CN107893049A - 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法 - Google Patents

产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107893049A
CN107893049A CN201711004766.7A CN201711004766A CN107893049A CN 107893049 A CN107893049 A CN 107893049A CN 201711004766 A CN201711004766 A CN 201711004766A CN 107893049 A CN107893049 A CN 107893049A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
reprogramming
urine
cells
ipscs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711004766.7A
Other languages
English (en)
Inventor
米格尔·埃斯特万
约翰内斯·格里亚里
雷吉娜·格里亚里
裴端卿
周厅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet fuer Bodenkultur Wien BOKU
Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Original Assignee
Universitaet fuer Bodenkultur Wien BOKU
Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet fuer Bodenkultur Wien BOKU, Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS filed Critical Universitaet fuer Bodenkultur Wien BOKU
Publication of CN107893049A publication Critical patent/CN107893049A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/25—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from renal cells, from cells of the urinary tract

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开通过对以非侵入方式获得的供体细胞重编程而产生iPSCs和目的分化细胞的方法。具体地，所述供体细胞是脱落的上皮尿细胞。所述分化的细胞可以通过重编程的iPSCs的分化或通过直接对尿细胞重编程而获得。

Description

产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法
本申请为申请号201180063411.X、申请日2011.12.23、发明名称“产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法”的中国发明专利申请的分案申请。
本发明涉及诱导多能干细胞和分化细胞以及产生它们的方法。
发明背景
胚胎干细胞(ESCs)是来源于由体外受精得到的胚泡的细胞，所述细胞具有自我更新和分化成任意成熟的哺乳动物例如人体细胞类型的能力(该特性称为“多能性”)。在特定的组织培养条件下，ESCs可以在延长的时间期间内保持不分化同时不丧失其多能性特征。由于这些特性，ESCs已经在再生医学领域中引起了极大的兴趣。潜在地，来源于ESCs的组织可以用于人类的临床治疗(急性病症或遗传和退行性疾病)。ESCs还可以用于药物筛选，例如，用来在体外研究对治疗和对模式遗传疾病的组织特异性易感性。然而，严格的伦理和实践(免疫排斥的危险)局限性已经严重地妨碍了ESCs在临床、在多个国家以及在研究中的应用。
最近的发现，即，体细胞可以通过外源因子转化为iPSCs(该方法还称为“外源因子引起的核重编程”(Takahashi和Yamanaka，Cell(细胞)2006；126：663-76))，具有改变当前的个性化用药的观念的潜力，并且还可以提供有价值的人类疾病的体外模型(Yamanaka和Blau，2010；Nature(自然)465，704-712；Lian等人，2010；Thromb Haemost 104，39-44)。
显著地，iPSCs与ESCs类似，并且具有用于患者特异性治疗的潜力，因此避免免疫排斥的危险。由于这些特征，iPSCs已经在世界范围内受到极大的关注。iPSCs的产生需要从供体收集组织，在体外扩增供体细胞，并且将所述细胞暴露于外源因子的混合物，所述外源因子以纯化的蛋白、蛋白提取物、RNA分子、非整合的质粒、病毒(例如，反转录病毒、慢病毒、腺病毒、仙台病毒)用或不用化学混合物提供给所述细胞，并且在细胞培养条件中有变化。
这些因子的应用具有这样的作用，即，逐渐出现具有ESC样形态的集落。这些集落表现为iPSC集落，其可以挑取并随后扩增和表征，从而验证其行为与ESCs类似。
迄今为止，已经使用来自皮肤(成纤维细胞和角质形成细胞)、羊水、胚外组织(胎盘和脐带；(Cai等人，2010；J Biol Chem(生物化学杂志)285，11227-11234)脐带血，骨膜，牙组织，脂肪组织，神经干细胞，肝细胞，羊膜来源的间质干细胞和外周血细胞(Ye和Cheng，2010；Regen Med(再生医学)5，521-530；Cai等人，2010；J Biol Chem(生物化学杂志)285，11227-11234))的供体细胞产生了人iPSCs。使用不同的频率已经实现了对来自这些组织的细胞的重编程，这表明细胞的来源(“供体细胞”)是有关系的。由于目前用于产生iPSC的供体细胞的异质性，难以设定使用iPSCs和ESCs进行比较测试的标准和从测试结果得出有意义的结论。
用于产生iPSCs的理想的供体细胞类型应该易于取得，易于重编程，并且是通用的(任意年龄、性别、种族，和身体状况)。目前，表皮成纤维细胞是最常用的进行重编程的细胞来源，但是其不仅需要令人不适的活组织检查(这需要由专家在无菌环境中进行)，在使用之前还需要延长的扩增。其还具有由于暴露于光和射线而导致体细胞突变的危险，该方法在严重皮肤白或烧伤中禁用。近来，有报道称三个研究组实现了对外周血细胞的重编程，无需CD34+细胞动员(Loh等人，2010；Cell Stem Cell(细胞与干细胞)7，15-19；Seki等人，2010；Cell Stem Cell(细胞与干细胞)7，11-14；Staerk等人，2010；Cell Stem Cell(细胞与干细胞)7，20-24)。Brown等人，2010，PloS ONE，2010，5，6，1-9，描述了从外周血产生T淋巴细胞来源的iPSCs。由于这些方法是最小侵入性的，需要少量的血，并且不需要延长的细胞培养，尽管事实上其效率非常低，但是其代表了显著的进步。然而，按照这些报道所用的主要的供体细胞是携带特定的T细胞受体重排的成熟的T细胞，这对于某些潜在的临床应用是不合乎需要的。此外，T细胞不携带最终分化成任意细胞类型所需要的完整的遗传信息。
除此之外，在极少的情形中，输血/献血不能免除伦理关注，例如，由于宗教信仰，并且在患有传染病、血液疾病或免疫抑制的患者中可能是不可行的。在后一种情形中，需要考虑这样的情形，即，影响凝血的情形(例如，血友病)，白血病和遗传或获得性(例如，癌症或艾滋病)免疫抑制。
在寻找新组织的重编程过程中，还已经由小鼠脑膜(Qin等人，2008；J Biol Chem(生物化学杂志)；283，33730-33735)和乳腺上皮细胞(Li等人，2010；Cell Stem Cell(细胞与干细胞)7，51-63)，以及在人中由骨外膜和脂肪干细胞(Esteban等人，2010；Cell StemCell(细胞与干细胞)6，71-79)、脐带基质和胎盘(Cai等人，2010；J Biol Chem(生物化学杂志)285，11227-11234)产生了iPSCs。
发明概述
为了加快未来iPSC技术应用的进展，需要由代表通用来源的供体细胞以及直接来源于所述供体细胞的分化细胞提供iPSCs、以及任意细胞类型的分化细胞、来源于其的组织或类器官。此外，由于按照现有技术方法分离用于产生iPSCs的供体细胞通常需要侵入性步骤来获得目的供体组织，本发明人尝试提供来源于非侵入性细胞来源的iPSCs和用于产生所述iPSCs的方法。
WO2008/153685描述了通过提供尿样品然后从所述样品分离尿祖细胞(urineprogenitor cells)产生尿祖细胞(UPCs)培养物的方法。所述祖细胞具有进一步分化为其他细胞类型的能力。
为了获得分化细胞的培养物，WO2010/065239提议从尿中分离干细胞，然后使其分化为特定细胞类型。
这些方法的共同之处在于所得到的尿细胞的分化仅允许有限数量的细胞类型。
本发明的目的是提供一种由非侵入性方式获得的细胞来源获得关于最终产生的细胞类型具有无限的分化能力的多能细胞的方法。
为了解决本发明的问题，本发明人考虑了由个体分离理想细胞来源然后重编程为iPSCs(其可以分化成任意特定的细胞类型)或直接分化(“转分化”，即，直接分化，没有产生iPSC的中间步骤)成特定细胞类型、组织或类器官应该满足的标准：所述细胞应该易于获得，没有或仅有最小的相关危险，其应该以足够的量可用，普遍存在于男性和女性中(在伦理关注、种族、年龄或健康或疾病状况方面没有限制)，并且其应该容易以良好的效率进行重编程。本发明人惊讶地发现来自非侵入性来源样尿的体细胞，即，最终分化的细胞，能够有效重编程成为iPSCs或特定的细胞或目的细胞谱系。
本发明涉及一种由另一种细胞类型的供体细胞产生目的分化细胞的方法，所述方法包括：
i)扩增来自以非侵入性方式从供体获得的细胞来源的细胞，其中所述细胞来源选自尿、粪便、唾液、毛发、鼻分泌物、耳垢、泪液或阴道，和
ii)通过下述由所述扩增的细胞产生分化细胞
a)使所述细胞重编程以变成iPSCs，然后使所述iPSCs分化为目的细胞，或者
b)直接使所述细胞重编程以形成目的分化细胞。
按照优选的实施方案，所述在步骤i)获得的供体细胞是存在于尿中的由尿道脱落的细胞(下文中，这些细胞称为“尿细胞(urine cells)”)。
在下文中，来源于尿细胞的iPSCs称为“UiPSCs”(如果没有另外指明，例如，关于UiPSCs的用途，该术语还包括由其他非侵入性方式得到的供体细胞获得的iPSCs)。
在其中细胞来源是尿的实施方案中，步骤i)可以按照本领域已知的方法进行，其通常包括下述分步骤：
a)收集来自供体的尿，
b)从所述尿分离脱落的细胞，和
c)扩增所述脱落的细胞。
所述脱落的细胞ii)可以是尿中存在的能够重编程的任意细胞类型。
按照特定的实施方案，所述脱落的细胞是上皮细胞，例如，肾小管细胞样人脱落的近端小管上皮细胞(human exfoliated proximal tubular epithelial cells(HEPTECs))。
按照其他实施方案，所述脱落的细胞是成纤维样细胞(fibroblastoid cells)。
按照其他实施方案，所述脱落的细胞是祖细胞样细胞、内皮样细胞、平滑肌样细胞或间质样细胞，如Zhang等人，2008；J Urol(泌尿学杂志)180，2226-2233所述。
所述细胞ii)还可以是脱落的癌细胞，例如，肾癌或膀胱癌细胞。
在尿收集后，离心尿细胞，并且通过将细胞在有利于其生长的培养基上生长(由此防止不需要的细胞类型的细胞的生长)而富集目的细胞类型，例如HEPTECs或成纤维细胞样细胞。
所述培养基在文献中已知和/或可商购。例如，特别满足上皮细胞的需求的培养基包括，但不限于，Renal Epithelial Basal Medium(REBM)和SingleQuot Kit CC-4127REGM，二者均可从Lonza获得，获自Millipore的EpiGRO培养基，Renal Epithelial CellBasal Medium(ATCC)，其他上皮细胞培养基，包括呼吸道或乳腺上皮细胞培养基，例如，如可从Lonza，ATCC或Cellapplications得到的那些，或它们的组合。类似地，基于Wieser等人，2008(Am J Physiol Renal Physiol 295，F1365-1375)所述的一种培养基的一种或多种培养基。
适于富集来自尿的成纤维样细胞的培养基的实例为成纤维细胞生长培养基(Fibroblast Growth Medium)，也可从Lonza获得。
除了尿细胞之外，其是用于本发明方法的优选的供体细胞，已经以非侵入方式从供体个体获得的其他细胞可以扩增并且重编程以变成iPSCs，或者直接分化为目的细胞类型，例如，从粪便、唾液、毛发、鼻分泌物、耳垢、泪液或阴道获得的细胞。分离并扩增所述细胞的方法在本领域中是已知的，例如，用于粪便中来自结肠的脱落细胞(Bandaletova等人，2002.Apmis 110，239-246)，或来自毛发的皮肤毛囊细胞(Warren等人，1992；J InvestDermatol 98，693-699)。
另一种有用的细胞来源是这样的流体，所述流体在血液透析过程中进入到腹膜腔中，从而与通过腹膜中的血管的血液交换物质，这允许血液以与肾中“相似的”方式被滤过。可以收集该流体，并且已知该流体包含多种细胞。
“重编程”[(步骤ii)，实施方案a)]是本领域中已知的通过外源因子的方式将体细胞转化为iPSCs的术语。
在本发明的实验中，使用递送四种重编程因子Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc(“Yamanaka因子”或“Yamanaka混合物”)的反转录病毒进行尿细胞重编程成为UiPSCs，如最先由Takahashi和Yamanaka，2006；Cell 126：663-76所述。
原则上，可以使用能够使供体细胞、特别是尿细胞转化为iPSCs、特别是UiPSCs的任何重编程的方法。
重编程可以通过选自Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因的一种或多种因子实现。此外，因子的组合可以包括Oct家族基因、Klf家族基因的一种或多种基因产物以及细胞因子。所述细胞因子可以是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和干细胞因子(SCF)中的至少一种。
优选地，这些因子插入在引入到体细胞中的非病毒表达载体中。
如果UiPSCs或其分化细胞意欲用于治疗应用，使用这样的方法，所述方法不使用癌基因和/或不涉及编码重编程因子的DNA整合到个体的基因组DNA中。
因此，本发明用于产生用于治疗目的的UiPSCs或其分化细胞的优选方法不使用慢病毒或反转录病毒或使用修饰的病毒，从而使转基因的基因组整合的危险和与所述整合相关的不需要的副作用减少至最少或完全消除。此外，还必须考虑转基因整合携带插入诱变的危险，这可能与被治疗的患者中肿瘤发生相关。
用于产生用于治疗应用的UiPSCs的优选方法是避免重编程的基因的整合(由Sun等人，2010；Cell Cycle(细胞周期)9：5，880-885综述)和/或避免癌基因如Klf4或c-Myc的那些方法，例如，
·使用Cre-重组酶可切割的慢病毒(Soldner等人，2009；Cell(细胞)136：964-77)；
·单独使用OCT4、SOX2和NANOG，省略c-Myc和Klf4(Li等人，2010；CellReprogram.(细胞重编程)Jun 12(3)：237-47)；
·通过使用基于oriP/EBNA1(埃巴病毒核抗原1)的编码重编程因子Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog，Lin28和SV40LT的附加体载体获得不含病毒且不含转基因的人iPS细胞衍生物(Yu等人，2009；Science(科学)324：797-801)；
·利用使用携带Yamanaka因子的多顺反子转基因的piggyBac转座子表达载体的无病毒的重编程技术(Woltjen等人，2009，Nature(自然)458：766-70)；non-viralminicircle DNA(非病毒小环DNA)(Jia等人，2010；Nat Methods Mar 7(3)：197-9)；
·基于重组蛋白的方法，例如，用采用缀合到细胞穿透肽(cpp)上的重组蛋白的形式的四种Yamanaka因子处理细胞(Kim等人，2009；Cell Stem Cell(细胞与干细胞)4：472-6)；将细胞暴露于外源因子的混合物，所述外源因子以纯化的蛋白、进行或不进行在先的化学处理的蛋白提取物提供给所述细胞(Cho等人，2010；Blood(血液)116，386-395；Han等人，2010；PLoS One.Aug 19；5(8)：e12297；Solanki和Lee，2010；Chembiochem 11，755-757)；
·添加小分子，例如，丙戊酸，其为一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(Huangfu等人，2008；Nat Biotechnol(自然生物技术)26：795-7；Huangfu等人，2008；Nat Biotechnol(自然生物技术)26：1269-75)；或多种其他小分子，例如糖原合酶激酶3(GSK-3)的抑制剂，MEK-ERK途径和TGF β途径抑制剂，以提高重编程因子的效率或替代一些重编程因子(Lin等人，2009；Nat Methods(自然方法)6：805-8；Li等人，2009；Cell Stem Cell(细胞与干细胞)4：16-9；Shi等人，2008；Cell Stem Cell(细胞与干细胞)2：525-8；Ichida等人，2009；CellStem Cell(细胞与干细胞)5：491-503)；或添加维生素C(Esteban等人，2010；Cell StemCell(细胞与干细胞)6，71-79)；
·添加小干扰RNAs(siRNAs)，例如p53siRNA，以提高通过Yamanaka因子重编程的效率(Zhao等人，2008；3：Cell Stem Cell(细胞与干细胞)475-9)；
·向重编程混合物中添加微小RNAs(miRNAs)(例如Wilson等人，2009；Stem CellsDev(干细胞开发)18：749-58；Judson等人，2009；Nat Biotechnol.(自然生物技术)May；27(5)：459-461)；
·递送编码重编程因子的mRNA或修饰的mRNA(Yakubov等人，2010；BiochemBiophys Res Commun(生物化学生物物理研究通讯)394，189-193)，由此，在修饰的情形中，其如上述，以使其增加翻译和/或稳定性，例如，如Kowalska等人，2008，RNA.2008Jun；14(6)：1119-31所述。
重编程的安全性和/或效率可以通过改变组织培养物或环境而进一步优化，例如，用敲除血清替换物(Knock Out Serum Replacement)(KSR，Invitrogen)替代含有血清的培养基，或者改变环境(例如使用可以控制其中的氧浓度的特定的培养箱的降低氧合作用)。
例如，可以通过对给定的扩增的尿细胞群体进行连续实验而实现优化。例如，来自多个个体的尿细胞在用产生外源因子的反转录病毒感染之前可以在不同的培养基中生长(例如，表皮细胞或成纤维细胞培养基)，以选择更易于重编程的细胞群体。感染后，使用不同的培养基混合物(在不同时间点更换)，含有血清或不含血清的，有或无添加的化学制品(见上)，以观察在何种条件下可以获得优化的效率。此外，细胞可以用不同因子组合感染，例如，有或无Nanog(或其他因子，例如，微小RNAs)的4 Yamanaka因子。还可以检测经过多少轮感染(1、2或3轮)可以获得最好的结果。当所述细胞在饲养细胞上分裂时，可以使用不同类型的饲养细胞，例如，小鼠成纤维细胞，人成纤维细胞，羊水细胞，羊膜等。
直接使供体细胞重编程(而不首先产生iPSC)变成目的分化细胞[步骤ii)，实施方案b)]也已知为“转分化”，其意指细胞或组织由一种分化状态到另一种分化状态的改变(Vierbuchen和Wernig，2011，Nat Biotechnol.(自然生物技术)2011；29(10)：892-907)。
在这一实施方案中，利用病毒载体、基于质粒的载体等过表达细胞类型特异性的转录因子，如用于iPS重编程的因子一样。
对于尿细胞(或其他非侵入性得到的细胞)的直接转分化为神经元，可以使用3种因子Ascl1、Brn2和Myt1l，如关于人成纤维细胞转化为神经元所述(Vierbuchen等人，2010；Nature(自然)463，1035-1041)，或如肝细胞转化为神经元，如Marro等人，2011，Stem Cell.(干细胞)Oct 4；9(4)：374-82所述。
Efe等人，2011，Nat Cell Biol.(自然细胞生物学)2011 Mar；13(3)：215-22，描述了一种方法，通过该方法可以将小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)直接重编程为自发收缩的分化的心肌细胞的片。
对于尿供体细胞向心肌细胞的转化，可以使用这样的方法，使用Gata4、Tbx5和Baf60c成功地进行所述方法，得到了来自中胚层的心肌细胞(Takeuchi等人，2009；Nature(自然)459，708-711)。
造血细胞的转分化可以通过使用单独的Oct4过表达进行(Szabo等人，2010；Nature(自然)468，521-526)。
筛选将尿细胞转分化为神经元、角质形成细胞、成纤维细胞、心肌细胞、肝、肾、血液细胞等的因子可以与上述转分化流程和最初的Yamanaka流程相似地进行(Takahashi和Yamanaka，2006)。基于关于谱系特异性转录因子的丰富的知识，所述因子可以组合(如在上述论文中)检测其与通常用于维持或培育特定目的细胞类型的培育条件组合直接使尿来源的细胞转分化的潜能。也可以进行依据上文关于优化重编程效率所述的原理的连续实验来优化转分化效率。
尽管本发明的方法优选地用于由人供体细胞产生UiPSCs或分化细胞，但是其也可以用于来自其他哺乳动物(例如，猴子、马、狗、猫、猪、大鼠和小鼠)的细胞。
由来自脱落的尿细胞直接产生或通过中间UiPSCs产生目的分化细胞提供了一种通用的易于重现的产生高质量的ESC样细胞的方法。其具有这样的优点：供体细胞的采集可以在任何地点和由任何人进行，条件是采用最低限度的卫生措施，并且来自任何人，与年龄、性别或状况无关。另外，灌注到腹膜中用以置换需要透析的患有肾功能不全的患者、或在膀胱手术后不产生尿的患者中肾功能缺乏的流体可以用作用于重编程或转分化的细胞来源。
本发明的方法提供一种独特的机会来比较全世界的重编程方法并且使该领域向安全的iPSCs的临床应用发展。
原则上，通过本发明的方法由其他非侵入性方式得到的供体细胞获得的UiPSCs或iPSCs可以用于与本领域已知的由其他细胞类型产生的iPSCs的相同目的。
UiPSCs的有利特征使得其从研究和商业前景观点来看都是有用的，后者例如提供来自健康个体或患病个体的UiPSCs，或来源于其的细胞、细胞谱系、类器官或组织，例如用于筛选目的。
UiPSCs可以用于产生用于组织修复或置换的细胞，同时避免使用ES细胞所固有的伦理和免疫学问题。
本发明的UiPSCs，或分别来源于其的组织或类器官，特别用于治疗具有严重烧伤的患者的治疗，其将被提供由来源于尿细胞的分化细胞(直接或通过UiPSCs)获得的人造皮肤。
对于血液疾病的治疗，UiPSCs或由其获得的分化细胞、或者通过尿细胞的直接转分化获得的细胞，可以输注到患有例如体细胞突变诱发的白血病的患者中。
在血友病的治疗中，遗传校正的UiPSCs可以用于自体移植，并且在减少免疫细胞数量的疾病的情形中，例如，在HIV的情形中，转化成造血细胞的UiPSCs可以用于通过输注来补充免疫细胞群体。在镰刀形细胞贫血症中，也可以使用基因校正的iPS(Hanna等人，2007；Science(科学)318，1920-1923)。
在退行性疾病的治疗中可以使用UiPSCs(或由其他非侵入性方式获得的供体细胞得到的iPSCs)，如同本领域已知的iPSCs一样，在退行性疾病中，特定的细胞类型或组织被破坏或机能不良，并且机体不能补充它们。在退行性病症中，例如，帕金森病，用UiPSCs治疗在受影响位点提供未分化的细胞，然后其可以用于修复组织损伤。因此，用UiPSCs治疗将重新引入新的健康细胞或组织以实现相同的功能。UiPSCs还具有用于开发完整的新器官的潜能，由于其是自体细胞，即，是来源于待治疗的患者的供体细胞的细胞，所述完整的新器官与患者相容并且减少移植排斥的机会，例如，在糖尿病的情形中，可以产生分泌胰岛素的胰岛样簇，如同由iPSCs产生的那样(Tateishi等人，2008；Am J Physiol Renal Physiol(美国生理学与肾生理学杂志)295，F1365-1375)。
UiPSCs还可以用于产生疾病特异性细胞系(如由Lau等人，2009；F1000BiolRep.1：84关于iPSCs的综述)，所述疾病特异性细胞系用作疾病模型和/或在体外筛选药物候选物和/或用于通过基因治疗校正遗传缺陷。由UiPSCs产生(或通过直接由尿细胞的转分化获得的)最终分化细胞(例如，肝细胞或心肌细胞)，例如，将允许在各种细胞谱系上筛选或进一步分析化合物，目的是限定化合物的患者特异性(用于个体化用药)或一般应用。例如，如Dimos等人2008(Science(科学)Aug 29；321(5893)：1218-2)所述。UiPSCs可以用作家族形式的肌萎缩侧索硬化的模型；或者分别作为其他遗传疾病的模型或用于其他遗传疾病的治疗，如Park等人，2008(Cell(细胞)Sep 5；134(5)：877-8)所述，其从具有10种不同遗传疾病(包括帕金森病，1型糖尿病，迪谢内和贝克尔肌萎缩(Duchenne and Becker musculardystrophy)，腺苷脱氨酶缺乏性相关的严重联合免疫缺陷(adenosine deaminasedeficiency-related severe combined immunodeficiency)，Shwachman-Bodian-Diamond综合征，III型戈谢病(Gaucher’s disease type III)，亨廷顿病(Huntington’sdisease)，唐氏综合症(Down’s syndrome)和莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)的携带状态)的患者产生了iPS细胞。此外，可以如Ebert等人；2009(Nature(自然)Jan 15；457(7227)：277-8)和Soldner等人，2009(Cell(细胞).Mar 6；136(5)：964-77)所述类似地产生基于人细胞的脊髓性肌萎缩和帕金森病模型，或者可以与Ye等人，2009(Proc Natl AcadSci USA(美国国家科学院学报)Jun 16；106(24)：9826-3)关于来源于皮肤成纤维细胞的iPSCs(其随后分化成产生血红蛋白的造血细胞)所述类似地使用来源于具有纯合β-珠蛋白生成障碍性贫血(homozygous beta-thalassemia)的患者的细胞的UiPSCs。所述UiPSCs，当遗传改造时，可以产生正常行使功能的自体造血细胞。UiPSCs还可以用来校正范科尼贫血(Fanconi anemia)患者的遗传缺陷，如Raya等人，2009(Nature(自然)Jul 2；460(7251)：53)所述，其由从范科尼贫血患者收集的皮肤成纤维细胞衍生iPS细胞，使用编码FANCA和FANCD2的慢病毒载体校正，随后衍生表型上没有疾病的体细胞。
UiPSCs还可以如由Lee等人，2009(Nature(自然)Sep 17；461(7262)：402)所产生的iPS那样使用，其从具有家族性自主神经机能异常(familial dysautonomia(FD))的患者产生iPSCs，重新分化所述iPS细胞并且使用体外模型来筛选候选药物。
UiPSCs具有作为疾病模型的潜在的巨大价值的另一种疾病的实例是普拉德-威利综合征(Prader Willi syndrome)(Yang等人，2010；J Biol Chem(生物化学杂志)285，40303-40311)。使用UiPSCs的基因治疗具有巨大潜力的遗传疾病的其他实例是大疱性表皮松懈症(Epidermolysis bullosa)(例如，通过K14 mRNA重编程，如Wally等人，2010；HumMol Genet(人类分子遗传学)19，4715-4725；Wally等人，2008；J Invest Dermatol(皮肤病学研究杂志)128，568-574所述)。一般地，基于遗传改造的UiPSCs的基因治疗具有治疗由单基因障碍引起的疾病的最大的潜力；迄今为止，已经描述了大约4000例这样的遗传疾病。
在上述使用最终分化细胞的疾病模型中，作为由UiPSCs获得的备选方案，所述细胞可以通过供体细胞的直接重编程获得。为了本发明的目的，“直接重编程”与本文定义的“转分化”同义使用。
如果供体细胞是癌细胞，例如，肾癌或膀胱癌细胞，可能代表所述癌症的早期阶段，UiPSCs或其分化细胞用作用于所述各种癌症的模型。
基因治疗包括在个体细胞内插入、改变或消除一种或多种基因，以校正引起疾病的遗传缺陷。迄今为止，主要是单基因疾病(其由单个基因内的突变引起)，已经被考虑用于治疗。最常见形式的基因治疗涉及将功能基因插入到未指定的基因组位置中，从而替换突变的基因。突变还可以直接被校正。
关于基因治疗应用，遗传修饰的细胞是UiPSCs或来源于其的分化细胞(或通过供体细胞的直接重编程得到的)；备选地，尽管较不优选，扩增的供体细胞可以在重编程之前进行遗传修饰。在本发明的范围内，遗传修饰的细胞广泛应用在体细胞基因治疗中。由于在重新输注或移植UiPSCs或来源于其的分化细胞(或通过供体细胞的直接重编程得到)之前在体外进行遗传缺陷的校正，因此对种系的基因转移的危险最小化。校正的细胞将作为来源于UiPSCs的分化细胞(或直接转分化无需之前的iPS重编程)输注或移植，以补充或替换无功能的组织和器官。校正的基因可以按照本领域已知的方法引入到细胞中，例如，通过病毒载体(被修饰以使复活的危险最小化)，包括反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒，通过使用基于质粒的载体，或甚至使用裸露的DNA进行。
基因缺陷的校正可以以多种方式进行，例如，通过递送编码正确行使功能的基因的DNA，通过递送shRNA或miRNA敲低突变的基因，通过使用锌指蛋白进行敲除或重组，或通过使用允许反式剪接事件的载体进行。
可以预测，由于非侵入性获得供体细胞的方式，可能存在高的健康个体接受性，从而预先和预防性地制备并储存来源于其自身尿的UiPSCs，以及衍生的细胞谱系、类器官或组织，如人造皮肤，这允许在严重疾病或损伤的紧急情形(如烧伤)的更迅速的应用。
由UiPSCs产生的成纤维细胞、角质形成细胞或人造皮肤(Bilousova等人，2010；JInvest Dermatol.(皮肤病学研究杂志)Dec 9)，例如来源于具有不同皮肤类型的个体的供体细胞，也可以用于化妆品工业进行检测。
UiPSCs还可以用于克隆动物，特别是哺乳动物，例如，赛马或宠物。
附图简述
图1
苏木精/曙红(esosin)染色的畸胎瘤的载玻片，所述畸胎瘤包括用2个代表性UiPSC克隆产生的3胚层的复杂衍生物；
图2
A：按照报道的流程由代表性UiPSC克隆产生的神经元样细胞的相差和免疫荧光照片；
B：使用报道的流程将代表性UiPSC克隆分化成心肌细胞样细胞。相差、PAS染色和免疫荧光照片；
C：使用报道的流程将代表性UiPSC克隆分化成肝细胞样细胞。相差、PAS染色和免疫荧光照片；
D：在来源于代表性UiPSC克隆的心肌细胞中测量的动作电位。
实施例
材料和方法
免疫荧光显微镜检
细胞在4％低聚甲醛中固定过夜，洗涤，封闭并且在封闭液(含有3％正常山羊血清和0.2％Triton X-100的PBS)中渗透化处理30分钟。然后，将其用在封闭液中的一级抗体在4℃温育过夜，洗涤两次，并且用相应的二级抗体在室温温育1小时。将细胞洗涤两次，并且用DAPI(Sigma)染色5分钟，然后用Leica TCS SP2光谱共聚焦显微镜(Leica MicrosystemsGmbH，Wetzlar，德国)观察和照相。免疫荧光之前，用剪刀剪下搏动区域(beating areas)，收集在具有低钙PBS的1.5mL管中，并且在室温放置30分钟。将这些细胞块转移到含有0.5-1mg/mL胶原酶2的酶缓冲液中并且在37°温育30-40分钟。消化用DMEM/Ham′s F121：1(Hyclone)、10％胎牛血清(FBS；PAA)、SingleQuot Kit CC-4127 REGM(Lonza)终止。然后，将样品离心，并且将沉淀重悬在DMEM/Ham′s F121：1(Hyclone)、10％胎牛血清(FBS；PAA)、SingleQuot Kit CC-4127 REGM(Lonza)中。将细胞混悬液涂布在明胶包被的盖玻片上，并且在37°温育至少2天，然后进行固定和免疫荧光。
组织特异性分化和电生理测量
神经元、肝细胞和心肌细胞分化按上述进行(Pankratz等人，2007，Stem Cells(干细胞)25，1511-1520；Song等人，2009，Cell Res(细胞研究)19，1233-1242；Zwi等人，2009，Circulation(循环)120，1513-1523)。N2和B27购自Invitrogen，肝素购自Sigma，EGF购自R&D系统。肌动蛋白A和制癌蛋白M购自R&D系统(Minneapolis，MN，USA)，BMP2，FGF4，HGF和KGF购自PeproTech(Rocky Hill，USA)，并且地塞米松(dexamethasone)购自Enzo LifeSciences(Farmingdale，USA)。RPMI1640，hepatoZYME-SPF，Periodic acid Schiff’s(PAS)染色使用购自Polysciences(Warrington，USA)的试剂盒进行。iPSC-衍生的心肌细胞(第23天)的电生理表征使用标准全细胞膜片钳进行，以记录动作电位表型(HEKA InstrumentsInc.，Southboro，MA)(Chan等人，2009 J Cardiovasc Electrophysiol(心血管电生理杂志)20，1048-1054)。膜片吸管(Patch pipettes)使用Sutter微量移液管拉出器P-97由1.5-mm薄壁硼硅酸盐玻璃管制备，并且在装满内部溶液时具有3-5MΩ的典型阻抗，所述内部溶液包含(mM)：110天冬氨酸K+，20KCl，1MgCl2，0.1Na-GTP，5Mg-ATP，5磷酸肌酸二钠，5EGTA，10HEPES，并且用KOH调节pH至7.3。外部Tyrode’s浴溶液由下述组成(mM)：140NaCl，5KCl，1MgCl2，0.4KH2PO4，1.8CaCl2，10葡萄糖，5HEPES，并且用NaOH将pH调节至7.4。测量自发电位，而iPSC-衍生的心肌细胞置于被动没有电流输入。记录来自自发激发的iPSC衍生的心肌细胞的二十次连续的动作电位，其确保稳定的波形进行分析。关于+15.9mV的液体接界电势校正数据。使用先前描述的流程(Ng等人，2010；J Mol Cell Cardiol 48，1129-1137)用共聚焦钙成像检测钙瞬变。简言之，将分离的iPSC-衍生的心肌细胞在Tyrode溶液中在37℃负载5μM Fluo-3 AM(Invitrogen)25分钟，所述Tyrode溶液含有下述(mM)：140NaCl，5KCl，1MgCl2，0.4KH2PO4，1.8CaCl2，10葡萄糖，5HEPES，pH 7.4。用安装在直立的奥林巴斯显微镜(IX71)上的共聚焦成像系统(Olympus Fluoview System version 4.2 FV300 TIEMPO)记录钙瞬变，然后以针对减去背景的基线荧光标准化的减去背景的荧光强度变化进行量化。将数据输入Felix 32(Photon Technology International)软件中进行分析。
i)尿收集和细胞扩增
在尿收集之前，将适当的容器(多至500ml)灭菌。仅将中段尿收集到无菌容器中。通常的样品体积为150-200mL。然后，将尿样品在组织培养通风橱中转移到50mL管中，并且将这些管在室温以400g离心10分钟。在组织培养通风橱中小心弃去上清，在管中留下约1mL以下的尿。分别重悬沉淀，并且将来自一份样品收集的所有50mL管汇集到一个单个的50mL管中。加入约10mL含有两性霉素B和青霉素/链霉素的PBS。将样品以400g离心10分钟。弃去上清，仅留下约0.2mL样品。加入约1mL原代培养基(primary medium)以重悬细胞沉淀。原代培养基的配方包含DMEM/Ham′s F12 1∶1(Hyclone)，10％胎牛血清(FBS；PAA)，SingleQuotKit CC-4127 REGM(Lonza)，两性霉素B和青霉素/链霉素。将细胞转移到用L-明胶包被的12孔平板中的1mL原代培养基中。前2天，加入几百mL原代培养基，以保持抗生素浓度，并且保持营养水平。接下来的日子里，将培养基小心更换为包含SingleQuot Kit CC-4127 REGM(Lonza)的REBM(Renal Epithelial Basal Medium(肾上皮基本培养基)，Lonza)培养基(二者的组合称为尿细胞培养基)，该步骤从未进行完全以允许由尿细胞分泌的因子的存在并且避免不需要的胁迫。通常在3-6天后出现可见的细胞/集落。在观察到第一个细胞/集落后进行首次全部培养基更换。当培养物生长为汇合时，通过0.25％含有1mM EDTA的胰蛋白酶辅助，使细胞分开在更大的表面上。该步骤和其他步骤得到广州生物医学和健康研究所伦理委员会(the ethics committee of the Guangzhou Institutes of Biomedicine andHealth)的核准。如Wieser等人，2008，Am J Physiol Renal Physiol(美国生理学肾脏生理学杂志)295，F1365-1375所述产生RPTECs，并且保持在尿细胞培养基中。成纤维细胞由购自Coriell细胞库(Coriell cell repository)的皮肤成纤维细胞获得，并且保持在DMEM(Invitrogen)+10％(vol/vol)胎牛血清(FBS；Hyclone)中。
乍看上去，尿细胞培养物主要由鳞状上皮细胞(可能来自尿道)和少量血液细胞(主要是红细胞)组成，但是2-3天后，这些细胞消失，并且取而代之的是快速生长的小集落(平均每份样品3个)。这些集落对应2种主要的形态：1型或2型，与之前关于尿细胞分离的报道一致(Dorrenhaus等人，Arch Toxicol 2000；74，618-626)。1型细胞倾向于更圆，并且与邻近细胞连接紧密地生长，提示上皮表型。2型细胞适度地更长，并且倾向于稍微更分散地生长。在一些样品收集中，所有的集落对应这2种类型中的1型，但是在其他样品收集中是混合的。当达到高密度时，汇集这些细胞培养物，并且分开(split)，用于进一步的表征或平行的重编程。在1型细胞中富集的那些表现出对E-钙粘着蛋白和β连环蛋白(黏附连接标记)和ZO-1(紧密连接蛋白1；一种紧密连接标记)阳性的充分形成的细胞-细胞连接，如通过免疫荧光显微镜检评估的。其也对中间丝角蛋白7(一种上皮标记)和肾近端小管标记CD13是阳性的。此外，肌动蛋白的分布是在皮质而非在应力纤维(stress fiber)。定量实时PCR(qPCR)也支持通过E-钙粘着蛋白、闭合蛋白和密蛋白1(紧密连接蛋白)和肾近端小管溶质载体家族2-转运蛋白SLC2A1分析证实的主要的上皮来源。肾近端上皮细胞(RPTECs；Wieser等人，2008；Am J Physiol Renal Physiol(美国生理学和肾生理学杂志)295，F1365-1375)和皮肤成纤维细胞分别作为阳性和阴性对照用于免疫荧光和qPCR。2型细胞富集的培养物表现出相当相似的免疫荧光模式，但是强度较弱，分布更有斑块性；qPCR结果同样是相当的。在两种情形中，观察到关于成纤维样标记纤连蛋白和波形蛋白的少量染色。
ii)UiPSC产生和扩增
将来自12名中国或高加索血统的年轻成年人的样品重编程，7名对应男性，5名对应女性。将第2-3代的尿细胞用产生Sox2，Klf4，Oct4和c-Myc的反转录病毒转导(Cai等人，2010；J Biol Chem(生物化学杂志)285，11227-11234；Esteban等人，2010；Cell Stem Cell(细胞与干细胞)6，71-79)：产生人Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc转录因子的反转录病毒质粒购自Addgene(Cambridge，MA，USA)。在转染后48小时开始的2个连续的日子收集病毒上清液。第2-4代尿细胞用胰蛋白酶酶解，并且接种在六孔培养皿中。每孔加入60,000个细胞。用通过用含有人Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc的cDNAs的反转录病毒pMXs载体(Addgene)转染293T细胞(使用Lipofectamine 2000，Invitrogen)产生的病毒上清液感染细胞。连续进行两轮转染(每轮12小时)。加入聚凝胺(Polybrene)(Sigma)以提高感染效率。在第二轮感染后(感染效率接近100％，如通过用表达GFP的载体的对照转导验证)，将转导细胞的组织培养基更换为尿细胞培养基，并且每天更新。在第3或4天，将细胞用胰蛋白酶酶解并且计数其数目。通常，将50,000个细胞接种在10cm培养皿中的一层饲养细胞上，并且使用人ESC培养基(F12[Invitrogen]+20％KSR[敲除血清替换物，Invitrogen]+10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子+非必需氨基酸[Invitrogen]，L-谷氨酰胺，和β巯基乙醇)，每天更新培养基。在第5天，将培养基更换为人ESC培养基+1mM丙戊酸(VPA；Sigma)或半ESC培养基+半dFBS培养基(由下述组成：DMEM高葡萄糖[Invitrogen]+20％人定义的胎牛血清[FBS，Hyclone]+VPA。VPA仅在第5-12天保留。培养基更换为mTesR1培养基(Stemcell)，并且每天更新，直到实验的最后一天。从第16天起，可以机械地挑取足够大并且可辨认为人ESC-样的那些集落(为具有确定的边缘和包含突出的核仁的大核的扁平形态)并且在人ESC培养基中在饲养细胞或在基质胶(Matrigel)上的mTesR1培养基上扩增。
iii)UiPSC表征
按照Cai等人，2010；J Biol Chem(生物化学杂志)285，11227-11234；Esteban等人，2010；Cell Stem Cell(细胞与干细胞)6，71-79所述进行AP染色、转基因整合、核型分析和亚硫氢酸盐测序(bisulfate sequencing)。
使用应用生物系统基因分析仪(Applied Biosystems Genetic Analyzer(ABI3130，ABI)进行STR分析。使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)提取基因组DNA，并且使用Trizol(Invitrogen，Paisley，USA)提取总RNA。使用热循环DiceTM实时系统(Thermal Cycler DiceTM Real Time System)(ABI7300，ABI，Foster，California，USA)和SYBR Green Premix EX TaqTM(Takara，Shiga，Japan)进行qPCR；β肌动蛋白用作标准化，并且所有项目一式三份测量。使用Illumina′s Human HT-12 V4.0 Expression Beadchip按照供应商的使用说明进行DNA微阵列。用Illumina BeadChip Reader扫描芯片，并且用illumina BeadStudio Application分析数据。对于畸胎瘤，皮下或肌内注射2×106个UiPSCs到免疫低下的NOD-SCID小鼠的右后腿中。8-10周后切除肿瘤，固定并且包埋在石蜡中，切片并用苏木精/曙红染色。对于EB分化，将在饲养细胞上的iPSCs用分散酶(Invitrogen)处理并且通过刮片收集。离心后，将细胞沉淀重悬在不含bFGF的人ESC培养基中并且在非贴壁培养皿中生长8天。然后，将EBs转移到明胶包被的培养皿中以允许分化另外的8天，然后进行免疫荧光分析。
原代培养物和得到的UiPSCs的表征表明小的集落通常在第9-16天出现，这在供体之间不同，没有显著的模式。这些集落中的多个逐渐采用人ESC-样形态并且在第16-25天挑取。重编程效率在供体之间不同，但是通常相当高，在0.1％-4％变化。还从一名65岁的男性个体产生UiPSCs，重编程效率较低(0.01％)，但是仍然显著高于报道的外周血细胞的效率。此外，可以冷冻并且在转导之前解冻来自一些供体的尿细胞，并且这不损害重编程效率。尿细胞还能以后续代次感染，不过效率上有较小的下降。
在集落扩增后，通过标准步骤(包括碱性磷酸酶染色(AP))表征UiPSCs，并且清楚地显示通过完整集落的暗染色显现的具有强AP染色的阳性细胞集落。这些集落在对于ES标记TRA-1-60，TRA-1-81，Nanog，SSEA-3和SSEA-4的间接免疫荧光染色中进一步染色为阳性的。此外，观察到对于内源ESC基因加这些转基因沉默的qPCR。由于针对UiPSCs的微阵列的任意荧光单位绘制的ES细胞的微阵列的任意荧光单位显示45°角的线性斜率，故DNA微阵列证明整体基因表达与H9 ESCs接近。供体尿细胞和UiPSCs的单串联重复分析(STR)在所有情形中显示匹配的起点(origin)。如果情况如此，后者排除不可能的污染和来自配偶的细胞的重编程。
在集落扩增后，通过标准步骤(包括碱性磷酸酶染色)表征UiPSCs，并且清楚地显示通过完整集落的暗染色显现的具有强AP染色的阳性细胞集落，而未转染的细胞没有显示任何碱性磷酸酶染色。在转基因整合到基因组DNA中后其表现出正常的核型，并且在关于ES标记TRA-1-60，TRA-1-81，Nanog，SSEA-3和SSEA-4的间接免疫荧光染色中进一步染色为阳性的。此外，观察到对于内源ESC基因加这些转基因沉默的qPCR(显示在下表中；hTERT表示人端粒酶逆转录酶)。数值表示供体尿细胞；H9 ESCs用作对照。由于针对UiPSCs的微阵列的任意荧光单位绘制的ES细胞的微阵列的任意荧光单位显示45°角的线性斜率，故DNA微阵列证明整体基因表达与H9 ESCs接近。亚硫酸氢盐测序显示在同一供体的2个代表性UiPSC克隆中在Oct4和Nanog近端启动子中的广泛的去甲基化作用。供体尿细胞和UiPSCs的单串联重复分析(STR)显示匹配的起点，并且DNA微阵列证明与H9 ESCs接近的整体基因表达模式。
iv)提供UiPSCs的多分化能力
为了证明UiPSCs是多能性的，进行通过畸胎瘤的非特异性分化(图1)和胚胎样小体(embryoid body，EBs)形成。在两种情形中，观察到来自3胚层的衍生物的出现，并且畸胎瘤包含相当复杂的结构，没有明显的坏死或肿瘤包膜侵入的迹象(图1)。然后，进行定向的UiPSC分化为神经谱系(神经干细胞，神经元和星形胶质细胞)(图2A)，心肌细胞(图2B)和肝细胞(图2B)；用高碘酸Schiff’s染色检测糖原累积)，这由针对适当的标记的免疫荧光显微镜检以及qPCR(仅对于肝细胞和心肌细胞)验证。值得注意的是，对于与11名供体对应的12种UiPSCs产生神经分化，对于3名供体的4种克隆产生肝细胞，和对于11名供体的14种克隆产生心肌细胞。影像显示高比例的自发博动的EBs(30-75％)。同样地，动作电位(图2D)和钙瞬变的电生理测量(两种克隆的心肌细胞的电生理模式)显示与由人ESCs或成纤维细胞衍生的iPSCs产生的心肌细胞相似的行为。

Claims (15)

1.一种由另一种细胞类型的供体细胞产生目的分化细胞的方法，所述方法包括：
i)扩增来自以非侵入方式从供体获得的细胞来源的细胞，其中所述细胞来源选自尿、粪便、唾液、毛发、鼻分泌物、耳垢、泪液或阴道，并且
ii)通过下述由所述扩增的细胞产生分化细胞：
a)使所述细胞重编程以变成诱导多能干细胞(iPSCs)，并且使所述iPSCs分化为所述目的细胞，或者
b)直接使所述细胞重编程以变成目的分化细胞。
2.权利要求1的方法，其中步骤i)所述的供体细胞是脱落的尿细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞由患病个体或健康个体获得，并且选自上皮细胞、成纤维样细胞或癌细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述重编程由包括选自Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因的因子的外源重编程因子的混合物实现。
5.权利要求1的方法，其中所述重编程由包括选自Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc和Nanog的因子的外源重编程因子的混合物实现。
6.权利要求4或5的方法，其中所述重编程涉及所述细胞不进行基因组整合和/或不进行癌基因表达而对重编程因子的表达。
7.权利要求4-6中任一项的方法，其中所述重编程还包括应用小分子、小干扰RNAs或微小RNAs，所述小分子、小干扰RNAs或微小RNAs提高所述重编程因子的效率或替代所述重编程因子中的一个或多个。
8.权利要求1的方法，其中所述细胞是人细胞。
9.产生诱导多能干细胞(iPSCs)的方法，所述方法包括：
i.扩增来自以非侵入方式从供体获得的细胞来源的细胞，其中所述细胞来源选自尿、粪便、唾液、毛发、鼻分泌物、耳垢、泪液或阴道，并且
ii.使所述扩增的细胞重编程以变成iPSCs。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞是尿细胞。
11.通过权利要求1的方法获得的分化细胞，来源于所述分化的细胞的类器官或组织，其被遗传修饰而携带核酸分子，所述核酸分子校正导致遗传疾病的缺陷。
12.权利要求11的分化细胞作为所述疾病的模型或用于筛选治疗所述疾病的化合物的应用。
13.尿细胞用于产生诱导多能干细胞的应用。
14.尿细胞用于产生目的分化细胞的应用。
15.权利要求14的应用，其中所述分化细胞通过下述获得：
a)使尿细胞重编程以变成诱导多能干细胞iPSCs，然后使所述iPSCs分化为目的细胞，或者
b)直接使尿细胞重编程以变成分化细胞，而没有产生诱导多能干细胞的中间步骤。
CN201711004766.7A 2010-12-31 2011-12-23 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法 Pending CN107893049A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2010/002226 2010-12-31
CNPCT/CN2010/002226 2010-12-31
EP11152519A EP2481795A1 (en) 2011-01-28 2011-01-28 Method of generating induced pluripotent stem cells and differentiated cells
EP11152519.2 2011-01-28
CN201180063411XA CN103348002A (zh) 2010-12-31 2011-12-23 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180063411XA Division CN103348002A (zh) 2010-12-31 2011-12-23 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107893049A true CN107893049A (zh) 2018-04-10

Family

ID=44072554

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711004766.7A Pending CN107893049A (zh) 2010-12-31 2011-12-23 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法
CN201180063411XA Pending CN103348002A (zh) 2010-12-31 2011-12-23 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180063411XA Pending CN103348002A (zh) 2010-12-31 2011-12-23 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP2481795A1 (zh)
CN (2) CN107893049A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111154807A (zh) * 2020-01-17 2020-05-15 山东农业大学 一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的构建方法
WO2020258637A1 (zh) * 2019-06-26 2020-12-30 中山大学附属第一医院 肾移植供体特异性尿源细胞及其dna的制备方法以及其应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10428309B2 (en) 2011-12-01 2019-10-01 New York Stem Cell Foundation, Inc. Systems and methods for producing stem cells and differentiated cells
CN110724636A (zh) 2011-12-01 2020-01-24 纽约干细胞基金会 用于产生诱导多能干细胞或分化细胞的自动化系统
WO2014210533A1 (en) * 2013-06-27 2014-12-31 The New York Stem Cell Foundation Improved systems and methods for producing stem cells and differentiated cells
CN104140951B (zh) * 2014-08-06 2016-08-24 深圳市科晖瑞生物医药有限公司 一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法
CN107937346B (zh) * 2017-11-20 2021-02-19 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种用人尿液细胞作为饲养层培养诱导多能干细胞的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010065239A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Wake Forest University Health Sciences Stem cells from urine and methods for using the same
CN101842105A (zh) * 2007-05-21 2010-09-22 韦克福里斯特大学健康科学院 来自尿的祖细胞及其使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101842105A (zh) * 2007-05-21 2010-09-22 韦克福里斯特大学健康科学院 来自尿的祖细胞及其使用方法
WO2010065239A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Wake Forest University Health Sciences Stem cells from urine and methods for using the same

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TROND AASEN等: "Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
张桂权: "《普通遗传学》", 30 August 2005 *
王英杰等: "诱导多能干细胞的研究进展", 《胃肠病学和肝病学杂志》 *
申红芬等: "诱导性多潜能干细胞(iPS cells)——现状与前景展望", 《生物化学与生物物理进展》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020258637A1 (zh) * 2019-06-26 2020-12-30 中山大学附属第一医院 肾移植供体特异性尿源细胞及其dna的制备方法以及其应用
CN111154807A (zh) * 2020-01-17 2020-05-15 山东农业大学 一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103348002A (zh) 2013-10-09
EP2481795A1 (en) 2012-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zakrzewski et al. Stem cells: past, present, and future
US11008550B2 (en) Use of RNA for reprogramming somatic cells
Novak et al. Enhanced reprogramming and cardiac differentiation of human keratinocytes derived from plucked hair follicles, using a single excisable lentivirus
Singh et al. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery
EP2658965B1 (en) Method of generating induced pluripotent stem cells and differentiated cells
Liu et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Friedreich ataxia patients
Zwi-Dantsis et al. Derivation and cardiomyocyte differentiation of induced pluripotent stem cells from heart failure patients
Song et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis
CN107893049A (zh) 产生诱导多能干细胞和分化细胞的方法
CN103987854A (zh) 来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法
JP2013535966A (ja) 引き抜かれた毛包由来のケラチン生成細胞から誘導多能性幹細胞を生成させる方法
JP6858757B2 (ja) 心臓内膜由来成体幹細胞から製造された誘導多能性幹細胞の心血管系細胞への分化方法およびその用途
Sackett et al. Modulation of human allogeneic and syngeneic pluripotent stem cells and immunological implications for transplantation
Nizzardo et al. Direct reprogramming of adult somatic cells into other lineages: past evidence and future perspectives
KR101562366B1 (ko) 메타크릴레이트화된 젤라틴을 포함하는, 심근세포분화 유도용 세포 지지체
CN101613717B (zh) 用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法
CN111484977B (zh) 重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法
WO2012165740A1 (en) Composition for improving dedifferentiation of cells and method for producing inducted pluripotent stem cells using the same
TWI769410B (zh) 新穎誘導性多能幹細胞(ipscs)及其應用
De Lazaro Del Rey In vivo cell reprogramming to pluripotency: generating induced pluripotent stem cells in situ for tissue regeneration
JP6654323B2 (ja) 重層上皮組織形成能を有する細胞、及びその製造方法
CN101671650B (zh) 一种可高效诱导产生诱导多能干细胞(iPS)的诱导重编程方法
CN112961858A (zh) T-all耐药模型的构建及应用
Dawson Cardiac Tissue Engineering
Rodríguez Polo Non-human primate iPS cells for cell replacement therapies and human cardiovascular disease modeling

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180410