WO2011040469A1 - 新規ペースメーカ細胞 - Google Patents

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WO2011040469A1
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cell
cells
pacemaker
channel
controlling
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一郎 久留
安昭 白吉
淳一朗 三明
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国立大学法人鳥取大学
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Definitions

  • the present invention relates to a cardiac pacemaker cell, in particular, a pacemaker cell capable of controlling a heart rate, a method for obtaining the same, a use thereof, and the like.
  • a cardiac pacemaker cell in particular, a pacemaker cell capable of controlling a heart rate, a method for obtaining the same, a use thereof, and the like.
  • Bradyarrhythmia with a marked decrease in heart rate is an arrhythmia that increases with age, causing sudden death, heart failure, and stroke, and has a large social impact in Japan, where the aging population is declining.
  • As a treatment method for this disease there is no useful means other than transplantation of an artificial pacemaker operated by a battery used to increase the heart rate, and about 50,000 people are transplanted annually.
  • Artificial pacemaker transplantation (1) requires surgery and is highly invasive to the living body, and (2) requires re-implantation in 5 to 8 years due to battery consumption. (3) Furthermore, since the heart rate does not increase in accordance with the activity level of the living body, a decrease in QOL is inevitable.
  • Embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells can be differentiated in vitro into three germ layers, especially when ES cell aggregates (embryoid bodies) are formed, which can be differentiated into cardiomyocytes, among which pacemaker cells It is known to be included (Non-Patent Document 1).
  • Biological pacemakers made from cells can make their own electrical signals and can compensate for the above-mentioned drawbacks of artificial pacemakers if they can control autonomic nerves.
  • embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells can be induced to differentiate into the heart relatively easily by culturing the cells three-dimensionally, but only pacemaker cells have not yet been selectively collected. The main cause is that an index that can select pacemaker cells has not been found.
  • pacemaker cells have not been successfully selected and collected. Furthermore, when considering application to future regenerative medicine, it is necessary to establish a method for selecting only pacemaker cells without requiring genetic modification of embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells. In addition, if a pacemaker cell capable of controlling the heart rate at any time and at any time is obtained, the heart rate does not increase in accordance with the degree of activity of the living body, so that a decrease in the patient's QOL can be avoided.
  • pacemaker cells could be selected using ion channels specifically present on the surface of pacemaker cells as an index. If this is possible, by using an ion channel antibody, pacemaker cells can be collected without genetic modification of embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, and application to regenerative medicine is facilitated.
  • the present inventors conducted intensive research based on the above hypothesis, and as a result of conducting comprehensive gene analysis, expressed a channel specific to pacemaker cells in the process of ES cell differentiation into the heart.
  • the HCN4 channel is a useful index for selective collection of pacemaker cells, and cells collected by this method are HCN channels, Ca It has been found that it has a feature as a pacemaker cell that expresses a channel, a HERG channel, but does not express an inward rectifying K channel.
  • the pacemaker cell of the present invention is a novel pacemaker cell that possesses a Na channel and that can control its heart rate by controlling the Na channel. I found it. Furthermore, the present inventors have found that when the pacemaker cells of the present invention are assembled and transplanted into the heart muscle of an animal as a cell mass, a powerful and permanent pacemaker function is exhibited and the heart rate can also be controlled. . Furthermore, the present inventors have succeeded in producing an antibody capable of recognizing this cell. Thus, the present inventors have completed the present invention.
  • the main features of the present invention are: (I) ES cells can be induced to differentiate into myocardium, and pacemaker cells can be selectively collected using the HCN4 channel as a marker.
  • the pacemaker cell of the present invention is a pacemaker cell that expresses many Na channels in addition to the basic properties as a pacemaker cell and can control the heart rate by controlling the Na channel.
  • the present invention can also be used in human ES cells and human iPS cells.
  • the pacemaker cell of the present invention exhibits a powerful and permanent pacemaker function when a certain number or more are assembled and actually transplanted into the heart as a cell mass. Moreover, the heart rate can be controlled by adjusting the autonomic nerve.
  • the antibody capable of recognizing the pacemaker cell of the present invention can be prepared using a specific amino acid sequence of the extracellular domain of HCN4 as an antigen recognition site.
  • the present invention provides the following: (1) A pacemaker cell having an HCN4 channel and an Na channel and capable of controlling the heart rate by controlling the Na channel, derived from embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells) or primordial germ cells A universal pacemaker cell. (2) An embryonic stem cell (ES cell), an induced pluripotent stem cell (iPS cell) or a primordial germ cell-derived universal cell is induced to differentiate into myocardium, and an HCN4 channel is selected as a marker. A method of acquiring pacemaker cells that can control heart rate by control.
  • the HCN4 channel gene is introduced into embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells) or primordial germ cell-derived universal cells to induce differentiation into myocardium, and cells that are positive for the labeling are selected.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • primordial germ cell-derived universal cells to induce differentiation into myocardium, and cells that are positive for the labeling are selected.
  • a method for producing a pacemaker cell capable of controlling a heart rate by controlling a Na channel is prepared by incorporating a gene encoding a selectable marker into the HCN4 channel gene, and this is used as an embryonic stem cell (ES cell), induced pluripotent stem cell (iPS cell) or primordial germ cell-derived universal cell.
  • ES cell embryonic stem cell
  • iPS cell induced pluripotent stem cell
  • primordial germ cell-derived universal cell The method for producing pacemaker cells according to (3), wherein the method is introduced into (1).
  • a method for producing a cardiac pacemaker capable of controlling a heart rate by controlling Na channel wherein the pacemaker cell according to (1) or (5) or the graft according to any one of (6) to (9) The method characterized by using.
  • An HCN4-specific antibody obtained using the amino acid sequence VSINGMVNNSW (SEQ ID NO: 1) or VPMLQDFPHD (SEQ ID NO: 2) as an immunogen and using these amino acid sequences as recognition sites.
  • the present invention provides a pacemaker cell capable of controlling the heart rate according to the present invention.
  • the pacemaker cell of the present invention can control the heart rate at any time and at any time. Therefore, it is possible to prevent the patient's QOL from decreasing. Further, in the method for obtaining pacemaker cells of the present invention, only pacemaker cells can be obtained without requiring genetic modification of embryonic stem cells (ES cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells). Also suitable for application. Furthermore, when a certain number or more of the pacemaker cells of the present invention are assembled and transplanted into the myocardium as a cell mass, the pacemaker function is powerful and lasts long.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • FIG. 1 schematically shows a targeting gene in which a GFP protein gene as a selective collection marker is linked to the promoter region of the HCN4 channel gene.
  • the GFP gene was subjected to homologous gene recombination into HCN4 locus of the AB1 (wild type) ES cell line to establish a knock-in ES cell line.
  • FIG. 2 shows the results of screening HCN4-GFP gene knock-in ES cells. Establishment of HCN4-GFP gene knock-in ES cells was confirmed by PCR and Southern blotting.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in the heart rate of the embryoid body accompanying induction of differentiation of HCN4-GFP gene knock-in ES cells into the heart.
  • FIG. 1 schematically shows a targeting gene in which a GFP protein gene as a selective collection marker is linked to the promoter region of the HCN4 channel gene.
  • the GFP gene was subjected to homologous gene recombination into HCN4 locus of
  • FIG. 4 is an observation result of the incubation imaging system showing the relationship between the pulsation site of the H7 embryoid body and GFP expression.
  • the pulsation site and the GFP expression site are indicated by arrows and surrounded by a white broken line.
  • FIG. 5 shows the results of sorting and collecting only GFP signal positive cells by FACS.
  • FIG. 6 is a microscopic image showing the morphology of H7 embryoid body-derived HCN4-GFP positive cells.
  • FIG. 7 shows the number of pulsations on the 11th, 13th, and 14th days of differentiation of GFP signal positive cells.
  • FIG. 8 shows the results of examining cardiac pacemaker gene expression in HCN4-GFP positive cells derived from H7 embryoid bodies on the 11th day after differentiation induction.
  • FIG. 9 shows the results of immunostaining of H7-embryoid-derived HCN4-GFP positive cells on days 7, 10, and 15 after differentiation induction. 7+, 7 ⁇ , 10+, 10 ⁇ , 15+, and 15 ⁇ are a GFP positive fraction and a GFP negative fraction on day 7 after differentiation induction, and a GFP positive fraction and a GFP negative fraction on day 10 after differentiation induction, respectively. The GFP positive fraction and the GFP negative fraction on the 15th day after differentiation induction are shown.
  • FIG. 10 shows the result of immunostaining of HCN4-GFP positive cells derived from H7 embryoid body 18 days after differentiation induction. FIG.
  • FIG. 11 shows the analysis result of the automatic ability driven by the HCN4 channel of HCN4-GFP positive cells derived from H7 embryoid bodies.
  • FIG. 12 shows the analysis results of ion channels responsible for the pacemaker activity of H7 embryoid body-derived HCN4-GFP positive cells.
  • FIG. 13 shows the result of simulating the electrical activity of GFP signal positive cells when Na channel is suppressed.
  • FIG. 14 is a graph showing the relationship between the Na channel inhibitor lidocaine concentration and the heart rate of the pacemaker cell of the present invention.
  • FIG. 15 shows the positive chronotropic action of H7 embryoid body-derived HCN4-GFP positive cells by ⁇ 1 receptor stimulation.
  • FIG. 17 shows the increase in the heart rate of the pacemaker cell of this invention by the autonomic nerve stimulant isoproterenol.
  • HCN4-GFP positive cells are pacemaker cells that are controlled by sympathetic nerves.
  • FIG. 16 shows that the number of beats of the pacemaker cell of the present invention increases in response to the sympathomimetic drug isopreterenol and decreases in response to the parasympathomimetic drug carbachol.
  • the left panel of FIG. 17 is an X-gal stained photograph of a heart transplanted with a cell mass containing organized pacemaker cells.
  • the right panels in FIG. 17 are all microscopic images obtained by X-gal staining of the heart myocardial sections shown in the left panel.
  • FIG. 18 is an electrocardiogram showing the effect of transplanting the pacemaker cell of the present invention into the heart of an atrioventricular block rat.
  • the horizontal axis represents time (seconds), and the vertical axis represents potential (mV).
  • FIG. 19 is an electrocardiogram showing the effect of transplanting the pacemaker cell of the present invention into the heart of an atrioventricular block rat, and the electrocardiogram showing the influence on the heart rate of intraperitoneal injection of the sympathomimetic drug isoproterenol.
  • the horizontal axis represents time (seconds), and the vertical axis represents potential (mV).
  • FIG. 20 is a schematic diagram showing the procedure for producing a specific antibody that recognizes the extracellular domain of HCN4.
  • FIG. 21 is a Western blot showing that a specific antibody recognizing the extracellular domain of HCN4 recognizes the HCN channel of HL-1 cells.
  • a specific antibody that recognizes the extracellular domain of HCN4 recognizes the HCN channel of HL-1 cells.
  • FIG. 22 is an immunostained image of H7 embryoid body-derived HCN4-GFP positive cells using a specific antibody that recognizes the extracellular domain of HCN4.
  • the present invention is mainly based on the following findings (I) to (V):
  • (I) A characteristic ion channel which is examined by using a computer simulation model relating to electrical characteristics of cardiac pacemaker cells responsible for heart pulsation, and which is responsible for the properties of the pacemaker cells of the present invention is HCN gene family, Ca channel Outward channels such as gene families and HERG channels are important. It has been found that the current generated by these can generate the automatic capability of the pacemaker cells of the present invention.
  • HCN channel a channel specific to pacemaker cells
  • HCN4 channel is expressed in ES cell-derived cardiomyocytes. I found out.
  • a reporter gene in which a GFP protein gene as a selective collection marker was linked to the promoter region of the HCN4 channel gene was prepared, and this was introduced into a cell in which the reporter gene was incorporated into one chromosome allele.
  • the pacemaker cells of the present invention were successfully collected from the established ES cells using GFP fluorescence as an index.
  • the pacemaker cells of the present invention that were selected and collected contained cells that showed automatic ability, had characteristics common to the pacemaker cells, and were controlled by autonomic nerves.
  • the pacemaker cells of the present invention proved from the cell biological and electrophysiological aspects that Na channel was expressed, and pharmacologically proved that heart rate can be controlled under the control of Na channel.
  • the pacemaker cells obtained by the present invention can exert a powerful and permanent pacemaker function when a certain number or more of them gather to form a cell mass. This was confirmed by cell mass transplantation experiments. Moreover, it was possible to control the heart rate of the transplanted heart with the excitation of autonomic nerves.
  • An antibody capable of recognizing the present cell was prepared using a specific amino acid sequence of the extracellular domain of HCN4 as an antigen recognition site, and it was confirmed that the pacemaker cell of the present invention could be recognized.
  • the present invention provides a pacemaker cell that has an HCN channel and an Na channel and can control the heart rate by controlling the Na channel, and is derived from an ES cell or an iPS cell.
  • the HCN channel of the pacemaker cell of the present invention may be any one of HCN1, HCN2, HCN3, and HCN4, but is preferably the HCN4 channel.
  • the animal species derived from the ES cell or iPS cell may be any animal species. ES cells or iPS cells derived from the same animal species to be treated with pacemaker cells are preferred.
  • the pacemaker cell of the present invention is characterized in that the number of beats (heart rate) can be controlled at any time by inhibiting or activating Na channel.
  • an HCN channel activator may be allowed to act on the cell.
  • usable HCN4 channel activators include salicylate and benzoate.
  • usable HCN4 channel inhibitors include lidocaine, plisicainide, procainamide and the like.
  • the pacemaker cell of the present invention can also increase the heart rate with a sympathomimetic drug.
  • Usable sympathomimetic agents include isoproterenol, norepinephrine and the like.
  • the pacemaker cells of the present invention can also reduce heart rate with parasympathomimetic drugs.
  • Examples of the parasympathomimetic that can be used include carbachol and acetylcholine. These agents are exemplary and are not intended to be particularly limited.
  • ES cells, iPS cells, or primordial germ cell-derived universal cells are induced to differentiate into myocardium, and HCN4 channel is selected as a marker.
  • a method for obtaining pacemaker cells capable of controlling the number is provided.
  • proteins present in cells are used as sorting indexes, and there are no examples using ion channels as sorting indexes.
  • pacemaker cells can be collected using the HCN channel as a marker.
  • What can be used as a marker in the method for obtaining pacemaker cells of the present invention is an HCN channel, which may be any of HCN1, HCN2, HCN3, and HCN4, and HCN4 is preferred.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • primordial germ cell-derived universal cells Means and methods for inducing differentiation of embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells) or primordial germ cell-derived universal cells into myocardium can be appropriately selected and employed by those skilled in the art.
  • Known media components and culture conditions can be used for this purpose.
  • the detection of the HCN channel of cells induced to differentiate into the myocardium can also be performed by a known method such as a method using an antibody specific for the HCN channel (preferably, the HCN4 channel). It is not limited.
  • a detectable label is attached to the antibody to be used and the HCN channel to be expressed.
  • the pacemaker cell of the present invention is obtained by FACS using a cell sorter using the HCN channel (preferably, HCN4 channel) as a marker.
  • an HCN channel gene (preferably an HCN4 channel gene) is introduced into embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells) or primordial germ cell-derived universal cells into the myocardium. And providing a method for producing pacemaker cells capable of controlling heart rate by controlling Na channel, wherein differentiation-induced cells are selected and cells having positive labeling are selected and obtained.
  • Means and methods for introducing HCN channel genes into cells are well known to those skilled in the art, and examples include the CaCl 2 method, lipofectamine method, nucleofector method, and electroporation method, but are not limited to these methods and methods. .
  • the HCN channel gene (preferably, the HCN4 channel gene) can be labeled with a selectable label and introduced into the cell. By using such a technique, it becomes easy to select and acquire cells having HCN channels. As shown in the Examples, it encodes a gene (eg, GFP gene, RFP gene, or other protein or peptide that can be detected or bound from the outside) that encodes an HCN channel gene (preferably an HCN4 channel gene) that can be selected.
  • a gene eg, GFP gene, RFP gene, or other protein or peptide that can be detected or bound from the outside
  • an HCN channel gene preferably an HCN4 channel gene
  • the pacemaker cell of the present invention may be obtained by sorting and obtaining cells having It is preferable to incorporate a gene encoding a selectable marker into the promoter region of the HCN gene.
  • the label is preferably GFP, RFP, an antibody binding site (for example, an antibody recognition site for HCN4 such as SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2), and the like.
  • the pacemaker cell selected and obtained using the HCN4 channel as a marker has the characteristics as a pacemaker cell that expresses not only the HCN4 channel and the Na channel but also the Ca channel and the HERG channel but does not express the inward rectifier K channel. Turned out to be. On the other hand, it is unexpected that the pacemaker cells collected as described above possess Na channels, and the pacemaker cells are a new type of pacemaker cells whose heart rate can be controlled by controlling Na channels. there were.
  • the present invention provides a pacemaker cell obtained by the above collection method, which has an HCN channel and an Na channel, and whose heart rate can be controlled by controlling the Na channel.
  • Arrhythmia can be treated or improved using the pacemaker cell of the present invention.
  • the types of arrhythmia that can be treated or ameliorated using the pacemaker cell of the present invention are types that can be treated or ameliorated by conventional pace pacers, such as bradyarrhythmias such as bradycardic ventricular fibrillation, atrioventricular block, sinus function Insufficiency syndrome and the like can be mentioned, but not limited to these arrhythmias.
  • the pacemaker cell suspension of the present invention may be applied directly to the heart. At that time, the pacemaker cell of the present invention may be contained in a suitable carrier or base material to form a graft.
  • the carrier or substrate examples include a temperature-sensitive culture dish and fibrin glue, and a temperature-sensitive culture dish is preferable. Also preferred is a biodegradable carrier or substrate such as biodegradable cellulose that is degraded after the pacemaker cells of the present invention have established and functioned in the heart.
  • the cells may be attached or immobilized on the surface of the carrier or substrate, or may be embedded in the carrier or substrate.
  • the pacemaker cell of the present invention may be applied to the heart by being contained in a sheet-like carrier or substrate made of a temperature-sensitive culture dish or a matrix such as Matrigel.
  • the pacemaker cells of the present invention are assembled and used as a cell mass in the pacemaker. By organizing as a cell mass, a powerful and permanent pacemaker function can be exhibited.
  • the cell mass obtained by assembling the pacemaker cells of the present invention contains the pacemaker cells of the present invention. Good.
  • the present invention comprises about 60,000 or more, about 70,000 or more or about 80,000 or more, preferably about 90,000 or more, more preferably about 150,000 or more, more preferably about 200,000 or more of the present invention.
  • the above-mentioned number of pacemaker cells of the present invention may be used as one cell cluster, or may be used as a plurality of cell clusters (for example, 2 to several cells, 10 to 20 cells, etc.).
  • 30 cell masses containing about 3000 pacemaker cells may be transplanted into the heart.
  • five cell clusters containing about 3000 pacemaker cells may be collected to create a larger cell cluster, and these four tissue clusters may be transplanted into the heart.
  • five cell masses containing about 3000 pacemaker cells may be collected to create a larger cell mass, and these 6 tissue masses may be transplanted into the heart.
  • the shape of the cell mass may be any shape as long as the pacemaker cells of the present invention in the cell mass can transmit electrical stimulation to each other, for example, a sheet shape, a linear shape, a spherical shape, a rod shape, a plate shape, and the like A three-dimensional shape may be sufficient and an irregular shape may be sufficient.
  • the shape of the cell mass can be appropriately selected according to the desired pacemaker shape or the shape of the transplant site.
  • the cell mass of the pacemaker cell of the present invention can be obtained by a known method such as hanging drop culture or sheet-like monolayer culture.
  • a cell mass formed by a certain number of pacemaker cells of the present invention can be transplanted or connected to the heart as a graft, as it is, or carried in a sheet or other matrix, or placed in a suitable container. it can.
  • the material for the sheet and matrix include those exemplified above, but other materials can also be used.
  • the cell mass of the pacemaker cell of the present invention when directly transplanted into the myocardium, it may be inside or on the myocardium, for example, it may be injected into the myocardium or adhered to the myocardial surface. Also good.
  • the cell mass containing the pacemaker cell of this invention may be put into a suitable container, and it may be used similarly to the conventional pacemaker.
  • the present invention provides a cardiac pacemaker that has the pacemaker cell of the present invention or the above graft as an essential component and can control the heart rate by controlling Na channel.
  • the cardiac pacemaker of the present invention may be, for example, one in which the pacemaker cell of the present invention or a cell mass containing the same is supported on a sheet or matrix, or may be the cell mass itself, or of the present invention.
  • the pacemaker cell or the cell mass may be put in a suitable container.
  • the heart rate of the pacemaker of the present invention can be controlled by using a Na channel inhibitor or activator or an autonomic nerve stimulator.
  • the cardiac pacemaker comprising the pacemaker cell of the present invention or a graft containing the same preferably has a means for contacting with, introducing or excreating Na channel inhibitors or activators or autonomic stimulants.
  • the pacemaker cell of the present invention or a graft (for example, a cell mass) containing the pacemaker cell may be directly contacted with the heart or implanted in the heart so that the drug can be directly delivered from the heart.
  • Examples of the means for administering the drug include internal use, intramuscular injection by a syringe, and intravenous administration.
  • the heart rate can be controlled by introducing or removing Na channel inhibitor, activator or autonomic nerve stimulator into cells in the cardiac pacemaker of the present invention through such means.
  • the present invention relates to a pacemaker cell obtained according to the present invention, or a graft containing the same, which is used for producing a cardiac pacemaker capable of controlling a heart rate by controlling Na channel.
  • the present invention relates to a method for producing a cardiac pacemaker capable of controlling a heart rate by controlling Na channel, wherein the pacemaker cell obtained by the present invention or a graft containing the same is used. Is.
  • the present invention controls the heart rate of the pacemaker cell of the present invention or the graft or cell sheet of the present invention, or the heart rate of the pacemaker of the present invention, which contains a Na channel inhibitor or activator.
  • the present invention provides an agent for controlling the heart rate of the pacemaker cell of the present invention or the graft or cell sheet of the present invention, or the heart rate of the pacemaker of the present invention, containing an autonomic nerve stimulant.
  • Such drugs include HCN4 channel activators, HCN4 channel inhibitors, sympathomimetic drugs, parasympathomimetic drugs, and the like, which have already been exemplified herein, but are not limited to these drugs.
  • Concentration of Na channel inhibitor or activator in drug, concentration of autonomic stimulant, amount of drug applied to pacemaker cell of the present invention or graft or cell sheet of the present invention, drug dose to pacemaker of the present invention The amount applied can be easily determined by a physician using tests that can usually be performed.
  • Such a drug can be applied not only directly to the pacemaker cell of the present invention or the graft of the present invention, but also to a patient by a route such as injection, infusion, or oral administration.
  • the pacemaker of the present invention does not need to be removed from the heart even when the pacemaker is no longer needed, such as when the patient's heart is healed, such as lidocaine, mexiletine, and pildicainide, which are sodium channel inhibitors.
  • the drug can be stopped by administering the drug, and when it is needed again, its function can be resumed by removing the sodium channel blockers such as lidocaine, mexiletine, and pildikainide. Can do.
  • the invention in a further aspect, is an antibody specific for HCN4, raised against the amino acid sequence of the extracellular domain of HCN4, preferably VSINGMVNNSW (SEQ ID NO: 1) or VPMLQDFPHD (SEQ ID NO: 2) HCN4 channel specific antibodies are provided.
  • cysteine can be added to the terminal of these sequences to contribute to the binding with the carrier protein.
  • the amino acid sequences VSINGMVNNSWC (SEQ ID NO: 3) and CVPMLQDFPHD (SEQ ID NO: 4) can be mentioned.
  • the antibody thus obtained has an amino acid sequence of the extracellular domain of HCN4, preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, as an antigen recognition site.
  • a person skilled in the art can obtain an antibody raised against the amino acid sequence of other parts of HCN4, not limited to the amino acid sequence, using the above-described method.
  • An antibody specific for HCN4 can be used in the method for obtaining pacemaker cells of the present invention.
  • Examples of antibodies specific to HCN4 that can be used in the method for obtaining pacemaker cells of the present invention include, but are not limited to, the antibodies described above.
  • the pacemaker cell of the present invention can be efficiently obtained by using an antibody specific for HCN4 with a detectable label.
  • a targeting gene was prepared by linking a GFP protein gene as a selective collection marker to the promoter region of the HCN4 channel gene. That is, a targeting vector designed to insert an EGFP + PGK ⁇ neo unit at the position of the Met codon of the first exon of the HCN4 gene and to delete a part of the coding region was obtained by electroporation with AB1 ES cells 90% confluent.
  • the gene was introduced into.
  • the medium was changed 24 hours after the introduction of the targeting gene, Geneticin was added to the medium so that the concentration was 250 ⁇ g / ml, and selection was performed for about one week.
  • Hybridization was overnight with a probe labeled with ⁇ - 32 P (Institut Isotopes) by Bca BEST Labeling Kit (TaKaRa).
  • the membrane after hybridization was washed twice with 2 ⁇ SSC / 0.5% SDS, 2 ⁇ SSC / 0.1% SDS, 0.2 ⁇ SSC / 0.1% SDS in the order 0.2 ⁇ SSC,
  • the target DNA sequence was detected by measuring radioactivity.
  • a targeting gene was introduced into an ES cell, and a knock-in ES cell in which the GFP gene was incorporated into a chromosomal allele on one side could be established. This establishment was confirmed by PCR and Southern blotting.
  • the GFP signal at the pulsation site of the embryoid body was observed by an incubation imaging system that can observe the embryoid body as it is. As shown in FIG. 4, a portion of the embryoid body pulsated in agreement with the GFP signal. Only GFP signal positive cells were selected and collected by FACS.
  • the formed embryoid bodies are treated with trypsin (1 ⁇ Trypsin / EDTA / GIBCO-BRL 37 ° C. for 5 to 15 minutes) to dissociate the cells into single cells.
  • collagenase treatment (collagenase type II / 37 ° C. for 1 hour) is additionally performed.
  • the cells were suspended in HBSS-1% FCS (HBSS: Hank's Balanced Salt Solution / CAMBREX), 2.5 ⁇ g / m Propium iodide (PI), and cell sorter (BECKMAN-COULTER TRICS EPICS) using AB1 or cos7 as a negative control.
  • FCS Hank's Balanced Salt Solution / CAMBREX
  • PI Propium iodide
  • BECKMAN-COULTER TRICS EPICS cell sorter
  • the pulsation probability of the GFP signal positive cells was 85%.
  • RNA extraction Undifferentiated ES cells of Day 0 to 21 and embryoid bodies were collected on a regular basis using HT7 strain, and RNA was extracted after lysis in buffer RLT (QIAGEN RNeasy Micro Kit (QIAGEN)). To prevent this, DNase treatment was performed at 37 ° C. for 30 minutes (TaKaRa Dnase I (RNase free). Nkx2.5-GFP positive cells using the HCGP7 strain were collected with a cell sorter and then washed with 1 ⁇ PBS. Processed.
  • RT-PCR The following formulation was carried out using the RNA obtained by the above method. Make up to 10 ⁇ l with Oligo dT primer (50 ⁇ M) 1 ⁇ l, dNTP mixture (10 mMeach) 1 ⁇ l, template RNA 0.5 ⁇ g, RNase-free dH 2 O (distilled water). Incubate at 65 ° C for 5 minutes and then cool on ice.
  • RNA / Primer Mixture 5 ⁇ Primescript (TM) buffer 4 ⁇ l, RNase inhibitor (40U / ⁇ l) 0.5 ⁇ l, Primescript ( registered trademark) RTase (200U / ⁇ l) 1 ⁇ l , RNase free dH 2 O 4.5 ⁇ l was added and incubated at 42 ° C. for 60 minutes to synthesize cDNA (PrimeScript® 1st strand cDNA synthesis Kit (TaKaRa). PCR was performed using the synthesized cDNA (TaKaRa Ex Taq® Hot Start) Version) PCR conditions were: denaturation: 94 ° C. for 30 seconds, annealing: 60 ° C. for 1 minute, extension: 72 ° C. for 30 seconds in 25-30 cycles. The sequence of had gene-specific primers are shown in Table 1.
  • the PCR product was electrophoresed on a 2.0% agarose gel (Nusieve 3: 1 agarose (CMR)).
  • CMR 1 agarose
  • GFP signal positive cells expressed HCN4 channel genes, and also expressed myocardial specific genes such as Tbx5, GATA4, mlc2a, mlc2v. Furthermore, the expression of various genes in GFP signal positive cells was examined over time (7th day, 10th day, 15th day of differentiation). The results are shown in FIG. There was a tendency for the expression of HCN gene and other myocardial specific genes to increase over time. In addition, the expression of Cx30.2, Cx40, Cx43, and Cx45 tends to increase with time in the GFP positive fraction (the gene enclosed in the square in FIG. 9), and the electrical stimulation of the cell is propagated with differentiation. It can be seen that the function has been enhanced.
  • the channel expressing GFP positive cells was also examined by the following experimental procedure. Immunostaining Cells were fixed with 4% paraformaldehyde-PBS for 30 minutes at room temperature, washed 3 times with PBS, placed in 0.2% TritonX-100-PBS for 10 minutes, then washed twice with PBS, 5% Blocking was performed with skim milk-PBS for 30 minutes at room temperature.
  • BSA-HBSS bovine serum albumin / SIGMA
  • Primary antibodies include anti-HCN4 antibodies, Anti-HCN4 Rabbit polyantibody (Osenses), monoclonal Anti-tropomyosin (Sarcomer) clone CH1 (SIGMA), Anti-Nav1.5Rabc-RabciKN Rabbit polyclonal IgG (alomone labs) and Purified Rat Anti-Mouse CD31 (BD Pharmingen) were used.
  • As secondary antibodies Alexa Fluor 568 goat anti rabbit IgG (H + L), Alexa Fluor 568 goat anti rat IgG (H + L), Alexa Fluor 546 goat anti mouse IgG (H + L) (Mo + ul) was used.
  • the GFP signal positive cells expressed not only the HCN4 channel but also a channel specific to pacemaker cells such as Cav3.2 channel. Moreover, Na channel (Nav1.5) was strongly expressed.
  • GFP signal positive cells action potential and HCN channel activity were examined by the following experimental procedure.
  • Patch clump Cells collected by cell sorting are seeded on gelatin-coated ⁇ 8mm cover glass (Warner Instruments), and automatic function observation and ion channel function analysis are performed using the Patch Clamp method after the next day. Went.
  • GFP signal positive cells generated spontaneous action potentials and had HCN channel activity.
  • automatic ability observation and ion channel functional analysis were performed by the same patch clump method as above.
  • FIG. 12 GFP signal positive cells not only expressed ERG and Ca channels necessary for pacemaker activity, but also had strong Na channel activity.
  • the GFP signal positive cells of the present invention can actually control the heart rate with a Na channel inhibitor. Furthermore, an experiment was conducted to show that the GFP signal positive cells of the present invention can increase the heart rate with an autonomic nerve stimulant. The electrical activity was quantified by the patch clamp method. As shown in FIG. 15, it was found that GFP signal positive cells can increase the heart rate with an autonomic nerve stimulant.
  • the cells were detached from the dish with 0.25% trypsin / EDTA (GIBCO-BRL), suspended to dilute the cells, and diluted to a new dish (with AB1 strain).
  • the # 33 strain was cultured by seeding on a new SNL cell treated with mitomycin C (SIGMA).
  • the composition of the Maintenance Medium was as follows: DULBECCO'S MODIFIED EAGLE's MEDIUM (DMEM Sigma) / AB1, # 33, bovine serum (FBS JRH), Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine Sodium (SIGMA), MEM Non-Essential Amino Acids Solution (GIBCO-BRL), SODIUM PYRUVATE (SIGMA ), 0.1 mM 2-mercaptoethanol (SIGMA), LIF (ESGRO / Cosmo Bio)
  • a 100 mm diameter dish (FALCON) coated with 0.1% gelatin (SIGMA) was used for culture, and the culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Embryoid bodies were formed by making hanging drops with 20 cells of differentiation medium adjusted to about 500 cells, inverting them, and culturing.
  • the composition of the differentiation medium was as follows: DMEM, FBS, Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine Sodium (100 ⁇ ), MEM Non-Essential Amino Acids Solution, SODIUM PYRUVATE, 2ME
  • the day of preparation is defined as day 0, and differentiation medium is added on day 2. Thereafter, suspension culture was continued for cells that were subjected to cell sorting in the early stage of differentiation induction, and those that were performed after the middle phase were transferred to a gelatin-coated dish on the 4th day and continued to be cultured in an adhered state.
  • the embryoid body was used for immunostaining after sorting GFP positive cells by cell sorting.
  • the obtained cells were suspended in HBSS-1% FCS (HBSS: Hank's Balanced Salt Solution / CAMBREX), 2.5 ⁇ g / ml Propium iodide (PI), and cell sorter (BECKMAN-COULTER EP using AB1 or cos7 as a negative control) GFP (+) / PI ( ⁇ ) cells in embryoid bodies were collected by ALTRA).
  • FCS Hank's Balanced Salt Solution / CAMBREX
  • PI Propium iodide
  • BECKMAN-COULTER EP using AB1 or cos7 as a negative control
  • GFP (+) / PI ( ⁇ ) cells in embryoid bodies were collected by ALTRA).
  • AVB Automatic Venticular Block
  • a 10-week-old male ICR rat was used.
  • 0.2 ml of anesthesia (0.2% pentoparbital, MiliQ) was injected.
  • Respiratory support with a ventilator and ECG monitor.
  • the chest was opened using a heating wire scalpel, and 15 ⁇ l of 30% glycerol was injected from the heart attachment site of the pulmonary artery using a microsyringe. After the injection, when the atrioventricular node was damaged, it was confirmed from the electrocardiogram whether an AVB waveform (decrease in heart rate, independence between P group and QRS group) occurred.
  • glycerol was injected again. 30 minutes after the confirmation, the AVB waveform was confirmed by an electrocardiogram, and then the chest was closed. The rat was removed from the ventilator, inhaled with oxygen at 37 ° C., and returned to the cage when the mouse woke up. Five days after the operation, an electrocardiogram was confirmed, and it was confirmed whether independence between the P group and the QRS group had occurred.
  • Pacemaker cells which are GFP-positive cells, are selected and collected by cell sorting, and the cells are collected in a conical tube, and then a cell pellet is prepared at 1000 rpm for 5 minutes. Then, the cells were suspended in a differentiation-inducing medium, adjusted to 3000 cells in 20 microliters, and then three-dimensionally cultured in a hanging drop. Forty-eight hours later, 30 cell clumps were combined together and transplanted through a needle into the right ventricular apex of a rat bradycardia model.
  • Anesthesia (0.2% pentobarbital, MiliQ) was injected in an amount of 0.2 ml to rats in which the waveform of the atrioventricular block was confirmed by an electrocardiogram on the 5th postoperative day.
  • Respiratory support with a ventilator and ECG monitor were performed.
  • the thoracotomy was performed using a heating wire scalpel, and aggregates suspended in 20 ⁇ l of PBS were injected into the ventricular wall using a microsyringe.
  • the chest was closed, the mouse was removed from the ventilator, oxygen was inhaled at 37 ° C, and when the rat woke up, it was returned to the cage. After 5 days, the chest was opened and the heart was removed and fixed with 4% paraformaldehyde-PBS.
  • Pacemaker cells which are GFP-positive cells, are selected and collected by cell sorting and cultured as an isolated cell in a differentiation-inducing medium. Lost.
  • the cells are adjusted to 3000 cells in 20 microliters and then a three-dimensional culture is performed in a hanging drop to create an agglomerate, it can be used as a pacemaker cell even after one month in the culture dish. It was possible to keep the nature of. In the experiment of the present invention, about 3000 aggregates were transplanted into the ventricular wall of a bradycardia model rat, and the pacemaker ability could be exhibited after the transplantation.
  • Staining solution (0.1 M phosphate buffer pH 7.3, 2 mM MgCl 2 , 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% nonidet P-40, 5 mM K 4 [Fe (CN) 6 ], 5 mM K 3 [ Fe (CN) 6 ]) was stained with 4 ml at 37 ° C. and protected from light overnight.
  • Physiological saline was transplanted. On the electrocardiogram, transplantation of a graft containing pacemaker cells produced a wide ventricular rhythm, but a narrow ventricular waveform was observed in physiological saline. In FIG. 19, it was confirmed that the atrioventricular block was maintained in the second row from the top, and in transplanting the graft containing pacemaker cells, a wide ventricular rhythm occurred (third row from the top). Therefore, it was confirmed that when ventricular sympathomimetic drug isoproterenol was injected into the abdominal cavity, the ventricular rhythm (paced maker cell-derived rhythm) with a wide pulse width was promoted (tachycardia).
  • HCN4-specific antibodies Production of antibodies was commissioned to MBL (Medical & Biological Laboratories).
  • MBL Medical & Biological Laboratories
  • HCN4 protein constituting an If channel specific to pacemaker cells was selected.
  • SEQ ID NO: 1 VSINGMVNNSW
  • SEQ ID NO: 2 VPMLQDFPHD
  • SEQ ID NO: 3 VSINGMVNNSWC
  • SEQ ID NO: 4 CVPMLQDFPHD
  • Immune No. 1 to 3; SEQ ID NO: 4 Immunization: No. 4-6
  • whole blood was collected and serum was collected to obtain antibodies.
  • Antibody purification was performed as follows. Protein in serum is purified by ammonium sulfate precipitation and passed through a column (PD-10 Desalting Columns / GE Healthcare) to remove ammonium sulfate. A protein G column (HiTrap ProteinG HP / GE Healthcare) is filled with 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) and then the protein solution is passed through. After washing with sodium phosphate, elution was performed with 0.1 M glycine HCl (pH 3.0).
  • the diluted secondary antibodies (HRP anti-rabbit IgG antibody and HRP anti-mouse IgG antibody) were each reacted at room temperature for 30 minutes, washed 3 times with TBST, ECL detection was performed, and the detection ability of each antibody was compared. As shown in FIG. 21, it was found that this antibody strongly recognizes HCN4.
  • Primary antibodies include anti-HCN4 antibody, Anti-HCN4 Rabbit polyclonal antibody (Osenses), monoclonal Anti-tropomyosin (Sarcomeric) clone CH1 (SIGMA), Anti-Nav1.5 Rabbit polyclonal IgG (abcam), Anti-Kir2.1 Rabbit polyclonal IgG (alomone labs) and Purified Rat Anti-Mouse CD31 (BD Pharmingen) were used.
  • Alexa Flulor 568 goat anti rabbit IgG (H + L), Alexa Flulor 568 goat anti rat IgG (H + L), Alexa Flulor 546 goat anti mouse IgG (H + L) was used. . As shown in FIG. 22, it was found that this antibody can recognize HCN4 in the cell membrane of GFP signal positive cells from the outside of the cell.
  • the present invention can be used in the field of medical devices, particularly in the field of cardiac pacemakers.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of a part of the extracellular domain of HCN4 protein.
  • SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of a part of the extracellular domain of HCN4 protein.
  • SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the peptide used to raise the HCN4-specific antibody.
  • SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the peptide used to raise the HCN4-specific antibody.
  • SEQ ID NO: 5 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 6 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 7 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 8 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 9 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 10 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 11 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 12 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 13 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 14 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 15 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 16 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 17 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 18 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 19 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 20 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 21 is the nucleotide sequence of a gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 22 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 23 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 24 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 25 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 26 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 27 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 28 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 29 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 30 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 31 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 32 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 33 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 34 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 35 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 36 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 37 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 38 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 39 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 40 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 41 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 42 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 43 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 44 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 45 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.
  • SEQ ID NO: 46 is the nucleotide sequence of the gene specific primer used in PCR.

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Abstract

　本発明は、ＨＣＮ４チャネルとＮａチャネルを有し、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞であって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来のペースメーカ細胞を提供する。さらに本発明は、上記ペースメーカ細胞を含む心臓ペースメーカを提供する。

Description

新規ペースメーカ細胞
　本発明は、心臓ペースメーカ細胞、詳細には心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞、その取得方法、その使用等に関する。本願は、２００９年９月３０日出願の日本国特許出願第２００９－２２６７６０号に対して優先権主張をするものであり、日本国特許出願第２００９－２２６７６０号の内容を本願に取り入れる。
　心拍数が著しく減少する徐脈性不整脈は加齢とともに増加し、突然死や心不全、脳卒中の原因となり、少子高齢化が進むわが国において社会的な影響が大きい不整脈である。この疾患の治療法としては、心拍数を増やすために用いられる電池で作動する人工ペースメーカの移植以外に有用な手段が無く、年間およそ５万名の移植が行われている。人工ペースメーカ移植は、（１）手術を必要とし生体への侵襲性が高く、（２）電池消耗により５～８年で再植え込み術が必要となる。（３）さらに生体の活動度に合わせて心拍数が増加しないためにＱＯＬの低下が避けられない。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞はｉｎ　ｖｉｔｒｏで３胚葉に分化でき、特にＥＳ細胞の凝集塊（胚様体）を形成すると心筋細胞に分化でき、その中にはペースメーカ細胞が含まれることが知られている（非特許文献１）。
　細胞から作成される生物学的ペースメーカは自ら電気信号を作ることができ、さらに自律神経のコントロールを受けることが出来れば、上記に示した人工ペースメーカの欠点を補うことが出来る。細胞から生物学的ペースメーカ細胞を作製するためには、幹細胞から心臓へ分化する過程で発生するペースメーカ細胞を選別採取する必要がある。前述のように胚性幹細胞や人工多能性幹細胞は細胞を３次元培養することで比較的容易に心臓へ分化誘導できるが、ペースメーカ細胞のみを選択的に採取することは未だ出来ていない。ペースメーカ細胞を選別できる指標が見つかっていないことがその主な原因である。
Yano S, Miake J, Mizuta E, Manabe K, Bahrudin U, Morikawa K, Arakawa K, et al. Changes of HCN gene expression and I(f) currents in Nkx2.5-positive cardiomyocytes derived from murine embryonic stem cells during differentiation. Biomed Res 2008; 29:195-203.
　これまでに国内外を問わず、心臓特異的な転写因子を用いて種々の心筋細胞を選別採取する研究は行われてきたが、ペースメーカ細胞の選別採取は成功していない。さらに将来の再生医療への応用を考えた時に、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞の遺伝子改変を必要とせずに、ペースメーカ細胞だけを選別する方法を確立する必要がある。加えて、心拍数を随時かつ随意に制御することができるペースメーカ細胞が得られれば、生体の活動度に合わせて心拍数が増加しないために患者のＱＯＬの低下を避けることができる。
　本発明者らはペースメーカ細胞の細胞表面に特異的に存在するイオンチャネルを指標としてペースメーカ細胞を選別できないかと考えた。これが可能であれば、イオンチャネルの抗体を用いることで胚性幹細胞や人工多能性幹細胞の遺伝子改変を行わずにペースメーカ細胞を採取することが出来、再生医療への応用が容易となる。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、上記仮説基づいて鋭意研究を行い、網羅的遺伝子解析を行った結果、ＥＳ細胞が心臓へ分化する過程でペースメーカ細胞に特異的なチャネルを発現すること、マウスＥＳ細胞にＨＣＮ－ＧＦＰレポーター遺伝子をノックインした系を用いた場合、ＨＣＮ４チャネルがペースメーカ細胞を選別採取するのに有用な指標であること、この方法で採取した細胞はＨＣＮチャンネル、Ｃａチャネル、ＨＥＲＧチャネルを発現するが、内向き整流Ｋチャネルを発現しないというペースメーカ細胞としての特徴をそなえていることを見出した。一方で、予測に反して、本発明者らは、本発明のペースメーカ細胞は、Ｎａチャネルを保有すること、さらにＮａチャネルを制御することでその心拍数をコントロールできる新規のペースメーカ細胞であることを見出した。さらに、本発明者らは、本発明のペースメーカ細胞を集合させて細胞塊として動物の心筋に移植したところ、強力かつ永続的なペースメーカ機能が発揮され、心拍数もコントロール可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、この細胞を認識できる抗体の作成に成功した。かくして本発明者らは本発明を完成させたのである。
　すなわち、本発明の主な特徴は：
（ｉ）ＥＳ細胞を心筋へ分化誘導しＨＣＮ４チャネルをマーカーとしペースメーカ細胞を選択的に採取することが出来る。
（ｉｉ）本発明のペースメーカ細胞は、ペースメーカ細胞としての基本的な性質に加えてＮａチャネルを多く発現し、Ｎａチャネルを制御することでその心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞である。
（ｉｉｉ）本発明は、ヒトＥＳ細胞ならびにヒトｉＰＳ細胞においても利用が出来る。
（ｉｖ）本発明のペースメーカ細胞は、一定数以上集合させて細胞塊として実際に心臓に移植した場合に、強力かつ永続的なペースメーカ機能を発揮する。しかも、その心拍数は自律神経の調節等でコントロール可能である。
（ｖ）本発明のペースメーカ細胞を認識できる抗体を、ＨＣＮ４の細胞外ドメインの特定のアミノ酸配列を抗原認識部位として作成することができる。
　したがって、本発明は下記のものを提供する：
　（１）ＨＣＮ４チャネルとＮａチャネルを有し、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞であって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞由来のペースメーカ細胞。
　（２）胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞を心筋へ分化誘導し、ＨＣＮ４チャネルをマーカーとして選択することを特徴とする、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞の取得方法。
　（３）ＨＣＮ４チャネル遺伝子を胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞に導入して心筋へと分化誘導させ、標識が陽性である細胞を選別取得することを特徴とする、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞の製造方法。
　（４）ＨＣＮ４チャネル遺伝子に選別可能な標識をコードする遺伝子を組み込んでターゲティング遺伝子を作成し、これを胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞に導入することを特徴とする、（３）記載のペースメーカ細胞の製造方法。
　（５）（２）～（４）のいずれかに記載の方法により得られるペースメーカ細胞であって、ＨＣＮチャネルとＮａチャネルを有し、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞。
　（６）（１）または（５）記載のペースメーカ細胞を含む移植片。
　（７）ペースメーカ細胞が細胞塊を形成している（６）記載の移植片。
　（８）細胞塊がペースメーカ細胞を約６００００個以上含むものである（７）記載の移植片。
　（９）細胞塊がペースメーカ細胞を約９００００個以上含むものである（７）記載の移植片。
　（１０）（１）または（５）記載のペースメーカ細胞、あるいは（６）～（９）のいずれかに記載の移植片を必須構成成分とする、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできる心臓ペースメーカ。
　（１１）Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできる心臓ペースメーカの製造に用いられる（１）または（５）記載のペースメーカ細胞、あるいは（６）～（９）のいずれかに記載の移植片。
　（１２）Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできる心臓ペースメーカの製造方法であって、（１）または（５）記載のペースメーカ細胞、あるいは（６）～（９）のいずれかに記載の移植片を用いることを特徴とする方法。
　（１３）アミノ酸配列ＶＳＩＮＧＭＶＮＮＳＷ（配列番号：１）またはＶＰＭＬＱＤＦＰＨＤ（配列番号：２）を免疫原として得られ、これらのアミノ酸配列を認識部位とするＨＣＮ４特異的抗体。
　（１４）（１３）記載の抗体を用いてペースメーカ細胞の選択または選別を行うことを特徴とする、（２）～（４）のいずれかに記載の方法。
　本発明により、本発明により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞が提供される。本発明のペースメーカ細胞は、心拍数の制御を随時にかつ随意に行うことができる。そのため、患者のＱＯＬの低下を防止することができる。また、本発明のペースメーカ細胞の取得方法においては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の遺伝子改変を必要とせずにペースメーカ細胞だけを得ることができるので、再生医療への応用にも適している。さらに、本発明のペースメーカ細胞を一定数以上集合させて細胞塊として心筋に移植すると、ペースメーカ機能が強力かつ長続きする。
図１は、ＨＣＮ４チャネル遺伝子のプロモーター領域に、選別採取標識であるＧＦＰ蛋白遺伝子を連結したターゲッティング遺伝子を図式的に示す。この遺伝子を用いて、ＧＦＰ遺伝子をＡＢ１（野生型）ＥＳ細胞株のＨＣＮ４　ｌｏｃｕｓへ相同遺伝子組み換えを行って、ノックインＥＳ細胞株を樹立した。 図２は、ＨＣＮ４－ＧＦＰ遺伝子ノックインＥＳ細胞のスクリーニング結果を示す。ＨＣＮ４－ＧＦＰ遺伝子ノックインＥＳ細胞の樹立をＰＣＲ法とサザンブロット法で確認した。 図３は、ＨＣＮ４－ＧＦＰ遺伝子ノックインＥＳ細胞の心臓への分化誘導に伴う胚様体の心拍数の変化を示すグラフである。 図４は、Ｈ７胚様体の拍動部位とＧＦＰ発現との関連を示すインキュベーションイメージングシステムの観察結果である。拍動部位とＧＦＰ発現部位を各々矢印で示し、白色破線で囲った。 図５は、ＧＦＰシグナル陽性細胞のみをＦＡＣＳにより選別採取した結果を示す。 図６は、Ｈ７胚様体由来ＨＣＮ４－ＧＦＰ陽性細胞の形態を示す顕微鏡像である。 図７は、ＧＦＰシグナル陽性細胞の分化１１日目、１３日目、１４日目の拍動数を示す。 図８は、分化誘導後１１日目のＨ７胚様体由来ＨＣＮ４－ＧＦＰ陽性細胞の心臓ペースメーカ遺伝子発現を調べた結果である。＋はＧＦＰ陽性分画、－はＧＦＰ陰性分画を示す。 図９は、分化誘導後７、１０、１５日目のＨ７胚様体由来ＨＣＮ４－ＧＦＰ陽性細胞の免疫染色の結果を示す。７＋、７－、１０＋、１０－、１５＋、１５－は、それぞれ分化誘導後７日目のＧＦＰ陽性分画およびＧＦＰ陰性分画、分化誘導後１０日目のＧＦＰ陽性分画およびＧＦＰ陰性分画、分化誘導後１５日目のＧＦＰ陽性分画およびＧＦＰ陰性分画を示す。 図１０は、分化誘導後１８日目のＨ７胚葉体由来ＨＣＮ４－ＧＦＰ陽性細胞の免疫染色の結果を示す。 図１１は、Ｈ７胚様体由来ＨＣＮ４－ＧＦＰ陽性細胞のＨＣＮ４チャネルに駆動される自動能の解析結果を示す。 図１２は、Ｈ７胚様体由来ＨＣＮ４－ＧＦＰ陽性細胞のペースメーカ活性を担うイオンチャネルの解析結果を示す。 図１３は、Ｎａチャネルを抑制した場合のＧＦＰシグナル陽性細胞の電気活動をシミュレーションした結果を示す。 図１４は、Ｎａチャネル阻害薬リドカイン濃度と本発明のペースメーカ細胞の心拍数の関係を示すグラフである。 図１５は、Ｈ７胚葉体由来ＨＣＮ４－ＧＦＰ陽性細胞のβ１受容体刺激による陽性変時作用を示す。具体的には、自律神経刺激薬イソプロテレノールによる本発明のペースメーカ細胞の心拍数の増加を示す図である。ＨＣＮ４－ＧＦＰ陽性細胞は交感神経の制御を受けるペースメーカ細胞である。 図１６は、本発明のペースメーカ細胞の拍動数が、交感神経刺激薬イソプレテレノールに応答して増加し、副交感神経刺激薬カルバコールに応答して減少することを示す図である。 図１７の左パネルは、組織化したペースメーカ細胞を含む細胞塊を移植した心臓のＸ－ｇａｌ染色写真である。図１７の右パネルはいずれも左パネルに示した心臓の心筋の切片をＸ－ｇａｌ染色した顕微鏡像である。 図１８は、房室ブロックラットの心臓に本発明のペースメーカ細胞を移植した効果を示す心電図である。横軸は時間（秒）、縦軸は電位（ｍＶ）である。 図１９は、房室ブロックラットの心臓に本発明のペースメーカ細胞を移植した効果を示す心電図、ならびに交感神経刺激薬イソプロテレノールの腹腔内注射の心拍数に対する影響を示す心電図である。横軸は時間（秒）、縦軸は電位（ｍＶ）である。 図２０は、ＨＣＮ４の細胞外ドメインを認識する特異抗体の作成手順を図式化したものである。 図２１は、ＨＣＮ４の細胞外ドメインを認識する特異抗体がＨＬ－１細胞のＨＣＮチャネルを認識することを示すウェスタンブロッティングである。ＨＣＮ４の細胞外ドメインを認識する特異抗体はＨＬ－１細胞のＨＣＮチャネルを認識する。 図２２は、ＨＣＮ４の細胞外ドメインを認識する特異抗体を用いたＨ７胚様体由来ＨＣＮ４－ＧＦＰ陽性細胞の免疫染色像である。
　本発明は、主に以下の知見（Ｉ）～（Ｖ）に基づくものである：
　（Ｉ）心臓の拍動を担う心臓ペースメーカ細胞の電気的な特徴に関するコンピューター・シミュレーションモデルを用いて検討し、本発明のペースメーカ細胞の性質を担う特徴的なイオンチャネルは、ＨＣＮ遺伝子ファミリー、Ｃａチャネル遺伝子ファミリー、ＨＥＲＧチャネルなどの外向きチャネルが重要である。これらによって生ずる電流が、本発明のペースメーカ細胞の自動能を発生させうることを見出した。
　（ＩＩ）網羅的遺伝子解析を行った結果、ＥＳ細胞が心臓へ分化する過程でペースメーカ細胞に特異的なチャネル（ＨＣＮチャネル）を発現すること、さらにＥＳ細胞由来心筋細胞にはＨＣＮ４チャネルを発現することを見出した。
　（ＩＩＩ）ＨＣＮ４チャネル遺伝子のプロモーター領域に、選別採取標識であるＧＦＰ蛋白遺伝子を連結したレポーター遺伝子を作成し、これを遺伝子導入して片側の染色体アリルにレポーター遺伝子が組み込まれた細胞を樹立した。樹立したＥＳ細胞からＧＦＰの蛍光を指標に本発明のペースメーカ細胞の選別採取に成功した。
　（ＩＶ）選別採取した本発明のペースメーカ細胞には自動能を示す細胞が存在し、ペースメーカ細胞に共通の特性を持っており、自律神経の制御を受けることを確認した。一方で、本発明のペースメーカ細胞はＮａチャネルを発現していることを細胞生物学的ならびに電気生理学的に証明し、Ｎａチャネルの制御下で心拍数をコントロールできることを薬理学的に証明した。そこで、ペースメーカ細胞のコンピューター・シミュレーションモデルにＮａチャンネルの要素を組み込んだモデルを作成し、実験結果を再現した。
　（Ｖ）本発明により得られたペースメーカ細胞は、一定数以上集合して細胞塊を形成した場合に、強力かつ永続的なペースメーカ機能を発揮できることを、房室ブロック後の動物の心室筋への細胞塊移植実験により確認した。しかも、移植された心臓の心拍数を自律神経の興奮でコントロールすることが可能であった。
　（ＶＩ）本細胞を認識できる抗体をＨＣＮ４の細胞外ドメインの特定のアミノ酸配列を抗原認識部位として作成し、本発明のペースメーカ細胞を認識できることを確認した。
　したがって、本発明は、１の態様において、ＨＣＮチャネルとＮａチャネルを有し、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞であって、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来のペースメーカ細胞を提供する。本発明のペースメーカ細胞のＨＣＮチャネルはＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３、ＨＣＮ４のいずれのＨＣＮチャネルであってもよいが、好ましくはＨＣＮ４チャネルである。ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の由来動物種はいずれの動物種であってもよい。ペースメーカ細胞にて処置を行うべき動物種と同じ動物種由来のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が好ましい。
　本発明のペースメーカ細胞は、Ｎａチャネルを阻害または活性化させることにより拍動数（心拍数）を随時かつ随意に制御できることを特徴とする。本発明のペースメーカ細胞の心拍数を増加させるにはＨＣＮチャネル活性化剤を細胞に作用させればよい。特に、使用可能なＨＣＮ４チャネル活性化剤としては、サリチレート（salicylate）およびベンゾエート（benzoate）などが挙げられる。また、本発明のペースメーカ細胞の心拍数を減少させるにはＨＣＮチャネル阻害剤を細胞に作用させればよい。特に、使用可能なＨＣＮ４チャネル阻害剤としては、リドカイン（lidocaine）、ピルシカイニド（plisicainide）、プロカイナミド（procainamide）などが挙げられる。さらに、本発明のペースメーカ細胞は、交感神経刺激薬によって心拍数を増加させることもできる。使用可能な交感神経刺激薬としてはイソプレテレノール（isoproterenol）、ノルエピネフリン（norepinephrine）などが挙げられる。本発明のペースメーカ細胞は、副交感神経刺激薬によって心拍数を減少させることもできる。使用可能な副交感神経刺激薬としてはカルバコール（carbachol）、アセチルコリン(acetylcholine)などが挙げられる。これらの薬剤は例示であり、とくに限定する意図はない。
　本発明は、もう１つの態様において、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、あるいは始原生殖細胞由来万能細胞などを心筋へ分化誘導し、ＨＣＮ４チャネルをマーカーとして選択することを特徴とする、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞の取得方法を提供する。従来のペースメーカ細胞の選別においては細胞内に存在する蛋白を選別指標としており、イオンチャネルを選別指標とした例は存在しなかった。今回はじめてＨＣＮチャネルをマーカーとしてペースメーカ細胞を採取出来ることが判明した。本発明のペースメーカ細胞の取得方法においてマーカーとして使用可能なものはＨＣＮチャネルであり、ＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３、ＨＣＮ４のいずれであってもよいが、ＨＣＮ４が好ましい。
　上記ペースメーカ細胞の取得方法において、使用できる好ましい出発材料は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞である。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞を心筋へと分化誘導させるための手段・方法は当業者が適宜選択して採用することができ、そのための培地成分、培養条件も公知のものを採用することができる。心筋へと分化誘導された細胞のＨＣＮチャネルの検出も、例えば、ＨＣＮチャネル（好ましくは、ＨＣＮ４チャネル）に特異的な抗体を用いる方法などの公知の方法により行うことができ、かかる検出方法は特に限定されない。好ましくは、使用する抗体や発現されるＨＣＮチャネルに検出可能な標識を付しておくことが好ましい。特に好ましくは、セルソーターを用いるＦＡＣＳによりＨＣＮチャネル（好ましくは、ＨＣＮ４チャネル）をマーカーとして本発明のペースメーカ細胞を取得する。
　本発明は、さらなる態様において、ＨＣＮチャネル遺伝子（好ましくは、ＨＣＮ４チャネル遺伝子）を胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞に導入して心筋へと分化誘導させ、標識が陽性である細胞を選別取得することを特徴とする、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞の製造方法を提供する。ＨＣＮチャネル遺伝子の細胞への導入手段・方法は当業者によく知られており、ＣａＣｌ２法、リポフェクタミン法、ヌクレオフェクター法、電気せん孔法などが例示されるが、これらの手段・方法に限定されない。
　また、上記ペースメーカ細胞の製造方法において、ＨＣＮチャネル遺伝子（好ましくは、ＨＣＮ４チャネル遺伝子）に選別可能な標識を付して、細胞に導入することもできる。かかる手法を用いることにより、ＨＣＮチャネルを有する細胞を選別取得することが容易になる。実施例に示すように、ＨＣＮチャネル遺伝子（好ましくは、ＨＣＮ４チャネル遺伝子）に選別可能な標識をコードする遺伝子（例えばＧＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子、その他の外部から検出または結合可能な蛋白やペプチドをコードする遺伝子）を組み込んでターゲティング遺伝子を作成し、これをＥＳ細胞（ｉＰＳ細胞、始原生殖細胞由来万能細胞などでも可）に導入し、心筋へと分化誘導させ、標識が陽性である細胞、すなわちＨＣＮチャネルを有する細胞を選別取得することにより、本発明のペースメーカ細胞を得てもよい。ＨＣＮ遺伝子のプロモーター領域に選別可能な標識をコードする遺伝子を組み込むことが好ましい。また、標識としてはＧＦＰ、ＲＦＰ、抗体の結合部位（例えば、配列番号：１や配列番号：２などのＨＣＮ４に対する抗体の認識部位）などが好ましい。
　本発明においてＨＣＮ４チャネルをマーカーとして選別取得されたペースメーカ細胞は、ＨＣＮ４チャネルおよびＮａチャネルのほか、Ｃａチャネル、ＨＥＲＧチャネルを発現するが、内向き整流Ｋチャネルを発現しないというペースメーカ細胞としての特徴をそなえていることが判明した。一方で、上記のごとく採取されたペースメーカ細胞がＮａチャネルを保有することは予想外のことであり、さらに該ペースメーカ細胞はＮａチャネルを制御することでその心拍数をコントロールできる新規タイプのペースメーカ細胞であった。
　さらなる態様において、本発明は、上記採取方法により得られるペースメーカ細胞であって、ＨＣＮチャネルとＮａチャネルを有し、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞を提供する。
　本発明のペースメーカ細胞を用いて不整脈の治療または改善を行うことができる。本発明のペースメーカ細胞を用いて治療または改善できる不整脈の種類は、従来のペースペーカで治療または改善できる種類であり、例えば、徐脈性心室細動などの徐脈性不整脈、房室ブロック、洞機能不全症候群などが挙げられるが、これらの不整脈に限定されない。本発明のペースメーカ細胞の懸濁液を直接心臓に適用してもよい。その際、本発明のペースメーカ細胞を適当な担体または基材に含ませて移植片としてもよい。使用可能な担体または基材としては温度感受性培養皿やフィブリンのりなどが挙げられるが、温度感受性培養皿が好ましい。本発明のペースメーカ細胞が心臓に定着し、機能を発揮してから分解される生分解性セルロースのような生分解性の担体または基材も好ましい。細胞を担体または基材に含ませるには、担体または基材の表面に細胞を付着または固定化してもよく、あるいは担体または基材中に埋め込んでもよい。また、本発明のペースメーカ細胞を、温度感受性培養皿などで作られたシート状の担体または基材、あるいはマトリジェルなどのマトリクス中に含ませて、心臓に適用してもよい。
　さらに好ましくは、本発明のペースメーカ細胞を集合させて細胞塊としてペースメーカに用いる。細胞塊として組織化することにより、強力かつ永続的なペースメーカ機能を発揮することができる。本発明のペースメーカ細胞を集合させて得られる細胞塊は本発明のペースメーカ細胞を含むものであるが、本発明のペースメーカ細胞以外の種類の細胞、ペースメーカ細胞の機能発揮のための物質などを含んでいてもよい。細胞塊は、約６万個以上、約７万個以上または約８万個以上、好ましくは約９万個以上、より好ましくは約１５万個以上、さらに好ましくは約２０万個以上の本発明のペースメーカ細胞を含む。上記個数の本発明のペースメーカ細胞を、１個の細胞塊として用いてもよく、複数個（例えば、２個～数個、１０個～２０個など）の細胞塊として用いてもよい。例えば、約３０００個のペースメーカ細胞を含む細胞塊３０個を心臓に移植してもよい。例えば、約３０００個のペースメーカ細胞を含む細胞塊を５個集めてより大きな細胞塊を作成し、この組織塊４個を心臓に移植してもよい。例えば、約３０００個のペースメーカ細胞を含む細胞塊を５個集めてより大きな細胞塊を作成し、この組織塊６個を心臓に移植してもよい。細胞塊の形状は、細胞塊中の本発明のペースメーカ細胞が互いに電気刺激を伝達できる限り、いずれの形状であってもよく、例えば、シート状、線状、球状、棒状、板状、その他の立体的形状であってもよく、不定形であってもよい。細胞塊の形状は、所望のペースメーカの形状あるいは移植部位の形状に応じて適宜形状を選択することができる。
　本発明のペースメーカ細胞の細胞塊は、ハンギングドロップ培養、シート状の単層培養などの公知の方法により得ることができる。
　一定数の本発明のペースメーカ細胞により形成された細胞塊を移植片として、そのまま、あるいはシートや他のマトリクス中に担持させて、あるいは適当な容器中に入れて、心臓に移植または接続することができる。シートやマトリクスの材料は上で例示したものが挙げられるが、それ以外のものでも使用可能である。また、本発明のペースメーカ細胞の細胞塊を心筋に直接移植する場合には、心筋内部または表面のいずれであってもよく、例えば、心筋中に注入してもよく、あるいは心筋表面に接着させてもよい。また、本発明のペースメーカ細胞を含む細胞塊を適当な容器に入れて、従来のペースメーカと同様に使用してもよい。
　さらなる態様において、本発明は、本発明のペースメーカ細胞、あるいは上記移植片を必須構成成分とし、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできる心臓ペースメーカを提供する。本発明の心臓ペースメーカは、例えば、本発明のペースメーカ細胞やそれを含む細胞塊をシートやマトリクスに担持させたものであってもよく、あるいは前記細胞塊そのものであってもよく、あるいは本発明のペースメーカ細胞または前記細胞塊を適当な容器に入れたものであってもよい。上述のごとく、Ｎａチャネル阻害剤または活性化剤あるいは自律神経刺激薬を用いることによって、本発明のペースメーカの心拍数をコントロールすることができる。
　本発明のペースメーカ細胞またはそれを含む移植片を含む心臓ペースメーカは、Ｎａチャネル阻害剤または活性化剤あるいは自律神経刺激薬と接触あるいはこれらを導入または排出するための手段を有していることが好ましい。本発明のペースメーカ細胞またはそれを含む移植片（例えば細胞塊）を心臓に直接接触させ、あるいは心臓に埋め込むことにより、上記薬剤を心臓から直接受け渡しできるようにしてもよい。上記薬剤の投与手段としては内服または、注射器による筋肉注射または静脈内投与などが例示される。このような手段を介して本発明の心臓ペースメーカ中の細胞にＮａチャネル阻害剤または活性化剤あるいは自律神経刺激薬を導入し、あるいは除去することにより、心拍数をコントロールすることができる。
　本発明は、さらなる態様において、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできる心臓ペースメーカの製造に用いられる、本発明により得られるペースメーカ細胞、あるいはそれを含む移植片に関するものである。
　本発明は、さらなる態様において、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできる心臓ペースメーカの製造方法であって、本発明により得られるペースメーカ細胞、あるいはそれを含む移植片を用いることを特徴とする方法に関するものである。
　本発明は、もう１つの態様において、Ｎａチャネル阻害剤または活性化剤を含有する、本発明のペースメーカ細胞あるいは本発明の移植片または細胞シートの心拍数、あるいは本発明のペースメーカの心拍数をコントロールするための薬剤を提供する。さらなる態様において、本発明は、自律神経刺激薬を含有する、本発明のペースメーカ細胞あるいは本発明の移植片または細胞シートの心拍数、あるいは本発明のペースメーカの心拍数をコントロールするための薬剤を提供する。かかる薬剤としては、ＨＣＮ４チャネル活性化剤、ＨＣＮ４チャネル阻害剤、交感神経刺激薬、副交感神経刺激薬などがあり、本明細書にてすでに例示しているが、これらの薬剤に限定されない。
　薬剤中のＮａチャネル阻害剤または活性化剤の濃度、自律神経刺激薬の濃度、本発明のペースメーカ細胞あるいは本発明の移植片または細胞シートへの薬剤の適用量、本発明のペースメーカへの薬剤の適用量は、通常行い得る試験を用いて医師が容易に決定することができる。また、このような薬剤は本発明のペースメーカ細胞あるいは本発明の移植片に直接適用できるのみならず、注射、輸液、経口投与などの経路により患者に与えることもできる。
　さらに、本発明のペースメーカは、患者の心臓が治癒された場合など、ペースメーカが不要になった場合であっても、心臓から除去する必要はなく、ナトリウムチャネル阻害薬であるリドカインやメキシレチンやピルジカイナイドなどの薬剤を投与することによって、その機能を止めることができ、再び必要となった場合に、ナトリウムチャネル阻害薬であるリドカインやメキシレチンやピルジカイナイドなどの薬剤を除去することによって、その機能を再開させることができる。
　本発明は、さらなる態様において、ＨＣＮ４に特異的な抗体であって、ＨＣＮ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列、好ましくはＶＳＩＮＧＭＶＮＮＳＷ（配列番号：１）またはＶＰＭＬＱＤＦＰＨＤ（配列番号：２）に対して惹起されるＨＣＮ４チャネル特異的抗体が提供される。なお、これらの配列の末端にシステインを付加してキャリアー蛋白との結合に資することができる。例えば、アミノ酸配列ＶＳＩＮＧＭＶＮＮＳＷＣ（配列番号：３）やＣＶＰＭＬＱＤＦＰＨＤ（配列番号：４）が挙げられる。かくして得られる抗体はＨＣＮ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列、好ましくは配列番号：１または配列番号：２で示されるアミノ酸配列を抗原認識部位とするものである。当業者は、上記のような手法を用いて、上記アミノ酸配列に限らず、ＨＣＮ４の他の部分のアミノ酸配列に対して惹起される抗体を取得することができる。
　ＨＣＮ４に特異的な抗体を、本発明のペースメーカ細胞の取得方法において使用することができる。本発明のペースメーカ細胞の取得方法において使用可能なＨＣＮ４に特異的な抗体としては、上記抗体が挙げられるが、これに限定されない。ＨＣＮ４に特異的な抗体に検出可能な標識を付して用いることにより、本発明のペースメーカ細胞を効率よく取得することができる。
　以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
　本発明のペースメーカ細胞の製造
　図１に示すようにＨＣＮ４チャネル遺伝子のプロモーター領域に、選別採取標識であるＧＦＰ蛋白遺伝子を連結したターゲッティング遺伝子を作成した。すなわち、ＨＣＮ４遺伝子第１エクソンのＭｅｔコドンの位置に、ＥＧＦＰ＋ＰＧＫ・ｎｅｏユニットを挿入しコード領域の一部を欠損させるよう設計されたターゲティングベクターを、エレクトロポレーション法で９０％コンフルエント状態のＡＢ１　ＥＳ細胞に遺伝子導入した。
　ターゲティング遺伝子を導入２４時間後に培地交換し、２５０μｇ／ｍｌ　になるようにＧｅｎｅｔｉｃｉｎを培地に加え、約１週間程度セレクションを行った。その結果出現したコロニーを９６穴プレートのフィーダー細胞上に回収した。得られたクローンで遺伝子挿入が起こっているかどうか、ＰＣＲで確認した。セレクション後回収したクローンのｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ　１０μｇを制限酵素（ＢｓｔＥ　II）で一晩切断し、０．５μｇ／ｍｌになるようにＥｔＢｒが加えてある１．０％アガロースゲルを用いて１００Ｖ、８０Ａの条件で約５時間電気泳動した。アルカリトランスファーバッファー（０．４Ｍ　ＮａＯＨ、１Ｍ　ＮａＣｌ）でＤＮＡを変性させ、ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にトランスファーした。Ｂｃａ　ＢＥＳＴ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）によってα－32Ｐ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）をラベルしたプローブで一晩ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後のメンブレンを２×ＳＳＣ・０．５％　ＳＤＳ、２×ＳＳＣ・０．１％　ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ・０．１％　ＳＤＳで２回、０．２×ＳＳＣの順に洗い、放射活性を測定して目的のＤＮＡ配列を検出した。
　図２に示すように、ターゲッティング遺伝子をＥＳ細胞に導入して片側の染色体アリルにＧＦＰ遺伝子が組み込まれたノックインＥＳ細胞を樹立することができた。この樹立をＰＣＲ法とサザンブロット法で確認した。
　次に、あらかじめ１時間程度ゼラチンコートディッシュにプレーティングして未分化ＥＳ細胞からフィーダー細胞を取り除いておき、約２５，０００個／ｍｌになるように分化用培地（ＤＭＥＭ、ＦＢＳ、ＰＳＧ、ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ、２－ＭＥ）に懸濁する。８連ピペットで２０μｌの水滴を数列作り、ディッシュを反転させ立体的に培養（＝Ｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐ法）し、細胞凝集塊であるＥＢｓを作成した。ＥＢｓを作製した日を分化誘導０日目と定義し、誘導２日目に分化用培地を加え、浮遊培養を行った。６日目に、ゼラチンコートｄｉｓｈに接着させ、翌日培地交換を行った。図３に示すように、ノックインＥＳ細胞は胚様体を形成すると、経時的に拍動する胚様体が増加し、野生株と同等に心臓に分化した。
　胚様体を生体のままで観察できるインキュベーションイメージングシステムにより胚様体（１２日目）の拍動部位でのＧＦＰシグナルを観察した。図４に示すように、ＧＦＰのシグナルが認められるところに一致して胚様体の一部が拍動した。
　ＧＦＰシグナル陽性細胞のみをＦＡＣＳにより選別採取した。形成した胚様体にトリプシン処理（１×Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ　／ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ　３７℃　５～１５分）を行い、細胞を単一細胞に解離する。分化誘導１０日以降の胚様体の場合は、これに加えてコラゲナーゼ処理（コラゲナーゼ　タイプII／　３７℃　１時間）をする。その細胞をＨＢＳＳ－１％ＦＣＳ（ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　／ＣＡＭＢＲＥＸ）、２．５μｇ／ｍ　Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で懸濁し、ＡＢ１またはｃｏｓ７をネガティブコントロールとしてセルソーター（ＢＥＣＫＭＡＮ－ＣＯＵＬＴＥＲ　ＥＰＩＣＳ　ＡＬＴＲＡ）により、胚様体中のＧＦＰ（＋）／ＰＩ（－）細胞を採取した。図５に示すように、ＧＦＰ陽性細胞は全細胞数の０．５％であった。図６はＦＡＣＳにより選別採取したＧＦＰシグナル陽性細胞を示す。
　セルソーティングによって回収した細胞をゼラチンコートしたディッシュに約５，０００個播いておき、回収した細胞の拍動率やその形態、大きさなどを翌日光学顕微鏡で調べ、拍動との関係を検討した。図７に示すように、ＧＦＰシグナル陽性細胞はその拍動確率が８５％であった。
　ＧＦＰ陽性細胞の遺伝子発現について以下の実験手順にて調べた。
　ＲＮＡ抽出：ＨＴ７株を用い、Ｄａｙ０～２１の未分化ＥＳ細胞および胚様体を定時に回収し、ｂｕｆｆｅｒ　ＲＬＴに溶解後ＲＮＡを抽出した（ＱＩＡＧＥＮ　ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）。ゲノムＤＮＡのコンタミネーションを防ぐためにＤＮａｓｅ処理を３７℃で３０分間行った（ＴａＫａＲａ　ＤｎａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ）。ＨＣＧＰ７株を用いたＮｋｘ２．５－ＧＦＰ陽性細胞についてはｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　で分取後、１×ＰＢＳで洗浄したのち同様の処理を行った。
　ＲＴ－ＰＣＲ：上記の方法で得たＲＮＡを用いて以下の配合を行った。Ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ（５０μＭ）　１μｌ、ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ　ｅａｃｈ）１μｌ、鋳型ＲＮＡ　０．５μｇ、ＲＮａｓｅ不含ｄＨ２Ｏ（蒸留水）で１０μｌにメスアップする。６５℃で５分インキュベートしたのち氷上で急冷する。この上記鋳型ＲＮＡ／Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘｔｕｒｅに５×Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ｂｕｆｆｅｒ　４μｌ、ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）０．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴａｓｅ（２００Ｕ／μｌ）１μｌ、ＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｄＨ２Ｏ　４．５μｌを加えて４２℃で６０分インキュベートしてｃＤＮＡを合成した（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）。合成したｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った（ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ）ＰＣＲの条件は変性：９４℃　３０秒、アニーリング：６０℃　１分、伸長：７２℃　３０秒で２５～３０サイクルで行った。ＲＴ－ＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのシークエンスを表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　シングルセルについては以下の方法で行った。
　Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ　１ｓｔｅｐ　ｅｎｚｙｍｅ　ｍｉｘ　１μｌ、２×１ｓｔｅｐ　ｂｕｆｆｅｒ　１μｌ、遺伝子特異的プライマー（２０μＭ）　２μｌ、鋳型ｃＤＮＡ　１μｌ、ＲＮａｓｅ不含ｄＨ２Ｏで５０μｌにメスアップする。この反応液を以下の条件でｃＤＮＡ合成、ＰＣＲを行った（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ）。
　逆転写反応：５０℃　３０分、逆転写酵素の失活：９４℃　２分、変性：９４℃　３０秒、アニーリング：６０℃　１分、伸長：７２℃　３０秒　３５～４３サイクルで行った。ＰＣＲ産物は２．０％　アガロースゲル（Ｎｕｓｉｅｖｅ　３：１　ａｇａｒｏｓｅ（ＣＭＲ）で電気泳動を行った。アガロースゲルでバンドが確認できなかったプライマーについては１０％アクリルアミドゲルで電気泳動（１５０Ｖ、１８０ｍＡ、７０分）後、銀染色によりバンドを確認した（ＰｌｕｓＯｎｅ　ＤＮＡ　Ｓｉｌｖｅｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＧＥ　Ｇｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
　図８に示すように、ＧＦＰシグナル陽性細胞はＨＣＮ４チャネル遺伝子を発現し、さらにＴｂｘ５、ＧＡＴＡ４、ｍｌｃ２ａ、ｍｌｃ２ｖなどの心筋特異的な遺伝子を発現していた。
　さらに、ＧＦＰシグナル陽性細胞の様々な遺伝子の発現を経時的（分化７日目、１０日目、１５日目）に調べた。結果を図９に示す。ＨＣＮ遺伝子、その他の心筋特異的な遺伝子の発現が経時的に増加する傾向が認められた。さらに、ＧＦＰ陽性分画においてＣｘ３０．２、Ｃｘ４０、Ｃｘ４３、Ｃｘ４５の発現が経時的に増加する傾向が見られ（図９の四角で囲った遺伝子）、分化に伴って細胞の電気刺激を伝搬させる機能が強化されたことがわかる。
　ＧＦＰ陽性細胞が発現しているチャネルについても以下の実験手順にて調べた。
　免疫染色
　細胞を４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳにより３０分間室温で固定し、ＰＢＳで３回洗い、０．２％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００－ＰＢＳを入れて１０分間おいた後、ＰＢＳで２回洗い、５％スキムミルク－ＰＢＳにより３０分間室温でブロッキングを行った。さらにＰＢＳで３回洗い、０．１％　ｔｗｅｅｎ２０－１％ＢＳＡ－ＨＢＳＳ（ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン／ＳＩＧＭＡ）で希釈した一次抗体と室温で３０分、遮光して二次抗体と室温で３０分、各々反応させ、ＰＢＳで３回洗った後、ＲＮａｓｅ処理、ＤＡＰＩ（Ｗａｋｏ）による核染色を行った。
　一次抗体には作製した抗ＨＣＮ４抗体、Ａｎｔｉ－ＨＣＮ４　Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｏｓｅｎｓｅｓ）、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ－ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ（Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ）　ｃｌｏｎｅ　ＣＨ１　（ＳＩＧＭＡ）、Ａｎｔｉ－Ｎａｖ１．５　Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ＩｇＧ　（ａｂｃａｍ）、Ａｎｔｉ－Ｋｉｒ２．１　Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ＩｇＧ　（ａｌｏｍｏｎｅ　ｌａｂｓ）、　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｒａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３１　（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた。二次抗体には　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｌｏｒ　５６８　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｌｏｒ　５６８　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　ｒａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｌｏｒ　５４６　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。
　図１０（および図９）に示すように、ＧＦＰシグナル陽性細胞はＨＣＮ４チャネルのみならず、Ｃａｖ３．２チャネルというペースメーカ細胞に特異的なチャネルを発現していた。また、Ｎａチャネル（Ｎａｖ１．５）を強く発現していた。
　ＧＦＰシグナル陽性細胞について、活動電位とＨＣＮチャネル活性を、以下の実験手順にて調べた。
　Ｐａｔｃｈ　ｃｌｕｍｐ：セルソーティングで回収した細胞を、ゼラチンコートしたφ８ｍｍ　カバーガラス（Ｗａｒｎｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に約１，５００個播いておき、翌日以降にＰａｔｃｈ　Ｃｌｕｍｐ法を用いて自動能の観測やイオンチャネルの機能解析を行った。図１１に示すように、ＧＦＰシグナル陽性細胞は自発的な活動電位を発生し、ＨＣＮチャネル活性を有していた。
　さらに、ＧＦＰシグナル陽性細胞について、上と同様のＰａｔｃｈ　ｃｌｕｍｐ法にて自動能の観測やイオンチャネルの機能解析を行った。図１２に示すように、ＧＦＰシグナル陽性細胞はペースメーカ活性に必要なＥＲＧ、Ｃａチャネルを発現するのみならず、Ｎａチャネル活性を強く持っていた。
　本発明のペースメーカ細胞の心拍数の制御
　Kurata Y, Matsuda H, Hisatome I, Shibamoto T. Effects of pacemaker currents on creation and modulation of human ventricular pacemaker: theoretical study with application to biological pacemaker engineering. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007 Jan;292(1):H701-18.に記載のペースメーカ細胞モデルを用いて、Ｎａチャネルを抑制した場合の電気活動をシミュレーションした。図１３に示すように、ＧＦＰシグナル陽性細胞はシミュレーションにてＮａチャンネルを制御すると心拍数を変動させることができることがわかった。
　次に、Ｎａチャネルを制御することにより本発明のＧＦＰシグナル陽性細胞の心拍数を実際に制御できることを示す実験を行った。パッチクランプ法による電気活動とビデオ撮影による収縮の定量化を行った。図１４に示すように、本発明のＧＦＰシグナル陽性細胞はＮａチャネル阻害薬により実際に心拍数を制御できることがわかった。
　さらに、本発明のＧＦＰシグナル陽性細胞が自律神経刺激薬により心拍数を増加できることを示す実験を行った。パッチクランプ法による電気活動の定量化を行った。図１５に示すように、ＧＦＰシグナル陽性細胞は自律神経刺激薬により心拍数を増加できることがわかった。
　本発明のペースメーカ細胞の拍動数が、交感神経刺激薬イソプレテレノールによって増加し、副交感神経刺激薬カルバコールによって減少することを確かめた。本実験はパッチクランプ法を用いていてペースメーカ細胞から直接電気現象（自発興奮）を測定し、潅流液中に交感神経刺激薬イソプレテレノールによって増加し、副交感神経刺激薬カルバコールを添加し、これらの薬剤効果を検討した後に、これらの薬剤を除去（wash out）して薬剤効果が消失するのを観察した。
　図１６に示すように、１０－５Ｍのイソプレテレノールを存在させる前後で拍動数に変化が生じ、イソプレテレノールによって拍動数が５４回／１０秒から６１回／１０秒に増加した。その後、イソプレテレノールを洗い流すと拍動数が４５回／１０秒に減少した。次に、１０－４Ｍのカルバコールを存在させると拍動数が１７回／１０秒～８回／１０秒に減少した。その後、カルバコールを洗い流すと拍動数が１４回／１０秒と増加傾向を示した。
　本房室ブロック心臓への発明のペースペーカ細胞の移植
　（１）ペースメーカ細胞の培養
　１２９ＳＶ／ＥＶマウス由来のＥＳ細胞であるＡＢ１（理化学研究所　下野博士より供与）と、これにｐＸＮＬ－ＨＣＮ４－ＥＧＦＰプラスミドを遺伝子ノックインして樹立したＨＣＮ４－ＥＧＦＰ－ＡＢ１株（＃３３株）、ＧＦＰ蛍光を指標にセルソーティングをして分取した細胞（ＨＣＮ４－ｃｏｓ７）を用いた。また、ＡＢ１株と＃３３株細胞はマイトマイシンＣ処理を行ったＳＮＬ細胞（ＳＴＯ由来、ＬＩＦ強制発現、ネオマイシン耐性遺伝子）上で培養した。
　ＥＳ細胞の継代培養は１×ＰＢＳで洗浄した後、０．２５％　トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ）で細胞をｄｉｓｈからはがし、サスペンドして細胞を希釈し、新たなｄｉｓｈに（ＡＢ１株と＃３３株はマイトマイシンＣ（ＳＩＧＭＡ）処理を行った新たなＳＮＬ細胞上に）まくことで培養を続けた。維持用培地（Maintenance Medium）の組成は以下のとおりであった：
DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’s MEDIUM (DMEM Sigma)／AB1，#33、bovine serum(FBS JRH)、Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine Sodium(SIGMA)、MEM Non-Essential Amino Acids Solution(GIBCO-BRL)、SODIUM PYRUVATE(SIGMA)、0.1mM　2-mercaptoethanol（SIGMA）、LIF（ESGRO /Cosmo Bio）
　また、培養には０．１％ゼラチン（ＳＩＧＭＡ）でコートした直径１００ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ）を用い、３７℃、５％　ＣＯ２で培養した。
　（２）胚様体の形成
　胚様体の形成は、分化用培地２０μｌ中に細胞が約５００個になるよう調整したものでハンギングドロップを作り、反転させ、培養した。分化用培地（Differentiation medium）の組成は以下のとおりであった：
DMEM、FBS、Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine Sodium(100×)、MEM Non-Essential Amino Acids Solution、SODIUM PYRUVATE、2ME
　作製したその日を０日目とし、２日目で分化用培地を加える。その後、分化誘導初期でセルソーティングを行うものについては浮遊培養を続け、中期以降に行うものは４日目でゼラチンコートをしたディッシュへ移し、接着させた状態で培養を続けた。胚様体はセルソーティングによるＧＦＰ陽性細胞分取後、免疫染色に用いた。
　（３）セルソーティング
　形成した胚様体にトリプシン処理（１×Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ　／ＧＩＢＣＯ－ＢＲＬ、３７℃　５～１５分）を行い、細胞を単一細胞に解離する。分化誘導１０日以降の胚様体の場合は、これに加えてコラゲナーゼ処理（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｔｙｐｅII／　３７℃　１時間）を行った。得られた細胞をＨＢＳＳ－１％　ＦＣＳ（ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　／ＣＡＭＢＲＥＸ）、２．５μｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）で懸濁し、ＡＢ１またはｃｏｓ７をネガティブコントロールとしてセルソーター（ＢＥＣＫＭＡＮ－ＣＯＵＬＴＥＲ　ＥＰＩＣＳ　ＡＬＴＲＡ）により、胚様体中のＧＦＰ（＋）／ＰＩ（－）細胞を採取した。
　（４）徐脈性不整脈モデルとしてのＡＶＢ（ＡｔｒｉｏＶｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｃｋ）モデルラット作製
　１０週齢のオスＩＣＲラットを使用した。麻酔（０．２％　ペントパルビタール，ＭｉｌｉＱ）を０．２ｍｌ注射した。人工呼吸器による呼吸補助、心電図モニターを行う。電熱線メスを使用して開胸し、マイクロシリンジを使用して３０％グリセロール１５μｌを肺動脈の心臓付着部位から注入した。注入後、房室結節を障害できた際、心電図からＡＶＢの波形（心拍数の減少、Ｐ派とＱＲＳ派の独立）が起こったかどうかを確認した。確認されない場合は再度グリセロールを注入した。確認されてから３０分後、心電図でＡＶＢの波形を確認してから、胸を閉じた。人工呼吸器からラットをはずし３７℃で酸素吸入を行い、マウスが目を覚めたらケージに戻した。
　術後５日後に心電図を確認し、Ｐ派とＱＲＳ派の独立が起こっているかどうかを確認した。
　（５）生物学的ペースメーカ細胞の組織学染色のためのＭｉｗＺ遺伝子導入
　Ａ６細胞にエレクトロポレーションによりＭｉｗＺ遺伝子をノックインし、増殖したコロニーを未分化の状態でＸ－ｇａｌ染色し、染色が強い株を４つセレクションした。これらを分化誘導し、セルソーティングによってＧＦＰ陽性細胞であるペースメーカ細胞を分取しＸ－ｇａｌ染色で染色されることを確認した。
　（６）生物学的ペースメーカ細胞の組織化と移植
　ＧＦＰ陽性細胞であるペースメーカ細胞をセルソーティングにて選別採取を行い、コニカールチューブに細胞を採取後、１０００回転５分で細胞のペレットを作成し、分化誘導メディウムに懸濁し、細胞を２０マイクロリットル中に３０００個となるように調整して、ハンギングドロップ内で３次元培養を行った。４８時間後に細胞集塊を３０個まとめて結合させて、ラット徐脈モデルの右心室心尖部に注射針を通して移植した。
　術後５日の心電図で房室ブロックの波形が確認できたラットに麻酔（０．２％　ペントバルビタール，　ＭｉｌｉＱ）を０．２ｍｌ注射した。人工呼吸器による呼吸補助、心電図モニターを行った。電熱線メスを使用して開胸し、マイクロシリンジを使用してＰＢＳ２０μｌに懸濁した凝集体を心室壁に注入した。胸を閉じ、人工呼吸器からマウスをはずし３７℃で酸素吸入を行い、ラットが目を覚めたらケージに戻した。５日後に開胸し、心臓を取り出し４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳで固定した。
　（７）ペースメーカ細胞の組織化の利点
　ＧＦＰ陽性細胞であるペースメーカ細胞をセルソーティングにて選別採取を行い、単離細胞として分化誘導培地の中で培養すると一週間で脱分化しペースメーカ細胞としての機能を失った。一方で、細胞を２０マイクロリットル中に３０００個となるように調整して、ハンギングドロップ内で３次元培養を行い凝集塊を作成すれば、培養皿の中で一カ月経過してもペースメーカ細胞としての性質を保つことが可能であった。
　本発明実験では、徐脈モデルラットの心室壁に約３０００個の凝集塊を３０個移植して、移植後にペースメーカ能力を発揮させることができた。約３０００個のペースメーカ細胞を含む細胞塊を５個集めてより大きな細胞塊を作成し、この組織塊６個を徐脈モデルラットの心室壁に移植した場合にも、移植後にペースメーカ能力を発揮させることができた。約３０００個のペースメーカ細胞を含む細胞塊を５個集めてより大きな細胞塊を作成し、この組織塊４個を徐脈モデルラットの心室壁に移植した場合にも、移植後にペースメーカ能力を発揮させることができた。約３０００個の凝集塊１５個を移植したのではペースメーカ機能を発揮できなかった。
　（８）Ｘ－ｇａｌ染色によるペースメーカ細胞の心室内生着の評価
　心臓を１％グルタルアルデヒドで３０分固定する。デタージェントリンス（Detergent rinse）（０．１Ｍ　リン酸バッファー　ｐＨ７．３，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．０１％デオキシコール酸ナトリウム，０．０２％　ノニデットＰ－４０，０．０２Ｍ　トリスバッファー　ｐＨ７．３）１０ｍｌにて３回で洗浄した（各１０分）。染色溶液（０．１Ｍ　リン酸バッファー　ｐＨ７．３，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．０１％デオキシコール酸ナトリウム，０．０２％　ノニデットＰ－４０，５ｍＭ　Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］，５ｍＭ　Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］）４ｍｌで３７℃、遮光で一晩染色した。
　（９）ペースメーカ細胞移植ラットの心電図変化
　まず、麻酔下で開胸して、グリセロールを使用して房室ブロックラットを作成し、その後に、組織化したペースメーカ細胞を含む細胞塊を心筋壁に注入して移植した。ペースメーカ細胞はＸ－ｇａｌ遺伝子が導入してあるので、Ｘ－ｇａｌ染色により染色できた。写真でブルーに染まる細胞が移植細胞であり、組織片が生着していることが確認された（図１７）。房室ブロック作成後、７日後に房室ブロックラットが生存し、かつ、房室ブロックが持続していることを確認し（図１８の房室ブロック後）、ペースメーカ細胞を含む移植片と対照として生理的食塩水を移植した。心電図上ではペースメーカ細胞を含む移植片の移植では、幅の広い心室リズムが生じたが、生理的食塩水では幅の狭い心室波形が認められた。
図１９では上から２列目にて房室ブロックが持続していることを確認し、ペースメーカ細胞を含む移植片の移植では、幅の広い心室リズムが生じた(上から３列目)。そこで交感神経刺激薬であるイソプロテレノールを腹腔に注入すると脈の速い幅の広い心室リズム（ペースメーカ細胞由来リズム）が促進（頻拍）することが確認された。
　ＨＣＮ４特異的抗体の作成
　抗体の作製は、ＭＢＬ（Ｍｅｄｉｃａｌ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に委託した。抗原には、ペースメーカ細胞特異的なＩｆチャネルを構成するＨＣＮ４タンパクを選択した。細胞外からの標識を可能にするため、細胞外に露出しているｐｏｒｅ領域の一部（配列番号：１：ＶＳＩＮＧＭＶＮＮＳＷ）、ｐｏｒｅ領域と膜貫通領域の一部（配列番号：２：ＶＰＭＬＱＤＦＰＨＤ）の２種類のアミノ酸配列にキャリアータンパクとの結合用のシステインを付加したペプチド（配列番号：３：ＶＳＩＮＧＭＶＮＮＳＷＣ；配列番号：４：ＣＶＰＭＬＱＤＦＰＨＤ）を合成し、それぞれ３匹のウサギに免疫した（配列番号：３にて免疫：Ｎｏ．１～３；配列番号：４にて免疫：Ｎｏ．４～６）。８回免疫後に全血採血して血清を回収し、抗体を得た。
　抗体の精製を以下のように行った。硫安沈殿により血清中のタンパクを精製し、カラム（ＰＤ－１０　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ　／ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通して硫安を除く。プロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　ＨＰ　／ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で満たし、続けてタンパク溶液を通す。リン酸ナトリウムで洗浄した後、０．１ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出した。回収した溶液は１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で中和し、フィルター付チューブ（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　／ＭＩＬＬＰＯＲＥ）に入れて遠心することで濃縮した。また、ＥＬＩＳＡの結果から、比較的検出能力の高いと見られるＮｏ．３、Ｎｏ．５を、抗原カラムを用いてアフィニティー精製した。
　図２０に示すように、ＨＣＮ４細胞外ドメインに特異的な新規抗体を作成することができた。
　得られた抗体がＨＣＮ４を認識することを以下の実験により確かめた。
　ウエスタンブロッティング：ｃｏｓ７、ＨＣＮ４－ＥＧＦＰ－ｃｏｓ７をＳＤＳ－Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　／ＢＩＯ　ＲＡＤ）、２－メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）に溶解し、得られたサンプルを７．５％アクリルアミドゲルの各レーンに１０ｕｌずつアプライし、８０Ｖで濃縮ゲル中を、分離ゲルに入ってからは１００Ｖにしてさらに９０分間電気泳動した。泳動後のゲルをｓｅｍｉ－ｄｒｙ法により、０．１８Ａの条件で３０分間メンブレンにトランスファーした。トランスファー後のメンブレンを５％スキムミルク－ＴＢＳＴでブロッキング後（室温で３時間、または４℃で一晩）、希釈した一次抗体（作製した抗ＨＣＮ４抗体、既製品抗ＧＦＰ抗体）と室温で３０分間、希釈した二次抗体（ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧ抗体、ＨＲＰ抗マウスＩｇＧ抗体）と室温で３０分間各々反応させ、ＴＢＳＴで３回洗浄した後ＥＣＬ検出を行い、各抗体の検出能力を比較した。図２１に示すように、本抗体はＨＣＮ４を強く認識することがわかった。
　次に、本抗体はＧＦＰシグナル陽性細胞の細胞膜のＨＣＮ４を細胞外から認識できることを確かめた。実験方法・手順は以下のとおりであった。
　免疫染色：細胞を４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳにより３０分間室温で固定し、ＰＢＳで３回洗い、０．２％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００－ＰＢＳを入れて１０分間おいた後、ＰＢＳで２回洗い、５％　スキムミルク－ＰＢＳにより３０分間室温でブロッキングを行った。さらにＰＢＳで３回洗い、０．１％　ｔｗｅｅｎ２０－１％ＢＳＡ－ＨＢＳＳ（ＢＳＡ：Ａｌｂｕｍｉｎ　ｆｒｏｍ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　／ＳＩＧＭＡ）で希釈した一次抗体と室温で３０分、遮光して二次抗体と室温で３０分、各々反応させ、ＰＢＳで３回洗った後、ＲＮａｓｅ処理、ＤＡＰＩ（Ｗａｋｏ）による核染色を行った。
　一次抗体には作製した抗ＨＣＮ４抗体、Anti-HCN4 Rabbit polyclonal antibody (Osenses)、monoclonal Anti-tropomyosin(Sarcomeric) clone CH1 (SIGMA)、Anti-Nav1.5 Rabbit polyclonal IgG (abcam)、Anti-Kir2.1 Rabbit polyclonal IgG (alomone labs)、Purified Rat Anti-Mouse CD31 (BD Pharmingen)を用いた。二次抗体にはAlexa Flulor 568 goat anti rabbit IgG(H+L)、Alexa Flulor 568 goat anti rat IgG(H+L)、Alexa Flulor 546 goat anti mouse IgG(H+L) (Molecular Probes)を用いた。
　図２２に示すように、本抗体はＧＦＰシグナル陽性細胞の細胞膜のＨＣＮ４を細胞外から認識できることがわかった。
　本発明は、医療器具の分野、特に心臓ペースメーカの分野において利用可能である。
　配列番号：１はＨＣＮ４タンパクの細胞外ドメインの一部のアミノ酸配列である。
　配列番号：２はＨＣＮ４タンパクの細胞外ドメインの一部のアミノ酸配列である。
　配列番号：３はＨＣＮ４特異的抗体を惹起するために用いたペプチドのアミノ酸配列である。
　配列番号：４はＨＣＮ４特異的抗体を惹起するために用いたペプチドのアミノ酸配列である。
　配列番号：５はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：６はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：７はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：８はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：９はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１０はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１１はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１２はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１３はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１４はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１５はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１６はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１７はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１８はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：１９はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２０はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２１はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２２はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２３はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２４はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２５はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２６はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２７はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２８はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：２９はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３０はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３１はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３２はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３３はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３４はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３５はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３６はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３７はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３８はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：３９はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：４０はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：４１はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：４２はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：４３はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：４４はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：４５はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。
　配列番号：４６はＰＣＲで用いた遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列である。

Claims (14)

  1. 　ＨＣＮ４チャネルとＮａチャネルを有し、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞であって、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞由来のペースメーカ細胞。
  2. 　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞を心筋へ分化誘導し、ＨＣＮ４チャネルをマーカーとして選択することを特徴とする、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞の取得方法。
  3. 　ＨＣＮ４チャネル遺伝子を胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞に導入して心筋へと分化誘導させ、標識が陽性である細胞を選別取得することを特徴とする、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞の製造方法。
  4. 　ＨＣＮ４チャネル遺伝子に選別可能な標識をコードする遺伝子を組み込んでターゲティング遺伝子を作成し、これを胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）または始原生殖細胞由来万能細胞に導入することを特徴とする、請求項３記載のペースメーカ細胞の製造方法。
  5. 　請求項２～４のいずれかに記載の方法により得られるペースメーカ細胞であって、ＨＣＮチャネルとＮａチャネルを有し、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできるペースメーカ細胞。
  6. 　請求項１または５記載のペースメーカ細胞を含む移植片。
  7. 　ペースメーカ細胞が細胞塊を形成している請求項６記載の移植片。
  8. 　細胞塊がペースメーカ細胞を約６００００個以上含むものである請求項７記載の移植片。
  9. 　細胞塊がペースメーカ細胞を約９００００個以上含むものである請求項７記載の移植片。
  10. 　請求項１または請求項５記載のペースメーカ細胞、あるいは請求項６～９のいずれかに記載の移植片を必須構成成分とする、Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできる心臓ペースメーカ。
  11. 　Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできる心臓ペースメーカの製造に用いられる請求項１または請求項５記載のペースメーカ細胞、あるいは請求項６～９のいずれかに記載の移植片。
  12. 　Ｎａチャネルの制御により心拍数をコントロールできる心臓ペースメーカの製造方法であって、請求項１または請求項５記載のペースメーカ細胞、あるいは請求項６～９のいずれかに記載の移植片を用いることを特徴とする方法。
  13. 　アミノ酸配列ＶＳＩＮＧＭＶＮＮＳＷ（配列番号：１）またはＶＰＭＬＱＤＦＰＨＤ（配列番号：２）を免疫原として得られ、これらのアミノ酸配列を認識部位とするＨＣＮ４特異的抗体。
  14. 　請求項１３記載の抗体を用いてペースメーカ細胞の選択または選別を行うことを特徴とする、請求項２～４のいずれかに記載の方法。
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