WO2015025958A1 - ペースメーカー組織片の製造方法 - Google Patents

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WO2015025958A1
WO2015025958A1 PCT/JP2014/072031 JP2014072031W WO2015025958A1 WO 2015025958 A1 WO2015025958 A1 WO 2015025958A1 JP 2014072031 W JP2014072031 W JP 2014072031W WO 2015025958 A1 WO2015025958 A1 WO 2015025958A1
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pacemaker
cells
cell
tissue piece
extracellular matrix
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PCT/JP2014/072031
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English (en)
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明石満
松▲崎▼典弥
伊藤浩
中村一文
斎藤幸弘
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国立大学法人大阪大学
国立大学法人岡山大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
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    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for manufacturing a pacemaker tissue piece and a pacemaker tissue piece.
  • Bradyarrhythmia refers to an arrhythmia in which the pulse becomes very slow or interrupted due to malfunction or stoppage of the sinus node of the heart. If sufficient bradycardia cannot be maintained due to bradyarrhythmia, various symptoms such as dizziness and heart failure are caused.
  • a common treatment for bradyarrhythmias is implantation of a cardiac pacemaker device. However, transplantation of pacemaker devices has various problems such as low biocompatibility, need for reimplantation due to battery life, breakage, infection and interference with other devices.
  • Non-Patent Document 1 when myoblasts were transplanted into the heart of a mouse, about 39.2% of the cells were alive 30 minutes after transplantation, but the engraftment rate was 72 hours later. Is reduced to about 7%.
  • Patent Document 1 discloses that an embryonic stem cell-derived pacemaker cell is prepared by introducing an HCN4 gene responsible for pacemaker current generation into an embryonic stem cell to induce differentiation into a cardiac muscle cell.
  • the present disclosure provides a new pacemaker tissue piece manufacturing method and pacemaker tissue piece that can function as a biological pacemaker.
  • the present disclosure is a method for producing a pacemaker tissue piece including forming a three-dimensional tissue piece in which pacemaker cells are stacked, and the three-dimensional tissue piece includes a pacemaker cell and an extracellular part.
  • the three-dimensional tissue piece is formed by laminating and culturing coated cells in which the surface of pacemaker cells is coated with a coating containing extracellular matrix components, or the cell layer of the pacemaker cells and the formation of the three-dimensional tissue piece.
  • the present invention relates to a method for producing a pacemaker tissue piece comprising alternately laminating and culturing layers containing an extracellular matrix component.
  • the present disclosure relates to a pacemaker tissue piece including a pacemaker cell and an extracellular matrix component, wherein the pacemaker cell is laminated via the extracellular matrix component to be three-dimensionally organized.
  • a new three-dimensional tissue piece that can function as a biological pacemaker and a manufacturing method thereof can be provided.
  • FIG. 1 is an example of a phase contrast photograph of a pacemaker tissue piece produced in Example 1.
  • FIG. 2 is an example of a graph showing changes in the number of beats per minute before and after the drug addition of the pacemaker tissue piece produced in Example 1.
  • FIG. 3 is an example of a graph showing the relationship between the number of cardiomyocyte layers and the number of beats in Example 4.
  • the present disclosure is based on the knowledge that when pacemaker cells are cultured in a state of being laminated via an extracellular matrix component, the pacemaker cells are three-dimensionally organized as a cell layer, and a pacemaker tissue piece showing uniform pulsation is obtained. Based on.
  • the present disclosure makes it possible to eliminate the scaffold material used for forming and holding the cell sheet by laminating pacemaker cells via the extracellular matrix component, and to easily reduce the thickness of the extracellular matrix between cells. Based on the knowledge that it can be controlled.
  • the action mechanism in which the pacemaker tissue piece obtained by the production method of the present disclosure exhibits uniform pulsation is not clear, but is presumed as follows. That is, when pacemaker cells are cultured in a state in which they are stacked via an extracellular matrix, the intercellular adhesion of pacemaker cells is strengthened, whereby individual pacemaker cells constituting a tissue piece are synchronized with each other. It functions as a single organization and is considered to exhibit a uniform beat. However, the present disclosure is not limited to this mechanism.
  • the “three-dimensional tissue piece” refers to a cell structure in which pacemaker cells are three-dimensionally stacked, including pacemaker cells and extracellular matrix components.
  • the “pacemaker tissue piece” refers to a three-dimensional tissue piece that can exhibit spontaneous pulsation, and preferably includes a pacemaker cell derived from a pluripotent stem cell and an extracellular matrix component, This refers to three-dimensionally organized pacemaker cells stacked via an outer matrix.
  • the pacemaker tissue piece of the present disclosure may further contain cells other than pacemaker cells.
  • “stacking pacemaker cells via an extracellular matrix component” means culturing by laminating and culturing coated cells in which the surface of the pacemaker cell is coated with a coating containing the extracellular matrix component, It can be carried out by alternately laminating cell layers and layers containing extracellular matrix components.
  • a “pacemaker cell” is a cell having a pacemaker function, and in one or a plurality of embodiments, is a cell having a pacemaker function obtained by inducing differentiation of a pluripotent stem cell, and having an activity.
  • a pacemaker cell refers to a cardiomyocyte in which an HCN channel is expressed in one or a plurality of embodiments, preferably a cardiomyocyte in which an HCN4 channel is expressed.
  • extracellular matrix component refers to a substance that fills the space outside a cell in a living body and performs a function such as a skeletal role, a role of providing a scaffold, and a role of holding a biological factor.
  • the extracellular matrix component may further contain a substance capable of performing a function such as a skeletal role, a role of providing a scaffold, and a role of holding a biological factor in in vitro cell culture, or artificially.
  • a synthesized substance or a part thereof may be included.
  • the “pluripotent stem cell” (hereinafter, also referred to as “pluripotent stem cell”) is an embryonic stem cell (ES cell) or an induced pluripotent stem cell (iPS cell) in one or a plurality of embodiments. ).
  • ES cell embryonic stem cell
  • iPS cell induced pluripotent stem cell
  • their origin is not particularly limited, and examples thereof include humans and mice.
  • the present disclosure relates to a method for manufacturing a pacemaker tissue piece including forming a three-dimensional tissue piece in which pacemaker cells are stacked (hereinafter, also referred to as “manufacturing method of the present disclosure”).
  • the three-dimensional tissue piece includes a pacemaker cell and an extracellular matrix component, and the formation of the three-dimensional tissue piece is performed by coating the surface of the pacemaker cell with a coating containing the extracellular matrix component.
  • the cell layers of pacemaker cells and the layers containing extracellular matrix components are alternately stacked and cultured.
  • a pacemaker tissue piece in which pacemaker cells are three-dimensionally organized via an extracellular matrix component, rather than a cell mass in which pacemaker cells are aggregated, is produced. be able to.
  • the production method of the present disclosure may include preparing pacemaker cells.
  • a pacemaker cell induces differentiation of a pluripotent stem cell subjected to a treatment capable of expressing an HCN channel into a pacemaker cell, and the resulting pacemaker cell cluster is an individual pacemaker cell. It can be prepared by dispersing in.
  • the treatment that enables expression of the HCN channel includes introduction of an HCN gene. Examples of the HCN gene include, in one or more embodiments, the HCN1 gene, the HCN2 gene, the HCN3 gene, and the HCN4 gene, with the HCN4 gene being preferred.
  • HCN gene into pluripotent stem cells and induction of differentiation into pacemaker cells can be performed by a conventionally known method and / or a method developed in the future.
  • Morikawa K. et al. Pacing Clin Electrophysiol, 2010 Mar 33 (3) 290-303 and the method described in Patent Document 1.
  • the embryoid body obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells can contain cells other than undifferentiated stem cells and cardiomyocytes in addition to pacemaker cells.
  • the production method of the present disclosure includes selecting pacemaker cells from embryoid bodies obtained by inducing differentiation. Thereby, the cell cluster comprised only by the pacemaker cell substantially can be obtained. Selection of pacemaker cells can be performed by a conventionally known method and / or a method developed in the future, and in one or a plurality of embodiments, is performed by culturing embryoid bodies in a medium in which only cardiomyocytes can survive. Is preferred.
  • Examples of the medium capable of surviving only cardiomyocytes include a sugar-free lactic acid-added medium in one or a plurality of embodiments.
  • the selection of pacemaker cells can be performed by, for example, Toyama, S et al. , Cell Stem Cell. , 12, 127-137 (2013).
  • dispersion from a cell mass to individual pacemaker cells can be performed using a cell dissociating agent in one or a plurality of embodiments.
  • the cell dissociation agent include trypsin and the like in one or a plurality of embodiments.
  • the pacemaker cells dispersed from the cell mass are used for forming a three-dimensional tissue piece in a state where the dispersion is maintained from the viewpoint of improving the tissue construction of pacemaker cells during culture. From the same point, in one or a plurality of embodiments, it is preferable to use the dispersed pacemaker cells for the formation of a three-dimensional tissue piece without adhesion culture. More preferably, it is used to form a tissue piece.
  • the manufacturing method of the present disclosure includes forming a three-dimensional tissue piece.
  • the formation of the three-dimensional tissue piece is performed by stacking and culturing coated cells in which the surface of pacemaker cells is coated with a coating containing extracellular matrix components, or by forming a cell layer of pacemaker cells and a layer containing extracellular matrix components. It is performed by alternately laminating and culturing. As a result, pacemaker cells are three-dimensionally stacked via the extracellular matrix.
  • the manufacturing method of the present disclosure includes forming a vascular network in the three-dimensional tissue in the formation of the three-dimensional tissue from the viewpoint of improving the stability of the function of the pacemaker tissue piece and maintaining the function for a long period of time. May be.
  • formation of a vascular network can be performed by culturing vascular endothelial cells in a state of being sandwiched between cell layers of the above-described coated cells or pacemaker cells. In this way, by culturing vascular endothelial cells while being sandwiched between cell layers, a dense vascular network closer to the human body can be formed.
  • vascular endothelial cell a cell surface coated with a coating containing an extracellular matrix component may be used, or it may be used as it is.
  • the manufacturing method of this indication may include forming other organs in one or some embodiment from the point which improves the functional stability as a biological pacemaker other than a vascular network.
  • the three-dimensional tissue piece can be formed by stacking and culturing coated cells in which the surface of pacemaker cells is coated with a coating containing an extracellular matrix component.
  • culturing the coated cell includes seeding the coated cell in a container, and culturing the coated cell in a stacked state in the container.
  • the production method of the present disclosure may include a coated cell preparation step described later.
  • the coated cells include pacemaker cells and a coating containing an extracellular matrix component that covers the pacemaker cells.
  • the coating containing the extracellular matrix component preferably includes a membrane containing the substance A and a membrane containing the substance B that interacts with the substance A.
  • a protein or polymer having an RGD sequence hereinafter also referred to as “substance having an RGD sequence” and a protein or polymer having the RGD sequence are used.
  • a combination with a protein or polymer that interacts with the protein hereinafter also referred to as “substance having interaction”
  • a protein or polymer that has a positive charge hereinafter also referred to as “substance with a positive charge”
  • a protein or polymer having a negative charge hereinafter also referred to as “substance having a negative charge”.
  • the thickness of the coating containing an extracellular matrix component is preferably 1 nm to 1 ⁇ 10 3 nm, or 2 nm to 1 ⁇ 10 2 nm, and a three-dimensional tissue in which coated cells are stacked more densely. From the reason that a piece can be obtained, 3 nm to 1 ⁇ 10 2 nm is more preferable.
  • the thickness of the coating containing the extracellular matrix component can be appropriately controlled by, for example, the number of membranes constituting the coating.
  • the coating containing the extracellular matrix component is not particularly limited, and may be a single layer. In one or a plurality of embodiments, for example, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 layers or more It may be a multilayer.
  • seeding of coated cells may be performed so that at least two layers of coated cells are laminated.
  • the density of the coated cells at the time of seeding can be appropriately determined according to the size and thickness of the target pacemaker tissue piece, the size of the container to be cultured, the number of cells to be stacked, and the like. In one or more embodiments, 1 ⁇ 10 2 pieces / cm 3 to 1 ⁇ 10 9 pieces / cm 3 , 1 ⁇ 10 4 pieces / cm 3 to 1 ⁇ 10 8 pieces / cm 3 , or 1 ⁇ 10 5 pieces / Cm 3 to 1 ⁇ 10 7 pieces / cm 3 .
  • the medium is not particularly limited and can be appropriately determined depending on the cell.
  • Eagle's MEM medium Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RDMI, GlutaMax medium, Or a serum-free culture medium etc. are mentioned.
  • the culture temperature is 4 to 60 ° C., 20 to 40 ° C., or 30 to 37 ° C. in one or more embodiments.
  • the culture time is not particularly limited, and in one or more embodiments, it is 1 to 168 hours, 3 to 24 hours, or 3 to 12 hours.
  • Examples of the container include a membrane filter because it is easy to handle, preferably a culture plate having a membrane filter, more preferably a culture plate having a housing part and a base part, and the base part being a membrane filter. Can be mentioned.
  • the housing part is preferably transparent.
  • a commercial item may be used for this culture plate. Examples of commercially available products include Transwell (registered trademark), Cell Culture Insert (trade name), and the like.
  • the size of the container can be appropriately determined according to the size of the pacemaker tissue piece to be produced.
  • the pore size of the membrane filter is not particularly limited as long as the cultured cells can be retained on the membrane filter, and in one or a plurality of embodiments, it is 0.1 ⁇ m to 2 ⁇ m, or 0.4 ⁇ m to 1.0 ⁇ m. .
  • the material of the membrane includes, for example, polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, or polytetrafluoroethylene (PTFE).
  • the three-dimensional tissue piece can be formed by alternately stacking and culturing the cell layer of pacemaker cells and the layer containing the extracellular matrix component.
  • the cell layer can be formed by seeding pacemaker cells in a container and culturing them for a certain period of time.
  • the culture medium, culture temperature, and culture time are the same as the formation of the three-dimensional tissue piece using the coated cells.
  • the formation of the layer containing the extracellular matrix component includes arranging the solution A and the solution B on the cell layer. Preferably, the solution A and the solution B are alternately arranged. . In one or a plurality of embodiments, the formation of the layer containing the extracellular matrix component is preferably performed by alternately arranging the solution A and the solution B, and repeating this two sets, or three or more sets. . Solution A and solution B are the same as the formation of a three-dimensional tissue piece using coated cells.
  • a washing operation may be performed by placing a washing solution.
  • the washing operation is preferably performed both after the formation of the cell layer and after the formation of the extracellular matrix. From the same viewpoint, the washing operation may be performed after introducing the solution A and / or after introducing the solution B.
  • the washing solution is the same as the formation of the three-dimensional tissue piece using the coated cells.
  • formation of a cell layer and formation of a layer containing an extracellular matrix component, etc. may be performed in consideration of the method disclosed in JP 2007-228921 A (Patent No. 4919464). it can.
  • the present disclosure includes a pacemaker tissue piece (hereinafter referred to as “the present disclosure”) including a pacemaker cell and an extracellular matrix component, wherein the pacemaker cell is laminated through the extracellular matrix component and is three-dimensionally organized. Also referred to as a pacemaker tissue piece.
  • the pacemaker tissue piece of the present disclosure is not simply a collection of pacemaker cells into a cell mass, but a three-dimensional organization of pacemaker cells stacked via an extracellular matrix component. Therefore, each cell not only exhibits a pacemaker function, but can exhibit a uniform pulsation as a single tissue.
  • pacemaker tissue pieces can function for extended periods of time.
  • the pacemaker tissue piece of the present disclosure can be manufactured by the method for manufacturing a pacemaker tissue piece of the present disclosure.
  • the pacemaker tissue piece of the present disclosure may contain, in addition to pacemaker cells and extracellular matrix components, cardiomyocytes and cells that can constitute organs included in the sinoatrial node.
  • organs include blood vessels, lymph vessels, nerves and the like.
  • cells constituting the organ include vascular endothelial cells, adipocytes, myoblasts, fibroblasts, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, nerve cells, cancer cells and the like.
  • the pacemaker tissue piece of the present disclosure may include 1 ⁇ 10 5 or more, 5 ⁇ 10 5 or more, or 1 ⁇ 10 6 or more pacemaker cells.
  • the size of the pacemaker tissue piece of the present disclosure is not particularly limited and can be appropriately determined according to the purpose. However, in one or a plurality of embodiments, 0.2 cm 2 or more, 0.5 cm 2 or more, 1 cm 2 or more. Or 4 cm 2 or more, 50 cm 2 or less, 25 cm 2 or less, or 15 cm 2 or less.
  • the size of the pacemaker tissue piece only needs to be large enough to cover the sinoatrial node and may be about the same size as a normal pacemaker device.
  • the density of pacemaker cells in the pacemaker tissue piece of the present disclosure is 1 ⁇ 10 5 cells / mm 3 or more, 5 ⁇ 10 5 cells / mm 3 or more, 1 ⁇ 10 6 cells / mm 3 or more. 5 ⁇ 10 6 pieces / mm 3 or more, or 1 ⁇ 10 7 pieces / mm 3 or more, and 1 ⁇ 10 10 pieces / mm 3 or less, 5 ⁇ 10 9 pieces / mm 3 or less, or 1 ⁇ 10 9 pieces / mm 3 or less.
  • the pacemaker tissue piece of the present disclosure expresses at least one of troponin, connexin 43, actin, myosin, and E-cadherin. In one or more embodiments of the pacemaker tissue piece of the present disclosure, troponin and actin are expressed at substantially the same position. Their expression can be confirmed by immunofluorescence staining in one or more embodiments.
  • the pacemaker tissue piece of the present disclosure can be used as a biological pacemaker in one or more embodiments.
  • the pacemaker tissue piece of the present disclosure can be used as a pacemaker by implanting into or inside the myocardium as one or more embodiments.
  • the pacemaker cells are three-dimensionally organized in one or a plurality of embodiments, the pacemaker tissue piece of the present disclosure can be easily transplanted, and can reduce outflow from the myocardium after transplantation into the myocardium.
  • the implantation site of the pacemaker tissue piece of the present disclosure is similar to the cardiac pacemaker device in one or more embodiments, and includes a sinoatrial node and the like.
  • Coated cells can be prepared by contacting a solution containing substance A and a solution containing substance B alternately with pacemaker cells.
  • the combination of the substance A and the substance B includes a combination of a substance having an RGD sequence and a substance having an interaction, or a combination of a substance having a positive charge and a substance having a negative charge. It is done.
  • a substance having an RGD sequence refers to a protein or polymer having an “Arg-Gly-Asp” (RGD) sequence, which is an amino acid sequence responsible for cell adhesion activity.
  • RGD Arg-Gly-Asp
  • having an RGD sequence may originally have an RGD sequence, or may have a RGD sequence chemically bound thereto.
  • the substance having the RGD sequence is preferably biodegradable.
  • Examples of the protein having an RGD sequence include conventionally known adhesive proteins or water-soluble proteins having an RGD sequence in one or a plurality of embodiments.
  • Examples of the adhesive protein include fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin, and collagen in one or a plurality of embodiments.
  • Examples of the water-soluble protein having an RGD sequence include, in one or more embodiments, collagen, gelatin, albumin, globulin, proteoglycan, an enzyme, an antibody, or the like to which the RGD sequence is bound.
  • Examples of the polymer having an RGD sequence include a naturally-derived polymer or a synthetic polymer in one or a plurality of embodiments.
  • Examples of the naturally-derived polymer having an RGD sequence include, in one or more embodiments, a water-soluble polypeptide, a low-molecular peptide, a polyamino acid such as ⁇ -polylysine or ⁇ -polylysine, and a sugar such as chitin or chitosan.
  • Examples of the synthetic polymer having an RGD sequence include, in one or more embodiments, a polymer or copolymer having an RGD sequence such as a linear type, graft type, comb type, dendritic type, or star type.
  • the polymer or copolymer may be polyurethane, polycarbonate, polyamide, or a copolymer thereof, polyester, poly (N-isopropylacrylamide-co-polyacrylic acid), polyamide amine dendrimer, polyethylene Examples thereof include oxide, poly ⁇ -caprolactam, polyacrylamide, or poly (methyl methacrylate- ⁇ -polyoxymethacrylate).
  • the substance having the RGD sequence is preferably fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin, polylysine, elastin, collagen to which the RGD sequence is bound, gelatin, chitin or chitosan to which the RGD sequence is bound, and more preferably fibronectin.
  • the substance that interacts refers to a protein or polymer that interacts with a substance having an RGD sequence.
  • “interact” means, in one or more embodiments, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, hydrogen bond, charge transfer interaction, covalent bond formation, specific interaction between proteins. , And / or a substance that interacts chemically and / or physically with a substance having an RGD sequence by van der Waals force or the like is close enough to allow bonding, adhesion, adsorption, or electron transfer.
  • the interacting substance is preferably biodegradable.
  • Examples of the protein that interacts with a substance having an RGD sequence include collagen, gelatin, proteoglycan, integrin, enzyme, or antibody in one or a plurality of embodiments.
  • Examples of the polymer that interacts with a substance having an RGD sequence include a naturally-derived polymer or a synthetic polymer in one or a plurality of embodiments.
  • the naturally-derived polymer that interacts with a substance having an RGD sequence includes, in one or more embodiments, a water-soluble polypeptide, a low-molecular peptide, a polyamino acid, elastin, heparin, a sugar such as heparan sulfate or dextran sulfate, and Examples include hyaluronic acid.
  • the polyamino acid include, in one or more embodiments, polylysine such as ⁇ -polylysine or ⁇ -polylysine, polyglutamic acid, or polyaspartic acid.
  • the synthetic polymer that interacts with a substance having an RGD sequence include those exemplified as the above-described synthetic polymer having an RGD sequence in one or more embodiments.
  • the interacting substance is preferably gelatin, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, globulin, albumin, polyglutamic acid, collagen, or elastin, more preferably gelatin, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, or collagen, More preferred is gelatin, dextran sulfate, heparin, or hyaluronic acid.
  • the combination of the substance having the RGD sequence and the substance that interacts is not particularly limited as long as it is a combination of different substances that interact with each other, and either one is a polymer or protein containing the RGD sequence, and the other is this. Any polymer or protein that interacts with the protein may be used.
  • the combination of the substance having an RGD sequence and the substance having an interaction includes, in one or more embodiments, fibronectin and gelatin, fibronectin and ⁇ -polylysine, fibronectin and hyaluronic acid, fibronectin and dextran sulfate, fibronectin and heparin, fibronectin And collagen, laminin and gelatin, laminin and collagen, polylysine and elastin, vitronectin and collagen, RGD-bound collagen or RGD-bound gelatin and collagen or gelatin, and the like.
  • fibronectin and gelatin fibronectin and ⁇ -polylysine, fibronectin and hyaluronic acid, fibronectin and dextran sulfate, fibronectin and heparin, or laminin and gelatin are preferable, and fibronectin and gelatin are more preferable.
  • sequence, and the substance which has interaction may be one each, respectively, and may use 2 or more types together in the range which shows interaction, respectively.
  • a substance having a positive charge refers to a protein or polymer having a positive charge.
  • the protein having a positive charge is preferably a water-soluble protein in one or a plurality of embodiments.
  • the water-soluble protein include basic collagen, basic gelatin, lysozyme, cytochrome c, peroxidase, or myoglobin in one or more embodiments.
  • the polymer having a positive charge include naturally-derived polymers and synthetic polymers in one or a plurality of embodiments.
  • Examples of the naturally-derived polymer include, in one or more embodiments, a water-soluble polypeptide, a low-molecular peptide, a polyamino acid, a sugar such as chitin or chitosan, and the like.
  • Examples of the polyamino acid include polylysine such as poly ( ⁇ -lysine) and poly ( ⁇ -lysine), polyarginine, and polyhistidine in one or more embodiments.
  • Examples of the synthetic polymer include, in one or more embodiments, a polymer or copolymer such as a linear type, a graft type, a comb type, a dendritic type, or a star type.
  • the polymer or copolymer may be polyurethane, polyamide, polycarbonate, or a copolymer thereof, polyester, polydiallyldimethylammonium chloride (PDDA), polyallylamine hydrochloride, polyethyleneimine, polyvinyl. Examples thereof include amines and polyamide amine dendrimers.
  • PDDA polydiallyldimethylammonium chloride
  • polyallylamine hydrochloride polyethyleneimine
  • polyvinyl examples thereof include amines and polyamide amine dendrimers.
  • a substance having a negative charge refers to a protein or polymer having a negative charge.
  • the protein having a negative charge is preferably a water-soluble protein in one or a plurality of embodiments.
  • the water-soluble protein include acidic collagen, acidic gelatin, albumin, globulin, catalase, ⁇ -lactoglobulin, thyroglobulin, ⁇ -lactalbumin, or ovalbumin in one or more embodiments.
  • Examples of the negatively charged polymer include naturally derived polymers and synthetic polymers.
  • Examples of the naturally-derived polymer include, in one or more embodiments, water-soluble polypeptides, low-molecular peptides, polyamino acids such as poly ( ⁇ -lysine), dextran sulfate, and the like.
  • Examples of the synthetic polymer include, in one or more embodiments, a polymer or copolymer such as a linear type, a graft type, a comb type, a dendritic type, or a star type.
  • the polymer or copolymer may be polyurethane, polyamide, polycarbonate, and a copolymer thereof, polyester, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide methylpropane sulfonic acid. , Terminal carboxylated polyethylene glycol, polydiallyldimethylammonium salt, polyallylamine salt, polyethyleneimine, polyvinylamine, or polyamidoamine dendrimer.
  • a combination of a positively charged substance and a negatively charged substance may be ⁇ -polylysine salt and polysulfonate, ⁇ -polylysine and polysulfonate, chitosan and dextran sulfate, poly Examples include allylamine hydrochloride and polystyrene sulfonate, polydiallyldimethylammonium chloride and polystyrene sulfonate, or polydiallyldimethylammonium chloride and polyacrylate, preferably ⁇ -polylysine salt and polysulfonate, or polydiallyl. Dimethylammonium chloride and polyacrylate.
  • polysulfonate examples include sodium polysulfonate (PSS) and the like in one or more embodiments.
  • PPS sodium polysulfonate
  • the substance having a positive charge and the substance having a negative charge may each be one kind, or two or more kinds may be used in combination within a range showing an interaction.
  • a cell is first contacted with a solution A containing a substance having an RGD sequence, and then a solution containing a substance having an interaction with the substance having an RGD sequence.
  • a method for preparing coated cells by contacting with B will be described by way of example. However, the present disclosure is not construed as being limited to the following embodiments.
  • the cells are brought into contact with the solution A.
  • a film containing a substance having an RGD sequence is formed on the cell surface, and the cell surface is covered with a film containing a substance having an RGD sequence.
  • the contact between the cells and the solution A is performed by applying or adding the solution A to the cells, immersing the cells in the solution A, dropping or spraying the solution A on the cells, or the like. be able to.
  • the contact condition can be appropriately determined according to a contact method, a substance having an RGD sequence and / or a cell type, a concentration of a contained liquid, and the like.
  • the contact time is preferably 30 seconds to 24 hours, 1 minute to 60 minutes, 1 minute to 15 minutes, 1 minute to 10 minutes, or 1 minute to 5 minutes.
  • the ambient temperature at the time of contact and / or the temperature of the solution A is preferably 4 to 60 ° C., 20 to 40 ° C., or 30 to 37 ° C.
  • Solution A only needs to contain a substance having an RGD sequence, and preferably contains a substance having an RGD sequence and a solvent or dispersion medium (hereinafter also simply referred to as “solvent”).
  • solvent a solvent or dispersion medium
  • the content of the substance having an RGD sequence in the solution A is 0.0001 to 1% by mass, 0.01 to 0.5% by mass, or 0.02 to 0.1% by mass. preferable.
  • the solvent include an aqueous solvent such as water, phosphate buffered saline (PBS), and a buffer solution in one or more embodiments.
  • the buffer includes Tris buffer such as Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, citrate-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer. , Britton-Robinson buffer, GTA buffer, and the like.
  • Tris buffer such as Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, citrate-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer. , Britton-Robinson buffer, GTA buffer, and the like.
  • the pH of the solvent is not particularly limited, and in one or more embodiments, 3 to 11, 6 to 8, or 7.2 to 7.4 is preferable.
  • the solution A may further contain a salt, a cell growth factor, a cytokine, a chemokine, a hormone, a bioactive peptide, a pharmaceutical composition, or the like.
  • a pharmaceutical composition include, in one or a plurality of embodiments, a therapeutic agent, preventive agent, inhibitor, antibacterial agent, or anti-inflammatory agent for diseases.
  • the salt include sodium chloride, calcium chloride, sodium bicarbonate, sodium acetate, sodium citrate, potassium chloride, sodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, and sodium succinate in one or more embodiments.
  • One kind of salt may be contained, or two or more kinds of salts may be contained.
  • Both the solution A and the solution B may contain a salt, or one of them may contain a salt.
  • the salt concentration in the solution A is not particularly limited, but in one or more embodiments, it is 1 ⁇ 10 ⁇ 6 M to 2M, preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M to 1M, more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ . 4 M to 0.05 M.
  • the removal can be performed by centrifugation or filtration.
  • the removal by centrifugation can be performed by centrifuging in a state where the cells are dispersed in the solution A, and then removing the supernatant. Centrifugation conditions can be appropriately determined depending on the type of cells, the concentration of cells, and the composition of inclusions contained in the solution A.
  • washing can be performed by centrifugation or filtration.
  • washing by centrifugation can be performed by adding a solvent to the cells from which the supernatant has been removed, followed by centrifugation and removal of the supernatant.
  • the solvent used for washing is preferably the same as the solvent of the solution A.
  • the cell covered with the membrane containing the substance having the RGD sequence is brought into contact with the solution B.
  • a membrane containing an interacting substance is formed on the membrane surface containing the substance having the RGD sequence, and the cell surface covered with the membrane containing the substance having the RGD sequence is covered with the membrane containing the interacting substance.
  • the contact with the solution B can be performed in the same manner as the contact with the solution A, except that a substance that interacts instead of the substance having the RGD sequence is used.
  • the extracellular surface in which the membrane containing the substance having the RGD sequence and the membrane containing the interacting substance are alternately laminated on the entire cell surface A coating containing a matrix component can be formed.
  • the number of times that the solution A or the solution B is brought into contact with the cells can be appropriately determined according to the thickness of the coating containing the extracellular matrix component to be formed.
  • the culture of the coated cells and the coated cells can be performed in consideration of the method disclosed in JP2012-115254A.
  • a method for producing a pacemaker tissue piece comprising forming a three-dimensional tissue piece on which pacemaker cells are laminated,
  • the three-dimensional tissue piece includes pacemaker cells and extracellular matrix components,
  • the three-dimensional tissue piece is formed by laminating and culturing a coated cell in which the surface of a pacemaker cell is coated with a coating containing an extracellular matrix component, or including the cell layer of the pacemaker cell and the extracellular matrix component
  • a method for producing a pacemaker tissue piece comprising alternately laminating and culturing layers.
  • the production method of [1] wherein the pacemaker cell is a pacemaker cell derived from a pluripotent stem cell.
  • Formation of the three-dimensional tissue piece includes seeding the coated cells in a container, and culturing the coated cells stacked in the container. [1] or [2] The manufacturing method as described. [4] comprising preparing the coated cells; The preparation of the coated cells comprises trypsinizing the cell mass of pacemaker cells and forming a coating containing extracellular matrix components on the surface of the pacemaker cells dispersed from the cell mass by the trypsin treatment [1 ] To [3]. [5] The cell mass is a cell obtained by culturing an embryoid body obtained by inducing differentiation of a pluripotent stem cell introduced with an HCN gene in a sugar-free lactic acid-added medium and selecting pacemaker cells.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the three-dimensional tissue piece includes 1 ⁇ 10 5 or more of the pacemaker cells.
  • [7] comprising pacemaker cells and extracellular matrix components; A pacemaker tissue piece in which the pacemaker cells are laminated and three-dimensionally organized via the extracellular matrix component.
  • the pacemaker tissue piece according to [7] which is produced by the production method according to any one of [1] to [6].
  • [9] The pacemaker tissue piece according to [7] or [8], which can be used as a biological pacemaker.
  • 50 mM Tris-HCl 50 mM Tris adjusted to pH 7.4 with HCl (manufactured by Nacalai Tesque), sterilized and filtered with 0.2 ⁇ m ⁇ -ray sterile filter (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.)
  • BFN Fibroconnectin from bovine plasma (manufactured by SIGMA)
  • BFN solution 0.2 mg BFN / 1 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)
  • DMEM Dulbecco's easy's medium (manufactured by SIGMA) including 10% FBS (manufactured by GIBCO)
  • Gelatin solution 0.2 mg Gelatin / 1 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) sterilized and filtered with 0.2 ⁇ m ⁇ -ray sterile filter (manufactured by Kurashiki Bos
  • Example 1 [Preparation of mES cell-derived cardiomyocytes] Rosa26-HCN4-IRES-AcGFP1 / AAVS1-Hcn4-IRES-AcGFP1 was introduced into mouse ES cells by electroporation to prepare Hcn4-overexpressing mouse ES cells. The produced Hcn4-overexpressing mouse ES cells were cultured in a suspension medium for 4 days to form an embryoid body, and then cultured in a differentiation medium for 10 days to induce differentiation into cardiomyocytes having a pacemaker function.
  • the differentiation-induced cells are cultured in a sugar-free lactic acid-added medium for 5 days to select Hcn4-overexpressing mouse ES cells (hereinafter also referred to as “mES cell-derived cardiomyocytes”) and selectively mES cell-derived cardiomyocytes.
  • mES cell-derived cardiomyocytes Hcn4-overexpressing mouse ES cells
  • the obtained mES cell-derived cardiomyocytes showed 252 beats per minute. The number of beats of cells was measured by phase contrast microscopy.
  • the obtained cell mass was trypsinized (0.25% trypsin, 0.02% EDTA) (37 ° C., 5 minutes), and dispersed from the cell mass into individual cells (mES cell-derived cardiomyocytes).
  • a film containing an extracellular matrix component was formed on the surface of the cells without adhering the obtained mES cell-derived cardiomyocytes to a flask or the like.
  • the coating was formed by the following procedure.
  • FIG. 1 shows a phase contrast photograph of the obtained pacemaker tissue piece.
  • pacemaker cells contained in the tissue piece were synchronized, and uniform pulsation was confirmed as a myocardial cell tissue (number of pulsations: about 250 times / min).
  • a single pacemaker cell layer was prepared in the same manner as in Example 1 except that the number of coated cells seeded on the membrane filter was 1 ⁇ 10 5 .
  • the obtained pacemaker cell layer showed a pulsation of about 50 times / minute, but no uniform pulsation was seen as a cell layer.
  • the obtained pacemaker tissue piece was cultured in a normal medium (12 mL) for 5 days, the number of pulsations was measured, and then 1.0 ⁇ M isoproterenol was added and cultured for 30 minutes. After measuring the number of pulsations, the cells were washed three times with PBS, cultured in a normal medium (12 mL) for 1 day, and the number of pulsations was measured. After adding 3.0 ⁇ M ivabradine, the cells were incubated for 30 minutes. After measuring the number of beats, 30 ⁇ M ivabradine was added and the mixture was further incubated for 30 minutes to measure the number of beats.
  • the medium used was a DMEM medium containing 10% by weight FBS and 1% antibacterial agent.
  • FIG. 2 is an example of a graph showing the change in the number of beats per minute of the pacemaker tissue piece before and after the drug addition.
  • isoproterenol Normal
  • 30 minutes after addition of isoproterenol after replacement with a normal medium
  • 30 minutes after addition of 3.0 ⁇ M ivabradine 30 minutes after addition of 30 ⁇ M ivabradine
  • the number of pulsations after replacement with a normal medium is shown.
  • FIG. 1 As shown in FIG.
  • Example 2 [Mouse transplantation experiment] A pacemaker graft (size: 0.33 cm 2 , cell density: 4 ⁇ 10 7 cells / mm 3 ) was prepared in the same manner as in Example 1, and transplanted subcutaneously into NOD-SCID mice. One week after transplantation, no particularly strong inflammatory reaction was observed, and good engraftment was confirmed.
  • Example 3 A pacemaker tissue piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that the number of coated cells was 1 ⁇ 10 6 and the culture period after seeding was 20 days. After formalin fixation, immunofluorescence staining was performed, and measurement using a confocal laser microscope (CLSM) was performed. As a result, the expression of troponin T, which is specific to muscle cells, and the expression of connexin 43, which is a protein constituting a gap junction that controls ion transduction between cells, were confirmed. In addition, the expression of actin and myosin could be confirmed, and troponin and actin were expressed at almost the same position, and a staining pattern similar to myocardial tissue in the living body could be confirmed. Expression of E-cadherin involved in cell-cell adhesion was also confirmed.
  • CLSM confocal laser microscope
  • Example 4 Three different cell layers in the same manner as in Example 1 except that the number of coated cells was 1 ⁇ 10 5 , 3 ⁇ 10 5 , or 5 ⁇ 10 5 and the culture period after seeding was 7 days.
  • Pacemaker tissue pieces (cell layer: 1 layer, 3 layers or 5 layers) were prepared, and the number of beats was counted. Further, as a reference example, it was prepared in the same procedure as in Example 4 except that cells differentiated into cardiomyocytes without introducing the Hcn4 gene were used, and the number of beats was measured. The results are shown in FIG. As shown in FIG.
  • the pacemaker tissue piece (thickness: 17 ⁇ 5.0 ⁇ m) with the cell layer number of 5 has the largest number of pulsations, followed by 3 layers (thickness: 11 ⁇ 0.5 ⁇ m) and 1 layer.
  • the number of beats decreased in the order of (thickness: 4.9 ⁇ 1.7 ⁇ m). That is, the greater the number and / or thickness of the cell layers, the higher the number of beats.

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Abstract

バイオロジカルペースメーカーとして機能しうる新たな三次元組織片の製造方法を提供する。 多能性幹細胞に由来するペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法であって、前記三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又は前記ペースメーカー細胞の細胞層と前記細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法に関する。

Description

ペースメーカー組織片の製造方法
　本開示は、ペースメーカー組織片の製造方法及びペースメーカー組織片に関する。
　徐脈性不整脈とは、心臓の洞結節の機能不全又は機能停止等によって脈が非常に遅くなったり途切れたりする不整脈のことをいう。徐脈性不整脈によって十分な拍出量を維持できないと、めまいや心不全等といった様々な症状が引き起こされる。徐脈性不整脈に対する一般的な治療方法としては、心臓ペースメーカー機器の移植がある。しかしながら、ペースメーカー機器の移植は、低い生体適合性、電池寿命による再移植の必要性、破損、感染及び他機器との干渉等といった様々な問題を有している。
　このため、ペースメーカー機器に代わる新たな技術が求められ、例えば、心筋への筋芽細胞や心筋細胞等の移植といった研究が行われている。しかしながら、これらの移植は、細胞の心筋への生着率が低く、また移植した細胞が心筋から流出して炎症を引き起こすという問題がある。例えば、非特許文献１には、筋芽細胞をマウスの心臓に移植したところ、移植３０分後では細胞の３９．２％程度が生存していたにもかかわらず、７２時間後になると生着率が７％程度にまで減少することが開示されている。
　一方、近年、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を様々な細胞に分化誘導させ、それらを医療に用いるための研究が行われている。例えば、多能性幹細胞をペースメーカー細胞に分化誘導させ、得られたペースメーカー細胞を用いてバイオロジカルペースメーカーを作製することが試みられている。特許文献１には、胚性幹細胞にペースメーカー電流発生を担うＨＣＮ４遺伝子を導入して心筋細胞へ分化誘導させることによって胚性幹細胞由来のペースメーカー細胞を作製することが開示されている。
ＷＯ２０１１／０４０４６９
Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１８，１１５３（２００４）
　上記の通り、心臓ペースメーカー機器に代わりうるバイオロジカルペースメーカーの研究が行われているが、いまだ実用可能なレベルにまでは至っていない。そこで、本開示は、バイオロジカルペースメーカーとして機能しうる新たなペースメーカー組織片の製造方法及びペースメーカー組織片を提供する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含むペースメーカー組織片の製造方法であって、前記三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、前記三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又は前記ペースメーカー細胞の細胞層と前記細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、前記ペースメーカー細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化された、ペースメーカー組織片に関する。
　本開示によれば、例えば、バイオロジカルペースメーカーとして機能しうる新たな三次元組織片及びその製造方法を提供できる。
図１は、実施例１で作製したペースメーカー組織片の位相差写真の一例である。 図２は、実施例１で作製したペースメーカー組織片の薬剤添加前後の１分間あたりの拍動数の変化を示すグラフの一例である。 図３は、実施例４における心筋細胞の層数と拍動数との関係を示すグラフの一例である。
　本開示は、ペースメーカー細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層した状態で培養すると、ペースメーカー細胞が細胞層として三次元組織化され、一律な拍動を示すペースメーカー組織片が得られる、との知見に基く。また、本開示は、ペースメーカー細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層することによって、細胞シートの形成や保持に用いる足場材料の排除が可能となり、また、細胞間の細胞外マトリックスの厚みを容易に制御できる、との知見に基く。
　本開示の製造方法によって得られるペースメーカー組織片が一律な拍動を示す作用機構は明らかではないが、以下のように推察される。すなわち、ペースメーカー細胞を、細胞外マトリックスを介して積層させた状態で培養すると、ペースメーカー細胞の細胞間接着が強くなり、それにより組織片を構成する個々のペースメーカー細胞がペースメーカー細胞同士が同期して１つの組織として機能し、一律な拍動を示すと考えられる。但し、本開示はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
　本開示において「三次元組織片」とは、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、ペースメーカー細胞が三次元的に積層された細胞の構造体をいう。
　本開示において「ペースメーカー組織片」とは、自発拍動を示すことができる三次元組織片のことをいい、好ましくは多能性幹細胞に由来するペースメーカー細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、細胞外マトリックスを介して積層されたペースメーカー細胞が三次元的に組織化されたものをいう。本開示のペースメーカー組織片は、さらに、ペースメーカー細胞以外の細胞を含んでいてもよい。本開示において「細胞外マトリックス成分を介してペースメーカー細胞を積層する」とは、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又はペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することによって行うことができる。
　本開示において「ペースメーカー細胞」とは、ペースメーカー機能を有する細胞であり、一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞を分化誘導させて得られたペースメーカー機能を有する細胞であって、活動電位を発生し、自発拍動可能な心筋細胞をいう。また、ペースメーカー細胞は、一又は複数の実施形態においてＨＣＮチャネルが発現した心筋細胞、好ましくはＨＣＮ４チャネルが発現した心筋細胞をいう。
　本開示において、「細胞外マトリックス成分」とは、生体内で細胞の外の空間を充填して骨格的役割、足場を提供する役割、及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たす物質をいう。また、細胞外マトリックス成分は、さらに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞培養において骨格的役割、足場を提供する役割及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たしうる物質を含んでいてもよく、また人工的に合成された物質やその一部を含んでもよい。
　本開示において「多能性を有する幹細胞（以下、「多能性幹細胞」ともいう）」としては、一又は複数の実施形態において、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。本開示において、これらの由来は特に限定されず、ヒト及びマウス等が挙げられる。
　［ペースメーカー組織片の製造方法］
　本開示は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含むペースメーカー組織片の製造方法（以下、「本開示の製造方法」ともいう）に関する。本開示の製造方法において、三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又はペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む。本開示の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、単にペースメーカー細胞を集合させた細胞塊ではなく、ペースメーカー細胞が細胞外マトリックス成分を介して三次元組織化したペースメーカー組織片を製造することができる。
　本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞を調製することを含んでいてもよい。ペースメーカー細胞は、一又は複数の実施形態において、ＨＣＮチャネルを発現可能となる処理を行った多能性幹細胞をペースメーカー細胞に分化誘導させること、及び得られたペースメーカー細胞の細胞塊を個々のペースメーカー細胞に分散させることによって調製できる。ＨＣＮチャネルを発現可能となる処理としては、一又は複数の実施形態において、ＨＣＮ遺伝子の導入が挙げられる。ＨＣＮ遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、ＨＣＮ１遺伝子、ＨＣＮ２遺伝子、ＨＣＮ３遺伝子、及びＨＣＮ４遺伝子が挙げられ、ＨＣＮ４遺伝子が好ましい。ＨＣＮ遺伝子の多能性幹細胞への導入及びペースメーカー細胞への分化誘導は、従来公知の方法及び／又は今後開発される方法によって行うことができ、例えば、Ｍｏｒｉｋａｗａ　Ｋ．，　Ｐａｃｉｎｇ　Ｃｌｉｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ，　２０１０　Ｍａｒ　３３（３）　２９０－３０３及び特許文献１に記載の方法を参酌して行うことができる。
　多能性幹細胞を分化誘導させて得られる胚様体は、ペースメーカー細胞の他に、未分化な幹細胞及び心筋細胞以外の細胞を含みうる。よって、本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、分化誘導して得られた胚様体からペースメーカー細胞を選別することを含む。これにより、実質的にペースメーカー細胞のみによって構成される細胞塊を得ることができる。ペースメーカー細胞の選別は、従来公知の方法及び／又は今後開発される方法によって行うことができ、一又は複数の実施形態において、心筋細胞のみ生存可能な培地で胚様体を培養することにより行うことが好ましい。心筋細胞のみ生存可能な培地としては、一又は複数の実施形態において、無糖乳酸添加培地等が挙げられる。ペースメーカー細胞の選別は、例えば、Ｔｏｈｙａｍａ，Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　１２，１２７－１３７（２０１３）に記載の方法を参酌して行うことができる。
　本開示の製造方法において、細胞塊から個々のペースメーカー細胞への分散は、一又は複数の実施形態において、細胞解離剤を用いて行うことができる。細胞解離剤としては、一又は複数の実施形態において、トリプシン等が挙げられる。
　本開示の製造方法において、培養時におけるペースメーカー細胞の組織構築を向上させる点から、細胞塊から分散させたペースメーカー細胞を分散を維持した状態で三次元組織片の形成に用いることが好ましい。同様の点から、一又は複数の実施形態において、分散させたペースメーカー細胞を接着培養することなく三次元組織片の形成に用いることが好ましく、分散後のペースメーカー細胞に剥離処理を行うことなく三次元組織片の形成に用いることがより好ましい。
　本開示の製造方法は、三次元組織片を形成することを含む。三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又はペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することによって行う。これにより、ペースメーカー細胞が細胞外マトリックスを介して三次元的に積層される。
　本開示の製造方法は、ペースメーカー組織片の機能の安定性を向上し、その機能を長期間維持させる点から、三次元組織の形成において、三次元組織内に血管網を形成することを含んでいてもよい。血管網の形成は、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞を上述の被覆細胞又はペースメーカー細胞の細胞層で挟んだ状態で培養することにより行うことができる。このように、細胞層間に挟まれた状態で血管内皮細胞を培養することにより、ヒトの生体内により近い緻密な血管網が形成されうる。血管内皮細胞は、細胞表面を細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆したものを使用してもよいし、そのまま使用してもよい。また、本開示の製造方法は、血管網以外にバイオロジカルペースメーカーとしての機能安定性を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、その他の器官を形成することを含んでいてもよい。
　＜被覆細胞を用いた三次元組織片の形成＞
　本開示の製造方法において、三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養することによって行うことができる。被覆細胞の培養は、一又は複数の実施形態において、被覆細胞を容器内に播種すること、及び容器内で積層された状態の被覆細胞を培養することを含む。本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、後述する被覆細胞の調製工程を含んでいてもよい。
　被覆細胞は、ペースメーカー細胞と、ペースメーカー細胞を覆う細胞外マトリックス成分を含む被膜とを含む。細胞外マトリックス成分を含む被膜は、物質Ａを含む膜と、前記物質Ａと相互作用する物質Ｂを含む膜とを含むことが好ましい。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「ＲＧＤ配列を有する物質」ともいう）と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子（以下、「相互作用を有する物質」ともいう）との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「正の電荷を有する物質」ともいう）と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「負の電荷を有する物質」ともいう）との組み合わせである。
　細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚みは、一又は複数の実施形態において、１ｎｍ～１×１０3ｎｍ、又は２ｎｍ～１×１０2ｎｍが好ましく、被覆細胞がより密に積層された三次元組織片が得られるという理由から、３ｎｍ～１×１０2ｎｍがより好ましい。細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚みは、例えば、被膜を構成する膜の数によって適宜制御することができる。細胞外マトリックス成分を含む被膜は、特に制限されず、１層であってもよいし、一又は複数の実施形態において、例えば、３、５、７、９、１１、１３、１５層又はそれ以上の多層であってもよい。
　被覆細胞の播種は、一又は複数の実施形態において、被覆細胞が少なくとも２層以上積層されるように行えばよい。播種時の被覆細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、目的とするペースメーカー組織片の大きさ及び厚み、培養する容器の大きさならびに積層される細胞の数等に応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、１×１０2個／ｃｍ3～１×１０9個／ｃｍ3、１×１０4個／ｃｍ3～１×１０8個／ｃｍ3、又は１×１０5個／ｃｍ3～１×１０7個／ｃｍ3である。
　培地は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定でき、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、ＧｌｕｔａＭａｘ培地、又は無血清培地等が挙げられる。
　培養温度は、一又は複数の実施形態において、４～６０℃、２０～４０℃、又は３０～３７℃である。培養時間は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、１～１６８時間、３～２４時間、又は３～１２時間である。
　容器としては、取扱が容易となるという理由から、メンブレンフィルタが挙げられ、好ましくはメンブレンフィルタを備える培養プレート、より好ましくはハウジング部と基底部とを備え、基底部がメンブレンフィルタである培養プレートが挙げられる。ハウジング部は、透明であることが好ましい。該培養プレートは、市販品を使用してもよい。市販品としては、例えば、トランスウェル（登録商標）、セルカルチャーインサート（商品名）等が挙げられる。容器の大きさは、製造するペースメーカー組織片の大きさに応じて適宜決定できる。
　メンブレンフィルタの孔径は、培養した細胞がメンブレンフィルタ上に保持可能な範囲であれば特に制限されず、一又は複数の実施形態において、０．１μｍ～２μｍ、又は０．４μｍ～１．０μｍである。また、メンブレンの材質は、一又は複数の実施形態において、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、又はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等が挙げられる。
　＜交互積層による三次元組織片の形成＞
　本開示の製造方法において、三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することによって行うことができる。
　細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、容器にペースメーカー細胞を播種し、一定時間培養することにより行うことができる。培地、培養温度及び培養時間は被覆細胞を用いた三次元組織片の形成と同様である。
　細胞外マトリックス成分を含む層の形成は、一又は複数の実施形態において、細胞層上に溶液Ａと溶液Ｂとを配置することが挙げられ、好ましくは溶液Ａと溶液Ｂとを交互に配置する。細胞外マトリックス成分を含む層の形成は、一又は複数の実施形態において、溶液Ａと溶液Ｂとを交互に配置することを１セットとして、これを２セット、又は３セット以上繰返し行うことが好ましい。溶液Ａ及び溶液Ｂは、被覆細胞を用いた三次元組織片の形成と同様である。
　細胞層の形成後及び／又は細胞外マトリックスの形成後に洗浄液を配置し洗浄操作を行ってもよい。洗浄操作を行うことにより、細胞外マトリックスの形成に用いられなかった細胞外マトリックス成分や、細胞層の形成に用いられなかった細胞等を除去することができ、効率よく所望の細胞層及び／又は細胞外マトリックスを形成することができる。洗浄操作は、一又は複数の実施形態において、細胞層の形成後と細胞外マトリックスの形成後との双方に行うことが好ましい。また、同様の観点から、溶液Ａの導入後及び／又は溶液Ｂの導入後に洗浄操作を行ってもよい。洗浄液は、被覆細胞を用いた三次元組織片の形成と同様である。
　細胞層の形成及び細胞外マトリックス成分を含む層の形成等は、一又は複数の実施形態において、特開２００７－２２８９２１号公報（特許第４９１９４６４号）に開示された方法を参酌して行うことができる。
　［ペースメーカー組織片］
　本開示は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、ペースメーカー細胞が細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化されたペースメーカー組織片（以下、「本開示のペースメーカー組織片」ともいう。）に関する。本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、単にペースメーカー細胞を集合させて細胞塊としたものではなく、ペースメーカー細胞を細胞外マトリックス成分を介して積層して三次元組織化したものであるため、個々の細胞がペースメーカー機能を発揮するのみならず、１つの組織として一律な拍動を示すことができる。また、ペースメーカー細胞が三次元マトリックス成分を介して細胞層として組織化されていることから、ペースメーカー組織片を構成するペースメーカー細胞の多くがその機能を保持した状態で生存可能であり、その結果、本開示のペースメーカー組織片は、長期間機能することができる。本開示のペースメーカー組織片は、本開示のペースメーカー組織片の製造方法により製造できる。
　本開示のペースメーカー組織片は、ペースメーカー細胞及び細胞外マトリックス成分以外に、心筋細胞、洞房結節に含まれる器官を構成しうる細胞を含んでいてもよい。器官としては、例えば、血管、リンパ管、神経等が挙げられる。器官を構成する細胞としては、例えば、血管内皮細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経細胞、癌細胞等が挙げられる。
　本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞を１×１０5個以上、５×１０5個以上、又は１×１０6個以上含みうる。本開示のペースメーカー組織片の大きさは、特に限定されるものではなく目的に応じて適宜決定できるが、一又は複数の実施形態において、０．２ｃｍ2以上、０．５ｃｍ2以上、１ｃｍ2以上、又は４ｃｍ2以上、また５０ｃｍ2以下、２５ｃｍ2以下、又は１５ｃｍ2以下である。また、ペースメーカー組織片の大きさは、一又は複数の実施形態において、洞房結節をカバーできる大きさがあればよく、また通常のペースメーカー機器と同程度の大きさであればよい。
　本開示のペースメーカー組織片におけるペースメーカー細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、１×１０5個／ｍｍ3以上、５×１０5個／ｍｍ3以上、１×１０6個／ｍｍ3以上、５×１０6個／ｍｍ3以上、又は１×１０7個／ｍｍ3以上であり、また、１×１０10個／ｍｍ3以下、５×１０9個／ｍｍ3以下、又は１×１０9個／ｍｍ3以下である。
　本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、トロポニン、コネキシン４３、アクチン、ミオシン、及びＥ－カドヘリンの少なくとも一つが発現している。本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、トロポニンとアクチンとがほぼ同じ位置に発現している。これらの発現は、一又は複数の実施形態において、免疫蛍光染色により確認できる。
　本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、バイオロジカルペースメーカーとして利用可能である。本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態として、心筋内部又は心筋表面に移植することによってペースメーカーとして使用することができる。本開示のペースメーカー組織片は、一又は複数の実施形態において、ペースメーカー細胞が三次元組織化されているため、移植が容易であり、また心筋に移植後の心筋からの流出を低減できる。本開示のペースメーカー組織片の移植部位は、一又は複数の実施形態において、心臓ペースメーカー機器と同様であり、洞房結節等が挙げられる。
　＜被覆細胞の調製＞
　以下に、本開示の製造方法において用いられる被覆細胞の製造方法の一例について説明する。
　被覆細胞は、物質Ａを含む溶液と、物質Ｂを含む溶液とを、ペースメーカー細胞に交互に接触させることにより調製することができる。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、上記の通り、ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用を有する物質との組み合わせ、又は、正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせが挙げられる。
　（ＲＧＤ配列を有する物質）
　ＲＧＤ配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する物質は、生分解性であることが好ましい。
　ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、従来公知の接着性タンパク質、又はＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質等が挙げられる。接着性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、又はコラーゲン等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、又は抗体等が挙げられる。
　ＲＧＤ配列を有する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α－ポリリジン又はε－ポリリジン等のポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド－ｃｏ－ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε－カプロラクタム、ポリアクリルアミド、又はポリ（メタクリル酸メチル－γ－ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
　ＲＧＤ配列を有する物質は、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、キチン、又はキトサンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンである。
　（相互作用する物質）
　相互作用する物質とは、ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、一又は複数の実施形態において、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等によって化学的及び又は物理的にＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
　ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、又は抗体等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はデキストラン硫酸等の糖、及びヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、α－ポリリジン又はε－ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、又はポリアスパラギン酸等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、上述のＲＧＤ配列を有する合成高分子として例示したものが挙げられる。
　相互作用する物質は、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、又はエラスチンが好ましく、より好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、又はコラーゲン、さらに好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、又はヒアルロン酸である。
　ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質との組み合わせは、特に制限されず、相互作用する異なる物質の組み合わせであればよく、いずれか一方がＲＧＤ配列を含む高分子又はタンパク質であり、他方がこれと相互作用する高分子又はタンパク質であればよい。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用を有する物質との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε－ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ結合コラーゲン又はＲＧＤ結合ゼラチンとコラーゲン又はゼラチン等が挙げられる。中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε－ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、又はラミニンとゼラチンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチンとゼラチンである。なお、ＲＧＤ配列を有する物質及び相互作用を有する物質は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
　（正の電荷を有する物質）
　正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、一又は複数の実施形態において、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、ポリ（α－リジン）、ポリ（ε－リジン）等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
　（負の電荷を有する物質）
　負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β－ラクトグロブリン、チログロブリン、α－ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ（βリジン）等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
　正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ε－ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ε－ポリリジンとポリスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、好ましくはε－ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩である。ポリスルホン酸塩としては、一又は複数の実施形態において、ポリスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）等が挙げられる。なお、正の電荷を有する物質及び負の電荷を有する物質は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
　以下に、被覆細胞の調製方法を好適な実施形態として、細胞に、まずＲＧＤ配列を有する物質を含有する溶液Ａを接触させた後、ＲＧＤ配列を有する物質に相互作用を有する物質を含有する溶液Ｂと接触させることにより被覆細胞を調製する方法を、例にとり説明する。但し、本開示は以下の実施形態に限定して解釈されるものではない。
　まず、細胞を溶液Ａと接触させる。これにより、細胞表面にＲＧＤ配列を有する物質を含む膜が形成され、細胞表面がＲＧＤ配列を有する物質を含む膜によって被覆される。細胞と溶液Ａとの接触は、一又は複数の実施形態において、溶液Ａを細胞に塗布又は添加すること、溶液Ａに細胞を浸漬させること、溶液Ａを細胞に滴下又は噴霧すること等により行うことができる。中でも、操作が容易であるという理由から、溶液Ａに細胞を浸漬させることにより、細胞と接触させることが好ましい。
　接触条件は、一又は複数の実施形態において、接触方法、ＲＧＤ配列を有する物質及び又は細胞の種類、及び含有液の濃度等に応じて適宜決定できる。接触時間は、一又は複数の実施形態において、３０秒～２４時間、１分～６０分、１分～１５分、１分～１０分、又は１分～５分が好ましい。接触時の雰囲気温度及び又は溶液Ａの温度は、一又は複数の実施形態において、４～６０℃、２０～４０℃、又は３０～３７℃が好ましい。
　溶液Ａは、ＲＧＤ配列を有する物質を含んでいればよく、好ましくはＲＧＤ配列を有する物質と溶媒又は分散媒体（以下、単に「溶媒」ともいう）とを含む。溶液ＡにおけるＲＧＤ配列を有する物質の含有量は、一又は複数の実施形態において、０．０００１～１質量％、０．０１～０．５質量％、又は０．０２～０．１質量％が好ましい。溶媒としては、一又は複数の実施形態において、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、グリシルグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、又はＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、３～１１、６～８、又は７．２～７．４が好ましい。
　溶液Ａは、一又は複数の実施形態において、塩、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、生理活性ペプチド、又は医薬組成物等をさらに含有してもよい。医薬組成物としては、一又は複数の実施形態において、疾患の治療剤、予防剤、抑制剤、抗菌剤、又は抗炎症剤等が挙げられる。塩としては、一又は複数の実施形態において、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、コハク酸ナトリウム等が挙げられる。塩は、一種類でもよいし二種類以上含有していてもよい。溶液Ａ及び溶液Ｂの双方が塩を含有していてもよいし、いずれか一方が塩を含有していてもよい。溶液Ａ中の塩濃度は、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、１×１０-6Ｍ～２Ｍであり、好ましくは１×１０-4Ｍ～１Ｍ、より好ましくは１×１０-4Ｍ～０．０５Ｍである。
　ついで、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜の形成に使用されなかった物質を除去する。除去は、一又は複数の実施形態において、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による除去は、一又は複数の実施形態において、溶液Ａに細胞を分散させた状態で遠心分離し、ついで上澄みを除去することにより行うことができる。遠心分離条件は、細胞の種類、細胞の濃度、及び溶液Ａに含まれる含有物の組成によって適宜決定できる。
　上記除去に加えて、洗浄操作を行うことが好ましい。洗浄は、一又は複数の実施形態において、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による洗浄は、一又は複数の実施形態において、上澄みを除去された細胞に溶媒を添加し、遠心分離及び上澄みの除去をすることにより行うことができる。洗浄に用いる溶媒は、溶液Ａの溶媒と同じであることが好ましい。
　ついで、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜で被覆された細胞を溶液Ｂと接触させる。これにより、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜表面に相互作用をする物質を含む膜が形成され、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜で被覆された細胞表面が相互作用をする物質を含む膜によって被覆される。溶液Ｂとの接触は、ＲＧＤ配列を有する物質に代えて相互作用する物質を使用する以外は、溶液Ａとの接触と同様に行うことができる。
　溶液Ａ又は溶液Ｂと細胞との接触とを交互に繰り返し行うことにより、細胞表面全体に、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜と相互作用をする物質を含む膜とが交互に積層された細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成することができる。溶液Ａ又は溶液Ｂと細胞との接触を行う回数は、形成する細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚み等に応じて適宜決定できる。
　なお、被覆細胞及び被覆細胞の培養は、一又は複数の実施形態において、特開２０１２－１１５２５４号公報に開示された方法を参酌して行うことができる。
　本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
［１］　ペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法であって、
　前記三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、
　前記三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又は前記ペースメーカー細胞の細胞層と前記細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法。
［２］　前記ペースメーカー細胞は、多能性を有する幹細胞に由来するペースメーカー細胞である、［１］記載の製造方法。
［３］　前記三次元組織片の形成は、前記被覆細胞を容器内に播種すること、及び前記容器内で積層された状態の前記被覆細胞を培養することを含む、［１］又は［２］記載の製造方法。
［４］　前記被覆細胞を調製することを含み、
　前記被覆細胞の調製は、ペースメーカー細胞の細胞塊をトリプシン処理すること、及び前記トリプシン処理により細胞塊から分散させたペースメーカー細胞の表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成することを含む、［１］から［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］　前記細胞塊は、ＨＣＮ遺伝子が導入された多能性幹細胞を分化誘導させて得られた胚様体を無糖乳酸添加培地で培養し、ペースメーカー細胞を選別することにより得られた細胞塊である、［４］記載の製造方法。
［６］　前記三次元組織片は、前記ペースメーカー細胞を１×１０5個以上含む、［１］から［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］　ペースメーカー細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、
　前記ペースメーカー細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化された、ペースメーカー組織片。
［８］　［１］から［６］のいずれかに記載の製造方法によって製造される、［７］記載のペースメーカー組織片。
［９］　バイオロジカルペースメーカーとして利用可能な、［７］又は［８］記載のペースメーカー組織片。
　以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
　なお、本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）：ＨＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社製）でｐＨ７．４に調整した５０ｍＭ　Ｔｒｉｓを、０．２μｍ　γ－ｒａｙ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｆｉｌｔｅｒ（倉敷紡績株式会社製）で滅菌濾過したもの
　ＢＦＮ：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｆｒｏｍ　ｂｏｖｉｎｅ　ｐｌａｓｍａ（ＳＩＧＭＡ製）
　ＢＦＮ溶液：０．２ｍｇ　ＢＦＮ／１ｍｌ　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
　ＤＭＥＭ：１０％　ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ社製）
　Ｇｅｌａｔｉｎ溶液：０．２ｍｇ　Ｇｅｌａｔｉｎ／１ｍｌ　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を、０．２μｍ　γ－ｒａｙ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｆｉｌｔｅｒ（倉敷紡績株式会社製）で滅菌濾過したもの
　（実施例１）
　［ｍＥＳ細胞由来心筋細胞の作製］
　マウスＥＳ細胞にＲｏｓａ２６－ＨＣＮ４－ＩＲＥＳ－ＡｃＧＦＰ１／ＡＡＶＳ１－Ｈｃｎ４－ＩＲＥＳ－ＡｃＧＦＰ１をエレクトロポレーションにより導入し、Ｈｃｎ４過剰発現マウスＥＳ細胞を作製した。作製したＨｃｎ４過剰発現マウスＥＳ細胞を４日間浮遊培地して胚様体を形成させた後、分化用培地で１０日間培養し、ペースメーカー機能を有する心筋細胞に分化誘導させた。分化誘導させた細胞を無糖乳酸添加培地で５日間培養することによって、Ｈｃｎ４過剰発現マウスＥＳ細胞（以下、「ｍＥＳ細胞由来心筋細胞」ともいう）を選別し、選択的にｍＥＳ細胞由来心筋細胞を細胞塊として取得した（Ｔｏｈｙａｍａ，　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　２０１２）。得られたｍＥＳ細胞由来心筋細胞は、１分間当たり２５２回の拍動を示した。細胞の拍動数は、位相差顕微鏡観察により測定した。
　［被覆細胞の作製］
　得られた細胞塊をトリプシン処理（０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ）（３７℃、５分間）し、細胞塊から個々の細胞（ｍＥＳ細胞由来心筋細胞）に分散させた。得られたｍＥＳ細胞由来心筋細胞をフラスコ等に接着させることなく、細胞の表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成した。被膜の形成は、以下の手順で行った。ｍＥＳ細胞由来心筋細胞を１×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で０．２ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら１分間分散状態を保った後、２，５００ｒｐｍの回転数で１分間の遠心分離を行った（ＦＮ浸漬操作）。ついで、上澄みを除き、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら１分間分散状態を保った後、２，５００ｒｐｍの回転数で１分間の遠心分離を行った（洗浄操作）。上澄みを除き、０．２ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、１分間分散状態を保った後、２，５００ｒｐｍの回転数で１分間の遠心分離を行い（Ｇ浸漬操作）、ついで洗浄操作を行った。そして、ＦＮ浸漬操作、洗浄操作、Ｇ浸漬操作、及び洗浄操作をこの順番で行った。ＦＮ浸漬操作及びＧ浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで１ステップとし、最終的に、ＦＮ浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことによって被覆細胞を作製した（コーティング層の厚み：７ｎｍ）。
　［ペースメーカー組織片の作製］
　２４ウェル培養プレートに配置したトランスウェル（コーニング社製；ポアサイズ：０．４μｍ、表面積：０．３３ｃｍ2）のメンブレンフィルタ上に４×１０5個の被覆細胞を播種し、１０重量％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を添加して３７℃で５日間培養した。これによりペースメーカー細胞が４層積層されたペースメーカー組織片（厚み：およそ３０μｍ）が得られた。得られたペースメーカー組織片におけるペースメーカー細胞の密度は４×１０7個／ｍｍ2であった。図１に得られたペースメーカー組織片の位相差写真を示す。得られたペースメーカー組織片は、組織片に含まれるペースメーカー細胞が同期して心筋細胞組織として一律な拍動が確認された（拍動数：約２５０回／分）。
　参考例として、メンブレンフィルタ上に播種した被覆細胞の数を１×１０5個とした以外は、実施例１と同様に、１層のペースメーカー細胞層を作製した。得られたペースメーカー細胞層は、５０回／分程度の拍動を示したが、細胞層として一律な拍動は見られなかった。
　［ペースメーカー組織片の評価］
　得られたペースメーカー組織片を通常の培地（１２ｍＬ）で５日間培養後、拍動数を測定し、ついで１．０μＭイソプロテレノールを添加して３０分間培養した。拍動数を測定した後、ＰＢＳで３回洗浄した後通常の培地（１２ｍＬ）で１日間培養して拍動数を測定し、３．０μＭイバブラジンを添加して３０分間培養した。拍動数を測定した後、３０μＭイバブラジンを添加してさらに３０分間培養して拍動数を測定した。ＰＢＳで３回洗浄した後通常の培地（１２ｍＬ）で３０分間培養し、拍動数を測定した。その結果を図２に示す。なお、培地は、１０重量％ＦＢＳ及び１％抗菌剤を含むＤＭＥＭ培地を用いた。
　図２は、薬剤添加前後のペースメーカー組織片の１分間あたりの拍動数の変化を示すグラフの一例である。図２において左から順に、イソプロテレノール添加前（Ｎｏｒｍａｌ）、イソプロテレノール添加３０分後、通常の培地への交換後（Ｎｏｒｍａｌ）、３．０μＭイバブラジン添加３０分後、３０μＭイバブラジン添加３０分後、通常の培地への交換後（Ｎｏｒｍａｌ）における拍動数を示す。図２に示すように、実施例１のペースメーカー組織片は、拍動促進剤であるイソプロテレノールを添加すると拍動数が大幅に上昇し、一方、Ｈｃｎ４遺伝子阻害剤であるイバブラジンを添加すると拍動数が減少した。また、参考例として、Ｈｃｎ４遺伝子を導入することなく心筋細胞に分化誘導させた細胞を用いた以外は実施例１と同様の手順で作製した組織片を使用して同様の実験を行ったところ、拍動数の変化はほとんど見られなかった。よって、実施例１のペースメーカー組織片に含まれるペースメーカー細胞は、Ｈｃｎ４チャネルが発現し、機能していることが確認できた。
　（実施例２）
　［マウスへの移植実験］
　実施例１と同様にしてペースメーカー移植片（大きさ：０．３３ｃｍ2、細胞の密度：４×１０7個／ｍｍ3）を作製し、それをＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。移植１週間後、特に強い炎症反応などは観察されず、良好な生着が確認された。
　（実施例３）
　被覆細胞の細胞数を１×１０6個とし、播種後の培養期間を２０日にとした以外は実施例１と同様にしてペースメーカー組織片を作製した。ホルマリン固定後、免疫蛍光染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いた測定を行った。その結果を、筋細胞に特異的なトロポニンであるトロポニンＴの発現、細胞間のイオン伝達をつかさどるギャップジャンクションを構成するタンパク質であるコネキシン４３の発現が確認できた。また、アクチン及びミオシンの発現が確認できると共に、トロポニンとアクチンとがほぼ同じ位置に発現しており、生体における心筋組織に類似する染色パターンが確認できた。細胞間接着に関与するＥ－カドヘリンの発現も確認できた。
　（実施例４）
　被覆細胞の細胞数を１×１０5個、３×１０5個又は５×１０5個とし、播種後の培養期間を７日間とした以外は実施例１と同様にして細胞層の異なる３種類のペースメーカー組織片（細胞層：１層、３層又は５層）を作製し、その拍動数を計測した。また、参考例としてＨｃｎ４遺伝子を導入することなく心筋細胞に分化誘導させた細胞を用いた以外は実施例４と同様の手順で作製し、拍動数の計測を行った。それらの結果を図３に示す。
　図３に示すように、細胞層数が５層のペースメーカー組織片（厚み：１７±５．０μｍ）の拍動数が最も多く、次に３層（厚み：１１±０．５μｍ）及び１層（厚み：４．９±1.7μｍ）の順番で拍動数の減少が見られた。つまり、細胞層の数及び／又は厚みが多ければ多いほど、拍動数が上昇した。

Claims (9)

  1. 　ペースメーカー細胞が積層された三次元組織片を形成することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法であって、
    　前記三次元組織片は、ペースメーカー細胞と細胞外マトリックス成分とを含み、
    　前記三次元組織片の形成は、ペースメーカー細胞の表面が細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された被覆細胞を積層して培養すること、又はペースメーカー細胞の細胞層と細胞外マトリックス成分を含む層とを交互に積層して培養することを含む、ペースメーカー組織片の製造方法。
  2. 　前記ペースメーカー細胞は、多能性を有する幹細胞に由来するペースメーカー細胞である、請求項１記載の製造方法。
  3. 　前記三次元組織片の形成は、前記被覆細胞を容器内に播種すること、及び前記容器内で積層された状態の前記被覆細胞を培養することを含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記被覆細胞を調製することを含み、
    　前記被覆細胞の調製は、ペースメーカー細胞の細胞塊をトリプシン処理すること、及び前記トリプシン処理により細胞塊から分散させたペースメーカー細胞の表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成することを含む、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　前記細胞塊は、ＨＣＮ遺伝子が導入された多能性幹細胞を分化誘導させて得られた胚様体を無糖乳酸添加培地で培養し、ペースメーカー細胞を選別することにより得られた細胞塊である、請求項４記載の製造方法。
  6. 　前記三次元組織片は、前記ペースメーカー細胞を１×１０5個以上含む、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
  7. 　ペースメーカー細胞と、細胞外マトリックス成分とを含み、
    　前記ペースメーカー細胞が前記細胞外マトリックス成分を介して積層され三次元組織化された、ペースメーカー組織片。
  8. 　請求項１から６のいずれかに記載の製造方法によって製造される、請求項７記載のペースメーカー組織片。
  9. 　バイオロジカルペースメーカーとして利用可能な、請求項７又は８記載のペースメーカー組織片。
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