JP6858757B2 - 心臓内膜由来成体幹細胞から製造された誘導多能性幹細胞の心血管系細胞への分化方法およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、末梢血液から分離した心臓内膜由来成体幹細胞の誘導多能性幹細胞への製造方法と、前記方法で製造された誘導多能性幹細胞の心血管系細胞への分化方法、およびその用途に関する。

２００６年に日本国の山中教授により開発された４種類の遺伝子を利用した誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）の製作方法の開発に伴い、患者個々に合わせたオーダーメード細胞治療市場と疾病発生機序の研究に新しい発展可能性が提示された。これにより、遺伝的変形を引き起こさない方法で誘導多能性幹細胞の製作方法を模索する部分に飛躍的な発展を遂げ、また、ｉＰＳＣ製作のために使用される様々な患者由来初代培養細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）の種類も共に摸索されてきた。

皮膚線維芽細胞は、ｉＰＳＣの製作に最も広範囲に使用される細胞であって、接近が容易であり、培養が簡易であるという長所がある。現在まで報告された研究結果を見ると、成体細胞より少し幼い段階の細胞が増殖力が高く、幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する特殊な遺伝的構成のため、ｉＰＳＣの製作時に提供する山中因子の数を減らすことができた。特に神経幹細胞の場合は、ＳＯＸ２とｃ−ＭＹＣを自体的に発現しているので、ＯＣＴ４とＫＬＦ４の二つの因子を導入することだけでも、ｉＰＳＣの製作が可能であった。したがって、体細胞より幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有しているより幼い段階の細胞を探して、初代培養細胞として利用すると、ｉＰＳＣの製作にかかる時間を短縮させると共に、製作効率性を高めることができる。さらに、その遺伝子発現を調査して、少ない数の山中因子でもｉＰＳＣを確立することができると、これは、前記細胞をターゲット細胞に分化させて治療に利用する時、癌の誘発危険を低減することができる長所になり得る。

また、マウスとヒト細胞を利用した様々な研究を行った結果、初代培養細胞によってｉＰＳＣからターゲット細胞への分化効率に差異が存在すると報告されたことがある。これは、本来の体細胞が持っているエピジェネティック記憶（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｅｍｏｒｙ）が逆分化後にも残っているからであると見なされる。したがって、誘導多能性幹細胞の製作初期からターゲット細胞への分化時の効率、分化後の細胞機能および安定性を念頭に置いて発生学的オリジンを考慮して初代培養細胞を選択しなければならない。

２０１４年の報告によれば、心臓前駆細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）由来のｉＰＳＣ（ＣＰＣ−ｉＰＳＣ）と線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）由来のｉＰＳＣ（Ｆｉｂ−ｉＰＳＣ）から心筋細胞に分化を進めた時、ＣＰＣ−ｉＰＳＣを使用した場合、Ｆｉｂ−ｉＰＳＣより分化効率が高く、同一細胞を利用した内皮細胞と平滑筋細胞への分化を用いた比較においても、ＣＰＣ−ｉＰＳＣを利用した場合、分化効率がさらに高く現れた（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｆｒｅｉｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１４，ＪＡＣＣ、６４（５）：４４９−４５０）。したがって、誘導多能性幹細胞を利用した心血管系細胞への分化を目的とする場合、心臓由来の初代培養細胞を使用することが、分化効率を高める重要な要素として作用することができる。

また、基本的に初代培養細胞の保管まで考慮する時、保管前後の細胞の構成に変化があってはならない。また、様々な応用の可能性を考慮した時、検体獲得の方法が感染に対する危険を持っている生検を用いた侵襲的な方法よりは、可能な限り、非侵襲的な方法で行う場合に、年齢別、性別、疾患別など多様な背景の初代培養細胞を得ることができる。

上記の内容を総合すれば、ｉＰＳＣの初代培養細胞となるための理想的な条件は、第一に、サンプル獲得が容易でなければならない。獲得時に、容易で且つ安全に多数の細胞を確保しなければならない。第二に、外部遺伝子の流入とその発現に敏感であり、第三に、寄贈者の年齢、性別、民族、身体状態と関係なく分離され得る細胞でなければならず、分離した時、その寄贈者の遺伝情報を代表できる細胞でなければならない。第四に、幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）があると、ｉＰＳＣの製作効率を高めることができ、エピジェネティック記憶が同じ細胞である場合、ターゲット細胞への分化時に分化効率の利点を生かすことができる。

しかしながら、現在までｉＰＳＣの製作に使用されたと報告された多様な細胞を分析した結果、このようなすべての条件を満たす細胞は存在しなかった。これを補完するために、一人の寄贈者から多様な細胞を確保する側に旋回することもあるが、分離、培養、保管に非常に多くの人力、時間、および資源が浪費されるため、本発明者らは、分野を制限して心血管系細胞の治療に限定して使用され得るｉＰＳＣの製作に利用される初代培養細胞を発掘しようとした。

本発明者らは、心血管系細胞の治療に使用され得る誘導多能性幹細胞の製作に最適化した初代培養細胞の獲得とその検証のために鋭意研究した結果、ヒト末梢血液から分離した心臓内膜由来成体幹細胞を利用して高効率で誘導多能性幹細胞を製造する方法を確立し、前記製造された誘導多能性幹細胞を心血管系細胞である内皮細胞、平滑筋細胞、および心筋細胞へ成功裏に分化させることにより本発明を完成した。

これにより、本発明らは、心臓内膜由来成体幹細胞を利用して誘導多能性幹細胞を製造する方法、およびこれにより製造された誘導多能性幹細胞を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記誘導多能性幹細胞から内皮細胞、平滑筋細胞、および心筋細胞を分化させる方法、およびこれにより分化した内皮細胞、平滑筋細胞、および心筋細胞を提供することを他の目的とする。

また、本発明は、前記分化方法へ分化した内皮細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞を有効成分として含む、心血管疾患治療用細胞治療剤を提供することをさらに他の目的とする。

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。

前記のような目的を達成するために、本発明は、下記の段階を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。
（ａ）心臓内膜由来成体幹細胞にＳＯＸ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）−ｂｏｘ ２）、ｃ−ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）、ＯＣＴ４（Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４）、およびＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）遺伝子を導入する段階；
（ｂ）前記遺伝子が導入された細胞をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地で８〜１２日間毎日交換しつつ培養して、上皮様細胞を得る段階；および
（ｃ）前記細胞をフィーダー細胞上に載置し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地で３〜７日間培養した後、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）培地に交換する段階。

本発明の一具現例において、前記心臓内膜由来成体幹細胞は、末梢血液から分離した末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）をＥＧＭ−２ＭＶ培地に懸濁してシーディングした後、５〜８日間毎日培地を交換しつつＴ細胞を除去して培養することにより収得されるものであってもよい。

本発明の他の具現例において、前記フィーダー細胞は、マウス由来胚性線維芽細胞株であってもよい。

本発明のさらに他の具現例において、前記ＥＳ培地は、ノックアウト血清代替剤（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびｂＦＧＦが処理されたＤＭＥＭ／ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）であってもよい。

また、本発明は、前記製造方法により製造された、誘導多能性幹細胞を提供する。

本発明の一具現例において、前記誘導多能性幹細胞は、次のような特性を示すことができる。
（ａ）ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ（Ｎａｎｏｇ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、およびＴＲＡ−１−８１に対して陽性の免疫学的特性を示す；
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで三胚葉への分化能を示す；および
（ｃ）付着して成長し、胚性幹細胞の形態学的特性と遺伝的特性を示す。

また、本発明は、下記の段階を含む、誘導多能性幹細胞から内皮細胞への分化方法を提供する。
（ａ）前記誘導多能性幹細胞にＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤を処理し、１〜３日間培養して中内胚葉細胞に分化させる段階；
（ｂ）前記中内胚葉細胞にＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）とＡｋｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ；ＰＫＢ）抑制剤を処理して中胚葉細胞に分化させた後、成長因子を処理し、毎日培地を交換しつつ７〜１０日間培養してＣＤ３４陽性細胞を得る段階；および
（ｃ）前記ＣＤ３４陽性細胞に前記成長因子を再処理し、毎日培地を交換しつつ１０〜２０日間継代培養する段階。

本発明の一具現例において、前記ＧＳＫ−３抑制剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（５−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）であってもよい。

本発明の他の具現例において、前記Ａｋｔ抑制剤は、ＰＤ９８０５９（２−（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）であってもよい。

本発明のさらに他の具現例において、前記成長因子は、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）およびｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）であってもよい。

また、本発明は、前記分化方法により分化した、内皮細胞を提供する。

また、本発明は、下記の段階を含む、誘導多能性幹細胞から平滑筋細胞への分化方法を提供する。
（ａ）前記誘導多能性幹細胞にＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤を処理し、１〜３日間培養して中内胚葉細胞に分化させる段階；
（ｂ）前記分化した中内胚葉細胞にＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）とＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３−ｋｉｎａｓｅ）抑制剤を処理し、１〜２日間培養する段階；および
（ｃ）前記培養された中内胚葉細胞に成長因子を処理し、１２〜１６日間継代培養する段階。

本発明の一具現例において、前記ＧＳＫ−３抑制剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（５−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）であってもよい。

本発明の他の具現例において、前記ＰＩ３Ｋ抑制剤は、ＬＹ２９４００２（２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−８−ｐｈｅｎｙｌ−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）であってもよい。

本発明のさらに他の具現例において、前記成長因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＢＢ）およびＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）であってもよい。

また、本発明は、前記分化方法により分化した、平滑筋細胞を提供する。

また、本発明は、下記の段階を含む、誘導多能性幹細胞から心筋細胞への分化方法を提供する。
（ａ）前記誘導多能性幹細胞をＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ビタミンＣ、アクチビンＡ、およびインスリンが除去されたＢ２７補充剤が含まれた培地で２０〜３０時間培養して中胚葉細胞に分化させる段階；
（ｂ）前記分化した中胚葉細胞をＢＭＰ４、成長因子、およびインスリンが除去されたＢ２７補充剤が添加された培地で２〜４日間培養する段階；および
（ｃ）前記培養された細胞をインスリンが除去されたＢ２７補充剤が含まれた培地で１〜２日間培養し、Ｗｎｔ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆａｍｉｌｙ）信号伝達抑制剤を添加して、１〜３日間培養した後、インスリンを含有するＢ２７補充剤が含まれた培地で追加培養する段階。

本発明の一具現例において、前記ＧＳＫ−３抑制剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（５−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）であってもよい。

本発明の他の具現例において、前記成長因子は、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）であってもよい。

本発明のさらに他の具現例において、前記Ｗｎｔ信号伝達抑制剤は、ＩＷＰ２（Ｎ−（６−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２−［（３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−４−ｏｘｏ−３−ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｔｈｉｏ］−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）であってもよい。

また、本発明は、前記分化方法により分化した、心筋細胞を提供する。

また、本発明は、前記分化した内皮細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞を有効成分として含む、心血管疾患治療用細胞治療剤を提供する。

本発明の一具現例において、前記心血管疾患は、狭心症、心筋梗塞、虚血性心臓疾患、高脂血症、脳卒中、動脈硬化、高血圧、不整脈、脳血管疾患、および冠状動脈疾患よりなる群から選択される疾患であってもよい。

また、本発明は、前記分化した内皮細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞を個体に投与する段階を含む、心血管疾患の予防または治療方法を提供する。

また、本発明は、前記分化した内皮細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞の心血管疾患の予防または治療用途を提供する。

本発明による誘導多能性幹細胞の製作のための初代培養細胞である心臓内膜由来成体幹細胞は、少量の末梢血液だけでも容易に分離および培養が可能であり、高い増殖力を有するので、遺伝的変移なしに保管することができ、細胞治療に使用され得る程度の細胞数を早く確保することができる。また、幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有していて、従来に使用した皮膚線維芽細胞より４種類の山中因子の形質導入を介した誘導多能性幹細胞の製作効率が高く、心内膜のオリジンを有するので、心血管系細胞のエピジェネティック記憶を有しているため、誘導多能性幹細胞を製作した後、高効率で内皮細胞、平滑筋細胞、および心筋細胞などの心血管系細胞に分化させることができる長所がある。したがって、前記誘導多能性幹細胞から分化した心血管系細胞は、心血管系疾患の治療剤開発のための治療物質のライブラリースクリーニングおよび心血管系疾患の治療のための機序研究に用いられ、また、直接細胞に操作を加え、増殖させて、患者にさらに注入することにより、細胞治療剤として利用するなど多様な分野に広く活用されるものと期待される。

図１ａは、ヒト血液から分離した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から山中因子（ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、およびＫＬＦ４）が形質導入された心臓内膜由来成体幹細胞（ＣｉＭＳ）を培養する過程を時間の流れによって絵で図示したものである。 図１ｂは、山中因子が形質導入されたＣｉＭＳをフィーダー細胞の上に載置した後、漸次的なＥＳ培地への交換が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の製作に効率的であることを示す結果である。 図１ｃは、寄贈者の末梢血液から分離して培養したＣｉＭＳ（左）、山中因子の形質導入８日後に形成されたコロニー（中央）、およびフィーダー細胞の上で培養中のＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）（右）の顕微鏡写真である。 図２ａは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）の未分化能を検証するためにアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色および免疫蛍光染色を用いて未分化マーカー遺伝子のタンパク質発現を確認した結果である。 図２ｂは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）の未分化能を検証するためにＲＴ−ＰＣＲを用いて未分化マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現水準を確認した結果である。 図２ｃは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）の未分化能を検証するためにマイクロアレイを用いて全体的な遺伝子発現パターンを比較分析した結果である。 図３ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）の三胚葉分化能を検証するために免疫蛍光染色を用いて三胚葉マーカー遺伝子のタンパク質発現を確認した結果である。 図３ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）の三胚葉分化能を検証するために未分化または分化したＣｉＭＳ−ｉＰＳＣで三胚葉マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現水準を比較分析した結果である。 図３ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏでＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）の奇形腫（ｔｅｒａｔｏｍａ）の形成を通じて生体内三胚葉分化能を確認した結果である。 図４ａは、ＣｉＭＳ、皮膚線維芽細胞、および２９３Ｔ細胞にＧＦＰを発現するレトロウイルスを形質導入させてその効率性を比較した結果である。 図４ｂは、ＣｉＭＳと皮膚線維芽細胞に山中因子を形質導入した後、９日目にアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色を行い、ｉＰＳＣの製作効率を比較した結果である。 図５は、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）のバンク構築過程を段階別に示したものである。 図６ａは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から内皮細胞への概略的な分化過程および分化プロトコルを絵で示したものである。 図６ｂは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から分化した内皮細胞と陽性対照群であるヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の形態を顕微鏡下で観察して比較した結果である。 図６ｃは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から分化した内皮細胞と陽性対照群であるヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の一酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）の濃度を測定して比較した結果である。 図６ｄは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から分化した内皮細胞で内皮細胞発現マーカーであるＰＥＣＡＭおよびＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現、マトリゲルチューブ形成、ＬＤＬ吸収能の結果を示したものである。 図７ａは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から平滑筋細胞への概略的な分化過程および分化プロトコルを絵で示したものである。 図７ｂは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から分化した平滑筋細胞で免疫蛍光染色を用いて平滑筋細胞マーカー（Ｃａｌｐｏｎｉｎ，ＳＭＡ）のタンパク質発現を確認した結果である。 図７ｃは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から分化した平滑筋細胞と陽性対照群であるヒト胃血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）でウェスタンブロッティングを用いて平滑筋細胞マーカー（Ｃａｌｐｏｎｉｎ，ＳＭＡ）のタンパク質発現水準を比較した結果である。 図７ｄは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から分化した平滑筋細胞と陽性対照群であるヒト胃血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）でＲＴ−ＰＣＲを用いて平滑筋細胞マーカー（Ｃａｌｐｏｎｉｎ、ＳＭＡ、ＳＭ２２α）のｍＲＮＡ発現水準を比較した結果である。 図８ａは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から心筋細胞への概略的な分化過程および分化プロトコルを描で図示したものである。 図８ｂは、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ）から心筋細胞に分化した拍動（ｂｅａｔｉｎｇ）胚様体の顕微鏡イメージを示したものである。

本発明は、末梢血液から分離した心臓内膜由来成体幹細胞を初代培養細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）として誘導多能性幹細胞を製造する方法と、前記方法で製造された誘導多能性幹細胞を心血管系細胞に分化させる方法、およびその用途に関する。

これにより、本発明は、下記の段階を含む誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。
（ａ）心臓内膜由来成体幹細胞にＳＯＸ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）−ｂｏｘ ２）、ｃ−ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）、ＯＣＴ４（Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４）、およびＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）遺伝子を導入する段階；
（ｂ）前記遺伝子が導入された細胞をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地で８〜１２日間毎日交換しつつ培養して、上皮様細胞を得る段階；および
（ｃ）前記細胞をフィーダー細胞上に載置し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地で３〜７日間培養した後、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）培地に交換する段階。

本発明で使用される用語「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、個体を構成する細胞や組織の根幹となる細胞であって、反復分裂して自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）することができ、環境によって特定の機能を有する細胞に分化できる多分化能力を有する細胞を意味する。胎児の発生過程中にすべての組織で生じ、成人になっても骨髄、上皮組織など細胞が活発に交替される一部の組織で発見される。幹細胞は、分化可能な細胞の種類によって受精卵が最初の分裂を始める時に形成される全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）と、この細胞が続いて分裂して作られた胚盤胞の内膜にある多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）と、成熟した組織と器官内に存在する複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）とに分類される。この際、複能性幹細胞は、この細胞が含まれている組織および器官に特異的な細胞にのみ分化できる細胞であって、胎児期、新生児期、および成体期の各組織および臓器の成長と発達はもちろん、成体組織の恒常性維持と組織損傷時に再生を誘導する機能に関与している。このような組織特異的複能性細胞を総称して成体幹細胞ともいう。

本発明で使用される用語「誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）」は、逆分化幹細胞であって、分化が終わった体細胞に細胞分化関連遺伝子を注入して分化以前の細胞段階に戻した、胚性幹細胞のように多能性を誘導した細胞を意味する。２００６年に京都大山中伸弥教授は、マウスの皮膚線維芽細胞にいくつかの遺伝子を導入して胚性幹細胞のように多能性を有する幹細胞を作り、２００７年に成人の皮膚細胞に遺伝子を導入して誘導多能性幹細胞を作るのに成功した。前記遺伝子は、山中因子とも呼ばれるＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、およびＫＬＦ４であり、本発明においても、心臓内膜由来成体幹細胞から誘導多能性幹細胞を製造するために前記４種類の遺伝子を導入した。

前記（ａ）段階の心臓内膜由来成体幹細胞は、末梢血液から分離した末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）をＥＧＭ−２ＭＶ培地に懸濁してシーディングした後、５〜８日間毎日培地を交換しつつＴ細胞を除去して培養することにより収得できる。本発明では、前記方法で収得された心臓内膜由来成体幹細胞をＣｉＭＳ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）と命名した。

本発明で使用される用語「末梢血液」とは、ヒトを含む哺乳動物で身体を漂う血液をいうもので、動脈、静脈、末梢血観などを利用して多様に抽出可能である。

本発明で使用される用語「末梢血液単核細胞」とは、末梢血液内に存在する単核の細胞であって、Ｂ細胞、Ｔ細胞、大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、樹枝状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）、自然殺害細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＮＫ ｃｅｌｌ）等の免疫細胞、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）のような顆粒球細胞（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）等を含む。前記末梢血液単核細胞は、通常の製造方法、例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを利用した比重遠沈法で分離することができるが、これに制限されるものではない。

本発明で使用される用語「遺伝子導入」は、遺伝子または遺伝子群を人為的に細胞に導入してその遺伝子群を発現させるか、またはその細胞のゲノムに他の遺伝子（群）を付加する操作を意味する。遺伝子導入は、リポソームナノ粒子またはカチオン性高分子のような非ウイルス性輸送体を利用する方法、ウイルス輸送体を利用する方法、または電気透過法のような物理的な方法を用いて行われることができ、より好ましくはウイルス輸送体を利用することができ、さらに好ましくはレトロウイルスを利用して遺伝子を導入することができるが、これらに制限されるものではない。レトロウイルスは、当業界に知られている通常の細胞を利用して通常の方法により製造することができる。本発明の一実施例では、山中因子と呼ばれる前記ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、およびＫＬＦ４遺伝子がそれぞれクローニングされたプラスミドとウイルスパッケージングベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることにより、前記４種類の遺伝子をそれぞれ発現するレトロウイルスを生産した。

本発明で使用される用語「フィーダー細胞（Ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓ）」とは、胚性幹細胞の未分化状態を維持するのに寄与する栄養因子などを分泌し、細胞接触で媒介される未分化維持機序と関連していると知られている。フィーダー細胞で分泌される信号伝達物質は、胚性幹細胞の未分化維持または分化開始を調節するのに寄与する。フィーダー細胞 から分泌される物質は、Ｗｎｔ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆａｍｉｌｙ）、ＢＭＰｓ（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）、細胞外基質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）等がある。マウスまたはヒト由来多様なフィーダー細胞を利用して胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞に分化させた報告がある。本発明では、フィーダー細胞としてマウス由来胚性線維芽細胞株を使用し、好ましくはＳＴＯ細胞であってもよいが、これに制限されるものではない。

前記（ｃ）段階でＥＳ培地は、ＤＭＥＭ／ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）培地であってもよく、好ましくはＤＭＥＭ／ｆ１２培地にノックアウト血清代替剤（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸２−メルカプトエタノール、ペニシリンとストレプトマイシン、およびｂＦＧＦを添加して使用できるが、これらに制限されるものではない。

本発明の一実施例では、前記方法により心臓内膜由来成体幹細胞にＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、およびＫＬＦ４遺伝子を導入し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地を毎日交換しつつ培養した結果、約２日目から上皮様細胞に形態が変化し、８〜１２日間にコロニーを形成した。前記形成されたコロニーをフィーダー細胞上に載置して培養した結果、遺伝子の導入後に約１５日目から誘導多能性幹細胞コロニーが形成され始め、コロニーが形成された後、ＥＳ培地に次第に交替して培養した結果、安定化した誘導多能性幹細胞を収得した（実施例２−２参照）。

本発明の他の実施例では、前記誘導多能性幹細胞の特性を確認するために観察した結果、付着して成長し、胚性幹細胞の形態学的特性と遺伝的特性を有していることを確認した。これに加えて、未分化能を検証した結果、ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ（Ｎａｎｏｇ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、およびＴＲＡ−１−８１等の未分化遺伝子がｍＲＮＡおよびタンパク質水準で発現されることを確認し、胚性幹細胞と非常に類似した遺伝子発現パターンを示した（実施例３参照）。また、前記誘導多能性幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで三胚葉へ分化できる能力があることを確認した（実施例４参照）。

本発明のさらに他の実施例では、心臓内膜由来成体幹細胞を利用した誘導多能性幹細胞の製作効率性を検証した結果、心臓内膜由来成体幹細胞は、従来、誘導多能性幹細胞の製作に利用される皮膚線維芽細胞および遺伝子導入効率が高い２９３Ｔ細胞と比較してウイルスの形質導入効率がさらに高く、ＡＬＰ染色を用いて心臓内膜由来成体幹細胞を利用した場合、皮膚線維芽細胞よりさらに高い効率で誘導多能性幹細胞が製造されたことを確認した（実施例５参照）。

本発明者らは、前記方法で心臓内膜由来成体幹細胞から製造された誘導多能性幹細胞を初代培養細胞のようなオリジンを有する心血管系細胞に分化させるために、内皮細胞、平滑筋細胞、および心筋細胞に高効率で分化させることができる方法を確立し、その効率を確認した。

これにより、本発明は、下記の段階を含む誘導多能性幹細胞から内皮細胞への分化方法を提供する。
（ａ）心臓内膜由来成体幹細胞から製造された誘導多能性幹細胞にＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤を処理し、１〜３日間培養して中内胚葉細胞に分化させる段階；
（ｂ）前記中内胚葉細胞にＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）とＡｋｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ；ＰＫＢ）抑制剤を処理して中胚葉細胞に分化させた後、成長因子を処理し、毎日培地を交換しつつ７〜１０日間培養して、ＣＤ３４陽性細胞を得る段階；および
（ｃ）前記ＣＤ３４陽性細胞に前記成長因子を再処理し、毎日培地を交換しつつ１０〜２０日間継代培養する段階。

前記（ａ）段階のＧＳＫ−３抑制剤は、逆分化効率を増加させるために、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（５−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）を利用することができ、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１をＢ２７が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地に希釈して処理することができるが、これに制限されない。また、前記分化した中内胚葉細胞は、好ましくはＢｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔ陽性細胞であってもよい。

前記（ｂ）段階のＡｋｔ抑制剤は、好ましくはＰＤ９８０５９（２−（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）であってもよく、前記成長因子は、好ましくはＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）およびｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）であってもよく、成長因子の処理は、ＣＤ３４陽性細胞数が増加できるように適宜調節することができるが、好ましくは７〜１０日、さらに好ましくは７〜８日であってもよい。

前記（ｃ）段階前に、ＣＤ３４陽性細胞のみを分離する過程をさらに含むことができる。前記過程は、ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）、ＩｓｏＲａｆｔ、およびＤＥＰＡｒｒａｙよりなる群から選択される方法を用いて行われ得、好ましくはＭＡＣＳ方法を用いて行われ得るが、ＣＤ３４陽性細胞のみを分離できる方法であれば、通常の方法で当業者が適宜選択して行うことができる。

前記（ｃ）段階でＣＤ３４陽性細胞は、より具体的に、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦが再処理されたＥＧＭ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ）培地に浮遊させてマトリゲルがコートされたプレートに接種して培養され得、内皮前駆細胞に分化すると、毎日培地を交換しつつ１０〜２０日、より好ましくは１０〜１５日間継代培養することにより、成熟した内皮細胞を収得することができる。

本発明のさらに他の実施例では、前記方法により心臓内膜由来成体幹細胞で製造された誘導多能性幹細胞から分化した内皮細胞を収得し、前記内皮細胞は、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣ）と比較した時、形態および総一酸化窒素の量が類似しており、内皮細胞発現マーカーであるＰＥＣＡＭおよびＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎを発現し、マトリゲルチューブ形成法および低密度脂質タンパク質（ＬＤＬ）吸収能を用いて内皮細胞に分化したことを確認した（実施例７−１および７−２参照）。

また、本発明は、下記の段階を含む誘導多能性幹細胞から平滑筋細胞への分化方法を提供する。
（ａ）心臓内膜由来成体幹細胞から製造された誘導多能性幹細胞にＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤を処理し、１〜３日間培養して中内胚葉細胞に分化させる段階；
（ｂ）前記分化した中内胚葉細胞にＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）とＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３−ｋｉｎａｓｅ）抑制剤を処理し、１〜２日間培養する段階；および
（ｃ）前記培養された中内胚葉細胞に成長因子を処理し、１２〜１６日間継代培養する段階。

前記誘導多能性幹細胞から中内胚葉細胞に分化させる（ａ）段階は、前記内皮細胞への分化方法と同一に行われ得、前記中内胚葉細胞は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔ陽性細胞であってもよい。

前記（ｂ）段階で前記ＰＩ３Ｋ抑制剤は、好ましくはＬＹ２９４００２（２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−８−ｐｈｅｎｙｌ−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）であってもよいが、これに制限されない。

前記（ｃ）段階で成長因子は、好ましくはＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＢＢ）およびＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）であってもよく、成長因子の処理後、分化した平滑筋前駆細胞をｔｙｐｅIIコラーゲンがコートされているティシュィで接種し、１２〜１６日、より好ましくは１４〜１６日間継代培養することにより、成熟した平滑筋細胞を収得することができる。

本発明のさらに他の実施例では、前記方法により心臓内膜由来成体幹細胞で製造された誘導多能性幹細胞から分化した平滑筋細胞を収得し、陽性対照群であるヒト胃血管平滑筋細胞（ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ；ｈＶＳＭＣ）と比較した時、免疫蛍光染色とウェスタンブロッティングを用いて平滑筋細胞マーカー遺伝子発現を検証した結果、ＣＮＮ１（ｃａｌｐｏｎｉｎ）およびＳＭＡタンパク質が陽性対照群細胞とほとんど類似した水準で発現され、ＲＴ−ＰＣＲを用いて前記マーカー遺伝子およびＳＭ２２α遺伝子ｍＲＮＡの発現を確認した（実施例７−３参照）。

また、本発明は、下記の段階を含む誘導多能性幹細胞から心筋細胞への分化方法を提供する。
（ａ）心臓内膜由来成体幹細胞から製造された誘導多能性幹細胞をＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ビタミンＣ、アクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）、およびインスリンが除去されたＢ２７補充剤が含まれた培地で２０〜３０時間培養して、中胚葉細胞に分化させる段階；
（ｂ）前記分化した中胚葉細胞をＢＭＰ４、成長因子、およびインスリンが除去されたＢ２７補充剤が添加された培地で２〜４日間培養する段階；および
（ｃ）前記培養された細胞をインスリンが除去されたＢ２７補充剤が含まれた培地で１〜２日間培養し、Ｗｎｔ信号伝達抑制剤を添加して、１〜３日間培養した後、インスリンを含有するＢ２７補充剤が含まれた培地で追加培養する段階。

前記（ａ）段階で誘導多能性幹細胞は、胚様体形態に進行され得る。前記誘導多能性幹細胞をディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）を利用してフィーダー細胞から剥離した後、インスリンが除去されたＢ２７補充剤とＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ビタミンＣ、およびアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地（１次培地）で２０〜３０時間、より好ましくは２４時間培養して、中胚葉細胞に分化させることができる。

前記ＧＳＫ−３抑制剤は、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１であっもよいが、これに制限されるものではない。

前記（ａ）段階により分化した中胚葉細胞は、インスリンが除去されたＢ２７補充剤、濃度を低減したＢＭＰ４、および成長因子が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（２次培地）で２〜４日、好ましくは３日間培養して、心筋前駆細胞に分化を誘導することができる。前記成長因子は、好ましくはＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）であってもよいが、これに制限されない。

前記（ｂ）段階により培養された細胞は、（ｃ）段階でインスリンが除去されたＢ２７補充剤が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地（３次培地）で洗浄し、１〜２日、好ましくは１日間培養し、Ｗｎｔ信号伝達抑制剤を添加して、１〜３日、好ましくは２日間培養した後、インスリンを含有するＢ２７補充剤が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地（４次培地）に交換し、追加培養して、拍動（ｂｅａｔｉｎｇ）心筋細胞を収得することができる。

前記（ｃ）段階のＷｎｔ信号伝達抑制剤は、好ましくはＩＷＰ２（Ｎ−（６−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２−［（３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−４−ｏｘｏ−３−ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｔｈｉｏ］−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）であってもよいが、これに制限されない。

本発明のさらに他の実施例では、前記方法により心臓内膜由来成体幹細胞で製造された誘導多能性幹細胞から分化した心筋細胞を収得し、顕微鏡観察結果、拍動（ｂｅａｔｉｎｇ）胚様体を確認した（実施例７−４参照）。

本発明の他の様態として、本発明は、前記方法で分化した内皮細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞を有効成分として含む心血管疾患治療用細胞治療剤を提供する。

前記心血管疾患は、狭心症、心筋梗塞、虚血性心臓疾患、高脂血症、脳卒中、動脈硬化、高血圧、不整脈、脳血管疾患、および冠状動脈疾患から選択される疾患であってもよいが、これに制限されない。

以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

実施例１．末梢血液を利用したＣｉＭＳ培養
ヒト血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを利用して末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）を分離し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に懸濁した後、１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンがコートされた６ウェルプレートにＰＢＭＣをウェル当たり４×１０^６個／ｍｌとなるように分株し、５％のＣＯ_２インキュベータで培養した。翌日、プレートを複数回強く振とうして、浮遊細胞を強い吸入（ｓｕｃｔｉｏｎ）を通じて除去した後、新しい培地に交替し、培養することを７日間繰り返し、７日後には２日に１回培地を交替した。その結果、５〜８日間に心臓内膜由来成体幹細胞であるＣｉＭＳ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の出現を確認することができ、２週内にＣｉＭＳがコロニーを形成しつつ増殖した。このコロニーを０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡを利用して継代培養するか、１０％のＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）が含まれているＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）ストック培地に懸濁して、イソプロパノールフリージングコンテナ（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）に入れて、−７０℃で２４時間放置した後、−１９０℃で凍結保管した。

実施例２．ＣｉＭＳを利用した誘導多能性幹細胞の製作
２−１．レトロウイルスの製作
山中因子と呼ばれる４種類の遺伝子、すなわちＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、およびＫＬＦ４をそれぞれ発現するレトロウイルスを製作して、誘導多能性幹細胞の製作に利用しようとした。

このために、２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳと抗生剤が含まれた高グルコースＤＭＥＭ培地で培養容器面積の９０％となるまで培養した。一方、１．５ｍｌのｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにｂａｓａｌ ＤＭＥＭ培地を８００μＬずつ分株し、これに、準備した前記４種類の遺伝子のうち一つがクローニングされたプラスミドとパッケージングベクター（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）、すなわちｐＶＳＶ−Ｇ、ｐＧａｇ−Ｐｏｌを各プラスミド当たり１０μｇずつ入れ混ぜて、１ｍｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ストックを６０μＬずつ添加してよく混ぜた後、室温で３０分間放置した。その間、トランスフェクション効率を高めるために、２９３Ｔ細胞をｂａｓａｌ ＤＭＥＭ培地５ｍｌで２回洗浄し、抗生剤が含まれていない高グルコースＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳを含む）１０ｍｌを入れて、抗生剤が除去された状態で３７℃インキュベータに保管した。プラスミドＤＮＡ−ＰＥＩ混合液を製造し、３０分後に抗生剤が除去された２９３Ｔ細胞を取り出し、４種類の遺伝子別にそれぞれのプラスミドＤＮＡ−ＰＥＩ混合液をピペットで軽く１回混ぜた後、２９３Ｔ細胞の上に滴下して、トランスフェクションさせた。１８時間後、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞をインキュベータから取り出して、３７℃に温めたｂａｓａｌ ＤＭＥＭ培地５ｍｌで２回洗浄し、余分のプラスミドＤＮＡ−ＰＥＩ混合液を除去し、１０％ＦＢＳと抗生剤が含まれた１０ｍｌの高グルコースＤＭＥＭを新しく入れた後、３７℃の培養器で培養し、この際、細胞が落下しいないように注意した。４８時間後、生産されたレトロウイルスを回収するために、２９３Ｔ細胞の培地のみを１５ｍｌのチューブに集めて２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、底に沈殿した落下細胞と残渣が含まれないように上清液のみを回収した後、０．２２μｍのフィルターでろ過し、４℃で１時間３０分間２５０００ｒｐｍで超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｉｆｕｇｅ）を行い、上清液に含まれているレトロウイルスを濃縮させた。ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）状態に沈んだ４種類のそれぞれの遺伝子を発現するレトロウイルスは、ＥＢＭ−２培地１００μＬに再懸濁させて、−７０℃で使用前まで保管した。

実施例２−２．ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞の製作および培養
実施例２−１で製作したレトロウイルスを処理する一日前に、実施例１の方法により得られたＣｉＭＳ細胞を０．０５％トリプシンを処理して培養容器から剥ぎ取り、６ウェルプレートにウェル当たり５×１０^５個ずつ分株した後、翌日２ｍＬの培地に交替した。培地交換４時間後、実施例２−１で製作したレトロウイルスとポリブレンを１０μｇ／ｍＬの濃度となるように処理し、３７℃で１８時間以上形質導入を進めた。その後、新しいＥＧＭ−２ＭＶ培地に交換し、毎日培地を交換しつつ観察した。

その結果、形質導入後に約２日目から徐々にＣｉＭＳ細胞が上皮様細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ）に形態が変化することが見られ、８〜１２日間にコロニーを形成することを確認した。このコロニーを顕微鏡で見ながら、チップで取ってミトマイシンＣが処理された新しいフィーダー細胞上に載置したり、形質導入されたＣｉＭＳ細胞全体を０．０５％トリプシンで剥ぎ取って、ウェル当たり５×１０^４個ずつフィーダー細胞上に載置して培養を継続した。培地は、上皮様細胞がコロニーをさらに生成するまでＥＧＭ−２ＭＶ培地に毎日交換した。ＰＢＭＣからＣｉＭＳを得、ＣｉＭＳコロニーをフィーダー細胞上に載置して培養するまでの時間的流れを図１ａに絵で示した。

一方、フィーダー細胞は、４種類の遺伝子が形質導入された細胞を載置する一日前に準備した。このために、マウス由来胚性線維芽細胞株（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＳＴＯ細胞にミトマイシンＣを１０μｇ／ｍｌの濃度となるように処理し、２時間３０分後にＳＴＯ細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、０．０５％トリプシンを処理して培養容器から剥ぎ取った。剥ぎ取った細胞を４℃で５分間９００ｒｐｍで遠心分離した後、０．１％ゼラチンがコートされている６ウェルプレートにウェル当たり２．６×１０^５個の細胞を分株して準備した。フィーダー細胞の上に４種類の遺伝子が導入されたＣｉＭＳ細胞を載置する前に、ＥＢＭ−２培地で洗浄し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地に交換した。

図１ｂに示したように、フィーダー細胞の上に載置した４種類の遺伝子が形質導入されたＣｉＭＳ細胞が集まって上皮様細胞コロニーを形成すると、ＥＳ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）培地とＥＧＭ−２ＭＶ培地を１：１で混ぜて交換した。翌日は、１．５：０．５でＥＳ培地の量を増やしながら徐々にＥＳ培地に適応させた。ＥＳ培地の組成は、ＤＭＥＭ／ｆ１２培地を基盤として２０％ノックアウト血清代替剤、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×１０^−４Ｍの非必須アミノ酸、１×１０^−４Ｍの２−メルカプトエタノール、および５０ｕｎｉｔｓと５０ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンで構成されており、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を添加して使用した。

フィーダー細胞上に載置した４種類の遺伝子が形質導入されたＣｉＭＳコロニーをＥＳ培地に毎日交換すると、形質導入その後、早くには１５日目からＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞（以下、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣという）コロニーが現れ始めた。適当にサイズが大きくなったＣｉＭＳ−ｉＰＳＣコロニーは、顕微鏡を見ながら剥ぎ取った後、ミトマイシンＣが処理された新しいＳＴＯ細胞上に載置し、１ｍｌのピペットでピペッティングして、コロニーを適当なサイズに分解した。継代する初日には、培地にＲＯＣＫ抑制剤であるＹ−２７６３２（ｔｒａｎｓ−４−［（１Ｒ）−１−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ］−Ｎ−４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を１０μＭの濃度となるように添加して、コロニーの付着効率を高めた。前記方法でＣｉＭＳ−ｉＰＳＣコロニーが安定化するまで続いて継代培養すると、図１ｃの顕微鏡写真のように安定化したＣｉＭＳ−ｉＰＳＣコロニーを取得することができる。

実施例２−３．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの凍結ストックの製作
ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣラインが確立されると、多様な継代回数（ｐａｓｓａｇｅ）別に凍結ストックを製作した。このためには、６ウェルプレートの３個のウェル（３０個のコロニー以上／ｗｅｌｌ）以上のコロニーを確保して進めることが、以後に凍結ストックを融解した時の効率が良かった。凍結ストックを製作するために、ｂＦＧＦが含まれていないＥＳ培地に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）を混ぜ、０．２２μｍのフィルターでろ過して、ディスパーゼ溶液を作った。その後、培養中のＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ細胞から培地を除去し、ディスパーゼ溶液を１ｍｌずつ入れた。３７℃培養器で３０分〜１時間培養して、コロニーがフィーダー細胞から落下して浮遊すると、コロニーがこわれないように、ＥＳ培地１ｍｌで扱いて１５ｍｌチューブに集めた。追加に、ＥＳ培地を添加して残っているＣｉＭＳ−ｉＰＳＣコロニーを扱いて全部集めた後、室温で３００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清液を除去し、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣペレットを室温に冷却しておいたｍＦｒｅＳＲＴＭ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１ｍｌでコロニーが最大限こわれないように浮遊させて、ストック用チューブ（ｃｒｙｏｖｉａｌ）に入れた。細胞を入れたチューブは、イソプロパノールを入れたフリージングコンテナに移して、一晩中−７０℃で保管した後、翌日に液体窒素をタンク（ＬＮ_２ ｔａｎｋ）に移して長期保管した。

実施例３．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの未分化能の検証
３−１．未分化マーカー遺伝子のタンパク質発現の確認
前記実施例１および２の方法により製作されたＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの未分化能を検証するために、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色を行い、免疫蛍光染色を用いて未分化マーカーであるＯｃｔ４，Ｎａｎｏｇ，およびＴｒａ−１−８１遺伝子のタンパク質発現を確認しようとした。

ＡＬＰ染色のために、ＤＡＫＯ社のＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍを利用して染色を進めた。具体的に、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣを培養したティシュィをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに希釈させた１％パラホルムアルデヒド溶液２ｍｌをティシュィに入れ、室温で１０分間放置して、細胞を固定させた。その後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍを細胞が覆われるように落とした後、遮光して、室温でロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）の上で乾かないように３０分間混ぜて反応させた。

次に、免疫蛍光染色を行うために、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣを培養したティシュィをＰＢＳで２回洗浄し、−２０℃に保管した冷たい１００％メタノールを１ｍｌティシュィに添加した後、直ちに−２０℃に細胞を移して、１０分間放置して、細胞を固定させた。１０分後、細胞を取り出してメタノールを捨て、０．０５％ＴＢＳ−Ｔ（１ＸＴＢＳ：Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０）で５分ずつ３回洗浄した後、染色しようとする部位にＤａｋｏ ｐｅｎで丸く表示をした。その後、１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をＰＢＳに溶かし、０．２２μｍフィルターでろ過して、準備したブロッキング溶液を細胞が乾かないように表示した部分に覆った後、室温で３０分間ブロッキング過程を実施した。次に、未分化マーカーであるＯｃｔ４、ｎａｎｏｇ、Ｔｒａ−１−８１に対する１次抗体を希釈額に１：１００で希釈して、１次抗体溶液を製造した後、ブロッキング溶液を除去して１次抗体溶液を処理した後、４℃で一晩中反応させた。翌日、０．０５％ＴＢＳ−Ｔで１０分ずつ３回洗浄した後、細胞が乾かないように、それぞれの抗体に相当する２次抗体溶液（１：１００）を製作して、それぞれの細胞に処理した後、室温で遮光して２時間反応させた。その後、さらに０．０５％ＴＢＳ−Ｔで室温で１０分間３回洗浄した後、核染色のために１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）溶液を１：１０００となるように希釈液に混ぜた後、細胞に入れ、遮光して、室温で１０分間反応させた。蛍光顕微鏡でＤＡＰＩが核に染色されたことを確認し、０．０５％ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、カバースリップを利用してｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社）にマウントした。

光学顕微鏡で観察した結果、図２ａに示したように、ＡＬＰ染色を行った場合、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣが濃い紫色で染色されたことを確認し、免疫蛍光染色結果、緑色蛍光を通じてＣｉＭＳ−ｉＰＳＣコロニー細胞核でＯｃｔ４とＮａｎｏｇが発現され、Ｔｒａ−１−８１が細胞膜で発現されることを確認した。

３−２．未分化マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現の確認
ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣでより多様な未分化遺伝子の発現を確認するために、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびマイクロアレイを行った。

ＲＴ−ＰＣＲを行うために、４種類のＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ（ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ１、２、３および４）と胚性幹細胞、初代培養細胞であるＣｉＭＳからＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲを行い、細胞内Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｎｏｄａｌ、ＲＥＸ１、ＤＮＭＴ、ＥＣＡＴ４、ＥＣＡＴ１５、ＦＧＦ４、ＧＡＢＲ３、ＧＡＬ、ＧＤＦ３、ＰＨ３４、ＴＤＧＦ１、およびＵＴＦ１遺伝子のｍＲＮＡ発現水準を観察した。

その結果、図２ｂに示したように、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣは、胚性幹細胞（ＥＳ）とほぼ同一に未分化遺伝子を高い水準で発現したが、初代培養細胞であるＣｉＭＳでは、前記遺伝子がほとんど発現されないことを確認した。

次に、３種類のＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ （ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ１、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ２およびＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ３）、３種類の胚性幹細胞（ＥＳ１、ＥＳ２およびＥＳ３）、および初代培養細胞である３種類のＣｉＭＳ（ＣｉＭＳ１、ＣｉＭＳ２およびＣｉＭＳ３）からそれぞれＲＮＡを抽出した後、マイクロアレイを行い、全体的な遺伝子発現パターンを比較分析した。

その結果、図２ｃに示したように、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣは、胚性幹細胞（ＥＳ）と同一ではないが、ほぼ類似した遺伝子発現パターンを示したが、初代培養細胞であるＣｉＭＳは、前記二つの細胞と相反した遺伝子発現パターンを示すことを確認した。

実施例４．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの三胚葉分化能の検証
胚性幹細胞のような未分化細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏで内胚葉、中胚葉、外胚葉の三つの胚葉（ｔｈｒｅｅ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）を構成する細胞に分化が可能であり、特にｉｎ ｖｉｖｏでは、奇形腫（ｔｅｒａｔｏｍａ）を形成できる能力がある。したがって、実施例１および２を通じて製作されたＣｉＭＳ−ｉＰＳＣが三胚葉への分化能を有するかについて確認しようとした。

４−１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣｉＭＳ − ｉＰＳＣの三胚葉分化能の確認
Ｉｎ ｖｉｔｒｏで三胚葉分化能を確認するために、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣを０．５Ｕ／ｍｌのディスパーゼを利用して胚様体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｄｙ；ＥＢ）に作り、ｂＦＧＦが含まれていないＥＳ培地で長期間維持しつつ、自発的な分化を誘導した。胚様体に培養中の細胞は、浮遊状態で一週間培養し、０．５％ゼラチンがコートされたティシュィに付着させて、２週間さらに培養した後、免疫蛍光染色法を行い、内胚葉マーカーであるＡＦＰ（Ａｌｐｈａ−ＦｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎ）、中胚葉マーカーであるα−ＳＡ（α−ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ ａｃｔｉｎ）とＳＭＡ（Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）、および外胚葉マーカーであるＮｅｓｔｉｎ、ＧＦＡＰ（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、β−III ｔｕｂｕｌｉｎの発現の有無を共焦点顕微鏡で観察した。

その結果、図３ａに示したように、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣで前記内胚葉、中胚葉、および外胚葉マーカーがすべて発現していることを確認した。前記結果より、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞が胚性幹細胞と同様に三種類の胚葉の細胞への分化が可能な全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有していることが分かった。

これに加えて、前記と同じ方法でＣｉＭＳ−ｉＰＳＣ細胞を準備し、三種類の胚葉へ分化させる培養条件下で分化（Ｄ）と未分化状態（Ｕ）のＣｉＭＳ−ｉＰＳＣからＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲを用いて各胚葉別分化マーカー（内胚葉：ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、中胚葉：ＴｎＴｃ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔ、外胚葉：ＢＭＰ４、Ｎｃａｍ１）の発現量を観察した。

その結果、図３ｂに示したように、分化したＣｉＭＳ−ｉＰＳＣで各胚葉別分化マーカーが発現されることを確認することにより、遺伝的発現を通じて三胚葉への分化能があることが分かった。

４−２．Ｉｎ ｖｉｖｏでＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの三胚葉分化能の確認
Ｉｎ ｖｉｖｏで奇形腫（ｔｅｒａｔｏｍａ）の形成実験を行うために、０．５Ｕ／ｍｌのディスパーゼを処理してＣｉＭＳ−ｉＰＳＣをフィーダー細胞から剥ぎ取り、１５ｍｌチューブに回収した後、遠心分離して、ペレットを得た。前記ペレットを氷の上でマトリゲルと混ぜた後、マトリゲル−ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの左右側腹の腹腔に注入し、１２週以上観察した。奇形腫が一定サイズ以上に成長すると、マウスから奇形腫を剥ぎ取って、適当なサイズに切断し、４％パラホルムアルデヒドに浸漬して固定させた後、パラフィンブロックを作って、組織スライド切片にカットした。カットされた組織切片は、１００％キシレンに１０分ずつ２回浸漬してパラフィンを溶かし、１００％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノールに順に５分ずつ浸漬し、最後に水で洗浄した。パラフィンが除去された組織スライドは、Ｈ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｒｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ）染色を進めて、顕微鏡下で観察した。

その結果、図３ｃに示したように、形態学的差異によって三種類の胚葉から分化して生成された様々な組織を観察した。

前記結果より、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏで三胚葉へ分化できる能力があることが分かった。

実施例５．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの製作効率の比較
前記実施例１および２の方法により製作されたＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの製作効率を比較するために、実施例２−１の方法によりＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現するレトロウイルスを製作した後、ＣｉＭＳ、皮膚線維芽細胞、および２９３Ｔ細胞へのウイルス形質導入効率を比較した。

その結果、ＣｉＭＳでは、１３．３×１０^３ＴＵ／μＬ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｎｉｔｓ／μＬ）のウイルス力価を示すのに対し、皮膚線維芽細胞は、８．３×１０^３ＴＵ／μＬ、形質導入が良好に行われる細胞と知られている２９３Ｔ細胞は、１１．３×１０^３ＴＵ／μＬの力価を示した。このような結果は、図４ａに示したように、ＧＦＰを発現するレトロウイルスの形質導入効率性の差異（ＣｉＭＳ：９３．８％、皮膚線維芽細胞：４９．４％、２９３Ｔ細胞：７６．４％）をもたらした。

また、図４ｂに示したように、ＣｉＭＳと皮膚線維芽細胞に山中因子を形質導入させた後、ＡＬＰ染色を実施した結果、ＣｉＭＳの場合、ＡＬＰ陽性コロニーが６６％であり、皮膚線維芽細胞の場合である４４％に比べて１．５倍増加した比率を示した。前記結果より、山中因子を発現するレトロウイルスを使用して誘導多能性幹細胞を製作する時に広く使用される初代培養細胞である皮膚線維芽細胞に比べてＣｉＭＳが１．５倍さらに高い効率でｉＰＳＣを製作することができることが分かった。

実施例６．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣバンクの製作
前記実施例１および２の方法により製作したＣｉＭＳ−ｉＰＳＣバンクを製作するために、図５に示した過程を通じてヒト由来誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）バンクを自体的に構築することができた。

具体的に、０歳（臍帯血）から７７歳の健康な志願者および心筋症、心臓移植患者、異型狭心症患者などの心血管系疾患を有する患者の血液からＣｉＭＳを分離して、ＣｉＭＳ由来ｉＰＳＣを主に製作し、皮膚線維芽細胞を利用して作ったルーゲリック病（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、球脊髄性筋萎縮症（Ｋｅｎｎｅｄｅｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）患者のｉＰＳＣや、尿から取得した細胞で作ったｉＰＳＣ、脱毛（Ａｌｏｐｅｃｉａ）患者の毛乳頭細胞（Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌ）を利用して製作したｉＰＳＣなども、ＣｉＭＳ由来ｉＰＳＣとの製作効率比較のために製作して保存するなど、約５５個株のＣｉＭＳ由来ｉＰＳＣ株で構成した。

ＣｉＭＳ由来ｉＰＳＣの製作効率には、血液を提供する志願者の年齢、性別が影響を及ぼさなかった。このように保管中のＣｉＭＳ−ｉＰＳＣは、心血管疾患の機序研究および患者オーダーメード型細胞に分化させて疾患モデルとして使用して新薬スクリーニングに使用されるなどの多くの応用可能性がある。

実施例７．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣを利用した心血管系細胞への分化
７−１．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣから中内胚葉細胞への分化
６ウェルプレートのウェル当たり１ｍｇの濃度となるように、マトリゲルをノックアウト血清代替剤（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）とｂＦＧＦが含まれていないＥＳ培地に希釈してプレートをコートした後、３０分間３７℃インキュベータに入れた。３０分後、マトリゲル溶液を除去し、前記と同じＥＳ培地で１回プレートを洗浄した。一方、ｍＴｅＳＲＴＭ１（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１ｍｌを適当なサイズで切断して剥ぎ取ったＣｉＭＳ−ｉＰＳＣと混ぜ、新しい１ｍのｍＴｅＳＲＴＭ１に１０μＭのＲＯＣＫ抑制剤であるＹ２７６３２を添加した後、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣと混合して、先立ってマトリゲルがコートされた６ウェルプレートに接種した。フィーダー細胞がない条件でｍＴｅＳＲＴＭ１培地を利用して７日間毎日交替しつつ、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣを培養した。７日目にｍＴｅＳＲＴＭ１培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）ｃｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに５００μＬずつ入れ、３７℃で５分間放置して、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣを単細胞状態となるようにした。その後、１０μＭのＹ２７６３２が含まれた１ｍｌのｍＴｅＳＲ１をウェルに入れ、１５ｍｌのチューブで細胞を全部回収した後、培地でチューブを満たして、３００×ｇで３分間遠心分離した後、上清液を除去した。単細胞ペレットは、１０μＭのＹ２７６３２が含まれた１ｍｌのｍＴｅＳＲ１で溶かし、１０μＬを取って細胞数を測定した。その後、マトリゲルがあらかじめコートされているプレートにウェル当たり１．５×１０^５〜２×１０^５個ずつ細胞を接種した。

翌日、中内胚葉細胞（Ｍｅｓｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）への分化のために１０μＭ濃度のＣＨＩＲ９９０２１を、Ｂ２７が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地に希釈して細胞に処理し、２日間培養した。その結果、７５．５１％の効率でＢｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔを発現する細胞（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ Ｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）へ分化したことを確認した。

その後、前記方法により約７５％の高効率で分化した中内胚葉細胞から順次に内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞の三種類の条件で分化を進めた。しかし、分化が終わった直後の細胞は、前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ｐＥＣ、ｐＶＳＭＣ、ｐＣＭＣ）の形質を有しているので、この細胞を成熟させる一連の段階を経て、最終的に分化した心血管系細胞（Ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ：ａＥＣ、ａＶＳＭＣ、ａＣＭＣ）を確保することができた。

実施例７−２．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの内皮細胞への分化確認
前記実施例７−１の方法で分化させた中内胚葉細胞から内皮細胞に分化させるために、図６ａに示した絵および分化プロトコルによって分化した前記中内胚葉細胞に２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４と１０μＭのＡｋｔ抑制剤であるＰＤ９８０５９を２日間処理して、中胚葉細胞に分化されるようにした。その後、細胞に１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを７〜１０日間毎日培地を交替しつつ、処理期間を調節して、ＣＤ３４を発現する細胞の数が増加するようにした。その後、ＣＤ３４を発現する細胞のみを均一に取得するために、ＣＤ３４ ＭＡＣＳを行った。具体的に、培養中の細胞の上清液を除去した後、ＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを処理して剥ぎ取った細胞を集めて、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットをＰＢＳと０．１％ＦＢＳが含まれたＭＡＣＳ洗浄溶液５００μＬで溶かした後、ＣＤ３４ ＭＡＣＳ抗体（Ｍｉｌｌｔａｒｙ）を５０μＬ添加して４℃で３０分間反応させた。３０分後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＭＡＣＳ ＬＳカラムを通過する過程を進めて、ＣＤ３４陽性細胞のみを取得した。ＣＤ３４陽性細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたＥＧＭ培地に浮遊させて、マトリゲルがコートされているプレートに接種して内皮前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ＥＣ；ｐＥＣ）を得た。その後、前記ＥＧＭ培地を毎日交換しつつ、継代培養して、成熟内皮細胞（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ＥＣ；ａＥＣ）へ分化するようにした。その後、分化した細胞は、陽性対照群であるヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣ）との比較を通じて内皮細胞の機能と形態を検証しようとした。

顕微鏡にて観察した結果、図６ｂに示したように、分化した内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ＨＵＶＥＣと形態が非常に類似していることを観察し、図６ｃのトータル一酸化窒素（ｔｏｔａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）の量も、ＨＵＶＥＣとほぼ類似した水準であることを確認した。また、図６ｄに示したように、分化した内皮細胞で内皮細胞発現マーカーであるＰＥＣＡＭ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）とＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎが発現することを観察し、マトリゲルチューブ形成（ｍａｔｒｉｇｅｌ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）法と低密度脂質タンパク質（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ）吸収能もまた確認した。

前記結果より、ＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞から内皮細胞への分化が高効率で行われたことが分かった。

実施例７−３．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの平滑筋細胞への分化確認
平滑筋細胞への分化は、前記実施例７−２の内皮細胞分化方法と同一に実施例７−１の方法でＣｉＭＳ−ｉＰＳＣから分化させた中内胚葉細胞を利用した。図７ａに示した絵および平滑筋細胞分化プロトコルによって前記中内胚葉細胞に１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４とＰＩ３Ｋ抑制剤であるＬＹ２９４００２を１０μＭとなるように処理し、翌日にＥＧＭ培地に２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βと２０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢを添加して１４日間培養した。この培養期間中に、初期に出現する細胞は、平滑筋前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ＶＳＭＣ；ｐＶＳＭＣ）であって、人造的な（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）平滑筋細胞の形態を示したが、追加培養後、マトリゲルで成長した細胞を２〜３回ｔｙｐｅＩＩコラーゲンがコートされているティシュィで継代培養して、成熟した収縮性の平滑筋細胞（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ＶＳＭＣ；ａＶＳＭＣ：ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ＶＳＭＣ）を得ることができた。前記分化した平滑筋細胞を検証するために、陽性対照群であるヒト胃血管平滑筋細胞（ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ；ｈＶＳＭＣ）と比較した。

免疫蛍光染色とウェスタンブロッティングを用いて平滑筋細胞マーカー遺伝子のタンパク質発現量を観察した結果、図７ｂおよび図７ｃに示したように、ＣＮＮ１（ｃａｌｐｏｎｉｎ）およびＳＭＡの平滑筋細胞マーカー遺伝子のタンパク質が陽性対照群（ｈＶＳＭＣ）とほぼ同じ水準で発現することを確認し、図７ｄのＲＴ−ＰＣＲ結果より、ＣＮＮ１（ｃａｌｐｏｎｉｎ）、ＳＭＡ、およびＳＭ２２αマーカー遺伝子ｍＲＮＡの発現量が陽性対照群よりかえってさらに高い水準で発現されることを確認した。

前記結果より、前記方法でＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞から平滑筋細胞が高効率で分化したことを確認した。

実施例７−４．ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの心筋細胞への分化確認
心筋細胞への分化は、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣの胚様体（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｄｙ）の形態で図８ａに示したプロトコルによって分化を進めた。具体的に、培養中のＣｉＭＳ−ｉＰＳＣのＥＳ培地を除去し、ｂＦＧＦが含まれていないＥＳ培地に０．５ｍｇ／ｍｌのディスパーゼを溶かして、１ｍｌずつ処理した後、３７℃で１時間培養して、ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣコロニーがフィーダー細胞から落下するようにした。浮遊されたＣｉＭＳ−ｉＰＳＣコロニーを回収して、１５ｍｌチューブに移して入れ、ｂＦＧＦが含まれていないＥＳ培地でＣｉＭＳ−ｉＰＳＣを２回洗浄した。翌日、インスリンが除去されたＢ２７（Ｂ２７ ｍｉｎｕｓ ｉｎｓｕｌｉｎ）が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ１６４０＋Ｂ２７ ｍｉｎｕｓ ｉｎｓｕｌｉｎ）に３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ、および１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加し、前記ＣｉＭＳ−ｉＰＳＣコロニーを正確に２４時間培養した。その後、ＲＰＭＩ１６４０＋Ｂ２７ ｍｉｎｕｓ ｉｎｓｕｌｉｎ培地に濃度を低減した１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４と１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを添加して３日間さらに培養した後、ＲＰＭＩ１６４０＋Ｂ２７ ｍｉｎｕｓ ｉｎｓｕｌｉｎ培地で洗浄し、一日をさらに培養した。翌日、Ｗｎｔ信号伝達経路を抑制する低分子物質である５μＭのＩＷＰ２を添加して２日間培養した後、ＲＰＭＩ１６４０＋Ｂ２７培地で続いて培養して、拍動（ｂｅａｔｉｎｇ）心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ；ＣＭＣ）を得た。

前記方法で分化させて得た心筋細胞を顕微鏡で観察した結果、図８ｂに示したように、拍動（beating）胚様体を確認した。前記結果より、前記方法でＣｉＭＳ由来誘導多能性幹細胞から心筋細胞への分化が良好に行われたことが分かった。

前記記述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。

Claims (12)

1. 下記の段階を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法：
   （ａ）末梢血液から分離した末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地に懸濁してシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、５〜８日間毎日培地を交換しつつ、Ｔ細胞を除去して培養することにより、心臓内膜由来成体幹細胞を収得する段階；
   （ｂ）心臓内膜由来成体幹細胞にＳＯＸ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）−ｂｏｘ ２）、ｃ−ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）、ＯＣＴ４（Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４）、およびＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）遺伝子を導入する段階；
   （ｃ）前記遺伝子が導入された細胞をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地で８〜１２日間毎日交換しつつ培養して、上皮様細胞を得る段階；および
   （ｄ）前記細胞をフィーダー細胞上に載置し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地で３〜７日間培養した後、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）培地に交換して、誘導多能性幹細胞のコロニーを形成する段階；および
   （ｅ）継代培養を通じて誘導多能性幹細胞株を獲得する段階。
2. 前記フィーダー細胞は、マウス由来胚性線維芽細胞株であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
3. 前記ＥＳ培地は、ノックアウト血清代替剤（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびｂＦＧＦが処理されたＤＭＥＭ／ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
4. 下記の段階を含む、誘導多能性幹細胞を製造し、誘導多能性幹細胞から内皮細胞への分化方法：
   （ａ）下記（ａ１）〜（ｄ１）段階を含んで誘導多能性幹細胞を製造する段階：
   （ａ１）末梢血液から分離した末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地に懸濁してシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、５〜８日間毎日培地を交換しつつ、Ｔ細胞を除去して培養することによって、心臓内膜由来成体幹細胞を収得する段階；
   （ｂ１）心臓内膜由来成体幹細胞にＳＯＸ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）−ｂｏｘ ２）、ｃ−ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）、ＯＣＴ４（Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４）、およびＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）遺伝子を導入する段階；
   （ｃ１）前記遺伝子が導入された細胞をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地で８〜１２日間毎日交換しつつ培養して、上皮様細胞を得る段階；および
   （ｄ１）前記細胞をフィーダー細胞上に載置し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地で３〜７日間培養した後、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）培地に交換して、誘導多能性幹細胞のコロニーを形成する段階；
   （ｅ）継代培養を通じて誘導多能性幹細胞株を獲得する段階；
   （ｂ）製造された誘導多能性幹細胞にＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤を処理し、１〜３日間培養して、中内胚葉細胞に分化させる段階；
   （ｃ）前記中内胚葉細胞にＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）とＡｋｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ；ＰＫＢ）抑制剤を処理して中胚葉細胞に分化させた後、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）またはｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）成長因子を処理し、毎日培地を交換しつつ、７〜１０日間培養して、ＣＤ３４陽性細胞を得る段階；および
   （ｄ）前記ＣＤ３４陽性細胞に前記ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）およびｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）成長因子よりなる成長因子のうち一つ以上を再処理し、毎日培地を交換しつつ１０〜２０日間継代培養する段階。
5. 前記ＧＳＫ−３抑制剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（５−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）であることを特徴とする請求項４に記載の内皮細胞への分化方法。
6. 前記Ａｋｔ抑制剤は、ＰＤ９８０５９（２−（２−Ａｍｉｎｏ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）であることを特徴とする請求項４に記載の内皮細胞への分化方法。
7. 下記の段階を含む、誘導多能性幹細胞を製造し、誘導多能性幹細胞から平滑筋細胞への分化方法：
   （ａ）下記（ａ１）〜（ｄ１）段階を含んで誘導多能性幹細胞を製造する段階：
   （ａ１）末梢血液から分離した末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地に懸濁してシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、５〜８日間毎日培地を交換しつつＴ細胞を除去して培養することによって、心臓内膜由来成体幹細胞を収得する段階；
   （ｂ１）心臓内膜由来成体幹細胞にＳＯＸ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）−ｂｏｘ ２）、ｃ−ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）、ＯＣＴ４（Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４）、およびＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）遺伝子を導入する段階；
   （ｃ１）前記遺伝子が導入された細胞をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地で８〜１２日間毎日交換しつつ培養して、上皮様細胞を得る段階；および
   （ｄ１）前記細胞をフィーダー細胞上に載置し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地で３〜７日間培養した後、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）培地に交換して、誘導多能性幹細胞のコロニーを形成する段階；
   （ｅ）継代培養を通じて誘導多能性幹細胞株を獲得する段階；
   （ｂ）製造された誘導多能性幹細胞にＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤を処理し、１〜３日間培養して、中内胚葉細胞に分化させる段階；
   （ｃ）前記分化した中内胚葉細胞にＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）とＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３−ｋｉｎａｓｅ）抑制剤を処理し、１〜２日間培養する段階；および
   （ｄ）前記培養された中内胚葉細胞にＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ＢＢ）またはＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）成長因子を処理し、１２〜１６日間継代培養する段階。
8. 前記ＧＳＫ−３抑制剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（５−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）であることを特徴とする請求項７に記載の平滑筋細胞への分化方法。
9. 前記ＰＩ３Ｋ抑制剤は、ＬＹ２９４００２（２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−８−ｐｈｅｎｙｌ−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）であることを特徴とする請求項７に記載の平滑筋細胞への分化方法。
10. 下記の段階を含む、誘導多能性幹細胞を製造し、誘導多能性幹細胞から心筋細胞への分化方法：
    （ａ）下記（ａ１）〜（ｄ１）段階を含んで誘導多能性幹細胞を製造する段階：
    （ａ１）末梢血液から分離した末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地に懸濁してシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、５〜８日間毎日培地を交換しつつＴ細胞を除去して培養することによって、心臓内膜由来成体幹細胞を収得する段階；
    （ｂ１）心臓内膜由来成体幹細胞にＳＯＸ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ）−ｂｏｘ ２）、ｃ−ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）、ＯＣＴ４（Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４）、およびＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）遺伝子を導入する段階；
    （ｃ１）前記遺伝子が導入された細胞をＥＧＭ−２ＭＶ（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉａ−２）培地で８〜１２日間毎日交換しつつ培養して、上皮様細胞を得る段階；および
    （ｄ１）前記細胞をフィーダー細胞上に載置し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地で３〜７日間培養した後、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）培地に交換して、誘導多能性幹細胞のコロニーを形成する段階；
    （ｅ）継代培養を通じて誘導多能性幹細胞株を獲得する段階；
    （ｂ）製造された誘導多能性幹細胞をＧＳＫ−３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）抑制剤、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ビタミンＣ、アクチビンＡ、およびインスリンが除去されたＢ２７補充剤が含まれた培地で２０〜３０時間培養して、中胚葉細胞に分化させる段階；
    （ｃ）前記分化した中胚葉細胞をＢＭＰ４、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）成長因子、およびインスリンが除去されたＢ２７補充剤が添加された培地で２〜４日間培養する段階；および
    （ｄ）前記培養された細胞をインスリンが除去されたＢ２７補充剤が含まれた培地で１〜２日間培養し、Ｗｎｔ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆａｍｉｌｙ）信号伝達抑制剤を添加して、１〜３日間培養した後、インスリンを含有するＢ２７補充剤が含まれた培地で追加培養する段階。
11. 前記ＧＳＫ−３抑制剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（５−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）であることを特徴とする請求項１０に記載の心筋細胞への分化方法。
12. 前記Ｗｎｔ信号伝達抑制剤は、ＩＷＰ２（Ｎ−（６−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２−［（３，４，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−４−ｏｘｏ−３−ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｔｈｉｏ］−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）であることを特徴とする請求項１０に記載の心筋細胞への分化方法。

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