기에 순서대로 첨가하고, 가교결합 반응이 동시에 일어난다. 예를 들어, NiColl/MPC IPN의 제조 (실시예 I): 콜라겐을 EDC/NHS에 의해 가교-결합시켜, 하나의 중합체 망상구조를 형성시키고; MPC를 PEG-디아크릴레이트에 의해 가교-결합시켜, 다른 중합체 망상구조를 형성시킨다. 이들 두가지 중합체 망상구조는 서로 상호침투성이며, IPN를 형성한다. 장치의 기계적 및 임의로 광학적 특성에 중요한 열역학적 상용성 상호침투성 중합체 망상구조를 제조하기 위해, 단량체 및 중합체 뿐만 아니라 가교제의 상대량은 특정 범위 내에서 조절된다. 하나의 구성성분의 초과량은 마이크로미터 범위의 큰 크기를 가져올 수 있으며, 이는 명백한 상 분리를 일으키고, 이는 장치의 특성을 악화시킬 것이다. 따라서, IPN 중 구성성분의 양을 선택하는 것은 먼저 IPN의 기본적 요구를 충족시켜야 한다. 구성성분의 비율은 눈 적용을 위한 투명한 IPN의 제조를 위해 조절될 수 있다. 또한, 구성성분의 비율은 최종 하이드로겔의 기계적 특성을 맞추기 위해 조절될 수 있다.
IPN 기재 하이드로겔 물질의 시험
본 발명에 따라, 조직 공학 목적으로 생체내 이식에 적합하기 위해, 첨가된 생활성제가 함유되거나 또는 함유되지 않은 하이드로겔 물질은 생리학적 온도에서 그의 형태를 유지하며, 취급 및 봉합에 적합하게 강건하고, 실질적으로 수난용성이며, 세포의 성장을 촉진시키고, 혈관으로서 백내장 수술용 카테터 또는 안내 렌즈를 사용하기 위해 불활성이어야 한다. 또한, 이는 신경의 성장을 촉진시키는 물질에 적합할 수 있다. 특정 특화된 적용을 위해 물질이 다른 특징을 필요로할 수 있다는 것은 쉽게 이해될 것이다. 예를 들어, 수술 목적으로, 물질은 상대적으로 유연할 뿐만 아니라, 봉합 실 및 바늘에 의한 수술 조작을 지지하는데 충분히 강할 것을 필요로 할 수 있으며, 안과적 적용을 위해, 예컨대 각막 치유 또는 대체를 위해, 물질의 광학적 투명도는 중요할 것이다. IPN 물질의 구성성분 및 그의 상대량은 필요한 특징을 제공하도록 선택된다.
물리적/화학적 시험
조직 공학 적용을 위해 사용되는 경우, 물질은 수술 과정 중 인열 또는 파열을 방지하고 세포 성장을 위해 적절한 지지를 제자리에 물질에 및/또는 그 주변에 제공하는데 필요한 기계적 특성을 나타내야 한다. 전단력 및 인열에 저항하는 물질의 능력은 그의 본래의 기계적 강도, 물질의 형태 및 두께 및 적용되는 장력과 관련된다.
전단력 및 인열에 저항하는 물질의 능력은 두쌍의 핀셋을 사용하여 검사물에 반대 방향으로 힘을 가함으로써 대략적으로 결정될 수 있다. 별법으로, 적합한 장비가 전단력에 저항하는 물질의 능력을 정량적으로 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위한 장력계는 예를 들어, MTS, 인스트론(Instron) 및 콜 파머(Cole Parmer)로부터 시판되고 있다.
시험을 위해, 물질은 시트로 형성될 수 있으며, 그 후 적절한 크기의 스트립(strip)으로 절단된다. 별법으로, 물질은 조직 공학 목적으로 원하는 형상으로 성형될 수 있으며, 전체 성형된 물질은 시험될 수 있다. 인장력을 계산하기 위해, 물질의 파열 또는 "실패"시의 힘을 시험 샘플의 횡단 면적으로 나누어, 단위 면적 당 힘(N)으로 표시될 수 있는 값을 얻는다. 물질의 경직(율)은 응력/변형 곡선의 선형 부분의 기울기로부터 계산된다. 변형은 시험 시작 전에 시험 샘플의 초기 길이로 나눈 시험 도중 길이의 실제-시간 변화이다. 파열시 강도는 파열시 시험 샘플의 최종 길이 빼기 초기 시험 샘플의 길이를 초기 길이로 나눈 값이다.
당업자는 하이드로겔의 유연성 및 집게로 집은 경우 수성 구성성분의 삼출로 인해, 의미있는 인장 데이타를 하이드로겔로부터 얻기 어려울 수 있다는 것을 이해할 것이다. 하이드로겔의 인장력의 양적 특징은 예를 들어, 성형된 물질 샘플 상에서 봉합 당기기(pull-out) 측정을 사용하여 성취될 수 있다. 전형적으로, 봉합은 시험 샘플의 가장자리로부터 약 2 mm에 위치하며, 샘플을 통한 봉합을 찢기 위해 적용되야 하는 피크 힘이 측정된다. 예를 들어, 인간 각막의 형상 및 두께에 형성된 안과적 용도로 의도된 물질의 시험 샘플을 위해, 두 직경방향으로 반대의 봉합이 물질로 삽입될 수 있으며, 눈 이식의 제 1 단계에서 필요로 될 것이다. 그 후, 두 봉합은 적합한 기기, 예컨대 인스트론 인장 시험기(Instron Tensile Tester) 상에서 약 10 mm/min에서 떨어져서 잡아당겨질 수 있다. 물질 파열시 강도를 파손시 연장율 및 탄성률과 함께 계산한다 [예를 들어, 문헌 [Zeng et al., J. Biomech., 34:533-537 (2001)] 참조]. 수술용으로 의도된 물질에 대해, 물질이 포유동물 조직만큼 강할 필요가 없다 (즉, 인열에 저항하는 동일한 능력을 가짐)는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 적용에서 물질의 강도에 대한 결정 인자는 신중하고 경험이 있는 수술의에 의해 제자리에서 봉합될 수 있거나 또는 봉합되지 않을 수 있냐이다.
원한다면, 하이드로겔 물질의 낮은 임계 용액 온도 (LCST)는 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, LCST는 분당 약 0.2℃에서 매트릭스의 샘플을 가열하고, 운점을 눈으로 관찰함으로써 계산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [H. Uludag, et al., J. Appl. Polym. Sci. 75:583 - 592 (2000)] 참조).
물질의 투과성은 표준 기술, 예컨대 투과성 세포 및/또는 원자력 현미경검사법을 사용하는 PBS 투과성 평가를 사용하여 물질에 대한 글루코스 투과성 계수 및/또는 평균 공극 크기를 분석함으로써 결정될 수 있다.
광학적 투과율 및 광 산란도는 또한 투과율 및 산란도를 측정하는 맞춤 기기를 사용하여 안과적 적용으로 의도된 물질에 대해 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Priest and Munger, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39: S352 (1998)] 참조)
시험관내 시험
생체내 사용에 적합하기 위해 물질이 비세포독성이거나 또는 최소로/허용가능하게 세포독성이고 생적합성이 있어야 한다는 것은 쉽게 이해될 것이다. 물질의 세포독성은 표준 기술, 예컨대 돌연변이유발 활성을 스크리닝하는 암즈(Ames) 검정, 포유동물 세포주에서 유전자 돌연변이를 유도하는 물질의 능력을 스크리닝하는 마우스 림프종 검정, 예를 들어 매트릭스에 의해 유도된 임의의 DNA 재배열 또는 손상에 대해 스크리닝하는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO)를 사용하는 시험관내 염색체 이상 검정을 사용하여 분석될 수 있다. 다른 검정에는 자매 염색분체 검정 (매트릭스에 의해 유도되는 염색체 팔 간의 임의의 교환을 결정함) 및 시험관내 마우스 미세핵 검정 (염색체 또는 유사분열 방추사에 대한 임의의 손상을 결정함)이 포함된다. 이들 및 다른 표준 검정에 대한 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, ISO에 의해 개발된 화학물질의 시험에 대한 OECD 가이드라인 및 프로토콜 참조).
세포 성장을 지지하는 물질의 능력은 또한 표준 기술을 사용하여 시험관내 분석될 수 있다. 예를 들어, 적절한 세포주로부터의 세포, 예컨대 인간 상피 세포는 직접 물질 상에 또는 물질을 둘러싼 적절한 지지물 상에 시딩될 수 있다. 적절한 시간 동안 적합한 배양 배지의 존재하에 성장 후, 세포가 물질의 표면 및/또는 물질내에서 성장했는가를 결정하기 위해 물질의 동일초첨 현미경검사법 및 조직학 시험이 수행될 수 있다.
신경 세포의 내부 성장을 지지하는 물질의 능력은 또한 시험관내 분석될 수 있다. 예를 들어, 신경 공급원, 예컨대 후근절은 물질을 둘러싼 적절한 지지물에 묻히거나 또는 물질에 직접 삽입될 수 있다. 적합한 지지물의 예는 연질 콜라겐 기재 겔일 수 있다. 그 후, 적절한 세포주로부터의 세포는 직접 물질로, 또는 물질을 둘러싼 적절한 지지물로 시딩될 수 있으며, 물질은 적합한 배양 배지의 존재하에 예정된 시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 직접적으로 및/또는 신경-특이적 마커의 존재하에, 예를 들어 신경-특이적 형광 마커를 사용하는 면역형광법 및 신경 성장에 대한 동일초첨 현미경검사법에 의한 물질의 시험은 성장한 신경을 지지하는 물질의 능력을 나타낼 것이다.
세포 성장을 지지하는 물질의 능력을 평가하기 위한 검사에서, 성장 보조제는 배양 매질에, 물질에, 또는 둘 다에 첨가될 수 있다. 사용한 특정 성장 보조제는 평가될 세포의 종류에 따라 좌우될 것이며 (예를 들면, 하이드로겔 물질의 의도하는 적용을 고려함), 당업계의 숙련자는 이를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들면, 신경 세포에 적합한 보조제는 라미닌, 레티닐 아세테이트, 레티노산 및 신경 세포를 위한 신경 성장 인자를 함유한다.
생체내 시험
물질의 생체적합성 및 이의 생체내 세포 성장을 지지하는 능력을 평가하기 위해, 면역원성, 염증, 배출 및 퇴화 연구, 및 또한 세포 성장의 결정을 위해 적절한 동물 모델에게 물질을 이식할 수 있다. 적합한 대조군 동물이 평가에 포함될 수 있다. 적합한 대조군의 예는, 예를 들면 수술하지 않은 동물, 공여 동물로부터 유사한 크기의 동종이식물을 받은 동물 및/또는 표준 허용 이식 물질과 크기가 유사한 이식물을 받은 동물을 포함한다.
이식후 다양한 단계에서, 생체검사는 표면상으로 및/또는 이식물 및 조직 검사로 세포 성장을 평가하기 위해 수행될 수 있으며, 면역조직화학 기술은 성장중인 신경이 발생하는지의 여부 및 염증 또는 면역 세포가 이식 부위에 존재하는지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 당업계에 공지된 다양한 세포 특이적 착색제는 다양한 세포 특이적 항체, 예컨대 신경 세포의 존재 또는 부재를 표시하는데 사용될 수 있는 항-신경필라멘트 항체 및 또한 존재하는 세포의 종류를 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 표준 기술을 사용한 신경 작용 가능성의 측정은 신경이 기능성인지의 여부를 표시할 수 있다. 생체내 공초점 현미경 검사는 선택된 수술후 시간에서의 동물의 세포 및 신경 성장을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 적절한 경우, 터치 감응성은 당업계에 공지된 기술에 의핸, 예를 들면 지각계(esthesiometer)를 사용하여 측정될 수 있다. 터치 감응성의 회복은 기능성 신경의 재생을 나타낸다.
적용
본 발명은 생체적합성이고 비세포독성 (또는 최소 세포독성)이며, 이로 인해 생체내 조직 재생을 가능하게 하는 골격으로 사용하기에 적합한 IPN 하이드로겔 물질을 제공한다. 예를 들면, 물질은 조직 밀봉재 또는 접착제, 피부 대체물 또는 각막 대체물, 또는 각막 피복물로서 상처 치유를 위해 손상된 또는 제거된 조직을 대체하기 위해 환자에게 이식하는데 사용될 수 있다. 물질은 이식 전에 적절한 형태로 성형될 수 있으며, 예를 들면 이는 손상된 또는 제거된 조직에 의해 남겨진 공간을 채우도록 예비 성형될 수 있다. 또한, 물질은 조직 재생이 가능한 것이 필수가 아닌 지지체/골격으로서 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 안내 렌즈 또는 치료 렌즈로서 사용되는 경우에 바람직할 수 있다.
또한, 본 발명의 IPN 하이드로겔 물질은, 예를 들면 i) 각막 이식물을 사용한 이식술(transplantation); ii) 각막 인레이, 온레이, 이식가능한 콘택트 렌즈, IOL을 사용한 굴절 보정; iii) 백내장 외과수술 - IOL; iv) 임의로는 피브린과의 배합물을 사용한 (혈관신생을 통해 혈관 내부성장을 감소시키기 위함), 피부의 재건; v) 줄기 세포 성장의 자극을 위한 성장 인자, 약물 또는 펩티드의 전달, 및 분화 (안대 렌즈, 또는 눈을 위한 이식물, 또는 항노화 또는 노화방지(rejuvenative) 적용 (성형 외과수술)에서 주름의 제거를 위한 콜라겐 단독에 비해 더 길게 존속되는 성형 필러로서의 본 발명의 물질의 상기 용도의 구체적인 예가 포함됨. 이와 관련하여, 시험은 래트에서의 30일 후의 피하 생체적합성 및 안정성을 나타냄), vi) 유전자 조작된 세포, 예를 들면 혈우병(Haemophilia A)의 치료에서 전달 시스템을 위한 VIII 인자를 생성하는 골수 줄기 세포의 전달; vii) 특히 섬유가 강화된 경우에, 신경 골격; 및 viii) 골격이 필요한 경우, 다른 기관 및 조직에의 이식물, 예를 들면 심장 패치 및 연골 대체물에 사용될 수 있다.
상기 적용은 대부분 하이드로겔 물질에 관한 것이지만, 물질이 피부를 재건하는 기재 물질, 심장 패치, 이식을 위한 유전자 조작된 세포의 캡슐화물 (예를 들면, 혈우병을 위한 세포를 생성하는 8 인자), 및 신경 재건물로서 사용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 생활성 인자, 성장 인자들의 배합물, 펩티드는 이러한 다른 조직 공학/재생 의약 적용을 위한 기재 물질을 분화시키기 위해 첨가될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 물질은 조직 공학에 적절한 형태로 예비 성형된다. 또다른 실시양태에서, 물질은 전체 두께 인공 각막 또는 각막 피복물에 적합한 부분 두께 물질로서 예비 성형된다.
본 발명의 또다른 실시양태에 따라, 장치가 개별적으로 배치되는 경우에 물체를 사용하여 신경 성장을 촉진하는데 효과적인 본 발명의 물질을 포함하는 물체를 포함하는 장치가 제공된다. 예를 들어 개별적인 눈에 배치되는 경우, 물질은 물체를 사용하여 신경 성장을 촉진할 수 있어, 각막이 장치 또는 터치 감응성을 유지하는 장치를 받아들이는 것을 가능하게 한다. 장치가 개별적인 눈에 배치하기 위한 안과적 장치인 특수한 예에서, 물체는 광 전력을 갖도록 성형된다. 따라서, 물체는 렌즈 물체인 것으로 해석될 수 있다. 본원에서 논의하는 안과적 장치는 각막 온레이, 각막 인레이 또는 전체 두께 각막 이식물이도록 크기 및 형태가 형성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 안과적 장치는 광 전력이 없는 굴절 오차 보정 장치이다. 예를 들면, 본 발명에 따른 굴절 오차 보정 장치는 환자의 각막 상피와 보우만(Bowman) 막 사이에, 또는 환자의 각막 스트로마에 배치될 수 있는 블랭크인 것으로 해석될 수 있다.
또한, 물질은 환자의 특정 영역에 생활성제를 전달하는 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 일단 물체 내에서는, 예를 들면 확산 제어 과정을 통해, 또는 생활성제가 물질에 공유 결합된 경우에는 물질로부터 효소적으로, 화학적으로 또는 물리적으로 절단된 후 확산 제어 과정에 의한 배출에 의해, 물질로부터 생활성제가 배출된다. 별법으로, 생활성제는 물질 내로부터 그 효과를 미칠 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 생합성 물질은 인공 각막으로서 사용된다. 이러한 적용을 위해, 물질은 완전 두께 인공 각막 또는 각막 피복물에 적합한 부분 두께 물질로서 예비 성형된다. 이러한 실시양태에 따라, 하이드로겔은 광 투과율이 높고 광 산란이 적도록 고안된다.
키트
또한, 본 발명은 하이드로겔 물질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 "기성품(ready-made)" 형태의 물질을 포함할 수 있거나, 이는 적절한 비율의 물질을 제조하는데 필요한 개별적인 성분들을 포함할 수 있다. 임의로는, 키트는 1종 이상의 생활성제를 더 포함할 수 있다. 사용을 위해 키트는 사용 설명서, 1종 이상의 적합한 용매, 1종 이상의 동물의 신체 내로 최종 물질 조성물의 주사 또는 배치를 보조하기 위한 기기 (예컨대, 주사기, 피펫, 핀셋, 점안기 또는 유사한 의학상 인증된 전달 매체), 또는 이의 조합을 더 포함할 수 있다. 키트의 개별적인 성분들은 별도의 용기에 포장될 수 있다. 키트는 생물학 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 경고문을 더 포함할 수 있으며, 경고문은 인간 또는 동물 적용을 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 인증을 반영한 것이다.
본원에 기재한 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 다음 실시예를 명시한다. 이러한 실시예는 단지 예시를 위한 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이러한 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하지 않아야 한다.
실시예 I - NiColl/MPC IPN 하이드로겔
물질. 니폰(Nippon) 콜라겐 (돼지 피부); 0.625 M 모르폴리노에탄술폰산 [MES, 알리자린 레드(Aalizarin Red) S pH 지시약 (6.5 mg/100 ml 물)을 함유함]; 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 HCl (EDC), N-히드록시숙신이미드 (NHS). 바이오컴패터블즈 인터내셔날(Biocompatibles internaional) PLC (영국 소재)로부터 MPC (2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린)을 구매하였다. 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 NaOH 용액 (2N); PEG-디아크릴레이트 (Mw = 575 Da); 및 암모늄 퍼술페이트 (APS) 및 N,N,N',N'-테트라메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)을 구매하였다.
NiColl/MPC IPN 하이드로겔의 제조. 먼저, 빙수조에서 플라스틱 티(Tee)로 연결된 2개의 주사기에서 13.7 wt％ 니폰 콜라겐 용액 0.3 ml 및 0.625 M MES 0.1 ml를 혼합하였다. 그 후, MPC 12.9 mg을 MES 0.25 ml 중에 용해시키고, 이의 0.2 ml를 100 ㎕ 미세주사기를 사용하여 상기 혼합물에 주사하였다 (콜라겐 대 MPC의 비율 4:1 w/w). 그 후, 500 ㎕ 미세주사기를 사용하여 PEG-디아크릴레이트 4.6 ㎕를 주사하였다 (MPC에 대한 중량 비율 1:2). 달리 명시하지 않는 한, PEG-디아크릴레이트 대 MPC의 비율을 1:2로 고정하였다. 그 후, 용액을 완전히 혼합하였다. 그 후, 100 ㎕ 미세주사기를 사용하여 (MES 중) 2％ APS 및 TEMED 용액 25 ㎕를 주사한 다음, (MES 중) EDC/NHS 용액 57 ㎕를 주사하였다 (콜라겐 NH2에 대한 몰 비율 3:3:1). 본 연구를 위해, EDC 대 콜라겐의 비율을 또한 일정하게 유지하였다. NaOH (2N)를 사용하여 pH를 약 5로 조정하였다. 균질 혼합물을 유리 금형에 캐스팅하고, 습도가 100％인 실온에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 후경화(port-curing)를 위해, 생성된 금형을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이터로 옮겼다. 콜라겐 대 MPC의 비율이 1:1, 2:1 및 3:1인 IPN (NiColl/MPC IPN 하이드로겔로 나타냄) 을 상기와 동일한 방법을 사용하여 제조하였다.
본 실시예에서 사용되는 용어 "NiColl/MPC IPN4-3, NiColl/MPC IPN3-3, NiColl/MPC IPN2-3 및 NiColl/MPC IPN1-3"는 각각 콜라겐:MPC의 비율이 4/1, 3/1, 2/1 및 1/1인 13.7％ 니폰 콜라겐으로부터의 IPN 겔을 의미한다.
특성 규명
굴절률 (RI). VEE GEE 굴절계를 사용하여 샘플의 RI를 결정하였다.
광 투과율. 통상적인 디자인의 기기를 사용하여 파장이 450, 500, 550, 600 및 650 nm인 백색광에서의 샘플의 광 투과율을 측정하였다.
기계적 특성. 인스트론(Instron) 전기기계 시험기 (모델 3340)을 사용하여 샘플의 응력, 파단 변형률 및 모듈러스를 결정하였다. 샘플의 크기는 5 mm x 5 mm x 0.5 mm였다.
수분 함량. 하기 수학식에 따라 샘플의 수분 함량을 계산하였다.
Figure 112008025768583-pct00001
상기 식에서, W0 및 W는 각각 건조 및 팽윤 샘플의 중량을 나타낸다.
결과
굴절률
하기 표 1에 콜라겐 하이드로겔의 굴절률 값을 열거하였다.
Figure 112008025768583-pct00002
광 투과율
하기 표 2에 광 투과율 결과를 요약하였다.
Figure 112008025768583-pct00003
기계적 특성
하기 표 3에 IPN 샘플의 기계적 특성을 나타내었다. NiColl/MPC IPN4-3은 360 KPa로 높은 파단 응력을 나타내었다.
Figure 112008025768583-pct00004
평형 수분 함량
또한, 콜라겐 겔의 평형 수분 함량을 측정하였다 (하기 표 4 참조).
Figure 112008025768583-pct00005
생체적합성 검정
시험관내 생체적합성 검정은 상기한 IPN 하이드로겔이 상피 성장을 매우, 그리고 대조군 (배양판)보다 더 큰 정도로 촉진함을 나타내었다.
생체내 연구는 IPN의 지지 신경 성장을 함유하는 함유 콜라겐/MCP를 나타내었다.
도 19는 전형적인 비처리된 반대쪽의 대조군 각막의 구성과 비교한, 수술후 6개월의 전형적인 이식물의 생체내 공초점 화상을 나타낸다. (EDC/NHS) 가교된 재조합 인간 콜라겐 및 의학 등급의 돼지 콜라겐-MPC IPN은 둘 다 스트로마 및 상피하 신경 망상구조로의 신경의 재성장을 나타내었다 (화살표 참조). 도 19에서 가교된 재조합 인간 콜라겐 (중앙 열) 및 왼쪽 열의 비처리 대조군과 IPN (오른쪽 열)을 비교하였다. 상기 결과는 주요 합성 성분임에도 불구하고 IPN은 신경 재생이 가능한 단지 콜라겐 (즉, 완전하게 천연인 중합체)만큼만 유효한 것임을 나타내었다.
참고 문헌
1. 문헌 [Schrader ME and Loeb GL (Eds), Modern approaches to wettabilty: theory and applications, Plenum Press, New York, pp 231-248 (1992)].
2. 문헌 [Konno T, Hasuda H, Ishihara K, Ito Y. Photo-immobilization of a phospholipid polymer for Surface modification. Biomaterials 2005, 26 :1381-1388].
3. 문헌 [Lewis AL, Crosslinkable coatings from phosphorylcholine-based polymers. Biomaterials 2001, 22: 99-111].
실시예 II - NiColl/MPC IPN 하이드로겔
EDC/Coll-NH2 비율 1.5에서 콜라겐 용액의 농도를 13.7％에서 20％로 증가시킴으로써 실시예 I과 같이 제조된 IPN의 특성이 변화하는 정도를 나타내기 위해, 본 연구를 수행하였다. 추가로, MES 결핍 pH 지시약을 사용하였다.
물질. 니폰 콜라겐 (돼지 피부); 0.625 M 모르폴리노에탄술폰산 [MES, pH 지시약이 없음]; 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 HCl (EDC); N-히드록시숙신이미드(NHS). 바이오컴패터블즈 인터내셔날 PLC (영국 소재)로부터 MPC를 구매하였다. 알드리치로부터 NaOH 용액 (2N); PEG-디아크릴레이트 (Mw = 575 Da); 암모늄 퍼술페이트 (APS); 및 N,N,N',N'-테트라메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)을 구매하였다.
NiColl/MPC IPN 하이드로겔의 제조.
먼저, 빙수조에서 플라스틱 티로 연결된 2개의 주사기에서 20.0 wt％ 니폰 콜라겐 용액 0.3 ml 및 MES (0.625 M) 0.1 ml를 혼합하였다. 그 후, MPC 12.9 mg을 MES 0.25 ml 중에 용해시키고, 이의 0.2 ml를 100 ㎕ 미세주사기를 사용하여 상기 혼합물에 주사하였다 (콜라겐 대 MPC의 비율 4/1 w/w). 그 후, 500 ㎕ 미세주사기를 사용하여 PEG-디아크릴레이트 4.6 ㎕를 주사하였다 (MPC에 대한 중량 비율 1:2). 그 후, 용액을 완전히 혼합하였다. 그 후, 100 ㎕ 미세주사기를 사용하여 (MES 중) 2％ APS 및 TEMED 용액 25 ㎕를 주사한 다음, (MES 중) EDC/NHS 용액 86 ㎕를 주사하였다 (Coll-NH2에 대한 몰 비율 1.5:1.5:1). 균질 혼합물을 유리 금형 또는 플라스틱 금형 (두께 500 μm)에 캐스팅하고, 습도가 100％인 실온에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 후경화를 위해, 금형을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이터로 옮겼다.
본원에서 사용되는 NiColl20/MPC IPN은 20％ 콜라겐 용액으로부터 제조된 IPN을 말한다.
특성 측정
굴절률 (RI). VEE GEE 굴절계를 사용하여 샘플의 RI를 결정하였다.
광 투과율. 자체 고안한 기기에서 파장이 450, 500, 550, 600 및 650 nm인 백색광에서의 하이드로겔 샘플의 투과율을 측정하였다.
기계적 특성. 하이드로겔 샘플의 인장 강도, 파단시 연신율 및 탄성 모듈러스는 인스트론 전자기계 시험기(Instron electromechanical tester) (모델 3340)에서 측정하였다. 샘플의 크기는 5 mm x 5 mm x 0.5 mm이었다.
수분 함량. 하이드로겔의 수분 함량 (WA)은 하기 수학식에 따라서 계산하였다.
(W - W0)/W x 100％
상기 식 중, W0 및 W는 각각 건조 샘플의 중량 및 습윤 샘플의 중량을 나타낸다.
결과
굴절률
20％ 용액으로부터의 IPN 하이드로겔은 투명하고 균일하였다 (도 1에 나타난 바와 같음). 굴절률은 대략 1.3519이었다.
광학 투과율
표 5에 광학 투과율의 결과를 요약하였다.
광학 특성
파장 백색 450 500 550 600 650
투과율(％) 87.9±2.2 81.1±2.2 83.1±2.2 83.2±2.2 84.9±2.2 86.6±2.2
기계적 특성
표 2에 겔의 기계적 특성을 나열하였다. NiColl20/MPC IPN의 인장 강도 및 모듈러스는 실시예 1에서 제조된 하이드로겔의 것에 비해 개선되었다. 중요한 것은, 이 겔은 가요성이지만 단단하다는 것이다 (예를 들어, 그것은 집게를 사용하여 파괴될 수 없다).
기계적 특성
인장 강도 (KPa) 파단시 연신율(％) 탄성 모듈러스(MPa)
566.0±243.9 49.08±6.73 2093±1157
평형 수분 함량
평형 수분 함량은 88.97％이었다.
시험관 내 생체 적합성 분석은 NiColl20/MPC IPN 하이드로겔이 대조군에 비해 상당한 양으로 상피 성장 웰 (배양 플레이트)을 촉진시킨다는 것을 나타내었다.
실시예 III - 시력 향상 안과적 장치를 위한 신규한 생합성 물질
본 실시예에서 기재된 조직 공학 물질은 본질적으로는 이전에 공지된 물질에 비해서 인성 및 탄성이 개선된 강인한 삽입형 물질이다. 비록 이들이 콜라겐 기재 물질일지라도, 이들은 또한 상당히 증가된 인장 강도를 제공하면서 인간의 각막 내에서 발견되는 자연의 세포외 매트릭스 분자를 모방하는 키토산과 같은 생모방성 분자를 혼입한다. 또한, 콜라겐/키토산 골격의 안정성을 위해서 이종의(hybrid) 가교 시스템을 개발하고 사용하여 물질의 탄성 및 인성을 더 증가시켰다. 이러한 증가된 물질을 기계적, 광학적 및 생물학적 특성에 대해서 시험하였다. 그 결과는 골격이 인간 안구 은행 각막에 비해서 광학 투명도가 우수하며, 시험관 내 시험에서 각막 세포 및 신경의 재생을 허용한다는 것을 제안한다.
물질 및 방법
기재 물질은 10％ (w/v) 아텔로-콜라겐 유형 I과 3％ (w/v) 키토산의 혼합물을 포함하였다. 니뽄 햄(Nippon Ham) (일본)에서 입수한 동결 건조된 돼지 콜라겐 분말을 저온수 (살균 dd H2O)에 용해하고 4℃에서 교반하여 10％ (w/v) 농축액을 얻었다. 또한, 키토산 분말 (플루카(Fluka)에서 입수한 MW 40000)을 0.2 N 염화수소산 (HCl)에 용해시키고 4℃에서 교반하여 3％ (w/v) 키토산 용액을 제조하였다. 이어서 두 용액을 소정의 비율로 주사기 시스템에서 혼합하여 가교 전에 균일한 블렌드를 제조하였다. 각종 가교제 (즉, PEG 디알데히드 및 EDC/NHS)를 사용하여, 가교제 및 생모방성 성분의 유형 및 농도를 기준으로 구별되는 특성을 갖는 상호침투성 망상구조 (IPN)를 개발하였다 (표 7 참고).
콜라겐 기재 각막 이식물 (IPN-I)의 제조.
전형적으로, 3％ 키토산 용액 0.12 mL를 루어 팁(Luer tip) 유리 주사기 내의 10％ 콜라겐 용액 0.6 mL [키토산:콜라겐 몰비 0.5:1]에 첨가하였다. 이어서 테프젤(Tefzel) 티 피스(Tee-piece)를 사용하여 조성물을 MES 완충액 0.4 ml와 혼합하였다. 이어서 공기 방울 트랩장치(entrapment)를 사용하지 않고 약 0℃ 내지 4℃에서 혼합물을 MES 완충액 0.35 ml 중에서 EDC/NHS 가교제 [(콜라겐/키토산 중의) EDC:NH2 몰 당량비 3:1 및 EDC:NHS 몰 당량비 1:1]와 혼합하였다. 티(Tee)를 통해서 제1 및 제2 주사기 사이에서 펌핑을 반복하여 조성물을 완전히 혼합하였다.
실질적으로 균일한 용액의 분취액 각각을 즉시 500 마이크로미터의 이식물 주형에 분배하고, 100％ 습도 환경에서 먼저 실온에서 16시간 동안, 이어서 37℃에서 16시간 동안 경화하였다. 인산염 완충 살린 (PBS)에 2시간 동안 담근 후 각각의 최종 이식물 샘플을 이의 주형으로부터 조심스럽게 분리하였다. 마지막으로, 가교된 이식 하이드로겔을 20℃에서 PBS 용액 (PBS 중의 0.5％, 1％ 클로로포름 함유)에 담궈 임의의 반응성 잔류물을 종결시키고 반응성 부산물을 추출하였다.
IPN-I (EP10-2):
콜라겐/키토산 블렌드를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 사용하여 가교하였다. 2-(N-모르폴리노)에탄술푼산 (MES) 완충액을 사용하여, pH가 갑자기 변하는 것을 방지하면서 약 pH 5의 산성에서 콜라겐/키토산 블렌드와 EDC/NHS 가교제를 함께 혼합하였다. 충분한 혼합 후, 혼합된 조성물의 분획을 주형에 놓고, 주형에서 경화시켜 망상구조를 형성하였다.
콜라겐 기재 각막 이식물 (IPN-II)의 제조.
3％ 키토산 용액 0.02 ml를 루어 팁 유리 주사기 중의 10％ 콜라겐 용액 [키토산:콜라겐 몰비 0.1:1] 0.6 ml에 첨가하였다. 이어서 테파젤 티 피스를 사용하여 조성물을 MES 완충액 0.4 ml과 혼합하였다. 이어서 공기 방울 트랩장치를 사용하지 않고 약 0℃ 내지 4℃에서 혼합물을 MES 완충액 중에서 이종의 가교제 [PEG:NH2 몰 당량비 0.25:1, EDC:NH2 몰 당량비 4.5:1 및 EDC:NH2 몰 당량비 1:1]와 혼합하였다. 티(Tee)를 통해서 제1 및 제2 주사기 사이에서 펌핑을 반복하여 조성물을 완전히 혼합하였다.
실질적으로 균일한 용액의 분취액 각각을 즉시 500 마이크로미터의 이식물 주형에 분배하고, 100％ 습도 환경에서 먼저 실온에서 16시간 동안, 이어서 37℃에서 16시간 동안 경화하였다. 인산염 완충 살린 (PBS)에 2시간 동안 담근 후 각각의 최종 이식물 샘플을 이의 주형으로부터 조심스럽게 분리하였다. 마지막으로, 가교된 이식 하이드로겔을 20℃에서 PBS 용액 (PBS 중의 0.5％, 1％ 클로로포름 함유)에 담궈 임의의 반응성 잔류물을 종결시키고 반응성 부산물을 추출하였다.
IPN-II (EP10-11):
콜라겐/키토산 블렌드를 PEG-디부틸알데히드 (네크타르 인크.(Nektar Inc.)로부터의 MW 4132 Da) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)로 구성된 이종의 가교 시스템 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 사용하여 가교하였다. 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충액을 사용하여, pH가 갑자기 변하는 것을 방지하면서 약 pH 5의 산성에서 콜라겐/키토산 블렌드와 PEG-EDC/NHS 가교제를 함께 혼합하였다. 충분한 혼합 후, 혼합된 조성물의 분획을 주형에 놓고, 주형에서 경화시켜 IPN-II를 형성하였다.
결과
이종의 가교제를 사용하여 제조된 IPN 하이드로겔은 취급, 봉합을 비롯한 이식, 및 설치 후 마모 및 인열을 견디기에 충분한 기계적 및 구조적 특성을 갖는다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 이들은 EDC/NHS (대조군 I 및 대조군 II)에 의해서 가교된 10％ 콜라겐으로부터 제조된 이전에 보고된 안과적 물질보다 기계적으로 더 강하다. 예를 들어, 대조군-I 및 대조군-II와 IPN-I 및 IPN-II를 각각 비교할 경우, 최종 인장 강도, 및 인성이 상당히 증가되었다.
일반적으로, 가교제가 증가되어 유발된 인장 강도의 증가는 특히 최종 연신율의 감소와 관련된다 (도 2에서 대조군-I에 대해서 비교된 IPN-I에 대한 값 참고). 이것은 아마도 중합체 망상구조의 유동성에 대한 추가 억제로부터 기인할 것이다. 이러한 특성은 대조군-II 및 IPN-I과 비교하여 IPN-II 하이드로겔에서는 관찰되지 않았다. 탄성을 비롯한 모든 기계적 특성은 IPN-II 하이드로겔에서 증가되었다. 이것은 키토산 및 PEG가 콜라겐 골격에 혼입될 시 IP 망상구조의 형성으로 인한 것일 것이다. PEG는 EDC/NHS에 의해서 제조된 0-길이 가교와 반대로 긴 가교를 생성할 수 있다. 이것은 보다 탄성인 골격을 생성하여 콜라겐 분자가 보다 자유롭게 이동하게 한다.
표 7에 요약되고, 도 3에 도시된 바와 같이, IPN 하이드로겔은 광학적으로 투명하다. 이들은 가시 광선에 대한 바람직한 광학적 투명성, 광학 투과율 및 광 산란이 건강한 인간의 각막 및 토기 각막에 비해서 동일하거나 우수하다. 이들 두 물질은 또한 세포독성이 없다. 이들은 도 4 (a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이 각막 상피 세포를 재생시킨다. 도 5는 IPN-II 상에서의 신경 성장을 나타낸다. 물질은 신경 친화적이며 신경이 하이드로겔 위로 및 하이드로겔을 통과하여 성장하게 하는 것 같다.
Figure 112008025768583-pct00006
EP10-11과 관련하여, 알부민 및 글루코스에 대한 하이드로겔의 투과성은 각각 1.67 x 10 (exp -7) 및 2.8 x 10 (exp -6)이었다.
또한, EP10-11 하이드로겔을 연구하여 생체 적합성/안정성을 시험하였다. 이식물을 쥐의 피부 아래에 30일 동안 넣어서 생체 적합성 및 또한 안정성을 측정하였다. 샘플 3 개당 하나에서 면역 세포의 약간의 침윤이 관찰되었지만, 30일 후에 여전히 안정하면서 변하지 않았다.
3종의 박테리아 (스트라필로코쿠스 아에우레우스(Staphylococcus aeureus), 스트렙토코쿠스 프네우모니아(Streptococcus pneumonia) 및 프세우도모나스 아에우로게노사(Pseudomonas aeurogenosa)의 성장을 평가하기 위한 시험을 수행하였다. 제조된 각막 매트릭스는 자연 각막의 광학적 투명성을 갖고 인간 각막의 곡률과 크기가 동일하게 주형된, 합성 N-이소프로필아크릴아미드 기재 중합체와 단백질 콜라겐의 복합물이었다. 먼저 합성 각막 각각을 시험관 내에서 검시용 인간 각막 가장자리에 봉합하고, 각막의 인장 강도 및 봉합성을 평가하였다. 물, 콜라겐, 및 중합체의 상대적인 백분율을 변화시켜 10종의 상이한 각막 구조물을 생성하였다. 각 구조물을 5개씩 3개의 세트로 다시 제조하고, 각 세트에 상기 박테리아를 각각 100 μl (0.1 mL) 주입하였다. 주입 후, 각막을 실온에서 24 내지 48시간 동안 배양하고 박테리아의 성장을 평가하였다.
결과: 안구 은행으로부터의 인간 각막 내보다 EP10-11 기재 각막 구조물 내의 박테리아 수가 더 적은 것으로 관찰되었다.
도 7은 표층각막이식 (부분 두께 이식편)에 의해서 유카탄 소형 돼지의 각막 내에 이식된 EP10-11의 사진이다. 500 μm, 5 mm 직경의 이식편을 돼지의 각막 내에 넣었다 (돼지 각막의 평균 두께는 약 700 내지 1000 μm임).
실시예 IV - 콜라겐/PAA IPN 하이드로겔
물질. 니뽄 콜라겐(돼지 피부). 0.625 M 모르폴리노에탄술폰산 [MES, 알리자린 레드(Aalizarin Red) S pH 지시약 (6.5 mg/100 ml 물) 함유], 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 HCl (EDC), N-히드록시-숙신이미드(NHS). 아크릴산 (AA)은 알드리치(Aldrich)로부터 구입하였다. PEG-디아크릴레이트(Mw575), 암모늄 퍼술페이트(APS) 및 N,N,N',N'-테트라메틸 에틸렌 디아민(TEMED)은 알드리치에서 입수하였다.
콜라겐/PAA IPN 하이드로겔의 제조. 먼저, 빙조에서 10.0 중량％ 니뽄 콜라겐 용액 0.3 ml 및 MES(0.625 M) 0.1 ml를 플라스틱 티로 연결된 두 주사기에서 혼합하였다. 두번째로, AA (콜라겐 대 AA 비, 1/1 w/w) 30 μl를 100 μl 마이크로주사기를 통해 상기 혼합물에 주입하였다. 세번째로, AA에 대한 중량비 1:5로 PEG-디아크릴레이트 5.0 μl를 50 μl 마이크로주사기를 통해 주입하였다. 달리 언급되지 않으면, PEG-디아크릴레이트 대 AA의 비는 1:5로 고정하였다. 이어서, 용액을 완전히 혼합하였다. 네번째로, 2％ APS 25 μl 및 (MES 중의) TEMED 용액을 100 μl 마이크로주사기를 통해 주입하고, 이후 6:6:1의 콜라겐 NH2에 대한 몰비로 (MES 중의) EDC/NHS 용액 57 μl를 주입하였다. EDC 대 콜라겐의 비도 이 배열을 유지하였다. 균일한 혼합물을 유리 주형 내에서 주조하고, 100％ 습도의 실온에서 16시간 동안 놓아두었다. 이어서 주형을 37℃에서 5시간 동안의 후경화를 위해 배양기로 옮겼다. 생성된 하이드로겔은 강인하고 투명하였다.
실시예 V - 각막을 위한 안구에 대한 약물, 생활성 인자 전달 시스템을 위한 물질의 적용
생활성 단백질 또는 성장 인자를 혼입한 생합성 물질이 개발되어 왔다. 이들 물질은 특히 생활성 YIGSR (라미닌) 단백질 (리(Li) 등, 2003, 2005)의 혼입 후에 각막 세포의 재생 및 몇몇 각막 신경의 재성장을 촉진하는 것으로 보여지는 각막 치환체로서 매우 유용하다. 이 물질은 또한 성장 인자의 전달에 적용될 수 있다 (클렌커(Klenker) 등, 2005)
목적은 1) 삽입형 전달 시스템 (예를 들어, 피복물, 온레이, 인레이, 라멜라 삽입편)을 통해서, 및 2) 치료용 콘택트 렌즈를 통해서, 각막에 대한 생활성 인자의 치료적인 전달을 위해서 두가지 상이한 모드 중 하나에 사용될 수 있는 물질을 개발하는 것이다.
1984년에 콜라겐 각막 보호막(shield)이 각막 안대 렌즈로서 개발되었고, 현재 백내장 및 굴절 교정 수술, 전층 각막이식술, 및 외상후 상피 결손 이후에 눈 표면의 보호를 위해서 시판되고 있다. 이들은 돼지 또는 돼지 또는 소의 콜라겐으로부터 제조되고 3가지 상이한 콜라겐 보호막은 현재 12, 24, 및 72시간의 용해 시간으로 사용가능하다. 이론적, 실험적 및 임상적 증거는 약물 전달 장치로서 및 상피 및 버팀질(stromal) 치유 촉진에서 콜라겐 각막 보호막에 대한 역할을 지지한다.
그러나, 이들 장치의 결점에는 상대적으로 짧은 수명이 포함된다. 가장 긴 사용가능 시간은 72시간이다. 또한, 이들은 원래 불투명하고 시각적으로 차단한다. 따라서 이러한 장치는 널리 사용되지 않았다.
광학적 적응 이외에 콘택트 렌즈 장치는 고통의 경감, 기계적 보호 및 구조적 지지, 약물 전달 등과 같이 현재 안과학적인 실시에서 다양한 범위의 치료 용도를 갖는다.
이들 완전한 합성 하이드로겔 렌즈는 자연 생물질로 구성되지 않아서 완전히 생체 적합하지는 않는다. 합성 안대 콘택트 렌즈와 관련된 합병증은 다양하다. 그 예로는 상피, 버팀질, 및 내피 손상, 렌즈 침착, 알레르기성 결막염, 거대 유두 결막염, 말초 침윤, 세균성 각막염, 및 신생혈관증식이 포함된다.
따라서, 또한 약물을 적재할 수 있는 연장된 마모성 치료용 콘택트 렌즈에 적합한 높은 생체 적합성이 매우 바람직하다. 적합한 렌즈는 두가지 주요 물질 군을 기재로 하여 제조할 수 있다.
● 키토산 합성 중합체 IPN 하이드로겔 렌즈
갑각류의 외골격의 주요 성분인 키토산은 의료용 및 제약적 용도를 위해서 최근 많은 관심을 받아왔다. 이것은 상처 치유를 촉진하고 또한 박테리아발육저지 효과를 갖는 것으로 보고되었다. 약 20년 전, 키토산이 콘택트 렌즈 제조에 유용한 물질로서 제안되었지만, 키토산은 중성수에 용해되지 않고 키토산 겔은 양호한 기계적 강도를 가지지 않았기 때문에, 성공적이지 않았다.
본원에 기재된 바와 같이, 키토산 및 키토산 유도체를 이식을 위한 각막 치환체로 사용하기 위한 물질의 개발에 사용하였다. 이들 물질은 하이드로겔에 대해서 양호한 기계적 강도 및 탄성을 갖는 것이 발견되었다. 또한 이들을 시험관 내 및 동물의 피하에서 시험하였고, 현재 설치류 및 돼지 모델에서 LKP 치료에 대해 시험하고 있다.
치료용 콘택트 렌즈 장치 개발
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 치료 용도를 위한 생체 적합성이 높은 안대 콘택트 렌즈는 하기 특징을 갖는다.
1. 상처 치유 촉진
2. 박테리아발육저지
3. 신경영양 각막염 치료를 위한 NGF-베타와 같은 다양한 약물의 적재 가능
4. 2 내지 3주 심지어는 그 이상으로 연장된 마모성
5. 투명 (90％ 초과의 광 투과율, 3％ 미만의 산란) - 시야 허용
이는, 키토산의 생물학적 성질과 함께 합성 하이드로겔의 기계적 성질을 겸비한 생합성 중합체를 사용하여 상호침입 망상구조를 형성시킴으로써 달성되었다. 이들 물질의 성질은 콜라겐의 첨가에 의해 향상될 수 있다. 콜라겐이란, 추출된 동물원 (예를 들어, 돼지 아테오콜라겐, 또는 재조합 인간 콜라겐, 예컨대 피브로겐(Fibrogen)으로부터 입수가능한 제I형 및 제III형 콜라겐)으로부터 유래하는 당단백질을 지칭한다. 또한, 이전에 개발된 방법을 사용하여 다양한 생리학적 활성 인자 (예를 들어, 펩티드, 성장 인자 또는 약물)를 혼입할 수 있다.
제조 방법
수용성 키토산 및 부분 카르복시메틸화 키토산을 사용하였다. 합성 단량체 또는 가교제 (예를 들어, 아크릴산, PEG-디아크릴레이트, 메타크릴산 및 비닐 피롤리돈 등)를 사용하였다.
· 콜라겐-기재의 생합성 렌즈
88.9％의 물 함량, 1.35의 굴절률 및 약 88％의 광 투과율 (500 ㎛ 두께의 샘플에 대한 것, 도 6 참조)를 갖는 여러 가지 콜라겐-합성 공중합 IPN을 개발하였다.
이들 하이드로겔에 대한 기계적 성질은 다음과 같다.
인장 강도 (kPa) 파단시 신장율(％) 탄성 계수(MPa)
566.0±243.9 49.08±6.73 2093±1157
예를 들어, 굴절률을 증가시키거나 광 투과율을 증가시키거나 기계적 강도를 개선시킴으로써 이들 하이드로겔의 특성을 추가로 개선시킬 수 있다. 하이드로겔의 강도가 향상되도록 기계적 강도를 개선시키기 위해, 더 높은 농도의 성분(예컨대, 콜라겐 및 합성 단량체)을 사용하여 IPN을 형성할 수 있거나, 하이드로겔을 1종 이상의 단량체를 함유하는 용액에 침지시켜 하나 이상의 추가적 중합 망상구조를 형성할 수 있다. 상기 물질은, 피하 이식물로서 시험관 내 및 생체 내에서 생체적합한 것으로 발견되었고, 생리학적 활성 인자의 혼입을 위한 기재 물질 및 각막 대용물로서 이식될 수 있다.
본원에 기재된 물질을 사용하면, 생체적합하고, 상처 치유를 촉진시키고/시키거나 정균성인 콘택트 렌즈를 제조할 수 있다. 이러한 콘택트 렌즈는 다양한 약물, 생리학적 활성 펩티드 및/또는 성장 인자, 예컨대 향신경성 각막염 치료를 위한 NGF를 장입할 수 있다. 추가로, 콜라겐을 상기 키토산-합성 렌즈에 혼합하여 생체적합성 및 약물 장입을 향상시킬 수 있다. 제조된 콘택트 렌즈는 임의로는 2 내지 3주 또는 그 이상의 연장된 마모에 적합할 수 있다.
실시예 VI - 눈의 전방 및 후방 격실용 접착제
각막 상처, 예컨대 각막 파단의 침투를 회복하기 위해, 봉합은 성공적 방법이었다. 그러나, 봉합은 지연되는 수술 시간 및 수술 기술의 필요와 같은 몇 가지 단점이 있다. 또한, 봉합은 유의한 지형적 왜곡 및 고도의 난시를 야기할 수 있다. 느슨한 봉합은 박테리아 서식처가 되고, 감염 및 조직 괴사를 야기할 수 있다. 추가적으로, 봉합은 유의한 불편을 초래할 수 있다. 또한, 환자가 계속 관리해야 하는 비(非)생분해성 봉합은 제거되어야 한다.
또한, 다양한 유형의 조직 접착제에 또한 유사하게 적용되는 접착제는, 합성 접착제 (예를 들어, 시아노아크릴레이트 유도체) 및 생물학적 접착제 (예를 들어, 피브린-기재 접착제)로 세분화될 수 있다. 시아노아크릴레이트 유도체는, 염기성 물질, 예컨대 물 또는 혈액과 접촉시 신속하게 중합하여 강한 결합을 형성하는 매우 높은 인장 강도를 갖는 화합물이다. 이들은 합성물이고 비생분해성이기 때문에, 일반적으로 외부 표면 상에 사용되고, 신생혈관증식 및 조직 괴사를 포함한 이물질 염증 반응을 유발할 수 있다. 안과학에서 시아노아크릴레이트 유도체는 다양한 기타 눈 수술법에서 시도되었지만, 주로 각막 천공 및 심각한 박막화의 관리에 사용되어 왔다.
그에 반해, 피브린-기재 접착제는 인장 강도가 낮고 중합이 느리지만, 생물학적이고 생분해성이어서, 이들은 표면 피복층 (예를 들어, 결막, 양수막) 아래에 사용될 수 있고 최소한의 감염을 유발한다. 각막 박막화 및 천공, 안구 표면 장애 및 녹내장을 치료하기 위해, 안과학에서 이들 접착제를 사용하여 왔다. 최근에는, 무봉합 층판 각막이식술을 수행하고, 공막 노출에 양수막을 부착하는데 피브린-기재 접착제를 사용하고 있다. 유감스럽게도, 피브린 아교는 인간 트롬빈을 사용하기 때문에, 상기 혈액 생성물은 여전히 오염된 공여자 풀로부터의 감염 및 바이러스 전파의 위험을 수반한다. 또한, 피브린-기재 아교의 제조 및 적용은 시아노아크릴레이트 아교의 제조 및 적용보다 훨씬 더 복잡하다.
생체적합성이고 생분해성이며 높은 인장 강도의 비독성이고 안전한 조직 접착제를 제조하는데 천연 생중합체 또는 그의 유도체를 사용할 수 있다. 측쇄 기의 개질에 의해 겔화 속도가 조절될 수 있는 2-성분 아교를 사용할 수 있다. 지속 방출을 위한 겔화 시스템에 약물, 생리학적 활성 펩티드 및 성장 인자를 또한 혼입할 수 있다. 또한, 겔화 속도뿐만 아니라 점도가 제어될 수 있기 때문에, 줄기 세포 및 전구 세포의 전달에 상기 시스템이 또한 사용될 수 있다.
조직 점착제는 1) 산화 콘드로이틴 술페이트 및 2) 수용성 키토산의 두 성분을 함유한다. 혼합 시, 이들 두 성분은 콘드로이틴 술페이트 상의 알데히드기와 키토산 상의 아민기 사이의 반응을 통해 아교 또는 겔을 형성할 것이다. 콘드로이틴 술페이트의 인접 히드록시기의 산화 정도를 조율함으로써 겔화 속도를 조절할 수 있다.
지속 방출을 위한 겔화 시스템에 약물, 성장 인자 (예를 들어 NGF-베타) 및 생리학적 활성 펩티드 (예를 들어, 라미닌, 피브로넥틴, 합성 물질 P 및 IGF-유사 펩티드의 조합물)를 또한 혼입할 수 있다.
콘드로이틴 술페이트-기재 물질은, 도 8에 나타낸 바와 같이, 내피 전구 세포 (EPC)를 근육 시험 시스템으로 전달하는데 사용될 수 있고, 혈관신생을 통해 표지 EPC (하기 도면에서 녹색 표지)를 혈관으로의 혼입으로 수득될 수 있다. 도 8은, 내피 전구 세포 (EPC)를 근육 시험 시스템에 전달하는 콘드로이틴 술페이트-기재 물질, 및 혈관신생을 통한 표지 EPC (하기 도면에서 녹색 표지)의 혈관으로의 혼입을 나타내고, (A) 쥐 허혈 뒷다리 골격근에서의 PC (녹색 표지) 주입 부위 (화살표), (B) 주입된 매트릭스로부터 조직으로의 EPC (화살표) 이동의 확대 이미지, (C) EPC를 혈관 구조 (화살표) 내에서 관찰하였다.
참고 문헌
문헌 [Klenkler B.J., Griffith M., Becerril C., West-Mays J., Sheardown H. (2005) EGF-grafted PDMS Surfaces in artificial cornea applications. Biomaterials 26: 7286-7296].
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문헌 [Li, F., Griffith, M., Li, Z., Tanodekaew, S., Sheardown, H., Hakim, M. and Carlsson, D.J. (2005) Recruitment of multiple cell lines by collagen-synthetic copolymer matrices in corneal regeneration. Biomaterials 26:3039-104].
실시예 VII - 12.1％ w/w 콜라겐을 사용한 재조합 인간 제III형 콜라겐-MPC IPN
우선, 0.3 ml의 제III형 콜라겐 용액 (12.1 중량％) 및 0.1 ml의 MES(0.625 M)를 빙수욕 중에서 플라스틱 티(Tee)와 연결된 2개의 시린지에서 혼합하였다. 이어서, 50 mg의 MPC (콜라겐 대 MPC의 비율: 1/1 w/w)를 0.138 ml의 MES에 용해시키고, 이 중 0.1 ml를 상기 혼합물에 100 ㎕ 마이크로시린지로 주입하였다. 이어서, 16 ㎕의 PEG-디아크릴레이트 (Mn=575) 대 MPC의 중량비가 1:2가 되도록 16 ㎕의 PEG-디아크릴레이트를 100 ㎕ 마이크로시린지로 주입하였다. 그런 다음, 용액을 완전 혼합하였다. 이어서, 25 ㎕의 APS (2％) 및 (MES 중의) TEMED 용액을 100 ㎕ 마이크로시린지로 주입한 후, EDC/NHS 대 Coll-NH2의 몰비가 3:3:1이 되도록, 57 ㎕의 (MES 중의) EDC/NHS 용액을 주입하였다. 균질 혼합물을 유리 금형 또는 플라스틱 금형 (두께 500 ㎛)에 붓고, 실온에서 100％ 습도로 16시간 동안 방치하였다. 그런 다음, 금형을 37 ℃에서 5시간 동안 후경화시키기 위해 인큐베이터로 옮겼다.
생성된 하이드로겔은 강성이고 광학적으로 투명한 반면, 동일한 조건에서 제조된 니뽄(Nippon) 콜라겐/MPC 콜라겐은 비투과성이었다. RHC 제III형의 장점은 폭넓은 범위의 pH 및 가교제 함량에서 투명한 채 남아있을 수 있다는 것이다.
실시예 VIII - 콜라겐 또는 콜라겐 하이드로겔
실시예 III에서와 같이, 상기 기재된 안물질은, 이전에 공지된 물질에 비해 인성 및 탄성이 향상된 본질적으로 강성인 이식성 물질이다. 비록 이들은 콜라겐을 기재로 하지만, 현저히 증가된 인장 강도를 부여하면서, 인간 각막 내에서 발견되는 천연 세포외 매트릭스 분자 (ECM)를 모방하는 생모방성 분자, 예컨대 키토산을 혼입한다. 또한, 콜라겐 및 콜라겐/키토산 스캐폴드의 안정화를 위해 가교 시스템을 개발하고 사용하여 물질의 탄성 및 인성을 더 향상시켰다. 이렇게 향상된 물질의 기계적 성질, 광학적 성질 및 생물학적 성질을 시험하였다. 그 결과, 스캐폴드는 강인하고, 탄성이고, 인간 안구 은행 각막에 비해 광학적 투명성이 우수하며, 시험관 내에서 각막 세포 및 신경을 재생할 수 있다.
물질 및 일반적 방법
기재 물질은, 10％ (w/v)의 아텔로-콜라겐 제I형 및 3％의 (w/v) 키토산의 혼합물을 포함하였다. 니뽄 햄(Ham) (일본)으로부터 수득한 동결 건조된 돼지 콜라겐을 차가운 물 (무균 dd H2O)에 용해시키고, 4 ℃에서 교반하여 10％ (w/v)의 농도를 얻었다. 또한, 0.2 N의 염산 (HCl) 중에 키토산 분말 (플루카(Fluka)로부터 수득함, MW 400000)을 용해시키고 4 ℃에서 교반함으로써 3％ (w/v)의 키토산 용액을 제조하였다. 그런 다음, 가교 전에 소정의 비율의 두 용액을 시린지 시스템에서 혼합하여 균질 블렌드를 제조하였다. 다양한 가교제, 예컨대 PEG-디부틸알데히드 (넥타 사(Nektar Inc), MW 3400 Da) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)을, 가교제 및 생모방성 성분의 유형 및 농도에 기초하는 구별가능한 성질을 갖는 상호침입 망상구조를 개발하는데 사용하였다 (표 8 참조).
실시예 IX - EDC/NHS 및 PEG-디부틸알데히드에 의해 가교된 콜라겐 하이드로겔(HPN-3)의 제조
루어(Luer) 팁 유리 시린지 중의 0.6 mL의 콜라겐 용액(10％)을 테프젤(Tefzel) 티(Tee)-부분을 사용하여 0.4 ml의 MES 완충액과 혼합하였다. 약 0 ℃ 내지 4 ℃에서 기포 포착 없이 0.35 ml의 MES 완충액 중의 PEG-디부틸알데히드 및 EDC/NHS [PEG:NH2의 몰당량 비율 0.36:1, EDC:NH2의 몰당량 비율 5.4:1 및 EDC:NHS의 몰당량 비율 1:1]를 포함하는 가교 시스템을 사용하여 콜라겐 블렌드를 가교시켰다. MES 완충액을 사용한 가교 반응 동안에 pH 5를 유지하였다. 티(Tee)를 통한 제 1 시린지 및 제 2 시린지간의 반복적 펌핑으로 조성물을 완전 혼합하였다.
각각의 본질적으로 균질한 용액 분취량을 500 미크론의 이식물 금형으로 즉시 분배하고, 먼저 실온에서 16시간 동안 경화시킨 다음, 37 ℃에서 16시간 동안 경화시켜(두 온도 모두 습도 100％ 환경임) HPN-3를 형성하였다. 각각의 최종 이식물 샘플을, 포스페이트 완충 용액 (PBS)에 2시간 동안 침지 후 금형으로부터 조심스럽게 분리하였다. 마지막으로, 가교된 이식물 하이드로겔을 20 ℃에서 PBS 용액 (PBS 중의 0.5％, 1％의 클로로포름을 함유함)에 침지시켜 임의의 반응성 잔사를 종결시키고 반응 부산물을 추출해냈다.
실시예 X - EDC/NHS 및 PEG-디부틸알데히드로 가교된 콜라겐-키토산 하이드로겔 (HPN-4)의 제조
0.036 mL의 키토산 용액 (3％)을 루어 팁 유리 시린지 내의 0.6 mL의 콜라겐 용액 (15％) [키토산:콜라겐 몰비: 0.01:1]에 첨가하였다. 그런 다음, 조성물을 테프젤 티-부분을 사용하여 0.4 ml의 MES 완충액과 혼합하였다. 콜라겐/키토산 블렌드를 약 0 ℃ 내지 4 ℃에서 기포 포착 없이, 0.35 ml의 MES 완충액 중의 PEG-디부틸알데히드 및 EDC/NHS [PEG:NH2 몰당량 비율 0.3:1, EDC:NH2 몰당량 비율 4.5:1, 및 EDC:NHS 몰당량 비율 1:1]를 포함하는 하이브리드 가교 시스템을 사용하여 가교시켰다. MES 완충액을 사용한 가교 반응 동안에 pH 5를 유지하였다. 티를 통한 제 1 시린지 및 제 2 시린지간의 반복적 펌핑으로 조성물을 완전 혼합하였다.
각각의 본질적으로 균질한 용액 분취량을 500 미크론의 이식물 금형으로 즉시 분배하고, 먼저 실온에서 16시간 동안 경화시킨 다음, 37 ℃에서 16시간 동안 경화시켜(두 온도 모두 습도 100％ 환경임) HPN-3를 형성하였다. 각각의 최종 이식물 샘플을, 포스페이트 완충 용액 (PBS)에 2시간 동안 침지 후 금형으로부터 조심스럽게 분리하였다. 마지막으로, 가교된 이식물 하이드로겔을 20 ℃에서 PBS 용액 (PBS 중의 0.5％, 1％의 클로로포름을 함유함)에 침지시켜 임의의 반응성 잔사를 종결시키고 반응 부산물을 추출해냈다.
실시예 XI: EDC/NHS 및 PEG-디부틸알데히드에 의해 가교된 콜라겐 하이드로겔 (HPN-5)의 제조
루어 팁 유리 시린지 중의 0.6 mL의 콜라겐 용액(15％)을 테프젤 티-부분을 사용하여 0.4 ml의 MES 완충액과 혼합하였다. 약 0 ℃ 내지 4 ℃에서 기포 포착 없이 0.35 ml의 MES 완충액 중의 PEG-디부틸알데히드 및 EDC/NHS [PEG:NH2의 몰당량 비율 0.36:1, EDC:NH2의 몰당량 비율 5.4:1 및 EDC:NHS의 몰당량 비율 1:1]를 포함하는 가교 시스템을 사용하여 콜라겐 블렌드를 가교시켰다. MES 완충액을 사용한 가교 반응 동안에 pH 5를 유지하였다. 티를 통한 제 1 시린지 및 제 2 시린지간의 반복적 펌핑으로 조성물을 완전 혼합하였다.
각각의 본질적으로 균질한 용액 분취량을 500 미크론의 이식물 금형으로 즉시 분배하고, 먼저 실온에서 16시간 동안 경화시킨 다음, 37 ℃에서 16시간 동안 경화시켜(두 온도 모두 습도 100％ 환경임) HPN-5를 형성하였다. 각각의 최종 이식물 샘플을, 포스페이트 완충 용액 (PBS)에 2시간 동안 침지 후 금형으로부터 조심스럽게 분리하였다. 마지막으로, 가교된 이식물 하이드로겔을 20 ℃에서 PBS 용액 (PBS 중 0.5％, 1％의 클로로포름을 함유함)에 침지시켜 임의의 반응성 잔사를 종결시키고 반응 부산물을 추출해냈다.
실시예 XII: PEG-디부틸알데히드에 의해 가교된 콜라겐 하이드로겔의 제조 (HPN-6)
루어 팁 유리 시린지 중의 0.6 mL의 콜라겐 용액(20％)을 테프젤 티-부분을 사용하여 0.4 ml의 MES 완충액과 혼합하였다. 약 0 ℃ 내지 4 ℃에서 기포 포착 없이 0.35 ml의 MES 완충액 중의 PEG-디부틸알데히드 [PEG:NH2의 몰당량 비율 1:1]를 사용하여 콜라겐 블렌드를 가교시켰다. MES 완충액을 사용한 가교 반응 동안에 pH 5를 유지하였다. 티를 통한 제 1 시린지 및 제 2 시린지간의 반복적 펌핑으로 조성물을 완전 혼합하였다.
각각의 본질적으로 균질한 용액 분취량을 500 미크론의 이식물 금형으로 즉시 분배하고, 먼저 실온에서 16시간 동안 경화시킨 다음, 37 ℃에서 16시간 동안 경화시켜(두 온도 모두 습도 100％ 환경임) HPN-6을 형성하였다. 각각의 최종 이식물 샘플을, 포스페이트 완충 용액 (PBS)에 2시간 동안 침지 후 금형으로부터 조심스럽게 분리하였다. 마지막으로, 가교된 이식물 하이드로겔을 20 ℃에서 PBS 용액 (PBS 중 0.5％, 1％의 클로로포름을 함유함)에 침지시켜 임의의 반응성 잔사를 종결시키고 반응 부산물을 추출해냈다.
실시예 XIII: PEG-디부틸알데히드에 의해 가교된 콜라겐 하이드로겔(HPN-7)의 제조
전형적으로, 루어 팁 유리 시린지 중의 0.6 mL의 콜라겐 용액(20％)을 테프젤 티-부분을 사용하여 0.4 ml의 MES 완충액과 혼합하였다. 약 0 ℃ 내지 4 ℃에서 기포 포착 없이 0.35 ml의 MES 완충액 중의 PEG-디부틸알데히드 [PEG:NH2의 몰당량 비율 2:1]를 사용하여 콜라겐 블렌드를 가교시켰다. MES 완충액을 사용한 가교 반응 동안에 pH 5를 유지하였다. 티를 통한 제 1 시린지 및 제 2 시린지간의 반복적 펌핑으로 조성물을 완전 혼합하였다.
각각의 본질적으로 균질한 용액 분취량을 500 미크론의 이식물 금형으로 즉시 분배하고, 먼저 실온에서 16시간 동안 경화시킨 다음, 37 ℃에서 16시간 동안 경화시켜(두 온도 모두 습도 100％ 환경임) HPN-7을 형성하였다. 각각의 최종 이식물 샘플을, 포스페이트 완충 용액 (PBS)에 2시간 동안 침지 후 금형으로부터 조심스럽게 분리하였다. 마지막으로, 가교된 이식물 하이드로겔을 20 ℃에서 PBS 용액 (PBS 중 0.5％, 1％의 클로로포름을 함유함)에 침지시켜 임의의 반응성 잔사를 종결시키고 반응 부산물을 추출해냈다.
HPN 물질 및 그의 대조군의 조성 및 성능
제형
코드		 콜라겐 공급사,
초기
농도		 XL/콜라겐
당량비		 키토산: 콜라겐
몰 당량비		 최대
응력
(kPa)		 최대
응력
(％)		 인성
(kPa)		 시험관내 에피
성장		 광 투과율(％)
(백색광)
HPN-3 니뽄 햄,
10％		 EDC:NHS:
PEG:NH2
5.4:5.4:
0.4:1		 0 276±
25		 40±
6.1		 35±
6		 우수 98±
0.9
HPN-4 니뽄 햄,
15％		 EDC:NHS:
PEG:NH2
4.5:4.5:
0.3:1		 0.01:1 69±
12		 105±
9		 30±
2		 중간 내지 우수 90.4±
0.5
HPN-5 니뽄 햄,
15％		 EDC:NHS:
PEG:NH2
5.4:5.4:
0.4:1		 0 216±
45		 71.5±
6.7		 65±
7		 우수 51.4±
1.9
HPN-6 니뽄 햄,
20％		 PEG:NH2
1:1		 0 - - - 분해성 97.5±
1.0
HPN-7 니뽄 햄,
20％		 PEG:NH2
2:1		 0 - - - 분해성 98.6±
0.4
대조군-1 니뽄 햄,
10％		 EDC:NHS:NH2
3:3:1		 0 72±
9		 52±
2.8		 13.9±
2		 탁월 99±
0.2
대조군-2 니뽄 햄,
10％		 EDC:NHS:NH2
6:6:1		 0 153±
23		 27±
2.7		 13.6±
3		 탁월 99±
0.5
실시예 XIV : 재조합 인간 제I형 콜라겐 및 EDC / NHS 로부터 제조된 콜라겐 매트릭스
재조합 인간 콜라겐 제I형 용액 (12.7％ w/w)의 분취량을 기포 없는 시린지 혼합 시스템에 장입하였다. 계산된 부피의 EDC 및 NHS (둘 다 10％의 w/v에서, EDC:콜라겐-NH2 비율=0.4:1; EDC:NHS 비율=1:1)을 제 2 시린지로부터 격막을 통해 첨가하고, 0 ℃에서 다시 완전히 혼합하였다. 최종 용액을 유리판 상에 즉시 부어 평필름을 형성하였다. 평필름을 100％ 습도에서 경화시켰다 (21 ℃에서 24시간 동안 경화시킨 다음 37 ℃에서 24시간 동안 경화시킴). 필름을 새로운 PBS로 3회 세척한 다음 1％ 클로로포름을 함유하는 PBS에 저장하여 무균성을 유지하였다. 그 밖의 비율의 EDC/Coll-NH2 겔을 동일한 방식으로 제조하였다.
Figure 112008025768583-pct00007
실시예 XV: 재조합 인간 제III형 콜라겐 및 EDC/NHS로부터 제조된 콜라겐 매트릭스
재조합 인간 콜라겐 제III형 용액의 분취액 (12.7％ w/w)을 공기 기포가 없는 시린지 혼합계에 로딩하였다. EDC의 부피를 계산하고, NHS (모두 10％ wt/vol에서, EDC:콜라겐-NH2 비 = 0.4:1; EDC:NHS 비 = 1:1)를 제2 시린지로부터 격막을 통해 첨가하고, 0℃에서 다시 완전히 혼합하였다. 최종 용액을 바로 유리 플레이트 상에 분주하여 편평한 막을 형성하였다. 편평한 막을 100％ 습도에서 (21℃에서 24시간, 이후에 37℃에서 24시간 동안) 경화시켰다. 상기 막을 새로운 PBS로 3회 세척한 후에, 1％ 클로로포름을 함유하는 PBS 중에 저장하여 무균 상태를 유지하였다. EDC/Coll-NH2의 여타 비를 갖는 겔을 동일한 방식으로 제조하였다.
Figure 112008025768583-pct00008
실시예 XVI: 재조합 인간 제I형 및 제III형 2중 콜라겐 및 EDC/NHS로부터 제조된 각막 매트릭스
재조합 인간 콜라겐 제I형 용액의 분취액 (12.7％ w/w)을 공기 기포가 없는 시린지 혼합계에 로딩하고, 칭량하였다. 동량의 재조합 인간 콜라겐 제III형 용액의 분취액 (12.7％ w/w)을 동일한 시린지 혼합계에 로딩하여, 시린지 혼합계 중 콜라겐 제I형 및 제III형 용액의 50/50 wt/wt％ 용액을 얻었다. EDC의 부피를 계산하고, NHS (모두 10％ (w/v)에서, EDC:NH2 비 = 0.4:1; EDC:NHS 비 = 1:1)를 제2 시린지로부터 격막을 통해 첨가하고, 0℃에서 다시 완전히 혼합하였다. 최종 용액을 바로 유리 플레이트 상에 분주하여 편평한 막을 형성하였다. 편평한 막을 100％ 습도에서 (21℃에서 24시간, 이후에 37℃에서 24시간 동안) 경화시켰다. 상기 막을 새로운 PBS로 3회 세척한 후에, 1％ 클로로포름을 함유하는 PBS 중에 저장하여 무균 상태를 유지하였다. 최종 겔의 수분 함량은 93.3％이었다.
Figure 112008025768583-pct00009
Figure 112008025768583-pct00010
Figure 112008025768583-pct00011
실시예 XVII: 콜라겐-합성 상호침투 중합체 망상구조
재료
니폰 (Nippon) 콜라겐 (돼지 피부); 0.625 M 모르폴리노에탄술폰산 [MES, 아알리자린 (Aalizarin) 레드 S pH 지시약을 함유함 (6.5 mg/100 ml 물)]; 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 HCl (EDC), N-히드록시-숙신이미드(NHS), NaOH 용액 (2 N); PEG-디아실레이트(Mw 575); 및 암모늄 퍼술페이트 (APS) 및 N,N,N',N'-테트라메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)을 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다.
N,N-디메틸아크릴아미드 (99％)를 시그마-알드리치로부터 구입하였다. 시그마-알드리치로부터 구입한 억제제 제거제를 사용하여 억제제를 제거하였다.
Coll-DMA IPN 하이드로겔의 제조.
첫째로, 0.3 ml의 13.7 wt％ 니폰 콜라겐 용액 및 0.3 ml의 MES (0.625 M)를 얼음-물 조 중의 T자형 플라스틱으로 연결된 두 시린지 중에서 혼합하였다. 둘째로, 14.2 ml의 DMA (콜라겐 대 DMA의 비, 3/1 w/w)를 50 ㎕ 마이크로시린지를 통해 상기 혼합물에 주사하였다. 셋째로, DMA에 대해 1:2 중량비의 6.14 ㎕의 PEG-디아실레이트 (Mn= 575)를 100 ㎕ 마이크로시린지를 통해 주사하였다. 달리 나타내지 않는다면, PEG-디아실레이트 대 DMA의 비는 1:2로 고정한다. 이후에, 상기 용액을 완전히 혼합하였다. 넷째로, DMA에 대해 1％ APS 및 1％ TEMED 용액 (MES 25 ㎕ 중)을 100 ㎕ 마이크로시린지를 통해 주사한 후에, EDC:NHS:Coll-NH2 = 3:3:1의 몰 비로 EDC/NHS 용액 (MES 중) 57 ㎕를 주사하였다. EDC 대 콜라겐의 비는 또한 상기 시리즈에 대해 일정하게 유지한다. 균질한 혼합물을 유리 성형물에 캐스팅하고, 실온에서 16시간 동안 100％ 습도로 방치하였다. 이후에, 성형물을 37℃에서 5시간 동안 경화 후 단계를 위해 인큐베이터로 옮겼다. 콜라겐 대 DMA의 비가 1:1, 2:1 및 4:1인 Coll-DMA IPN 하이드로겔을 동일한 방법으로 제조하였다.
하이드로겔의 특성
도 12, 도 13 및 도 14는 DMA:콜라겐 = 1:1, 1:2, 1:3 및 1:4 (w/w)로부터의 모든 겔의 인장강도, 변형률 및 모듈러스 결과치를 보여준다.
도 15는 콜라겐-DMA 하이드로겔의 백색광 투과도 결과치를 보여준다. 1:1 겔을 제외한 모든 비에 대해, 백색광 투과도는 90％가 넘고, 인간 각막과 비교하여 유사하거나 우수하다.
콜라겐-DMA 하이드로겔은 매우 생체적합성이고, 상피 과다 성장을 보조한다 (도 16 참조). 상피 세포는 3일 동안 배양하여 전면 성장 상태가 되었다.
실시예 XVIII: 생활성제를 함유하는 안과적 장치.
생활성제, 예컨대 항박테리아제, 항바이러스제, 또는 성장 인자, 예컨대 신경성장 인자를 포함하는 하이드로겔 물질은, 예를 들어 각막 이식에 유용하거나, 약물 전달 또는 상처 치유를 위한 치료 렌즈로서 유용할 수 있는 진보된 장치를 구성한다. IPN 하이드로겔에 포함되는 항박테리아 펩티드의 예로는
펩티드 #1:
Figure 112008025768583-pct00012
펩티드 #2:
Figure 112008025768583-pct00013
가 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 펩티드들은 지안가스페로 (Giangaspero) 등에 의해 보고된 염기성 펩티드 서열을 함유한다 (문헌 [Giangaspero, A., Sandri, L., and Tossi, A., Amphipathic alpha helical antimicrobial peptides. A systematic study of the effects of structural and physical properties on biological activity. Eur. J. Biochem. 268, 5589-5600, 2001]). 별도로, 또는 이에 더하여, 디펜신 (defensin)이 각막 매트릭스에 포함될 수 있다.
각막 매트릭스에 생활성제 도입 방법:
하기 방법들이 사용될 수 있다:
1. 흡수 및 방출
IPN 하이드로겔 물질을 생활성제-포화 용액에 첨가하여 생활성제가 각막 매트릭스에 스며들게 한다. 일단 평형상태가 달성되면, 각막 매트릭스는 안구용 안대 렌즈 또는 이식물로 사용될 수 있다.
2. 매트릭스 내/상의 화학적 이식
이 절차는 상기 절차 1과 유사하나, 하나의 (또는 둘 이상의) 화학물질이 IPN 하이드로겔 물질 내/상의 펩티드의 화학적 결합을 용이하게 하는데 사용된다. 생활성 펩티드-로딩된 각막 매트릭스는 약물 전달을 위한 이식물 및 안대 렌즈 모두에 유익하다.
3. 생활성제를 나노- 또는 마이크로구체로의 도입, 및 나노- 또는 마이크로구체를 매트릭스로의 도입.
이 절차는 생활성제의 연장된 방출을 수반하면서 IPN 하이드로겔 매트릭스를 생성한다. 생성된 매트릭스는 약물 전달을 위한 이식물 및 안대 렌즈 모두에 유익하다. 도 17은 생활성제를 캡슐화하기 위해 제조된 알기네이트 마이크로구체의 주사 전자 현미경 (SEM) 화상이다. 생활성제를 로딩한 후에, 상기 마이크로구체들을 연장된 약물 방출을 위해 매트릭스에 도입한다.
알기네이트 마이크로구체 알기네이트 구체의 제조 절차는 문헌 [C.C. Ribeiro, C.C. Barrias, M.A. Barbosa Calcium phosphate-alginate microspheres as enzyme delivery matrices, Biomaterials 25 4363?4373, 2004]에 따라 제조한다.
실시예 XIX: 콜라겐-MPC IPN 하이드로겔의 시험관내 생분해
절차:
50 내지 80 mg의 수화된 하이드로겔을 5 ml의 0.1 M PBS (pH 7.4)를 함유하는 바이알에 넣은 후, 60 ㎕의 1 mg/mL 콜라게나제 (클로스트리듐 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum), EC 3.4.24.3, 시그마케미컬 코. (SigmaChemical Co.))를 첨가하였다. 이후에, 바이알을 37℃에서 상이한 시간 간격으로 오븐에서 인큐베이션하고, 겔을 표면의 물을 닦아내면서 칭량을 위해 꺼냈다. 시간 경과에 따른 하이드로겔의 잔여 질량을 초기 팽창된 중량을 기준하여 추적하였다. 3개의 시편을 각 하이드로겔 샘플에 대해 시험하였다. 하이드로겔의 잔여 질량 백분율을 하기 식으로 계산하였다:
잔여 질량 ％ = Wt/Wo
여기서, Wo는 하이드로겔의 초기 중량이고, Wt는 각 시점에서의 하이드로겔 중량이다.
결과 및 토의
시간 경과에 따른 콜라겐 및 IPN 하이드로겔의 시험관내 생분해
도 18에 나타낸 바와 같이, EDC/NHS와 가교된 돼지 콜라겐 하이드로겔은 매우 신속하게 분해되었다. 3시간 후에, 완전히 분해되었다. MPC 및 PEG의 도입은 분해 속도를 낮추었고, IPN-4-1 및 IPN-3-1은 각각 10시간 및 15시간 후에 완전히 분해되었다. 하이드로겔, 즉 IPN-2-1 및 IPN-1-1에 대해 MPC 함량을 더 증가시킴에 따라, 분해가 유의하게 억제되었다. 48시간 내에, IPN-2-1의 잔여 질량이 약 79％ 잔여하는데 반해, IPN-1-1은 단지 6％ 질량만이 손실되었다. 48시간 후에, 그의 잔여 질량을 7일 동안 추적하였다. IPN-2-1 및 IPN-1-1 하이드로겔 모두가 그들의 잔여 질량이 일정하게 잔여한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, IPN 망상구조들은 콜라겐 하이드로겔의 생안정성을 증진시키는데 효과적이다.
실시예 XX: 제III형 콜라겐-MPC IPN 하이드로겔의 특성 및 시험관내 생분해
제III형 재조합 인간 콜라겐 (rhc)-MPC IPN 하이드로겔의 제조
첫째로, 0.3 ml의 13.7 wt％ rhc III 용액 및 0.1 ml의 MES (0.625 M)를 얼음-물 조 중의 T자형 플라스틱으로 연결된 두 시린지 중에서 혼합하였다. 둘째로, 250 ㎕의 MPC 용액 (MES 중, MPC/콜라겐 = 2/1, w/w)을 500 ml 마이크로시린지를 통해 상기 혼합물에 주사하였다. 셋째로, MPC에 대해 1:2 중량비의 9.3 ml의 PEG-디아실레이트를 100 ml 마이크로시린지를 통해 주사하였다. 이후에, 상기 용액을 완전히 혼합하였다. 넷째로, 25 ml의 2％ APS 및 TEMED 용액 (MES 중)을 100 ml 마이크로시린지를 통해 주사한 후에, 콜라겐 NH2에 대해 1:1:1 몰 비의 19 ml의 EDC/NHS 용액 (MES 중)을 주사하였다. 상기 균질한 혼합물을 유리 성형물에 캐스팅하고, N2 하에 실온에서 24시간 동안 100％ 습도에서 방치하였다. 이후에, 성형물을 37℃에서 24시간 동안 경화 후 단계를 위해 인큐베이터로 옮겼다. 생성물을 Coll-III-MPC-IPN2-1-1로 코딩하였다.
EDC/NHS/Coll-NH2 = 3/3/1을 제외하고 동일한 조건으로 다른 rhc III/MPC IPN을 제조하였다. 코드 Coll-III-MPC-IPN4-1-3, Coll-III-MPC-IPN3-1-3, Coll-III-MPC-IPN2-1-3, Coll-III-MPC-IPN1-1-3은 각각 rhc III/MPC = 4/1, 3/1, 2/1 및 1/1 (w/w)로부터의 IPN을 나타낸다.
기계적 및 광학적 특성
표 14 및 15는 제III형 콜라겐-MPC IPN 하이드로겔의 기계적 및 광학적 특성을 보여준다.
Figure 112008025768583-pct00014
Figure 112008025768583-pct00015
시험관내 생분해:
콜라겐 제III형-MPC IPN 하이드로겔에 대한 시험관내 생분해 절차는 돼지 콜라겐-MPC IPN 하이드로겔에 대한 것과 동일하다. 단지 Coll-III-MPC-IPN2-1-1 만을 시험관내 생분해에 대해 시험하였다. 상기 겔은 20일 이상 동안 콜라게나제 용액 (12 ㎍/mL) 중에서 안정하였다.
실시예 XXI: 알기네이트 이식된 거대분자.
이 실시예에서, 본 발명자들은 콜라겐-기재 인공 각막 매트릭스의 후부 표면에 대해 알기네이트 거대분자들을 공유 결합적으로 이식하여 내피 세포 부착 및 증식을 막는, 2단계 플라즈마-보조 표면 개질 기술을 개발하였다.
냉동 건조된 돼지 제I형 콜라겐 분말을 니폰 햄 (Nippon Ham, Japan)으로부터 구입하였고, 즉시 찬 물 (멸균 dd H2O) 중에 용해시켰고, 4℃에서 교반하여 10％ (w/w) 농도를 얻었다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 시그마-알드리치로부터 구입하였다. 3％ 키토산 용액을 키토산 분말 (MW 40,000 Da, 플루카 (Fluka)로부터 구입함)을 0.2 N 염산 (HCl) 중에 용해시켜 제조하였고, 4℃에서 교반하였다.
10％ 콜라겐 용액, 3％ (w/w) 키토산 용액 및 EDC/NHS 가교제를 미리 정해진 비로 시린지계 중에서 함께 혼합하여 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 균질한 블렌드를 만들었다.
<표 1>
Figure 112008025768583-pct00016
내피 세포 성장 시험으로부터 얻어진 결과들은 알기네이트 표면 이식이 각막 하이드로겔 후부 표면으로의 내피 세포 이동 및 접착을 방지하는 것을 보여준다. 도 20은 기질 물질, 플라즈마 전력 및 알기네이트 용액 농도의 함수로서 시딩 후 5일차에 대한 각막 물질의 후부 표면에 부착된 내피 세포들의 수를 나타낸다. 대조군 표면과 비교하였을 때, 모든 알기네이트-이식된 표면에 대해 내피 세포 성장의 전반적인 억제가 관측되었다. 개질되지 않은 대조군 표면들은 모든 도 및 표에서 RF 전력 및 알기네이트 농도가 0인 것을 나타낸다.
군 평균들의 편차를 신뢰 구간과 플로팅하여 나타낸 구간 플롯인 도 20에 도시한 바와 같이, 40 W의 플라즈마 전력 및 5％의 알기네이트 농도에서 처리된 표면들이 내피 세포 성장을 약 89％까지 막는 것으로 보이는 반면, 100 W의 플라즈마 전력 및 5％의 알기네이트 농도에서 처리된 표면들은 내피 세포 성장을 99％까지 유효하게 억제하는 것으로 보인다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원들은 본 발명에 관한 당업자의 기술 수준을 나타내고, 마치 각각의 개별 문헌, 특허 또는 특허 출원들이 구체적이고 개별적으로 참고문헌으로 포함되도록 나타내는 것과 동일한 정도로 본원에 참고문헌으로 포함된다.
이에 따라 기재된 본 발명이 수많은 방식으로 변화될 수 있음은 명백할 것이다. 그러한 변화는 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나는 것으로 간주되지 않으며, 당업자에게 명백할 그러한 모든 변형들은 하기 특허청구범위의 범주 내에 포함되도록 의도한다.

Claims (24)

  1. 둘 이상의 중합체 망상구조로 이루어진 상호침투성(interpenetrating) 망상구조를 포함하며, 상기 상호침투성 망상구조는
    미리 형성된 생중합체와 혼합된 후 중합되어, 미리 형성된 생중합체와 얽힌 제2 중합체를 형성하는 단량체 (상기 제2 중합체는 가교결합되어 제1 망상구조를 형성하고, 이어서 상기 미리 형성된 생중합체가 가교결합되어 제1 망상구조와 얽힌 제2 망상구조를 형성함)를 포함하는,
    각막 온레이, 각막 인레이 또는 전체-두께 각막 이식물인, 이식가능하고, 광학적으로 투명하며, 균일한 굴절률을 갖는 안과적 장치.
  2. 제1항에 있어서, 미리 형성된 생중합체가 콜라겐, 변성된 콜라겐, 피브린-피브리노겐, 엘라스틴, 당단백질, 다당류, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸 또는 산화된 다당류, 또는 이들의 조합물인 장치.
  3. 제2항에 있어서, 콜라겐이 제I형 콜라겐, 제II형 콜라겐, 제III형 콜라겐, 제IV형 콜라겐, 제V형 콜라겐, 제VI형 콜라겐 또는 재조합 콜라겐인 장치.
  4. 제2항에 있어서, 다당류가 알기네이트, 키토산, N-카르복시메틸 키토산, O-카르복시메틸 키토산, N,O-카르복시메틸 키토산, 히알루론산 또는 콘드로이틴 술페이트인 장치.
  5. 제2항에 있어서, 산화된 다당류가 산화된 콘드로이틴 술페이트, 산화된 알기네이트 또는 산화된 히알루론산인 장치.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 제2 중합체가 합성 단량체로부터 형성되며, 상기 합성 단량체가 알킬 아크릴아미드, 수용성 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 아크릴산 및 그의 유도체, 알킬 아실레이트, 메틸아크릴산 및 그의 유도체, 알킬 메타크릴레이트, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 비닐 피롤리돈 또는 당단량체(glycomonomer)인 장치.
  8. 제1항에 있어서, 무 세포독성, 세포 및/또는 신경 성장 촉진능, 취급, 이식, 봉합 또는 설치 후 마모 및 인열에 견디는 능력 중 하나 이상을 특징으로 하는 장치.
  9. 제1항에 있어서, 생활성제 또는 약물을 추가로 포함하는 장치.
  10. 제9항에 있어서, 장치가 각막 온레이이고, 생활성제 또는 약물이 세포의 생존, 성장 및 분화를 촉진하거나 또는 향상시키는 장치.
  11. 제1항에 있어서, 안과적 약물 전달에 사용하기 위한 장치.
  12. 5의 산성 pH에서 중합체를 1종 이상의 가교제와 가교결합시키는 단계, 및
    장치를 성형하는 단계
    를 포함하는, 제1항에 따른 장치의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 미리 형성된 생중합체 및 제2 중합체가 가교결합되어 망상구조를 형성하는 동안 완충액을 사용하여 pH가 5의 pH에서 갑자기 변하는 것을 방지하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 완충액이 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 중합체를 원하는 장치 형상의 주형에 넣어 경화시킨 후에 가교결합 단계가 완료되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 포유동물에 사용되는 장치.
  17. 제16항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 장치.
  18. 제16항에 있어서, 포유동물에게 전달하기 위한 생활성제 또는 약물을 포함하는 장치.
  19. 제18항에 있어서, 상기 생활성제 또는 약물이 중합체 망상구조 내에 분산된 것인 장치.
  20. 제18항에 있어서, 생활성제 또는 약물이 중합체 망상구조 내에 분산된 나노스피어 또는 마이크로스피어 내에 함유된 것인 장치.
  21. 제19항에 있어서, 생활성제가 성장 인자, 레티노이드, 효소, 세포 부착 인자, 세포외 매트릭스 당단백질, 호르몬, 골생성 인자, 사이토카인, 항체, 항원, 생물학적 활성 단백질, 약제 화합물, 생물학적 활성 단백질로부터 유래된 펩티드, 단편 또는 모티프, 항박테리아제 또는 항바이러스제인 장치.
  22. 제1항에 있어서, 상호침투성 망상구조가 중합체 총량 중 40 중량% 이상의 생중합체를 포함하고, 생리학적 온도에서 그의 형태를 유지하는 장치.
  23. 둘 이상의 중합체 망상구조로 이루어진 상호침투성 망상구조를 포함하며, 상기 상호침투성 망상구조는
    콜라겐 또는 키토산 생중합체와 혼합된 후 중합되어, 콜라겐 또는 키토산 생중합체와 얽힌 제2 중합체를 형성하는 단량체 (상기 제2 중합체는 가교결합되어 제1 망상구조를 형성하고, 이어서 상기 콜라겐 또는 키토산 생중합체가 가교결합되어 제1 망상구조와 얽힌 제2 망상구조를 형성함)를 포함하는,
    각막 온레이, 각막 인레이 또는 전체-두께 각막 이식물인, 이식가능하고, 광학적으로 투명하며, 균일한 굴절률을 갖는 안과적 장치.
  24. 둘 이상의 중합체 망상구조로 이루어진 상호침투성 망상구조를 포함하며, 상기 상호침투성 망상구조는
    2개의 다른 생중합체 (이들 생중합체는 혼합되어 제2 생중합체와 얽힌 제1 생중합체를 생성한 후, 동시에 가교결합되어 제2 망상구조와 얽힌 제1 망상구조를 형성하며, 여기서 제1 망상구조는 제1 생중합체로부터 형성되고, 제2 망상구조는 제2 생중합체로부터 형성됨)를 포함하는,
    각막 온레이, 각막 인레이 또는 전체-두께 각막 이식물인, 이식가능하고, 광학적으로 투명하며, 균일한 굴절률을 갖는 안과적 장치.
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