KR102634091B1 - 생체 외 및 생체 내 조직 전도의 향상을 위한 생체재료를 포함하는 전도성 벤조산계 폴리머 - Google Patents

생체 외 및 생체 내 조직 전도의 향상을 위한 생체재료를 포함하는 전도성 벤조산계 폴리머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심장 임펄스의 전위를 전달할 수 있는 생체적합성 전기 전도성 생체재료에 관한 것이다. 생체재료는 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 포함한다. 전도성 폴리머는 아미노메톡시벤조산(AMBA) 폴리머를 포함한다. 본 발명은 또한 생체적합성 전기 전도성 생체재료를 사용하는 치료, 용도 및 장치에 관한 것이다.

Description

생체 외 및 생체 내 조직 전도의 향상을 위한 생체재료를 포함하는 전도성 벤조산계 폴리머
관련 출원
본 출원은 2017년 7월 27일자로 출원된 미국 가특허출원번호 제62/537,755호의 우선권의 이익을 주장하는 특허협력조약(PCT) 출원서로, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 발명은 심장 임펄스의 전위를 전달할 수 있는 생체적합성 전기 전도성 생체재료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전기 전도성 생체재료를 사용한 치료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전기전도성 생체재료를 사용하는 장치에 관한 것이다.
방실 차단(atrioventricular block; AVB)와 같은 심장 전기 전도 지연 및 차단은 생명을 위협하는 리듬 교란 및 심부전의 위험을 증가시키는 심각한 임상 질환과 관련이 있다[1]. 표준 치료는 전자 심박조율기에 의존하여 동기성을 인위적으로 복원한다. 그러나 급성심장사의 사망률은 여전히 주요 임상 문제이다.
영구적인 인공 심박조율기는 전도 시스템이 재생되지 않기 때문에 현재 AVB에 대한 치료법이다. 또한 증상성 서맥에 대한 현재 치료법이다. 심박조율기는 환자 생존과 삶의 질에 혁명을 가져왔지만, 리드 및 전원 공급장치의 제한된 수명과 같은 한계는 분명하다[2].
이들의 제한된 수명으로 인해, 환자는 첫 이식 후 소진된 심박조율기를 교체하기 위해 두 번째 수술을 받아야 할 수도 있다[2]. 심박조율기 임계값은 심장 박동조율기의 에너지 소비와 관련된 중요한 매개 변수이며[8, 9] 임계값을 줄일 수 있는 새로운 기법은 심장 박동조율기 에너지 절약에 도움이 된다.
심박조율기의 기능을 향상시키기 위해 많은 기술이 개발되었다. 페이싱 임계값을 줄이기 위해 다공성 전극 팁이 개발되었다[14]. 스테로이드 용출 팁은 염증 반응을 감소시킨 다음 국소 섬유증을 감소시켜 자극 임계값을 낮춘다[15]. 페이싱 임계 값을 줄이기 위해 탄소 팁 전극도 사용되었다. 이러한 개질은 효과적이지만, 배터리 수명은 여전히 제한적이며, 심근 임피던스를 추가로 줄이고 심박조율기 자극의 임계값을 더 낮추기 위한 추가의 기술이 필요하다.
또한, 심박조율기에서 제공하는 활성화 패턴은 생리학적이지 않다. 우심실 페이싱은 적절한 임펄스 전파를 제공하지 않으며, 좌심실 페이싱은 정상적인 심실 수축 순서를 복원하지 못할 수 있다. 따라서 새로운 치료 전략이 필요하다. 지난 10년 동안, 전자 심박조율기의 대안으로 생물-인공 심박조율기를 생산하기 위해 다양한 유전자- 및 세포-기반 접근법이 추구되어 왔다[3]. 유전자 변형은 생체 내 심장에서 자발적인 리드미컬한 전기적 활동을 생성하기 위해 정지성 심근 세포를 심박조율기 세포로 전환시키는데 사용되었다[4-6]. Choi 등은 세포-파종 콜라겐 패치를 제작하였으며, 이는 랫트에서 AVB 유도 후 우심방 및 좌심방 사이에 이식되었다. 광학 맵핑은 제작된 심장의 3분의 1이 전기 AV 전도를 확립했으며, 이식물이 파괴될 때 사라졌음을 보여주었다[7]. 이러한 연구 데이터는 심장에 대한 동시 수축과 조직 공학적 생체재료의 천연 심근과의 전기적 통합은 물론 자극에 대한 적절한 시기에 수축의 활성을 보장하기 위해 새로운 기술이 필요함을 제안한다.
심근 경색은 전 세계적으로 사망률 및 이환율에 기여하는 주요 임상문제이다. 선진 의료 요법은 심장 마비 후 환자의 80%를 초과하여 구한다. 그러나 대부분의 생존자들은 심근 섬유증과 뒤따르는 심근 세포 괴사로 인해 심장 부정맥을 겪는다. 심근의 섬유 조직은 전도성 저항이 우수하다. 따라서, 심근 섬유성 조직과 정상 심근 사이의 불균일한 전도는 미세 재진입 경로를 통한 태아 심박성 부정맥을 초래하여 급성심장사를 초래한다. 약물 요법은 효과가 제한적이다.
전도성 생체재료는 전기를 전송하는 한 종류의 유기 생체재료이다. 이들의 전도성 특성은 전기화학적으로 향상될 수 있다. 전도성 폴리머(예컨대 폴리피롤, 폴리아닐린, 폴리티오펜, 및 폴리3-4-에틸렌디옥시티오펜)의 가역적 산화는 이들의 전도성을 증가시키지만, 산화환원 안정성을 유지할 수 있다. 이러한 전도성 폴리머는 현재 생체 전극, 신경 재생 자극, 제어된 약물 방출 및 인공근육으로 사용하기 위해 평가되고 있다.
지난 수십 년 동안, 피브린, 콜라겐 및 히알루론산을 포함한 다양한 생체재료가 경색 영역을 안정화시키고 MI 후 흉터 희석 및 심실 팽창을 방지 또는 지연시키기 위해 사용되어 왔다[11-13]. 전자 심박조율기의 대안으로 생체 인공 심박조율기를 생산하기 위해 유전자 및 세포 기반 접근법이 추구되어 왔다[3-7]. 그러나 이들 생체재료 중 어느 것도 전기 전도성이 없다.
본 발명은 심근 경색 및 다른 심장 관련 질환을 포함하는 전도성 관련 기형의 심장 질환을 치료할 수 있는 생체적합성 전기 전도성 생체재료에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 포함하는 생체적합성 전도성 생체재료에 관한 것이다. 전도성 폴리머는 아미노메톡시벤조산(AMBA)와 같은 벤조산과 중합될 수 있다. 생체적합성 성분은 다당류, 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 젤라틴을 포함할 수 있다. 생체적합성 전도성 생체재료는 예를 들어, 전도성 하이드로겔, 멤브레인, 3D-패치 또는 스펀지, 시트, 또는 그라프팅용 매쉬에 통합되거나, 이로 제조될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 심장 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 심장에 생체적합성 전도성 생체재료를 도입하는 것을 것을 포함하고, 여기서 생체재료는 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 포함한다. 심장 질환은 심근 경색, 허혈성 심근, 심근 섬유증, 심장 부정맥, 심부전, 방실 차단(AVB) 및/또는 다른 전도 이상을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 개인의 심장 질환을 치료하기 위한 생체적합성 전도성 생체재료의 용도에 관한 것으로, 상기 생체재료는 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 생체 적합성 생체재료 중 하나를 이용하는 심박조율기 장치에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 이러한 상세한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이기 때문에, 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내는 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시의 방식으로 주어진 것임을 이해해야 한다.
본 명세서에 기술된 실시 형태들에 대한 더 나은 이해 및 이들이 어떻게 수행될 수 있는지를 보다 명확하게 나타내기 위해, 이제 적어도 하나의 예시적인 실시 형태를 나타내는 첨부 도면을 참조하여 설명할 것이다:
도 1은 암모늄퍼설페이트(APS)를 사용한 젤라틴 및 3-아미노-4-메톡시벤조산 (3-4-AMBA) 단량체의 중합에 이어 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)와의 가교반응으로 3-4-AMBA-젤라틴 하이드로겔을 형성하는 것을 나타내는 개략도를 도시한다.
도 2는 젤라틴 및 AMBA-젤라틴 또는 AMBA-젤라틴 스펀지의 전도도 측정을 나타낸다. AMBA-젤라틴 또는 젤라틴을 1.5cm * 1.5cm 접시에 넣어 전도성을 테스트하였다. (A). 생체재료 저항(R)을 측정하는데 사용되는 장치의 개략도. 각 전극 사이의 거리는 1.5cm 이다. 전도도(S/cm으로 측정)는 1/(2πDR)로 계산되며, 여기서 D는 전극 사이의 거리 (mm), R = V/I이다. I는 공급 전류(mA)이고, V는 대응 전압(mV)이다. (B). AMBA-젤라틴은 젤라틴 그룹에 비해 전도성이 약 5배 더 높다 (** p <0.01, n = 72). (C) 젤라틴 스펀지 (Gelfoam®) (겔폼, 왼쪽), AMBA와 Gelfoam® 혼합 (AMBA + 겔폼, 중앙) 및 암모늄 퍼설페이트 (APS)로 처리한 후 Gelfoam®에 접합된 AMBA (MBS-겔폼, 오른쪽). (D) 암모늄 퍼설페이트로 처리한 후의 Gelfoam®에 접합된 AMBA는 Gelfoam® 또는 Gelfoam®과 혼합된 AMBA에 비해 전도성이 더 높다.
도 3은 젤라틴과 비교한 폴리머성 3-4-AMBA, 4-아미노-2-메톡시벤조산 (4-2-AMBA), 4-아미노 -3-메톡시벤조산 (4-3-AMBA), 2-아미노-5-메톡시벤조산 (2-5-AMBA) 및 2-아미노-4-메톡시 벤조산 (2-4-AMBA)의 전도도 측정을 나타낸다.
도 4는 생체 내 방실 차단 랫트 AVB 모델을 도시한다. (A) 정상 랫트에서의 대표적인 원 표면 ECG 흔적. 각 심방파 "A"(회색 화살표로 식별)에는 심실파 "V" (검은색 화살표로 식별)가 뒤따랐다. (B) AV 블록 랫트에서의 대표적인 원 표면 ECG 흔적. 심방 파 "A" 및 심실 파 "V"는 ABV 랫트에서 해리되었다. "A" 파 다음에는 "V" 파가 뒤따르지 않았다. (C) 정상 및 AV 블록 랫트의 평균 PP 간격. 그룹간 PP 간격에는 큰 차이가 없었다. (D) 정상 및 AV 블록 랫트의 평균 RR 간격. AV 블록 랫트는 정상 랫트보다 상당히 더 긴 RR 간격을 가졌다(**p<0.01, n=5). P=P 파; R=R 파.
도 5는 3-4-AMBA-젤라틴 주사 부위의 국소화를 나타낸다. AMBA-젤라틴을 AV 결절 영역(원)에 주사하였다.
도 6(A)는 젤라틴 및 3-4-AMBA-젤라틴 주사 랫트의 평균 심방률 (BPM)을 나타낸다. 에탄올 주사 전 또는 후 및 젤라틴 처리에서 그룹간의 유의한 차이는 없었다. 도 6(B)는 젤라틴- 및 AMBA-젤라틴 주사된 랫트의 평균 심실 속도 (BPM)을 나타낸다. 에탄올 주사 전 또는 후에서 그룹간에 유의한 차이는 없었다. 그러나 AMBA-젤라틴 주사는 정상을 폐쇄하기 위해 AVB 심장 박동을 회복시켰고, 심장 박동은 젤라틴만 주사된 랫트의 것보다 현저히 높았다(n = 6/그룹, * P <0.05).
도 7은 전류를 심장 생체전기로 변환 및 전류 자극에 대한 심근 반응성을 증가시키는 3-4-AMBA-젤라틴을 나타낸다. 도 7(a) 체외 실험의 개략도. 도 7(b) (a)ECG에 요약된 분석 사진은 활동 전위를 탐지하는데 사용되었다. 도7(c 및 d) 10 mV 자극 하에서 젤라틴 (c) 및 AMBA-젤라틴 (d) 그룹에서 ECG에 의해 검출된 활동전위. 도 7(e) 도 7(a)에 요약된 분석 사진. 다중 전극 어레이(MEA)를 사용하여 전도성 속도를 검출하였다. 도 7(f 및 g) MEA에 의해 포착된 신호는 300mV 자극 하에서 젤라틴(f) 및 AMBA-젤라틴(g) 그룹에서의 전도를 나타내었다. 도 7(h 및 i) 전압 자극 범위 (n = 6/군)에서 젤라틴에 부착 된 심방 심근과 비교하여 AMBA-젤라틴 상에 부착된 심방 심근이 현저히 높은 활동 전위 진폭 (h) 및 전도 속도 (i)를 나타내었다(n = 6/그룹, * P <0.05).
도 8은 랑겐도르프 분리 랫트 심장 모델에서 3-4-AMBA-젤라틴의 감소된 심장 페이싱 임계 전압을 보여준다. 도 8(a) 랑겐도르프 분리된 랫트 심장 모델의 사진으로, 분리된 심장을 참조선이 그려진 매트 위에 놓고, 음극 전극은 심장 정점 근처의 AMBA-젤라틴 영역에 삽입되었고, 양극 전극은 음극 전극으로부터 약 1.5 cm 떨어진 크렙스-헨셀라이트 완충액 (Krebs-Henseleit buffer; KHB)에 삽입되었다. ECG는 심장 전기 활동을 기록하는데 사용되었다. 도 8(b) AMBA-젤라틴-전극 페이싱은 정상 페이싱 또는 젤라틴-전극 페이싱과 비교하여 임계 전압이 현저히 낮았다 (n = 6/그룹, 전극에 비해 * P <0.05, 젤라틴에 비해 #P <0.05). 도 8(c) 0.5V 정상 전극 페이싱에서 대표적인 ECG 기록이다. 자극과 심장 박동은 서로 독립적이었다. 상세한 ECG 기록을 상자에 나타내었다. 도 8(d 및 e) 0.5V 정상 전극 페이싱 하에서 대표적인 광학 맵핑 결과. 전극은 심장 정점(d) 근처에 삽입되었고, 활성화 맵(e)는 자극이 심장을 페이싱하지 않았고 국소적인 탈분극을 유도했음을 보여주었으며, 활성화 방향은 검은색 화살표로 식별된다. 도 8(f) 0.5v 젤라틴-전극 페이싱 하에 대표적인 ECG 기록, 자극 및 심장 박동은 서로 독립적이었다. 상세한 ECG 기록을 상자에 나타내었다. 도 8(g 및 h) 0.5v 젤라틴 전극 페이싱 하에 대표적인 광학 매핑 결과. 전극은 심장 정점(g) 근처의 젤라틴 주사 영역 내에 삽입되었고, 활성화 맵(h)은 자극이 심장을 페이싱 하지 않았음을 나타내었고, 젤라틴 주사 영역은 높은 노이즈를 나타내었음을 보여주었고, 활성화 방향은 검은색 화살표로 식별되었다. 도 8(i) 0.5v AMBA-젤라틴 전극 페이싱 하에 대표적인 ECG 기록. 자극은 전체 심장 탈분극을 성공적으로 유도하였고, 심장은 페이싱 리듬 하에 놓여졌다. 상세한 ECG 기록을 상자 내에 나타낸다. 도 8(j 및 k) 0.5v AMBA 전극 페이싱 하에 대표적인 광학 매핑 결과. 전극은 심장 정점(j) 근처의 AMBA-젤라틴 주사 영역 내에 삽입되었고, 활성화 맵(k)은 자극이 심장에 성공적으로 페이싱 하였음을 보여주었고, 자극이 주어질 때 심박조율기 포인트(화살표 꼬리로 식별된 영역)는 AMBA-젤라틴 주사 영역으로 변경되었다. 활성화 방향은 검은색 화살표로 식별되었다.
도 9는 랑겐도르프 분리 랫트 심장 모델에서 3-4-AMBA-젤라틴으로 개선된 페이싱 전기생리학적 성능을 나타낸다. 도 9(a-c) 5v 페이싱을 갖는 (a) 정상 전극 (b) 젤라틴 전극 및 (c) AMBA-젤라틴 전극의 대표적인 ECG 기록. Q-T 파의 지속 시간은 수직막대로 식별되고 자극은 검은색 화살표로 식별된다. 도 9(d) AMBA-젤라틴-전극 페이싱은 정상 전극 페이싱 또는 젤라틴-전극 페이싱과 비교하여 상대적으로 Q-T 파 지속 시간이 상당히 감소된 것으로 나타났다(n = 6/그룹, 전극과 비교하여 *P<0.05). 도 9(e) 5v 자극을 갖는 직접 전극, 젤라틴 전극 및 AMBA-젤라틴 전극 하의 광학 맵핑에서의 대표적인 80 % 활동 전위 지속시간 (APD) 맵. 전극, 젤라틴 및 AMBA-젤라틴 주사 영역은 화살표로 식별된다. 도 9(f) 5v 페이싱을 갖는 정상 전극과 젤라틴 전극은 동성 박동(sinus rhythm)에 비해 APD 시간이 상당히 더 높았으나, 반면 AMBA-젤라틴 페이싱은 차이를 나타내지 않았다(n = 6/그룹, 동성과 비교하여 *P<0.05). 도 9(g) 5v 자극을 갖는 정상 전극, 젤라틴 전극 및 AMBA-젤라틴 전극 하의 광학적 맵핑에서의 대표적인 전체 심장 전도속도 맵. 전극, 젤라틴 및 AMBA-젤라틴 주사 영역은 화살표로 식별된다. 도 9h에서, 5v 페이싱을 갖는 정상 전극과 젤라틴 전극은 동성 리듬에 비해 상당히 더 낮은 전도성 속도를 나타내었으나, AMBA-젤라틴 페이싱은 차이를 나타내지 않았다(n = 6/그룹, 동성과 비교하여 *P<0.05).
도 10은 AMBA-젤라틴이 생체 내 심장 페이싱 임계 전압 및 페이싱 전기생리 학적 성능을 감소시켰음을 나타낸다. 도 10(a) AMBA-젤라틴-전극 생체 내 페이싱 모델의 사진, 음극 전극은 심장 정점 근처의 AMBA-젤라틴 영역 내에 삽입되었고, 양극 전극은 흉골의 왼쪽 내에 피하로 삽입되었다. 도 10(b) AMBA- 젤라틴-전극 페이싱은 생체 내 정상 전극 페이싱 또는 젤라틴-전극 페이싱에 비해 임계 전압이 상당히 더 낮다(n = 6/그룹, 전극과 비교하여 *P<0.05, 젤라틴과 비교하여 #P <0.05). 도 10(c-e) 0.5 v 페이싱에서 정상 전극(c) 젤라틴 전극(d) 및 AMBA-젤라틴 전극(e) 하에 대표적인 ECG 기록. 자극 및 심장 리듬은 정상 전극 및 젤라틴-전극 페이싱 하에 상호 독립적인 반면, AMBA-젤라틴-전극 페이싱은 전체 심장 탈분극을 성공적으로 유도하였고 심장은 페이싱 리듬 하에 있었다. 아데노신을 사용하여 심박동을 느리게 하기 위해 방실 차단을 유도하였으며, ECG 기록의 세부 사항을 박스 내에 나타내었다. 도 10(f-h) 5 v 페이싱에서 정상 전극(f) 젤라틴 전극(g) 및 AMBA-젤라틴 전극(h)의 대표적인 ECG 기록. Q-T 파의 지속시간은 수직 막대로 식별되고, 자극은 검은색 화살표로 식별된다. 도 10(i) AMBA-젤라틴 전극 페이싱은 정상 전극 페이싱 및 젤라틴 전극 페이싱에 비해 상대적 Q-T 파 지속시간이 상당히 감소한 반면 젤라틴 전극 페이싱은 정상 전극 페이싱에 비해 증가된 Q-T 파 지속시간이 증가한 것으로 나타내었다(n = 6/그룹, 전극과 비교하여 *P<0.05, 젤라틴과 비교하여 #P<0.05).
도 11은 아데노신 유도 방실 차단 모델을 나타낸다. 대표적인 ECG 기록은 아데노신 주사 동방결절(sinoatrial node) 전기 활동을 억제하였고, 동성 박동이 아데노신 주사 후 수십 초 후에 자발적으로 회복되었음을 나타내었다. 상세한 ECG 기록을 상자 내에 표시하였고, P 파는 화살표로 식별된다.
도 12는 생체 내(in vivo) 실험에 대한 중심 사진을 나타낸다. 생체 내 실험 하에 아데노신은 방실 차단 모델을 구축하는데 사용되었고, AMBA-젤라틴-전극 페이싱은 전체 심장 탈분극을 성공적으로 유도하는 반면, 정상 및 젤라틴-전극 페이싱은 실패하였다.
도 13은 섬유성 흉터(scar) 조직 내에서 AMBA-젤라틴이 국소적 및 전반적인 전계 전위 진폭 모두를 향상시킨 것을 나타낸다. 도 13(A) 랫트에서 심근 경색(myocardial infarction; MI)을 유도하기 위해 좌측 전방 하강 관상 동맥 (Left anterior descending coronary artery; LAD) 결찰을 수행하였다. 젤라틴 또는 AMBA-젤라틴은 일주일 후에 결찰 부위 내에 주사되었다. MI 후 4 주차에 형성된 섬유성 흉터 조직상의 국소적 전계 전위 진폭을 다중 전극 어레이(MEA 36 전극)로 측정하였다. 도 13(B) 36 터미널에서 기록된 대표적인 전기기록도. 도 13(C) 흉터 영역 내로의 AMBA-젤라틴 주사는 MEA에 의해 평가된 국소적 섬유성 흉터 조직 전계 전위 진폭을 향상시켰다. 도 13(D) 전반적인 섬유성 흉터 조직 전계 전위 진폭은 8-리드 카테터로 평가하였다. 도 13(E) 8-리드 카테터를 통해 외곽, 경계 및 흉터 부위에서 기록된 대표적인 전기기록도. 도 13(F) 흉터/외곽 전계 전위 진폭의 비율은 젤라틴 주사 랫트에 비해 AMBA-젤라틴 주사 랫트에서 유의하게 더 높았다.
도 14는 경색증의 랫트 심장에서 AMBA-젤라틴 주사가 자발적 및 유도된 부정맥을 감소시키고, 전도 속도를 개선함을 나타낸다. 도 14(A) 랫트에서 심근 경색(MI)을 유도하기 위해 좌측 전방 하강 관상 동맥 (LAD) 결찰을 수행하였다. 젤라틴 또는 AMBA-젤라틴은 일주일 후에 결찰 부위에 내에 주사되었다. MI 후 4주차에 자발적인 조기 심실 수축 (premature ventricular contractions; PVC, 화살표)을 원격 측정으로 측정하였다. 도 14(B) AMBA-젤라틴 그룹은 젤라틴 그룹에 비해 시간당 자발적 PVC의 비율이 다 낮았다. 도 14(C) 유도 심실 빈맥 (ventricular tachycardia;VT) 및 PVC는 프로그램 전기 자극 (program electrical stimulation; PES)으로 평가하였다. 도 14(D) AMBA-젤라틴 그룹은 젤라틴 그룹에 비해 시간당 유도 PVC 속도가 더 낮았다. (E, F, G) 생체 외(ex vivo) 랑겐도르프-관류 랫트 심장의 전기적 신호 전도 동역학은 MI 후 4주차에 전압 민감성 염료 di-4-ANEPPS로 랫트 심장을 관류하여 측정하였다. 심장의 좌심실 (left ventricle; LV)을 통한 전기적 자극 전파(화살표)의 광학 맵핑이 수행되었다. 시작점은 별표로 표시된다. 도 14(H) 경색되지 않은 정상 심장에 비해 경색 된 심장 내에서 전도 속도가 크게 감소하였다. 그러나 AMBA-젤라틴 처리된 심장은 젤라틴 주사된 심장보다 상당히 더 큰 전도 속도를 나타내었다.
도 15는 AMBA-젤라틴 주사는 MI 후에 심장 기능을 개선시켰음을 나타낸다. 도 15(A) 랫트에서 심근 경색 (MI)을 유도하기 위해 좌측 전방 하강관상동맥 (LAD) 결찰을 수행하였다. 젤라틴 또는 AMBA- 젤라틴)을 일주일 후에 결찰 부위 내에 주사하였다. MI 후 4 주차에 심초음파 검사로 심장 기능을 평가하였다. MI 후 4 주차에 대표적인 M-모드 에코 이미지는 AMBA-젤라틴 그룹이 젤라틴 그룹보다 좌심실 내부 수축기 치수(left ventricular internal systolic dimension;LVIDS)가 더 작다는 것을 입증하였다. 도 15(B) 및 (LVIDS 도 15C) 실험군 사이의 평균 분획 단축을 비교할 때 AMBA-젤라틴 주사는 젤라틴 단독 그룹과 비교하여 현저한 개선을 나타냈다. LVIDd = 좌심실 내부 이완기 치수.
선천성 또는 후천성 전도 차단을 갖는 환자는 전기적 자극의 정상적인 전파 및 동기 심실 수축이 없다. 임상 연구는 심박조율기는 심부전의 진행을 막음을 입증하였다. 그러나 심박조율기의 사용에는 제한이 있고 심근 경색(myocardial infarction , MI) 후 심근 섬유증 또는 선천성 결손 부위에서 심근 조적 결핍은 중대한 비-동기 장애를 나타낸다. 생리적 전파를 회복시키는 생체적합성 전도성 생체재료는 수축을 동기화하고, 심실 기능을 회복시키며, 환자가 보다 활동적인 생활 방식으로 복귀할 수 있게 한다.
본 발명은 심장 임펄스의 전위를 전달할 수 있는 생체적합성 전기전도성 생체재료("생체적합성 생체재료") 및 전기 전도성 생체재료를 사용한 처리에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체적합성 전기 전도성 생체재료를 심장에 도입함으로써 MI와 같은 심장 질환의 치료에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 생체재료 내로 및 생채재료를 가로지르는 전기적 자극의 전파를 모두 허용한다. 전도성 생체재료의 주사는 손상된 심장의 전도성 특성을 변화시키기 위해 생체재료를 심장에 도입하는 효과적인 기술일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 전도성 생체재료는 전기 전도도를 생성 또는 향상시키며 다리 역할을 하여 전기적 지연 또는 차단을 치료한다.
정의
본원에 사용된 용어 "아미노메톡시벤조산" 또는 "AMBA"는 하기 화학식으로 표시되는 화합물, 뿐만 아니라 이의 유도체 및 혼합물 뿐만 아니라 상기 중의 임의의 것의 염을 의미한다:
(I)
AMBA의 예는 3-아미노-4-메톡시벤조산 (3-4-AMBA), 4-아미노-2-메톡시벤조산 (4-2-AMBA), 2-아미노-4-메톡시벤조산 (2-4-AMBA), 4-아미노-3-메톡시벤조산 (4-3-AMBA), 5-아미노-2-메톡시벤조산 (5-2-AMBA), 이의 유도체 및 이의 혼합물을 포함한다. AMBA는 당업계 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있고, 예컨대 시그마알드리치(MO)와 같은 화학 회사로부터 구입할 수 있다.
본원에 사용된 "AMBA 폴리머" 또는 "AMBA 기반 폴리머"는 AMBA를 사용하여 제조된 임의의 폴리머를 의미하고, 임의로 상기 폴리머는 AMBA를 사용하여 완전히 제조된다.
본원에 사용된 용어 "생체적합성"은 생물학적 시스템에 독성 또는 유해한 영향을 미치지 않는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "생체재료"는 신체의 임의의 조직, 기관 또는 기능을 부분적으로 또는 완전히 증강 또는 대체하기 위한 폴리머 조성물, 하이드로겔 또는 물품을 지칭한다. 생체재료는 예컨대 하이드로겔, 멤브레인, 스펀지, 임의적으로 시트, 3D-패치 또는 스펀지 또는 이식(grafting)용 메쉬와 같은 상이한 물리적 형태의 물품을 포함할 수 있다. 이들 형태에는 수술 또는 조직 복구에서, 예컨대 심장 수술 후에 사용되는 전형적인 멤브레인, 시트, 3D-패치 또는 스펀지, 또는 이식용 메쉬 등을 포함한다. 이들 물품은 천연 제품, 합성제품 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 생체재료는 이들 물품 중 하나를 형성하기 위해 독점적으로 사용될 수 있거나 이들 물품 중 하나의 구성요소로서 사용될 수 있다.
제1 화합물 및 제2 화합물과 관련하여 본원에 사용된 용어 "공액된"은 제1 화합물은 임의로 정전기적으로 및/또는 공유 결합을 통해 제2 화합물과 커플링됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "아미노"는 -NH2 기를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "하이드로겔"은 폴리머 물질, 전형적으로 수 중에서 팽윤되거나 물로 팽윤될 수 있는 폴리머 사슬의 네트워크 또는 매트릭스를 지칭한다. 하이드로겔은 또한 물을 평형 상태로 유지하는 물질인 것으로 이해될 수 있다. 네트워크 또는 매트릭스는 가교되거나 또는 가교되지 않을 수 있다.
본원에 사용된 "전도성 폴리머"는 전기 전도성이 선천적으로 또는 본질적으로 가능한 폴리머를 의미한다.
본원에서 사용된 "생체적합성 성분"은 천연 제품, 합성 제품 또는 이들의 조합을 의미하거나 포함한다. 일 실시 형태에서, 생체적합성 성분은 선형 또는 분 지형 다당류, 단백질 또는 폴리펩티드와 같은 천연 생성물을 포함할 수 있다. 이들 천연 생성물은 예를 들어 키토산, 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 알지네이트 및 이들의 유도체 및 조합을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 생체적합성 성분은 생분해성 합성 폴리머와 같은 합성 생성물을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "젤라틴"은 전형적으로 이종의 폴리펩티드 혼합물로 구성된 콜라겐의 폴리펩티드 생성물 유도체를 지칭하고, 유형 A 및 유형 B 젤라틴을 포함한다. 젤라틴은 예를 들어 콜라겐을 산 처리하거나 콜라겐을 적절한 온도에서 가열함으로써 얻을 수 있다. 젤라틴은 소, 돼지 또는 양 콜라겐과 같은 포유동물 콜라겐 뿐만 아니라 해양 콜라겐 또는 조류 콜라겐으로부터 유래 될 수 있다. 젤라틴은 예를 들어 GELFOAM®과 같은 스펀지로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전도성 이상"은 심장을 통한 부적절한 전기적 자극에 의해 야기되는 장애를 의미한다. 전도성 이상은 예를 들어 각차단(bundle branch block), 예를 들어 우각차단(right bundle branch block) 및 좌각차단(left bundle branch block); 심차단, 예를 들어 1급 심차단, 2급 심차단, 3급 심차단 또는 완전 심차단, 좌각반각차단, 좌각후각차단, 이섬유속 차단, 삼섬유속 차단; 및 긴 Q-T 증후군을 포함한다. 전도성 이상은 예를 들어 심장 전도성 세포, 심근세포, 또는 섬유아세포를 포함하는 심장 세포의 비정상적인 기능에 의해, 심근세포 또는 전도성 세포의 죽음에 의해, 또는 심장 내 섬유성 조직의 축적에 의해 유발된 심장 이상에 의해 야기될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "제니핀"은 통상의 기술자에게 일반적으로 화학적 화합물로서 제니핀으로서 인식되는 화합물 또는 화학적 화합물로서 제니핀의 등가물을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "제니핀"은 유도체, 유사체, 입체이성질체 및 이의 혼합물을 포괄하는 것으로 의도된다. 제니핀 화합물은 천연 공급원으로부터 유래되거나 합성적으로 만들어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "전극을 포함하는 이식가능한 장치"는 이식가능한 전자 장치를 의미한다. 전극을 포함하는 이식가능한 장치는, 예를 들어, 심박조율기, 이식가능한 심혈관 제세동기(implantable cardioverter defribrillators; ICDs) 및 심장 재동기화 치료 (cardiac resynchronizing therapy;CRT) 장치를 포함 할 수 있다.
본원에 사용되고 당업계에 잘 이해되는 용어 "처치" 또는 "치료"는 임상 결과를 포함하여 유리한 또는 원하는 결과를 얻는 접근법을 의미한다.
유익하거나 바람직한 임상 결과는 비제한적으로, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병의 정도의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병의 확산 방지, 질병의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 개선 또는 완화, 질병의 재발 감소, 및 감지가능 또는 감지불가능 여부에 관계없이 완화(부분적이든 전체적이든 상관없이)를 포함한다. 예를 들어, 심장 질환을 갖는 대상체는 심장 질환의 진행을 방지하기 위해 치료할 수 있거나, 또는 대안으로, 심장 질환을 갖는 대상체는 예를 들어 심장 페이싱, 심장 전도도 및/또는 심장 전도도 전파를 개선함으로써 치료될 수 있다. "처치" 및 "치료"는 또한 치료를 받지 않을 때의 예상 생존과 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다. 본원에 사용된 "처치" 및 "치료"는 또한 예방 치료를 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 “한”, “하나”, “상기”는 그 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"을 포함하는 조성물은 둘 이상의 화합물의 혼합물을 포함한다. 또한, 용어 "또는"은 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 의미로 일반적으로 사용된다는 점에 유의해야 한다.
본 명세서 및 청구 범위에서 사용된 바와 같이, "구성되는"이란 단어 및 그 파생어는 언급된 특징, 요소, 구성요소, 그룹 정수 및/또는 단계의 존재를 명시하고, 또한, 언급되지 않은 다른 특징, 요소, 구성요소, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제하는 폐쇄형 용어로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "약", "실질적으로" 및 "대략"은 최종 결과가 크게 변경되지 않도록 변형된 용어의 합리적인 양의 편차를 의미한다. 이러한 정도의 용어는 이 편차가 수정하는 단어의 의미를 부정하지 않으면 수정된 용어의 적어도 ± 5% 또는 적어도 ± 10%의 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
특정 섹션에 기술된 정의 및 실시 형태는 통상의 기술가 이해하는 바와 같이 적합한 본원에 기술된 다른 실시 형태에 적용되도록 의도된다. 예를 들어, 다음 구절들에서, 상이한 측면들이 보다 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 측면은 달리 명확하게 지칭되지 않는 한 임의의 다른 측면 또는 측면들과 조합 될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 지칭된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
생체적합성 전도성 생체재료 및 사용 방법
본원에 제공된 제1 측면은 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 포함하는 생체적합성 전도성 생체재료에 관한 것이다.
본원에 제공된 제2 측면은 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 공액시키는 단계를 포함하는 생체적합성 전도성 생체재료의 제조방법이다.
전도성 폴리머는 벤조산계 폴리머 및 이들의 혼합물 또는 공중합체를 포함할 수 있다. 특히 전도성 폴리머는 아미노메톡시벤조산 (AMBA) 계열 폴리머이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산 (AMBA)은 3-아미노-4-메톡시벤조산 (3-4-AMBA)이다. 일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산은 4-아미노-2-메톡시벤조산 (4-2-AMBA)이다. 일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산은 2-아미노-4-메 톡시벤조산 (2-4-AMBA)이다. 일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산은 4-아미노-3-메톡시벤조산 (4-3-AMBA)이다. 일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산은 5-아미노-2-메톡시벤조산 (5-2-AMBA)이다. AMBA는 예를 들어 친핵성 또는 친전자성 방향족 치환기를 사용하여 다른 치환된 벤젠류로부터 당업계에 잘 알려진 방법론을 통해 합성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산은 다음을 포함한다:
및 이의 염.
일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산은 다음을 포함한다:
및 이의 염.
일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산은 다음을 포함한다:
및 이의 염.
일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산은 다음을 포함한다:
및 이의 염.
일부 실시 형태에서, 아미노메톡시벤조산은 다음을 포함한다:
및 이의 염.
전도성 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 전도성 폴리머의 분자량은 약 300 달톤, 또는 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤, 또는 약 1,500 달톤, 또는 약 2,000 달톤, 또는 약 3,000 달톤, 또는 약 4,000 달톤, 또는 약 5,000 달톤, 또는 약 7,000 달톤, 또는 약 9,000 달톤, 또는 약 10,000 달톤, 또는 약 12,000 달톤, 또는 약 14,000 달톤, 또는 약 16,000 달톤 초과이다.
다른 실시 형태에서, 전도성 폴리머의 분자량은 약 200 달톤, 또는 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤, 또는 약 1,500 달톤, 또는 약 2,000 달톤, 또는 약 3,000 달톤, 또는 약 4,000 달톤, 또는 약 5,000 달톤, 또는 약 7,000 달톤, 또는 약 9,000 달톤, 또는 약 10,000 달톤, 또는 약 12,000 달톤, 또는 약 14,000 달톤, 또는 약 16,000 달톤, 또는 약 18,500 달톤 미만이다. 또 다른 실시 형태에서, 분자량은 이들 값 중의 임의의 값의 범위일 수 있다(예컨대, 약 200 달톤 내지 약 7,000 달톤, 또는 약 50 달톤 내지 약 10,000 달톤 등).
일 실시 형태에서, 생체적합성 성분은 천연 제품, 합성제품 및 이들의 혼합물을 포함한다.
일 실시 형태에서, 천연 제품은 젤라틴, 키토산, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 알지네이트 및 이의 유도체 및 혼합물로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, 생체적합성 성분은 젤라틴을 포함하거나 젤라틴이다. 젤라틴은 콜라겐의 유도체이며, 생체적합성 및 기계적 특성으로 인해 조직 공학 분야에서 널리 사용된다.
다른 실시 형태에서, 생체적합성 성분은 합성 생성물, 예를 들어 생분해성 합성 폴리머를 포함한다.
생체적합성 성분은 약 50,000 내지 약 150,000 달톤, 임의로 약 50,000 달톤 내지 약 100,000 달톤 범위의 분자량을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 분자량은 약 50,000 달톤, 또는 약 60,000 달톤, 또는 약 70,000 달톤, 또는 약 80,000 달톤, 또는 약 90,000 달톤 또는 약 100,000 달톤 또는 약 110,000 달톤, 또는 약 120,000 달톤, 또는 약 130,000 달톤 초과이다. 다른 실시 형태에서, 생체적합성 성분의 분자량은 약 60,000 달톤, 또는 약 70,000 달톤, 또는 약 80,000 달톤, 또는 약 90,000 달톤, 또는 약 100,000 달톤, 또는 약 110,000 달톤, 또는 약 120,000 달톤 또는 약 130,000 달톤, 또는 약 140,000 달톤 또는 약 150,000 달톤 미만이다.
전도성 폴리머 및 생체적합성 성분은 예를 들어 화학 컨쥬게이션에 의해 조합되어 전기 전도성 생체적합성 생체재료를 형성할 수 있다. 생체재료에서 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분의 몰비는 각각 1000:1 내지 1:1000의 범위 일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분의 몰비는 약 1:3, 또는 약 1:2, 또는 약 1:1, 또는 약 2:1, 또는 약 3:1, 또는 약 5:1, 또는 약 10:1, 또는 약 25:1, 또는 약 50:1, 또는 약 100:1, 또는 약 150:1, 또는 약 200:1, 또는 약 250:1, 또는 약 300:1 또는 약 350:1 또는 약 400:1, 또는 약 500:1 초과일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분의 몰비는 약 1:2, 또는 약 1:1, 또는 약 2:1, 또는 약 3:1, 또는 약 5:1, 또는 약 10:1, 또는 약 25:1, 또는 약 50:1, 또는 약 100:1, 또는 약 150:1, 또는 약 200:1, 또는 약 250:1, 또는 약 300:1 또는 약 350:1 또는 약 400:1, 또는 약 500:1, 또는 약 1000:1 미만일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분의 몰비는 이들 값 중 임의의 범위일 수 있다(예, 1:1 내지 1:350 사이, 또는 1:3 내지 1:150 사이, 또는 3:1 및 300:1 사이 등). 일 실시 형태에서, 비는 2:1 내지 1000:1 이다. 일 실시 형태에서 몰비는 약 30:1 내지 약 60:1 이다.
일부 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료의 분자량은 약 50,000 내지 약 1,000,000 달톤의 범위 일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 생체재료의 분자량은 약 50,000 달톤, 또는 약 60,000 달톤 또는 약 75,000 달톤, 또는 약 100,000 달톤, 또는 약 150,000 달톤, 또는 약 200,000 달톤, 또는 약 300,000 달톤, 또는 약 400,000 달톤 또는 약 500,000 달톤, 또는 약 600,000 달톤, 또는 약 700,000 달톤, 또는 약 800,000 달톤 초과이다. 다른 일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료의 분자량은 약 60,000 달톤, 또는 약 75,000 달톤, 또는 약 100,000 달톤, 또는 약 150,000 달톤, 또는 약 200,000 달톤, 또는 약 300,000 달톤, 또는 약 400,000 달톤 또는 약 500,000 달톤, 또는 약 600,000 달톤, 또는 약 700,000 달톤, 또는 약 800,000 달톤, 또는 약 1,000,000 달톤 미만이다. 또 다른 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료의 분자량은 이들 값 중 임의의 값의 범위 일 수 있다(예, 50,000 달톤 내지 약 800,000 달톤, 또는 약 150,000 달톤 내지 약 300,000 달톤 등).
일 실시 형태에서, 생체재료의 전도성은 약 10-6 S/cm 이상, 또는 약 10-5 S/cm 이상이다. 일부 실시 형태에서, 생체재료의 전도성은 10-5 S/cm 이상, 또는 약 10-4 S/cm 이상, 또는 약 10-3 S/cm 또는 약 10-2 S/cm 이상이다. 예를 들어, 상기 범위는 약 10-6 S/cm 내지 약 10-2 S/cm, 또는 약 10-1 S/cm 일 수 있다. 도 7(h)에 도시된 바와 같이, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 생체적합성 전도성 생체재료는 젤라틴 단독과 비교하여 AMBA-젤라틴의 존재하에서 조직이 0 내지 100 mV로 자극될 때 활동 전위의 진폭을 증가시켰다. 특정 실시 형태에서 재료는 약 10 내지 약 110 mV, 또는 약 20 내지 약 100 mV, 또는 약 50 내지 약 100mV, 또는 약 75 내지 약 100mV 또는 이들 값의 임의의 조합의 심장 임펄스의 전위를 전달할 수 있다(예, 약 50 내지 약 100 mV 등).
일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 전도성 폴리머를 포함하지 않는 대조군 생체재료보다 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 약 10배 이상, 약 11배 이상, 약 12배 이상, 약 13배 이상, 약 14배 이상, 약 15배 이상 또는 약 20배 또는 25배 이상 또는 약 20배 이상 또는 약 25배까지의 전도도를 갖는다.
생체재료는 다른 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, AMBA-젤라틴 스펀지는 젤라틴 및 다른 폴리펩티드와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 생체재료는 액체 용액, 하이드로겔, 멤브레인, 3D-패치 또는 스펀지, 시트 또는 이식용 메쉬이다. 예를 들어 실시예에서 나타낸 바와 같이, AMBA는 APS를 사용하여 젤라틴에 접합될 수 있으며, 접합된 물질은 액체 형태이다. 이어서, 용액을 예를 들어 EDC를 사용하여 가교시켜 AMBA-젤라틴 용액을 하이드로겔로 가교시킨다. 젤폼과 같은 젤라틴 스펀지 또는 메쉬 등과 같은 다른 스캐폴드를 사용하는 경우, APS를 사용하여 AMBA를 젤라틴 스펀지(또는 스캐폴드)에 접합시킬 수 있으며, EDC와 같은 가교제는 필요하지 않다.
시트 또는 3D-패치 또는 스펀지(3D 패치 및 스펀지는 서로 바꾸어 사용할 수 있다)로 형성된 AMBA-젤라틴은 예를 들어, 보호 커버로서 또는 조직 결함에 대한 구조적 지지를 제공하기 위해 사용될 수 있다. AMBA-젤라틴은 또한 예를 들어, 조직 결함을 복구하는데 있어서 이식용 메쉬로서 형성될 수 있다.
AMBA-젤라틴을 포함하는 액체 용액 또는 하이드로겔의 제조방법이 실시예에 개시되어 있다. 예를 들어 상기 방법은 AMBA (하나 이상의 상이한 AMBA) 및 젤라틴을 조합하고, AMBA 및 젤라틴을 중합하여 접합 AMBA-젤라틴(예컨대 액체 용액)을 생성하고, 임의로 AMBA-젤라틴을 가교결합시키거나 액체 용액을 냉각시켜 하이드로겔을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
AMBA는 APS를 사용하여 젤라틴(임의로, 젤라틴 그 자체 또는 젤라틴을 포함하는 스캐폴드)에 접합시켜 중합될 수 있다. 젤라틴 또는 다른 생체적합성 폴리머가 압축 또는 스캐폴드 없이 사용되는 경우, AMBA-젤라틴은 예를 들어 EDC를 사용하여 가교될 수 있다.
생체적합성 전도성 생체재료는, 예를 들어 용액일 때 하이드로겔 형성을 보조하기 위해 가교제를 사용하여 가교 될 수 있다. 예를 들어, 실시예에 나타낸 바와 같이, AMBA-젤라틴 폴리머는 가교되어 가교된 하이드로겔을 형성할 수 있다. 가교제는 공지된 가교제일 수 있고, 친전자성 그룹, 친핵성 그룹 또는 둘 다를 함유하는 것일 수 있다. 가교제는 천연 제품 또는 합성 제품일 수 있다. 사용될 수 있는 다기능성 가교제의 예는 예를 들어, EDC, N-히드록시숙신이미드, 글루터알데히드, 메틸렌-비스-아크릴아민, 디에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디아트릴레이트, 트리에틸렌 글리콜-비스-메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜-비스-메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜-디메타크릴레이트, 비스아크릴아마이드, 트리에틸렌글리콜-비스-아크릴레이트, 3,3'-에틸리덴-비스 (N-비닐-2-피롤리돈), 트리메틸올프로페이트, 트리메타크릴레이트, 글리세롤 트리메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디메타아크릴레이트, 다른 폴리아크릴레이트 및 폴리메타크릴레이트 에스터 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일 실시 형태에서, 가교제는 EDC이다. 일 실시 형태에서 가교제는 제니핀 또는 탄닌산이다.
가교제 대 생체적합성 전도성 생체재료의 비는 부피 기준으로 약 2:100,000 내지 약 5:1,000의 범위 일 수 있다. 가교제는 표적 위치(예를 들어, 심장)로의 도입 전(예, 도입 1-10 분 전)에 생체재료에 추가될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 생체재료가 겔화되는데 1-10분이 소요된다. 겔화 시간 동안, 생체재료는 목표 위치(예를 들어, 심장)로 도입될 수 있다.
일 실시 형태에서, 하이드로겔은 아미노메톡시벤조산(AMBA) 폴리머 및 젤라틴을 포함한다. 예를 들어 실시예에 상세히 기재된 바와 같이, AMBA 폴리머는 젤라틴의 하나 이상의 아미노기에 접합된다.
일 실시 형태에서, 하이드로겔의 수분 함량은 약 75 중량% 내지 약 95 중량%이다. 예를 들어, 수분 함량은 약 80 중량%이다. 예를 들어, 수분 함량은 약 82 중량%이다. 예를 들어, 수분 함량은 약 85 중량%이다. 예를 들어, 수분 함량은 약 90 중량%이다.
일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 하기에 상세히 설명된 실시예 1 및 4에 개시된 방법에 따라 합성된다.
본 명세서에 제공된 또 다른 측면은 본 명세서에 기재된 생체적합성 생체재료 중 하나를 이용하는 장치에 관한 것이다.
장치는 전극을 포함하는 이식 가능한 장치일 수 있다.
일 실시 형태에서, 이식 가능한 장치는 본원에 기재된 전도성 폴리머 중 하나 이상을 포함하는 생체적합성 전도성 생체재료에 의해 적어도 부분적으로 코팅된 하나 이상의 전극을 포함한다. 예를 들어, 생체적합성 전도성 생체재료는 전도 개선을 필요로 하는 심장 조직(예컨대, 예를 들어, 심방 심실 마디)에 주사될 수 있고, 전극은 겔화 동안 또는 겔화 후에 생체재료 내에 삽입되어 전극이 코팅된다. 다른 예로서, 생체적합성 전도성 생체재료는 전극의 말단 주위에 캐스트 형상으로 형성될 수 있으며, 형상은 심장 조직 내에서 미리 결정된 크기의 주사 부위에 상응한다.
일 실시 형태에서, 이식 가능한 장치는 심장 박동조율기이다.
예를 들어, 심장박동조율기는 단일 챔버 심박조율기, 이중 챔버 심박조율기 또는 심실 심박조율기일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 상기 장치는 이식 가능한 심장제세동기(Implantable cardioverter defibrillator; ICD)이며, 여기서, 적어도 하나의 전극이 본 명세서에 기재된 전도성 폴리머 중 적어도 하나를 포함하는 생체적합성 전도성 생체재료에 의해 적어도 부분적으로 코팅된다.
일 실시 형태에서, 심박조율기 또는 ICD의 리드는 생체적합성 생체재료에 의해 적어도 부분적으로 코팅된다.
심박조율기 및 ICD 능력을 포함하는 이중 기능 장치가 또한 고려된다.
또 다른 측면은 심박조율기와 같은 전극 및 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분, 예를 들어, 아미노메톡시벤조산(AMBA) 폴리머를 포함하는 전도성 폴리머를 포함하는 생체적합성 전도성 생체재료를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 키트는 장치를 이식하고, 이식될 때 생체적합성 전도성 생체재료가 전극을 둘러싸도록 장치를 이식하기 위한 지침을 포함한다.
생체적합성 전도성 생체재료는 또한 심장 결함의 심장 회복 또는 심장 조직을 생성하기 위해 심근세포를 성장시키기 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 3D 패치 또는 스펀지의 전도도는 실시예 6에 지시된 바와 같이, 패치의 심근 세포를 동기화시킬 수 있다. 생체적합성 전도성 생체재료(예컨대 패치로서)는 단독으로 또는 심근세포와 함께 이용하여 선천성 심장 결함을 치료할 수 있을 뿐만 아니라 울혈성 심부전환자의 확장된 심장을 외과적으로 치료할 수 있다.
따라서, 다른 실시 형태에서 임의적으로 하이드로겔 또는 시트, 3D-패치 또는 스펀지, 또는 메쉬 및 하나 이상의 배양 배지 및 심근세포로서 생체적합성 전도성 생체재료를 포함하는 조성물이 제공된다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 심장 질환을 개선 또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 생체적합성 전도성 생체재료를 이를 필요로 하는 대상의 심장에 도입하는 것을 포함하고, 상기 생체재료는 본원에 개시된 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 포함한다.
예를 들어, 심장 질환은 심근 경색, 허혈성 심근, 심근 섬유증, 심부전, 방실 차단, 부정맥, 및 예를 들어 심장 수술로 인한 전도 이상을 포함할 수 있다.
임의로 하이드로겔 형태의 AMBA-젤라틴은 또한 심장 수술에 의해 생성된 전도를 재설정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 심장 판막 교체에서 손상된 판막은 외과적으로 제거된다. 수술은 주변의 심장 조직을 손상시킬 수 있으며, 전도 차단(밸브 치료의 부작용)을 초래할 수 있다. 대동맥 질환 환자를 치료하기 위해 잘 받아들여진 옵션인 카테터경유 대동맥판막교체(transcatheter aortic valve replacement; TAVR)는 TAVR-관련 전도 방해, 주로 새로운 좌각차단 및 영구 심박조율기 이식이 필요한 고도 방실 차단을 초래할 수 있다고 보고되었다.
따라서, 하이드로겔 및 본 명세서에 기술된 다른 형태의 생체적합성 전도성 생체재료는 이러한 상황에서 전도를 회복시키기 위해 주사될 수 있다.
일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 심장의 영향을 받는 영역으로 또는 그 위에 도입된다.
예를 들어, 생체적합성 전도성 생체재료는 심박조율기 또는 다른 장치의 리드가 부착될 수 있는 계면에 근접하여 심장 조직 내로 또는 위로 도입될 수 있다. 본원에 도시된 바와 같이, 이는 리드 자극에 대한 조직의 저항을 감소시킨다.
일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 심장의 영향을 받는 영역 내로 또는 그 위에, 예를 들어 섬유성 흉터 조직 내로 또는 그 위에 도입된다. 실시예에 도시한 바와 같이, 이것은 심장 부정맥의 발생을 감소시킬 수 있다. 일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 심장 전도성을 증가시키기 위한 것이다.
일 실시 형태에서, 도입된 생체적합성 전도성 생체재료의 양은 처리되지 않은 대조군에 비해 심장 조직 전도성을 2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상, 또는 10 배 이상 증가시키기에 충분하다.
일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 대상체의 심실 심장 박동을 순차적으로 (심방 박동에 이어 심실 수축) 동기화시키기 위한 것이다.
본 명세서에서 입증된 바와 같이, 생체적합성 전도성 생체재료는 또한 심장 박동조율기의 페이싱 임계 전압을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 생체적합성 조성물은 이를 필요로 하는 대상에서 심장 페이싱에 대한 심근 반응성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
이러한 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 심박조율기 포함하는 대상체 또는 심박 조율기 이식을 받는 대상체에서 심박 조율기의 하나 이상의 전극에 근접하여 도입 될 수 있다. 생체적합성 전도성 생체재료는 대상체가 심박조율기 이식을 받기 전에 또는 후에 도입될 수 있다.
일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 대상의 심장으로 또는 심장위에 도입된 후 심박조율기 또는 ICD 또는 이중 ICD 심박조율기의 이식으로 심장을 페이싱한다.
또한, 심박조율기 또는 ICD와 같은 이식 가능한 장치를 사용하는 방법이 고려되며, 여기서 심박조율기의 하나 이상의 전극은 본원에 기재된 생체적합성 전도성 생체재료로 적어도 부분적으로 코팅된다.
일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 심장 페이싱 임계 전압을 감소시키기 위한 것이다.
추가의 실시 형태에서, 도입된 생체적합성 전도성 생체재료의 양은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 심장 페이싱 임계 전압을 2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상 또는 5 배 이상 감소시키기에 충분하다.
일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 심장 작용 전위의 진폭을 증가시키거나, 심장 전도성 속도를 증가시키거나 또는 QT 간격 지속 시간을 감소시키기 위한 것이다.
또 다른 실시 형태에서, 도입된 생체적합성 전도성 생체재료의 양은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 심박조율기에 의해 유도된 심장 작용 전위 진폭을 약 10 % 이상, 약 20 % 이상, 약 30 % 이상, 약 40 % 이상 또는 약 50 % 이상 증가시키기에 충분하다.
일 실시 형태에서, 도입된 생체적합성 전도성 생체재료의 양은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 QT 간격 지속시간 및/또는 심장 활동 전위 지속시간을 약 10 % 이상, 약 20 % 이상, 약 30 % 이상, 약 40 % 이상 또는 약 50 % 이상 감소시키기에 충분하다.
다른 실시 형태에서, 대상은 포유 동물, 임의로 랫트, 마우스 또는 인간이다. 일 실시형태에서, 대상은 인간이다.
본원에서 제공되는 추가의 측면은 이를 필요로하는 대상에서 심장 질환을 치료 및/또는 심장 페이싱에 대한 심근 반응성을 증가시키기 위해 본원에 기재된 생체적합성 전도성 생체재료 또는 본원에 기재된 전도성 하이드로겔의 용도이다.
생체적합성 전도성 생체재료 (예를 들어, 하이드로겔)은 하이드로겔 및 유사한 물질로 생물학적 조직 및 기관을 치료하는 공지된 방법에 의해 도입될 수 있다. 일 실시 형태에서, 생체재료는 영향을 받는 영역 내로 또는 위로 침상 주사, 임의적으로 이미지 유도 침상 주사에 의해 도입된다. 일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 심장, 예를 들어 심방 심실 전도성 결절 및 주변 영역 내로 또는 위로 주사될 수 있다.
일 실시 형태에서, 생체적합성 전도성 생체재료는 응고 전에 영향을 받는 영역 내로 또는 위로 도입된다(임의적으로 바늘 주사). 그후, 생체재료는 응고된다(예컨대 겔화됨). 다른 실시 형태에서, 생체재료는 프리캐스트 형태, 예를 들어 섬유, 시트, 3D-패치 또는 스펀지, 또는 메쉬로 프리캐스트된 후, 영향을 받는 영역 내로 주사된다.
생체적합성 전도성 생체재료는 또한 시트 또는 3D-패치와 같은 다른 물품으로 형성될 수 있으며, 예를 들어, 손상된 조직의 상단 또는 예를 들어 심장에 대한 심박조율기의 전극 연결과 같은 장치를 둘러싸기 위해 사용할수 있다.
일 실시 형태에서, 조직 또는 기관에 도입된 생체적합성 전도성 생체재료(예컨대, 하이드로겔)의 양은 생체재료의 조성, 조직 또는 기관의 위치 및 상태, 생체재료 도입의 목적(예컨대, MI 치료 또는 페이싱 역치 감소), 조직 또는 기관의 크기 및/또는 손상된 크기 또는 치료될 영역과 같은 다수의 인자에 의존할 수 있다.
일 실시 형태에서, 생체재료의 부피는 약 1 μl 내지 약 10 mL, 또는 약 2 μl 내지 약 5 mL, 또는 약 5 μl 내지 약 3 mL, 또는 약 10 μl 내지 약 2 mL, 또는 약 50 μl 내지 약 1 mL, 또는 약 100 μl 내지 약 500 μl, 또는 이들 값의 임의의 조합(예를 들어, 약 1 mL 내지 약 2 mL)의 범위일 수 있다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, 생체적합성 전도성 생체재료는 섬유성 흉터 조직을 갖는 심장에서 효과적이다. 따라서 일부 실시 형태에서 대상체는 심근경색을 앓거나 및/또는 흉터 조직을 갖는다.
공보, 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 인용 문헌의 개시 내용은 그 전문이 본원에 명백히 참조로 포함된다.
양, 농도 또는 다른 값 또는 파라미터가 범위, 바람직한 범위, 또는 바람직한 상한값 및 바람직한 하한값의 리스트로서 제공될 때, 이는 범위가 개별적으로 개시되는지 여부에 관계없이 임의의 상한 범위 또는 바람직한 값 및 임의의 하한 범위 또는 바람직한 값의 쌍으로부터 형성된 모든 범위를 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야한다. 본 명세서에서 수치 범위가 언급되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 범위는 그의 종점, 및 범위 내의 모든 정수 및 분율을 포함하도록 의도된다. 범위를 정의할 때, 본 발명의 범위가 언급된 특정 값으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내지만, 단지 예로서 제시된 것임을 이해해야 한다.
실시예
실시예 1 - AMBA -젤라틴 하이드로겔 및 젤라틴 스펀지의 합성
약간의 유동성을 갖는 심장 조직에 주사될 수 있는 전도성 하이드로겔을 생성하였고, 심장 자극 전파를 허용하는 적절한 전도성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 중합된 AMBA(poly-AMBA)는 전도성 폴리머이다(도 1). 그러나, 추가 공정이 없는 poly-AMBA는 비-열가소성이고 기계적으로 단단하고 부서지기 쉬우며, 심장 응용 분야에 적합하지 않다. AMBA를 중합시키고 젤라틴에 접합시켜 AMBA-젤라틴 전도성 용액을 생성한 후, 이를 가교시켜 AMBA-젤라틴 하이드로겔을 형성하였다(도 1 및 도 2A 및 B). AMBA를 또한 중합하고 젤라틴 스펀지(Gelfoam®)에 접합하여, 전도성 AMBA-젤라틴 스펀지 (AMBA-Gelfoam)를 생성하였다(도 2C).
전도성 생체재료는 전도성 폴리 3-아미노-4-메톡시벤조산 (AMBA)을 젤라틴 상에 접합시킴으로써 생성되었다. 2g 젤라틴 분말 (LOT NO.895893A, Fisher Scientific, Canada)을 기계적 교반 하에 10 ml 탈이온수에 용해시킨 다음, 0.2g 3-아미노-4-메톡시벤조산 분말 (B20669, Alfa Aesar, MA)을 용액에 첨가하였다. 분말을 완전히 용해시킨 후, 0.546 g 암모늄퍼설페이트 (APS) (AMMONIUM PERSULFATE, CAS # 7727-54-0, Bio Basic Canada Inc.)를 용액에 첨가하여 AMBA를 중합하고 AMBA 중합체를 젤라틴의 아미노기에 연결하여 AMBA-젤라틴 용액을 형성하였다. 수조에서 50 ℃로 6 시간 동안 중합 반응을 유지시켰다. 마지막으로, AMBA-젤라틴 용액의 pH는 NaOH (Sigma-Aldrich)으로 약 7.0으로 조정하였다. 사용하기 전에, AMBA-젤라틴 용액을 4 μl N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC, 22980, Thermo fisher, MA) 및 2 μl N-히드록시숙신이미드 (NHS, 130672-5G, Sigma-Aldrich, MO)와 5분 동안 가교시켜 AMBA-젤라틴 하이드로겔을 형성시켰다.
실시예 2 - 전도도 평가
2-포인트 프로브 저항 장치 (HF2IS, Zurich Instruments, Switzerland)를 사용하여 실시예 1에 따라 제조된 AMBA-젤라틴 하이드로겔의 실온에서 생체재료 저항을 측정하였다. 프로브를 1.5 cm 간격으로 젤라틴 및 AMBA-젤라틴 하이드로겔 필름 상에 두었다. 전도도 (S/cm로 측정)는 1/(2πDR)로 계산되며, 식 중에서 D는 프로브 사이의 거리 (mm)이고, R = V/I이다(I는 공급 전류 (mA)이고, V는 해당 전압임). 1.5cm * 1.5cm 접시의 겔화된 AMBA-젤라틴의 저항 및 생체재료 저항을 측정하였다(도 2A). AMBA-젤라틴 하이드로겔은 젤라틴과 비교하여 약 5 배 높은 전도성 (저항의 역수)을 가졌다(도 2B, ** p <0.01, n = 72). 상이한 AMBA-젤라틴 하이드로겔은 상이한 AMBAs, 즉 3-4-AMBA, 4-2-AMBA, 4-3-AMBA, 2-5-AMBA 및 2-4-AMBA를 사용하여 제조되었으며, 모두 젤라틴 하이드로겔 보다 전도성이 우수한 것으로 밝혀졌다 (도 3).
실시예 3 - AVB 모델
AVB 랫트 모델을 에탄올을 심장의 AV 결절에 주사함으로써 생성하였다. AVB를 갖는 랫트를 사용하여 생체 내 AMBA-젤라틴의 전기 전도 브리지 효과의 능력을 조사하였다. 심전도 (ECG) 프로파일을 사용하여 조사하였다. 전류의 전파는 AMBA-젤라틴 하이드로겔 주사된 또는 젤라틴 주사된 동물의 손상된 AV 결절을 가로지른다.
모든 실험 프로토콜은 대학 건강 네트워크(University Health Network)의 동물 자원 센터 (Animal Resource Center)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 (NIH, 8th Edition, 2011)를 준수하였다.
무게가 235-250 g인 암컷 SD 랫트는 종래 보고된 바와 같이 에탄올 유도 AV 차단을 받았다[10]. 요약하면, ECG를 생리학적 기록기에 표시하였다. 마이크로 리터 주사기 (Hamilton, Reno, NV)에 연결된 30 게이지 바늘을 사용하여 용액을 심근에 주사하였다. 결절 조직을 향하는 바늘의 방향을 용이하게 하기 위해, 바늘을 팁으로부터 3 mm의 샤프트에서 90°구부림으로써 준비하였다. 따라서 바늘은 심 외막 표면으로부터 최대 3 mm까지 심근에만 삽입될 수 있다. 정중 흉골절개(midline sternotomy) 및 심막절개(pericardiotomy) 후, 우측 심방 부속기의 끝이 측면에 반사되어 이 영역의 AV 접합부에 접근할 수 있게 되었다. 이 책략은 대동맥 근부와 우심방의 내벽 사이에 일관되게 위치한 지방 패드인 AV 결절에 대한 심외막 접근의 랜드 마크를 노출시켰다. 이 지방 패드는 대동맥 판막의 우측 관상동맥과 비 관상동맥 사이의 접합 면에 해당하는 대동맥 근부의 외막 측면 지점을 나타낸다. 바늘의 끝은 지방 패드의 1mm 후방 및 1mm 측점에서 심장 외막 표면을 관통하였다. 심장의 정점을 향하여(즉, 심장의 긴 축에서) 바늘이 굽어진 곳까지 삽입하였다. 바늘의 각진 부분을 항상 상승하는 대동맥에 평행하게 유지시켰다. 바늘의 삽입으로 순간적인 완전한 AV 블록이 이루어졌을 때[심장과 심전도 (ECG)의 전기기계적 해리에 의해 결정됨], 70 % 에탄올 50 μl를 주사하였다. 에탄올 손상 후, 젤라틴 또는 AMBA-젤라틴을 AV 결절에 주사하였다. 에탄올 손상 전에 표면 ECG를 얻었다. 형태학적 분석을 위해 주사 후 모든 동물을 희생시켰다.
랫트를 이소플루란으로 마취시키고, 통상적인 표면 ECG를 사용하여 심장 리듬을 모니터링하고 기록하였다. ECG 전극을 심방 및 심실 심장 근육에 개별적으로 연결하여 심방 및 심실 심장 파장을 모니터링하였다.
데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현하였다. p <0.05로 설정된 임계 α- 레벨로 GraphPad Prism 소프트웨어 (v.6.0)를 사용하여 분석을 수행하였다. 일원 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 여러 그룹 간의 비교를 수행하였다. F 값이 유의미한 경우, Tukey의 다중 범위 사후 테스트를 사용하여 그룹 간의 차이를 조사하였다.
AMBA-젤라틴은 젤라틴과 비교하여 5 배 더 높은 전도성을 갖는 것으로 결정되었다. ECG 결과에 따르면, 55 마리의 랫트 중 48 마리 (87 %)에서 안정적이고 완전한 AVB가 생성되었다. 생체재료를 AVB 랫트에 주사한 후, 표면 ECG 결과는 심방률에 유의한 차이가 없었으며, 이는 임의의 치료가 AV 결절 위의 동성 충격에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 그러나, AMBA-젤라틴 주사 동물에서 젤라틴 단독 주사 동물 (290 ± 87 vs. 60 ± 28, p <0.01)에 비해 심실 속도가 유의하게 더 빨랐으며, AMBA-젤라틴 주사가 방실 전도 블록을 회복시키는 반면 젤라틴-주사된 심장은 정상 대조군과 비교하여 전파 패턴이 계속 지연되었음을 제시한다.
심방 및 심실 탈분극 및 재분극을 기록하기 위해 표면 ECG를 수행하였다(도 4A 및 B). ECG 결과는 AVB 랫트의 P 파(P)에서 P 간격이 정상 심장에 비해 연장되지는 않았지만(도 4C), R 파 (R)에서 간격은 정상 심장과 비교하여 유의하게 연장되었다(도 4D, ** p <0.01). 연장된 RR 간격은 심실 탈분극이 AV 결절 아래의 수준에서 허용되고, 페이스가 심실에 도달하지 않기 때문에 심장의 심방과 심실 사이의 전도가 손상되었음을 나타낸다. 생체 내에서 온전한 AVB 심장에서 기능하는 AMBA-젤라틴의 능력을 평가하였다. 도 5는 AMBA-젤라틴이 AV 결절 영역에 성공적으로 주사되었음을 입증한다. 표면 ECG 결과는 심방 비율이 에탄올- 젤라틴- 또는 AMBA-젤라틴-주사 후 유의한 차이가 없었음을 보여주며, 이는 어떠한 처리도 AV 결절 수준을 넘어 동성 충격에 영향을 미치지 않았으나(도 6A), 심실 속도는 젤라틴 단독 주사와 비교하여 AMBA-젤라틴 주사 후 상당히 더 빨랐음을 보여준다(도 6B, p <0.01). 이러한 결과는 AMBA-젤라틴이 심장 전도 전파를 회복시키는 반면, 젤라틴 주사된 심장은 계속 전파를 지연시켰음을 보여준다.
따라서, AMBA-젤라틴 하이드로겔은 심장에서 AVB를 재-가교하고 심장 리듬을 복원하는데 유용할 수 있다. 데이터는 AMBA-젤라틴 주사가 정상을 폐쇄하기 위해 AVB 심장 박동을 회복시켰고, 심장 박동은 젤라틴만 주사된 랫트의 것보다 현저히 빠르다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 또한 AMBA-젤라틴이 젤라틴의 장점을 가지는 것 뿐만 아니라 충격이 이러한 하이드로겔을 가로질러 전파될 수 있음을 시사한다. AMBA-젤라틴은 탄성 및 지혈 특성을 가지며, 광범위한 조직 공학 응용에 사용하기 위한 전도성 생체재료일 수 있다.
실시예 4 - 전도성 AMBA-젤라틴 하이드로겔은 심장 박동조율기의 페이싱 임계 전압을 감소시킴
젤라틴은 생체적합성 천연 단백질이며 우수한 기계적 성질을 가지고 있다 [19]. 이것은 심근 세포외 매트릭스의 구성의 일부를 형성하지만 전도성은 아니다. 3-아미노-4-메톡시벤조산 (3-4-AMBA)을 젤라틴의 측쇄에 접합시켜 전도성 생체재료 AMBA-젤라틴을 제조하고, 심장 페이싱에 미치는 영향을 심근 전극-조직 계면에 주사함으로써 조사하였다.
방법:
AMBA-젤라틴 하이드로겔 합성
AMBA-젤라틴 하이드로겔을 실시예 1에 기재된 바와 같이 합성하였다.
AMBA-젤라틴 하이드로 겔의 전기적 특성 분석
2-포인트 프로브 저항 장치 (HF2IS, Zurich Instruments, Switzerland)를 사용하여 실온에서 생체재료 저항을 측정하였다. 프로브를 1.5 cm 간격으로 젤라틴 및 AMBA-젤라틴 하이드로겔 필름 상에 두었다. 전도도 (S/cm로 측정)는 1/(2πDR)로 계산되었으며, 식 중에서 D는 프로브 사이의 거리 (mm), R = V/I; I는 공급 전류 (mA)이고 V는 해당 전압 (mV)이다.
시험관 내(in vitro) 전극-조직 계면 전도의 측정
시험관 내에서 전극-조직 계면의 전도를 측정하였다. 건강한 랫트 심장 심방 심근을 좌심방에서 분리하였고 각각 양쪽에 젤라틴 또는 AMBA-젤라틴을 통해 자극 전극에 연결하였다. 음극은 양극으로부터 5mm 떨어져 있다. 심전도 활동 전위를 감지하기 위해 3-리드 심전도 (ECG) 레코더 (Power Lab, AD Instruments, CO)를 사용하였으며 전도 속도를 검출하기 위해 다중 전극 어레이 (MEA, Multichannel Systems Reutlingen, Germany)를 사용하였다. 자극은 ECG 기록의 경우 1 mv 내지 100 mv이고, MEA 기록의 경우 100 mv 내지 1000 mv이며, 자극기 (STG 4002, Multichannel Systems Reutlingen, Germany)와 함께 제공하였고, 모든 자극은 4 ms 지속 시간으로 4 Hz 이다. MEA 데이터는 Cardio2D+ (Multichannel Systems Reutlingen, Germany)로 분석하였다.
Langendorff 분리 랫트 심장 모델에서 페이싱 임계 전압 측정
모든 실험 프로토콜은 대학 건강 네트워크의 동물 자원 센터에 의해 승인되었고 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 (NIH, 8th Edition, 2011)를 준수 하였다. 이 연구에서는 235-250 g의 암컷 SD 랫트를 사용하였다. 임계 전압을 측정하기 위해 얼음 상의 대동맥 근부를 통해 뭉툭한 16G 바늘(blunted 16G needle)을 사용하여 심장을 신속하게 외식화 및 캐뉼러화하였다. 다음으로 심장을 37 ℃에서 10 mL/분으로 크렙스-헨셀라이트 (Krebs-Henseleit, K-H) 용액 (117 mM NaCl, 24 mM NaHCO3, 11.5 mM 덱스트로스, 3.3 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4를 5% CO2/95% O2로 평형화)을 역행 관류시켰다. 모션 노이즈를 방지하기 위해, 2,3-부탄디온 모노옥심 (1 mg/ml, B-0753, Sigma-Aldrich, MO)으로 흥분-수축(excitation-contraction) 커플링을 차단하였다. ECG를 사용하여 심장 전기 활동을 검출하고 자극기 (SD9, Grass, Canada)를 사용하여 심장을 자극하였다. K-H 완충액 관류 하에서, AMBA-젤라틴 하이드로겔 약 20 μl을 심실 정점 근처의 심근에 주사하였다. 그 다음 음극을 AMBA-젤라틴 영역에 삽입하고 양극 전극을 음극 전극에서 약 1.5cm 떨어진 크렙스-헨셀라이트 용액에 삽입하였다. 자극은 0.5 V에서 시작하여 심실 포획이 이루어질 때까지 0.1V 씩 증가시켰다. 100 % 페이싱 리듬의 최저값을 페이싱 임계 전압으로 기록하였다. 각 그룹에서 5.0 V 자극을 수행하였고 ECG를 전기생리학적 분석을 위해 모니터링하였다. 젤라틴 주사 페이싱 영역에서 주사 및 페이싱 자극이없는 정상 전극 페이싱이 대조군으로 작용하였다. 모든 자극은 4 ms 지속시간으로 6 Hz 이다.
전-심장 광학 맵핑
랑겐도르프(Langendorff) 관류 절차를 전술한 바와 같이 수행하였다. 자발적인 박동으로 심장 회복 5 분 후, 심장을 크렙스-헨셀라이트 용액 (25μM)에 용해된 전압 감응성 염료 4-(2-(6-(디부틸아미노)-2-나프탈레닐)에테닐)-1-(3-설포프로필)-피리디늄 (di-4 ANEPPS; D1199, Invitrogen, CA)으로 5 mL/분의 속도로 6분간 관류시켰다. 염료를 투여한 후, AMBA-젤라틴 하이드로겔을 주사하고 상기와 동일한 방법으로 전극을 삽입하였다. 자극기에 0.5 V 및 5.0 V 자극을 채택하고, 광학 매핑 데이터를 카메라 (Evolve 128, Photometrics, AZ)로 기록하였다. Matlab (MathWorks, MA) 기반의 맞춤형 소프트웨어를 광학 매핑 신호의 데이터 분석에 사용하였다[20]. 정산 전극 페이싱 및 젤라틴 주사 페이싱은 대조군으로서 작용하였다. 모든 자극은 4 ms 지속 시간으로 6 Hz 이다.
랫트 방실 차단 모델
랫트 방실 차단 (AV 블록)을 유도하기 위해 아데노신(AD; 519 987, Boehringer Mannheim, German)을 사용하였다. 중앙 흉골 절개술 후, 150 μl AD (10 mg/ml)를 하대 정맥을 통해 신속하게 주사하여 방실 차단을 유도하고 차단 시간을 기록하였다. 이어서, AV 블록 지속을 120 초로 유지하기 위해 AD 용량을 조정하였다.
생체 내(in vivo) 페이싱 임계 전압 측정
랫트를 이소플루란으로 마취시키고, 통상적인 표면 ECG를 사용하여 심장 리듬을 모니터링하고 기록하였다. 중앙 흉골 절개술을 수행하고 적절한 심장 노출 후, AMBA-젤라틴 하이드로겔 20 μl을 심장 정점 근처의 우심실 벽에 주사하였다. 이어서, AMBA-젤라틴 영역에 음극을 삽입하고 흉골의 좌측에 양극 전극을 피하 삽입하였다. 자극 절차는 랑겐도르프 분리 랫트 심장 모델에 대해 전술한 것과 동일하였고, 페이싱 임계 전압값을 기록하였다. 각 그룹에서 5.0 v 자극 하의 ECG도 전기생리학적 분석을 위해 기록하였다. 정산 전극 페이싱 및 젤라틴 주사 페이싱은 대조군으로서 작용하였다. 모든 자극은 4 ms 지속 시간으로 6 Hz 이다.
통계적 방법
데이터 분석에는 사회 과학 통계 패키지 버전 22.0 (SPSS, Chicago, Ill)을 사용하였다. 분산이 같을 때, 각각 2 그룹 및 3개 이상의 그룹에 대해 HSD post hoc 시험에 이어 Student's test와 one way ANOVA가 채택되었다. 분산이 같지 않은 경우, 각각 2 그룹 및 3개 이상의 그룹에 대해 Tamhane T2 post hoc 시험에 이어, Welch's t-test 및 Welch 분석이 채택되었다. 데이터는 평균±SD로 제시되었다. P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
결과
AMBA-젤라틴 하이드로겔 합성 및 특성
도 1에 도시된 바와 같이, AMBA를 중합하고 젤라틴에 접합하여 전도성 AMBA- 젤라틴 용액을 생성하였다. 과황산암모늄 (APS)을 사용하여 반응을 촉진시켰다. 사용하기 전에, AMBA-젤라틴 용액을 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 4 μl 와 가교결합시켜 AMBA-젤라틴 하이드로겔을 형성 하였다. 젤라틴 단독과 마찬가지로, 실온에서 AMBA-젤라틴은 콜로이드 형태를 유지할 수 있다. 또한, AMBA는 중합되고, 젤라틴 이식편, 예를 들어 Gelfoam®와 같은 젤라틴 스펀지 상에 APS 처리와 함께 접합될 수 있다(도 2C). 전도도 측정은 AMBA-젤라틴이 젤라틴과 비교하여 상당히 향상된 전도성을 가짐을 보여준다(도 2B). 또한 전도도 측정은 Gelfoam®과 접합된 AMBA (AMBA-Gelfoam)이 Gelfoam® (Gelfoam) 또는 Gelfoam®과 혼합된 AMBA (AMBA + Gelfoam)와 비교하여 전도성이 크게 향상되었음을 보여주었다(도 2C 및 D).
AMBA-젤라틴과 젤라틴 사이의 전도를 비교하기 위해 분리된 심방 심근으로 전극-조직 계면을 시뮬레이션하기 위한 시험관 내(in vivo) 모델을 개발하였다(도 7a). 먼저, 분리된 심방 심근의 활동 전위 진폭을 ECG 모니터링으로 상이한 자극 전압 하에서 검출하였다(도 7b). 심근 작용 전위 진폭은 젤라틴보다 AMBA-젤라틴에서 유의하게 더 큰 것으로 밝혀졌다(도 7c, 7d 및 7h). 다음으로 분리된 심방 심근의 전도성 속도를 MEA 모니터링을 통해 다른 자극 전압에서 검출하였다(그림 7e). 전도성 속도는 젤라틴 단독과 비교하여 AMBA-젤라틴 그룹에서 300 에서 1,000 mV 자극으로 상당히 증가되었다(도 7g 및 7i). 이러한 데이터는 전도성 AMBA-젤라틴 하이드로겔이 젤라틴 단독보다 상당히 높은 전도성 및 개선된 전도성 전파를 나타낸다는 것을 시사한다.
AMBA-젤라틴 하이드로겔은 성인 랫트 심장에서 심장 페이싱 임계 전압을 감소시킴
페이싱 전극 부위에서 심근 내로 AMBA-젤라틴을 주입한 후 심근 임피던스의 변경 및 심장 페이싱 임계 전압의 감소를 평가하기 위해, 랑겐도르프 장치를 사용하여 심장을 관류시키고 심장은 동성 리듬으로 박동하였다(도 8a). 페이싱 프로브를 좌심실에 놓고 0.5V 자극을 사용하였다. 정상 심장 그룹은 완전히 분리된 자극 파와 심장 리듬을 보여 주었다(도 8c). 광학 매핑은 전극 삽입 부위에 작은 국소 탈분극 영역을 보여주었다(도 8d 및 8e). 0.5 V 자극의 젤라틴 그룹에서 ECG는 또한 완전히 분리된 자극 파와 심장 리듬 기록을 보여 주었고(도 8f) 광학 매핑은 젤라틴 주입 영역에서 노이즈를 보여주었고, 이는 젤라틴의 낮은 전도도를 반영하였다(도 8g 및 8h). AMBA-젤라틴 그룹에서, 0.5 V 자극은 자율 심장 리듬에서 페이싱 리듬으로 리듬을 변경하기에 충분히 높았으며(도 8i), 광학 매핑 결과는 자극을 받는 AMBA-젤라틴 주사 부위에서 이소성 심작조율기를 감지하였다 (도 8j 및 8k). 이들 데이터는 0.5 V 미만에서 전도성 생체재료로의 자극이 페이싱 임계값을 감소시킴으로써 심장 탈분극을 강화시킨다는 것을 제안하였다. 심장의 3 개 그룹에서 심장 탈분극을 유도하는데 필요한 최저 전압을 추가로 평가하기 위해, 페이싱 심장에 대한 임계값을 식별하기 위해 자극 전압을 증가시켰다(페이싱 동기화 및 자율 심장 박동수). 결과는 AMBA-젤라틴 주사가 정상 전극 또는 전극-젤라틴 페이싱과 비교하여 심장 페이싱 임계 전압을 상당히 감소시켰음을 보여주었다(도 8b).
심근 내 AMBA-젤라틴이 페이싱 전기생리학적 성능을 개선함
정상, 젤라틴 또는 AMBA-젤라틴 그룹에서의 랑겐도르프 관류의 정상 심장은 6 Hz 및 4 ms 지속 시간으로 5.0 V 자극을 사용하여 일정한 리듬을 유지하였다. 페이싱 리듬 하의 ECG 데이터는 전극(정상), 젤라틴 및 AMBA-젤라틴 그룹에 대해 분석되었다(도 9a, 9b 및 9c). AMBA-젤라틴 그룹은 정상 전극 및 젤라틴 그룹과 비교하여 Q-T 지속 시간이 크게 감소하였다(도 9d). 이는 좌심실과 우심실 사이의 더 잘 조정된 수축을 시사한다[23].
광학 맵핑 데이터를 80% 활동 전위 지속 (80 % APD) 시간의 계산에 사용하였다. 각 그룹에서 대표적인 광학 이미지 및 80 % APD 그래프가 도 9e에 도시되어있다. 광학 매핑 결과 ECG 결과를 확인하여 정상 및 젤라틴 그룹에서 80% APD 시간이 AMBA-젤라틴 그룹보다 상당히 길다는 것을 보여주며, 반면 5.0V 자극으로 동성 리듬과 AMBA-젤라틴 그룹 사이에 80 % APD 시간에 큰 차이가 없음을 보여주었다(도 9f).
광학 맵핑 데이터는 또한 3 개의 그룹에서 심근 전도성 속도 (CV)를 도시하였다. 정상 심근 및 젤라틴 그룹의 전도성 속도는 동성 리듬 및 AMBA-젤라틴 그룹에 비해 상당히 느리지만 5.0V 자극 동안 동성과 AMBA-젤라틴 그룹 사이의 전도성 속도에는 유의한 차이가 없었다(도 9g 및 9h). 이러한 결과는 AMBA-젤라틴 페이싱이 정상 전극 및 젤라틴 페이싱과 비교하여 생리학적 전기조건에 더 가깝다는 것을 나타내고, 이를 동성 리듬과 비교하여 유사한 Q-T 간격, 80 % APD 시간 및 CV에 반영하였다.
AMBA-젤라틴 하이드로겔은 생체 내 페이싱 임계 전압을 감소시키고 페이싱 전기생리학적 성능을 개선시킴
페이싱 특성을 평가하기 위해, 아데노신(AD)을 하대 정맥을 통해 주입하여 생체 내 심박수를 감소시켰다(도 10a). AD 주사 후, 동성 결절을 ECG에서 역 P 파와 감소된 심박수로 억제하였다(도 11). 대표적인 ECG는 정상 조직 및 젤라틴 그룹에서 0.5 V/6 Hz 및 4 ms 지속시간을 사용한 전극 자극이 완전히 분리된 페이싱 기록 및 자율 리듬을 초래하는 반면, 심장 리듬은 AMBA-젤라틴 그룹에서 증가된 심박수를 갖는 심장 박동 리듬으로 완전히 조정된 리듬으로 변화되었다(도 10c, 10d 및 10e). 통계 결과는 AMBA-젤라틴 그룹에서 페이싱 임계 전압이 정상 전극 및 젤라틴 그룹에 비해 현저하게 감소되었음을 보여주었다(10b). Q-T 간격 분석을 정상, 젤라틴 및 AMBA-젤라틴 그룹에서 각각 수행하였다(각각 도 10f, 10g 및 10h). Q-T 지속 기간은 AMBA-젤라틴 그룹과 비교하여 정상 및 젤라틴 그룹에서 유의하게 증가하였다(도 10i). 이러한 데이터는 AMBA-젤라틴 하이드로겔 주사가 페이싱 임계 전압을 감소시키고 생체 내 페이싱 전기생리학적 성능을 개선시키며, 이는 랑겐도르프 분리 랫트 심장 모델에서 발견된 것과 일치함을 시사한다.
종합하면, AMBA-젤라틴은 더 높은 전극-조직 계면을 제공함으로써 심장 페이싱 임계 전압을 감소시키고 페이싱 전기생리학적 성능을 향상시킬 수 있고 전극과 세포막 사이의 거리를 감소시킬 수 있다(도 12).
AMBA-젤라틴 하이드로겔의 전도성 생체재료가 개발되어 심장 페이싱 임계 전압을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 전도성 생체재료는 심박 조율기 에너지 소비를 줄이는 데 유용할 수 있다.
임상 적용 동안 심근 탈분극의 시작이 국소 섬유증으로 인한 증가된 임피던스를 극복해야 할 때, 심박조율기의 배터리 수명이 기능적인 문제가 된다. 전극 표면적 감소[24], 음극 전극에 미세 다공성 구조 채택[17], 새로운 재료의 사용 [25-27] 및 국소 섬유증 억제에 스테로이드-용출 리드의 도입[28]과 같은 몇가지 새로운 기술이 개발되었다. 이러한 기술을 적용하면 심박조율기 임계 전압을 감소시켰고[29, 30], 지난 수십 년 동안 심박조율기 배터리 수명이 연장되었다[31,32]. 그러나, 현재 심박조율기의 에너지 소비는 여전히 높으며 대부분의 환자는 소진된 배터리를 교체하기 위해 두 번째 작업이 필요하다[33].
전극-심근 조직 계면이 심장 페이싱에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 외부 페이싱을 사용하면 전극 끝의 전류가 전기장을 생성해야 한다. 심근 세포의 전기장이 임계 전압에 도달하면, 세포막에서 전압 게이트 나트륨 채널을 열고 활동 전위를 생성한다[28]. 심근 섬유증이 증가함에 따라 조직 임피던스는 심근 전도성을 감소시키고 더 높은 페이싱 임계값에 기여하는 전기 신호 전파를 지연시킨다[18]. 감소된 심근 조직 임피던스는 탈분극 역치를 감소시킬 수 있다. 전극-조직 계면에 AMBA-젤라틴 하이드로겔을 주입하는 것은 심근 세포 임피던스를 감소시킴으로써 대조군과 비교하여 심근 세포막 전압을 상당히 증가시키는 것으로 나타났다.
생체 외 연구 결과, AMBA-젤라틴에 대한 페이싱 임계 전압이 1 v 미만이고, 대조군 또는 젤라틴 페이싱 전극보다 3-4 배 더 낮았다. 유사하게, 생체 내 AVB 연구는 AMBA-젤라틴에 대한 역치가 0.5 v 미만이고 대조군 또는 젤라틴 페이싱 전극보다 3 배 이상 낮음을 보여 주었다. 생체 외 및 생체 내 데이터 모두 페이싱 임계 전압이 현재 임상적으로 사용되는 1.5 v 보다 낮음을 보여주었다[29, 30]. 이러한 데이터는 AMBA-젤라틴 페이싱이 임계값을 상당히 감소시켜 에너지 소비를 감소시킬 수 있음을 시사한다.
이전의 연구에서 전극 표면과 세포막 사이의 거리가 전극 기하 반경보다 길 때 임계 전압이 상당히 증가함을 발견하였다[34]. 현재, 전극 표면으로부터 세포막까지의 거리는 도 12에 도시된 바와 같이 전극-조직 계면에 AMBA-젤라틴 하이드로겔을 주입함으로써 상당히 감소되었다. 이는 세포막에 더 강한 전기장을 만들어 임계값을 줄이는데 도움이 된다.
전도성 생체재료가 생성될 때, AMBA는 겔화가 어렵고 생체적합성이 좋지 않기 때문에 심근 조직으로의 직접 주사에 사용될 수 없다는 것이 밝혀졌다. 생체적합성을 향상시키고 점도 또는 겔 형성을 증가시키기 위해, AMBA를 콜라겐으로부터 유래된 천연 단백질인 젤라틴에 접합시켰다.
건강한 랫트의 페이싱 전기생리학 또한 조사되었으며, 페이싱 전기생리학적 성능은 대조군 또는 젤라틴 페이싱 전극과 비교하여 AMBA-젤라틴의 생리학적 전기적 조건에 더 가까운 것으로 밝혀졌다. 데이터는 AMBA-젤라틴 주사가 정상 전극 간격에 비해 QT 지속 시간 및 80 % APD 시간을 감소시켰음을 보여준다. 또한, AMBA-젤라틴 페이싱 하에서의 전체 심장 전도 속도는 정상 전극 페이싱에 비해 상당히 증가되었다. QT 간격은 심실 전기 탈분극 및 재분극을 나타낸다. 연장된 QT 간격은 일반적으로 심실내 전도 지연의 결과이며 진행성 심부전에 기여할 수 있다. AMBA-젤라틴 페이싱을 이용한 개선된 심장 전도 및 단축된 QT 간격은 심실 페이싱뿐만 아니라 심실 기능 장애 및 진행성 심부전 감소에 임상 적용할 수 있다.
실시예 5 - 섬유성 흉터 조직에서 AMBA-젤라틴 하이드로겔은 전기전도성을 개선시킴
방법:
심근 경색 및 생체재료 주사
성체 스프라그 다울리 (Sprague Dawley, SD) 랫트 (230 내지 260 g)를 Charles River Laboratories (Saint-Constant, QC, Canada)로부터 구입하였다. 모든 동물 프로토콜 및 절차는 대학 건강 네트워크의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 동물 연구에서의 실험 절차는 실험동물의 관리 및 사용가이드(NIH, 8 판, 2011)에 따라 수행되었다. 랫트를 기계적으로 환기시키고 2 % 이소플루란으로 마취시켰다. 심장을 노출시키기 위해 왼쪽 측면 흉강 절제술을 시행하였고, 심근 경색(MI)을 만들기 위해 왼쪽 전방 하강 관상 동맥을 결찰하였다. 이어서, 흉부를 닫고, 동물은 진통을 위해서 부프레노르핀 (0.05 mg/kg)을 제공받았다. 모든 동물을 식염수 (n = 12), 젤라틴 (n = 12) 또는 AMBA-젤라틴 (n = 12) 주사 그룹으로 무작위화하였다. MI 후 1주차에, 심장에 접근하기 위해 두 번째 흉강 절개술을 수행하였으며, 심실 흉터를 좌심실의 전방 벽에 흰색-회색 영역으로 시각화하였다. 28 게이지 바늘(BD Biosciences, Mississauga, ON)을 사용하여 100 μL의 식염수, 젤라틴 또는 AMBA-젤라틴을 하나의 흉터 및 2개의 경계 영역에 주사하였다. 이어서, 흉부를 닫고 동물은 진통을 위해서 부프레노르핀 (0.05 mg/kg)을 제공받았다. 광학 매핑 실험을 위해 생체재료 주사 후 12주차에 모든 동물을 희생시켰다.
심장 전기생리학
8-리드 카테터 ECG 기록방법 및 미소전극 어레이(MEA)를 사용하여 전체 및 국소 심장 표면 작용 전위를 평가하였다.
원격측정 ECG
ECG 기록은 밀러 원격측정 시스템(Millar Inc., Houston, Texas)을 사용하여 의식이 있고, 자유롭게 움직일 수 있는 동물로부터 획득하였다. 모든 기록은 24시간 동안 획득하였다. 주사 후 12주차에 AMBA-젤라틴 또는 젤라틴을 주사한 동물로부터 기록을 얻었다. 모든 ECG 흔적을 히스토그램 소프트웨어(Millar Inc.)를 사용하여 맹검(blinded) 심장병전문의에 의해 평가하였으며, 단일 및 다중 형태의 조기 심실 수축(premature ventricular contractions, PVCs) 뿐만 아니라 비지속 및 지속 심실 빈맥(ventricular tachycardia, VT)을 포함하여 부정맥 사건의 총 수와 빈도를 결정하였다. 램버스 협약 가이드라인[21]에 따라, VT는 4개 이상의 PVC의 런(run)으로 정의하였고, 15 비트 초과의 빠른 심실 리듬으로서 VT를 지속시켰다.
프로그래된 전기 자극
프로그램된 전기 자극 (PES) 연구를 Nguyen 등으로부터 수정된 방법을 사용하여 주사 12주 후에 수행하였다. 요약하면, 각 동물을 기계적으로 환기시키고, 2 % 이소플루란으로 마취시켰다. 모니터링 및 후속 오프라인 분석을 위해 아날로그-디지탈 변환기를 통해 컴퓨터에 연결된 27 게이지 피하 전극을 사용하여 표면 ECG를 기록하였다(Lab Chart 6 Pro, AD Instruments). 흉골에서 중앙선 절개가 이루어졌고, 가슴을 열고 심장의 심장 외막 표면을 노출하였다. 두 개의 심장 외막 자극 전극 바늘(Millar Inc.)을 정상 우심실 심근에 삽입하였다. 이어서, PES 연구를 분리된 자극제-발전기 (STG-4002, Multichannel Systems, Germany)를 사용하여 수행하였다. 자발적인 리듬에서 적용된 버스트 (120 ms 주기 길이), 단일 (70 ms 주기 길이), 이중 (60 ms 주기 길이) 및 삼중 (50 ms 주기 길이) 추가 자극을 포함한 표준 임상 PES 프로토콜을 사용하였다. 심장은 8회 또는 이어서 단일 추가-자극의 기차로 3번 도전을 받았다. PVC가 유도되지 않은 경우, 이 절차를 반복하여 2회, 필요한 경우 3회 추가 자극으로 3번 과제를 적용하였다. PES 프로토콜은 지속(≥15 VT) 또는 지속되지 않은 VT가 유도되거나 프로토콜이 소진될 때 중지하였다. PVC 및 VT를 모든 경색 동물에서 8개의 컨디셔닝 자극의 트레인을 적용 또는 최대 3회 추가 자극을 적용하여 유도하였다. 부정맥 감수성을 다음과 같이 유도성 지수를 사용하여 결정하였다: PVC 또는 VT가 없는 심장은 0 점을 받음; 3 회의 추가 자극으로 유도된 비-지속 PVC 또는 VT (≤15 비트)는 1의 점수를 부여받음; 3 회의 추가 자극으로 유도된 지속된 PVC 또는 VT (> 15)는 2의 점수를 부여받음; 2 회의 추가 자극으로 유도 된 비지속 PVC 또는 VT는 3의 점수를 부여받음; 2 회의 추가 자극으로 유도된 지속된 PVC 또는 VT는 4의 점수를 부여받음; 1 회의 추가 자극으로 유도된 비-지속 PVC 또는 VT는 5의 점수를 부여받음; 1 회의 추가 자극으로 유도된 지속된 PVC 또는 VT는 6의 점수를 부여받음; 8의 트레인 후 유도된 지속 또는 비-지속 PVC 또는 VT는 7의 점수를 부여받음; 페이싱 종료 후 수축기는 8의 점수를 부여받음. 점수가 높을수록 부정맥의 유도력이 커진다[22].
광학 맵핑
12주 말 시점에 심장 마비 용액을 사용하여 동물을 안락사시키고, 심장은 정지되었으며, 랑겐도르프 (120142, Radnoti, Monrovia, California) 기술을 사용하여 관류시켰다(식염수: n = 6, 젤라틴: n = 6, AMBA-젤라틴: n = 6). 심장을 얼음에서 심장마비 용액 및 전압-감응성 염료(di-4-ANEPPS, D1199, Life Technologies)로 10분간 관류시켰다. 전자-다중 전하-결합된 장치 카메라 시스템(Evolve 128, Photometrics, Tucson, Arizona)을 사용하여 전기 전도를 측정하고, 등시성 맵을 작성하였다. 비디오는 브레인비젼 소프트웨어를 사용하여 분석되었다(Brainvision Inc. Tokyo, Japan).
심장 좌심실 기능
심장 기능은 경색 전에(0), 생체재료 주사시, 및 주사 후 2주 및 4주에 심초음파(echo, Vivid7, General Electric Healthcare)를 사용하여 평가하였다. 다음 파라미터를 에코(n = 6/그룹)로 계산하였다: 좌심실 내부 수축기 치수(LVID), 좌심실(LV) 내부 이완기 치수(LVIDd), 분수 단축 비율(LVFS) 및 방출 분율의 백분율(LVEF).
통계 분석
데이터는 평균±표준 편차로 표시된다. p<0.05로 설정된 임계 α-레벨로 GraphPad Prism 소프트웨어(v.6.0)를 사용하여 분석을 수행하였다. 스튜던트-검정(Student's t-test)은 두 그룹 간의 평균 비교에 사용되었고 3개 이상의 그룹 간의 평균 비교는 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 상이한 시점에서 동일한 동물을 평가한 심전도 및 심초음파 분석의 경우, 반복-측정 ANOVA가 사용되었다. ANOVA F 값이 유의한 경우, 그룹 간 차이는 Tukey의 사후 테스트를 사용하여 결정되었다.
결과
전도성 생체재료는 감소된 심근 섬유 조직 저항성을 갖는 섬유성 흉터 조직 장(field) 전위 진폭 및 전기적 자극 전파를 향상 시킴
생체 내 심장 흉터/섬유성 조직의 전기적 활성 및 조직 저항성에 대한 전도성 생체재료의 효과를 랫트 MI 모델을 사용하여 평가하였다. 주사 4주 후, 36개의 리드 가요성 미세전극 어레이(MEA)를 사용하여 국소 전기장 전위를 평가하고 흉터 영역을 가로지르는 전기적 자극 전파를 검출하였다(도 13A). AMBA-젤라틴이 주입된 경색 심장은 젤라틴이 주입된 경색 심장과 비교하여 더 큰 흉터 전계 전위 진폭을 가졌다(도 13B 및 C, N = 6/그룹).
전도성 생체재료의 생물학적 전도성 특성을 평가하기 위해, 주사 4주 후, 수축하는 동안 전체 심장 표면 전계 전위 진폭을 측정하기 위해 정상적인 심근에 배치된 2개의 리드, 외각 존에 2개의 리드 및 섬유성 흉터 부위에 2개의 리드를 가진 8-리드 카테터를 사용하였다(도 13D-F). AMBA-젤라틴-주입된 심장은 젤라틴이 주입된 경색된 심장과 비교하여 가장 높은 흉터 전계 전위 진폭 비(흉터 진폭/원격 진폭)를 가졌다(p <0.01, N = 5/그룹). 이러한 결과는 AMBA-젤라틴 주사가 섬유성 흉터 조직에서 전기적 활성을 향상시킴을 시사한다.
AMBA-젤라틴 주사된 경색된 렛트 심장에서 전도성 생체 재료는 MI 후의 자발적인 부정맥의 비율을 감소시킴
심장 경색에 대한 감수성을 증가시키기 위한 경색 흉터 내로의 전도성 중합체의 주사에 대한 우려를 완화시키기 위해, 외래 원격 ECG 기록을 섬유성 흉터 내로 전도성 물질을 주사한 후 4 주에 획득하였다. 72 시간 연속 기록에서, 경색 동물은 일관된 조기 심실 수축 (PVC)을 보였지만 (도 14A), AMBA-젤라틴 그룹은 시간당 PVC 비율이 더 낮았다 (도 14, p <0.05 vs 젤라틴, N = 5).
전도성 생체재료 주입으로 유도 부정맥을 감소시킴
심장 부정맥에 대한 경색된 심장의 민감성을 조사하기 위해, 표준 임상 방법, 프로그램된 전기 자극(PES)을 사용하여 부정맥을 유도하였다. 생체 물질 주입 4주 후, 랫트 심장에 PES를 적용하여 PVC 유도에 대한 생체재료 주입의 효과를 측정하였다(도 14C). PES로 도전했을 때, 유도성 지수에 근거한 부정맥 감수성은 AMBA-젤라틴을 주사한 랫트에서 젤라틴을 주사한 랫트에 비해 현저하게 더 낮았고, 이는 더 낮은 부정맥 감수성을 제시한다(도 14D, p<0.01, N = 5/그룹).
전도성 생체재료의 주입은 전반적인 섬유성 흉터 조직 전계 전위 진폭을 향상시키고, 생체 내 전도 속도를 개선함
좌심실 전기 신호 전도 속도를 직접 평가하기 위해, 생체재료-주사된 동물에서 광학 맵핑 기술을 사용하였다. 건강한 랫트(MI가 없음)의 심장, 및 젤라틴 단독 또는 AMBA-젤라틴 MI 후 주사된 심장을 연구의 끝(4주 차에)에 랑겐도르프-관류법으로 절제하였다. 전압-민감성 염료(di-4-ANEPPS)를 사용하여 모든 그룹에서 정상 및 경색 흉터 영역을 가로지르는 전기적 자극 전도 속도를 평가하였다(도 14E-G). 도 5H는 젤라틴 주사된 심장이 정상 심장과 비교하여 종 방향 전도 속도를 상당히 감소시켰음을 보여준다. 그러나, AMBA-젤라틴-주입된 심장에서의 종 방향 전도 속도는 정상 심장에 가까웠고 젤라틴-주입된 심장에서 보다 상당히 더 높았다(도 14H, p<0.01, N = 6/그룹). 이러한 결과는 AMBA-젤라틴 주사가 손상 후 심장 전기 신호 전도를 개선시킨다는 것을 시사한다.
전도성 생채재료는 MI에 따른 추정된 동기화 수축 및 보존된 심장기능을 개선함
AMBA-젤라틴 또는 젤라틴이 주사된 심장을 생체재료 주사와 관련하여 -7 일에서 +28 일까지 심초음파법(Echo)을 사용하여 평가하였다(도 15). 모든 그룹은 기준선에 비해 0 일에 감소된 좌심실 분획 단축 (LVFS), 증가된 LV 내부 수축기 치수 (LVID)를 보여주었지만, 두 그룹간에 유의한 차이는 없었다. 젤라틴 대조군은 -7 일에서 +28 사이에 증가된 LVID 및 감소된 FS를 나타냈다. 그러나, AMBA- 젤라틴은 주사 후 28 일에 이들 파라미터를 개선시켰으며, 이는 젤라틴 대조군보다 더 낮은 LVID를 갖는 상당히 큰 FS를 나타냈다(p <0.01, N = 6). 더 낮은 LVID는 아마도 개선된 동기화 수축으로 인한 부정적인 심장 리모델링의 감소를 암시한다.
실시예 6
AMBA-젤라틴 스펀지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. AMBA 젤라틴 스펀지 및 일반적인 젤라틴 스펀지(AMBA 폴리머 없음)를 각각 심장 세포 배양 배지에 침지시키고 심근 세포를 각 스펀지에 로딩하였다.
세포를 약 2주 동안 성장시키고 영상 분석을 사용하여 칼슘 방출을 측정함으로써 수축의 동기화를 시험하였다. AMBA-젤라틴 폴리머에서 성장한 세포는 동기화된 반면, AMBA-젤라틴 폴리머 없이 성장한 세포는 동기화되지 않았다.
본 개시가 그의 예시적인 실시예를 참조하여 특히 도시되고 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에 대한 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허출원이 전체적으로 참고로 포함되는 것으로, 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일할 정도로 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함된다.
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Claims (57)

  1. 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 포함하는 생체적합성 전도성 생체재료로서, 전도성 폴리머는 아미노메톡시벤조산(AMBA) 폴리머를 포함하고, 전도성 폴리머는 생체적합성 성분에 접합된, 생체적합성 전도성 생체재료.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AMBA는 3-아미노-4-메톡시벤조산 (3-4-AMBA), 4-아미노-2-메톡시벤조산 (4-2-AMBA), 4-아미노-3-메톡시벤조산 (4-3-AMBA), 2-아미노-5-메톡시벤조산 (2-5-AMBA), 및 2-아미노-4-메톡시벤조산 (2-4-AMBA), 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체적합성 성분은 젤라틴, 키토산, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 알지네이트 및 이들의 유도체 및 혼합물로부터 선택되거나, 또는 생체적합성 성분은 합성 제품(synthetic product)을 포함하는 것인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  4. 제3항에 있어서, 상기 합성 제품은 생분해성 합성 폴리머를 포함하는 것인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  5. 제3항에 있어서, 상기 생체적합성 성분은 젤라틴이거나 젤라틴을 포함하는 것인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전도성 폴리머는 생체적합성 성분에 공유 접합되는 것인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체재료는 액체 용액, 하이드로겔, 막(membrane), 3D-패치 또는 스펀지, 시트(sheet), 또는 이식용 메쉬인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체재료는 하이드로겔이고, 선택적으로 상기 하이드로겔은 가교된 것인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 10-6 S/cm 이상 또는 10-5 S/cm 이상, 또는 10-4 S/cm 이상 또는 10-3 S/cm 이상 또는 10-2 S/cm 이상의 전도도를 갖는 것인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 전도성 폴리머를 포함하지 않는 대조군 생체재료 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 또는 10배 이상의 전도도를 갖는 것인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분의 몰비는 30:1 내지 60:1인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 배양 배지 및 심근 세포(cardiomyocytes)를 추가로 포함하는 것인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  13. 아미노메톡시벤조산(aminomethoxybenzoic acid, AMBA) 폴리머 및 젤라틴을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 배양 배지 및 심근 세포를 추가로 포함하는, 전도성 하이드로겔.
  14. 제13항에 있어서, 상기 AMBA 폴리머는 젤라틴의 하나 이상의 아미노기에 접합된 것인, 전도성 하이드로겔.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 하이드로겔은 10-6 S/cm 이상, 10-5 S/cm 이상, 10-4 S/cm 이상 또는 10-3 S/cm 이상 또는 10-2 S/cm 이상의 전도도를 갖는 것인, 전도성 하이드로겔.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 하이드로겔은 AMBA 폴리머를 포함하지 않는 젤라틴 하이드로겔 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 또는 10배 이상의 전도도를 갖는 것인, 전도성 하이드로겔.
  17. 제13항 또는 제14항에 있어서, 하이드로겔의 수분 함량은 하이드로겔의 80 중량% 내지 90 중량%인, 전도성 하이드로겔.
  18. 제1항 또는 제2항의 생체적합성 전도성 생체재료 또는 제13항 또는 제14항의 전도성 하이드로겔을 이용하는 장치.
  19. 제18항에 있어서, 상기 장치는 전극을 포함하는 이식가능한 장치인, 장치.
  20. 제19항에 있어서, 상기 장치는 생체적합성 전도성 생체재료 또는 전도성 하이드로겔에 의해 적어도 부분적으로 코팅된 하나 이상의 전극을 포함하는 것인, 장치.
  21. 제18항에 있어서, 상기 장치는 심장박동조율기(cardiac pacemaker)인, 장치.
  22. 제21항에 있어서, 상기 장치는 단일 챔버 심박조율기, 이중 챔버 심박조율기 또는 심실 심박조율기인, 장치.
  23. 제18항에 있어서, 상기 장치는 이식가능한 심장 제세동기(cardioverter defibrillator)인, 장치.
  24. 전극; 선택적으로 심박조율기 또는 ICD; 및 아미노메톡시벤조산(AMBA) 폴리머를 포함하는 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 포함하는 생체적합성 전도성 생체재료;를 포함하는 이식가능한 장치, 및 설치 시 생체적합성 전도성 생체재료가 전극을 둘러싸도록 장치를 설치하기 위한 지침을 포함하는 키트.
  25. 이를 필요로 하는 대상의 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체재료로서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 포함하고, 상기 전도성 폴리머는 아미노메톡시벤조산(AMBA) 폴리머를 포함하며,
    상기 심장 질환은 심근 경색, 허혈성 심근, 심근 섬유증, 심장 마비, 방실 차단, 부정맥, 서맥 또는 전도 이상인 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  26. 제25항에 있어서, 상기 심장 질환은 심장 수술로부터 발생된 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 심장의 영향을 받는 영역 안으로 또는 위로 도입되기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 생체적합성 전도성 생체재료는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 심장 전도도를 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 또는 10배 이상, 선택적으로 20배까지 증가시키기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 대상의 심장 박동을 순차적으로 동기화하기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 심장 질환이 방실 차단이고, 생체적합성 전도성 생체재료는 심장 판막을 교체한 후 심장 수술로 인한 방실 상태 또는 심장 질환을 회복시키기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  31. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 심장 질환은 심근 섬유증이고, 생체적합성 전도성 생체재료는 섬유성 흉터 조직 내로 또는 위로 도입되는 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  32. 제31항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 심장 부정맥의 발생을 감소시키기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  33. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 심장박동조율기의 페이싱(pacing) 임계값 감소 및/또는 대상체에서 심장 페이싱에 대한 심근 반응성을 증가시키기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  34. 제33항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 대상의 심장에 삽입된 심박조율기의 전극에 인접하게 도입하기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  35. 제34항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 심박조율기의 전극 주위에 코팅되는 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  36. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 비처리된 대조군과 비교하여 심장 페이싱 임계 전압을 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 또는 5배 이상 감소시키기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  37. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 비처리된 대조군의 심장 심박조율기 페이싱과 비교하여 심장 작용 전위를 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상 증가시키기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  38. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 비처리된 대조군과 비교하여 심장 전도성 속도를 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상 증가시키기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  39. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 비처리된 대조군과 비교하여 QT 간격 지속기간 및/또는 심장 작용 전위 지속기간을 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상 감소시키기 위한 것인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  40. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 대상이 포유동물인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  41. 제40항에 있어서, 상기 포유동물은 랫트, 마우스 또는 인간인, 심장 질환 개선 또는 치료용 생체적합성 전도성 생체 재료.
  42. 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 접합시키는 것을 포함하고, 상기 전도성 폴리머는 아미노메톡시벤조산(AMBA) 폴리머를 포함하는 것인, 제1항 또는 제2항의 생체적합성 전도성 생체재료의 제조방법.
  43. 전도성 폴리머 및 생체적합성 성분을 공액(conjugating)시키는 것을 포함하고, 상기 전도성 폴리머는 아미노메톡시벤조산(AMBA) 폴리머를 포함하며,
    상기 접합된 전도성 폴리머 및 생체 적합성 성분을 가교 결합(cross-linking)시키는 것을 포함하는 것인, 제13항 또는 제14항의 전도성 하이드로겔의 제조방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 제조방법은 AMBA 및 젤라틴을 조합하는 것, AMBA 및 젤라틴을 중합하여 공액된 AMBA-젤라틴을 생성하는 것, 및 AMBA-젤라틴을 가교하거나 AMBA-젤라틴을 냉각하는 것을 더 포함하는 것인, 제조방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 AMBA 및 젤라틴은 APS를 사용하여 중합된 것인, 제조방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 AMBA-젤라틴은 EDC를 사용하여 가교된 것인, 제조방법.
  47. 삭제
  48. 제5항에 있어서, 상기 생체적합성 전도성 생체재료는 심장 질환의 개선 또는 치료용이며, 상기 심장 질환은 심근 경색, 허혈성 심근, 심근 섬유증, 심장 마비, 방실 차단, 부정맥, 서맥 또는 전도 이상인, 생체적합성 전도성 생체재료.
  49. 제48항에 있어서, 상기 심장 질환은 심장 수술로부터 발생된 것인, 생체적합성 전도성 생체 재료.
  50. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 전도성 하이드로겔은 심장 질환의 개선 또는 치료용이며, 상기 심장 질환은 심근 경색, 허혈성 심근, 심근 섬유증, 심장 마비, 방실 차단, 부정맥, 서맥 또는 전도 이상인, 전도성 하이드로겔.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 심장 질환은 심장 수술로부터 발생된 것인, 전도성 하이드로겔.
  52. 제18항에 있어서, 상기 장치는 심장 질환의 개선 또는 치료용이며, 상기 심장 질환은 심근 경색, 허혈성 심근, 심근 섬유증, 심장 마비, 방실 차단, 부정맥, 서맥 또는 전도 이상인, 장치.
  53. 제52항에 있어서, 상기 심장 질환은 심장 수술로부터 발생된 것인, 장치.
  54. 제24항에 있어서, 상기 키트는 심장 질환의 개선 또는 치료용이며, 상기 심장 질환은 심근 경색, 허혈성 심근, 심근 섬유증, 심장 마비, 방실 차단, 부정맥, 서맥 또는 전도 이상인, 키트.
  55. 제54항에 있어서, 상기 심장 질환은 심장 수술로부터 발생된 것인, 키트.
  56. 심장 질환을 개선 또는 치료하기 위한 제13항 또는 제14항의 전도성 하이드로겔을 제조하기 위한 키트로서, 상기 심장질환은 심근 경색, 허혈성 심근, 심근 섬유증, 심장 마비, 방실 차단, 부정맥, 서맥 또는 전도 이상인, 제조키트.
  57. 제56항에 있어서, 상기 심장 질환은 심장 수술로부터 발생된 것인, 제조키트.
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