WO2017051978A1 - 심장내막 유래 성체줄기세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포의 심혈관계 세포로의 분화방법 및 이의 용도 - Google Patents

심장내막 유래 성체줄기세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포의 심혈관계 세포로의 분화방법 및 이의 용도 Download PDF

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induced pluripotent
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양한모
김주영
이주은
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing endometrial derived adult stem cells isolated from peripheral blood into induced pluripotent stem cells, a method for differentiating induced pluripotent stem cells prepared in the above method into cardiovascular cells, and use thereof.
  • iPSCs induced Pluripotent Stem Cells
  • Skin fibroblasts are the most widely used cells for iPSC production and have the advantage of easy access and easy culture.
  • the results reported so far indicate that cells of a little younger stage than adult cells have a high proliferative capacity and have reduced the number of Yamanaka factors provided in iPSC production due to the special genetic composition with stem cell capacity.
  • neural stem cells express SOX2 and c-MYC by themselves, iPSC production was possible only by introducing two factors, OCT4 and KLF4. Therefore, finding younger cells with stemness than somatic cells and using them as primary cultured cells can shorten the time required for iPSC production and increase production efficiency.
  • iPSC can be established even with a small number of Yamanaka factors by investigating the gene expression, this may be an advantage of lowering the risk of cancer when the cells are differentiated into target cells and used for treatment.
  • primary cultured cells should be selected in consideration of the developmental origin in consideration of efficiency, differentiation of cell function and stability in differentiation into target cells from the early stage of production of induced pluripotent stem cells.
  • CPC-iPSCs were differentiated from cardiac progenitor cell-derived iPSCs (CPC-iPSCs) and fibroblast-derived iPSCs (Fib-iPSCs) to cardiomyocytes. Differentiation efficiency was higher than that of Fib-iPSC, and differentiation efficiency was higher when CPC-iPSC was used in comparison with endothelial cells and smooth muscle cells using the same cell (Sanchez-Freire et al. 2014). , JACC, 64 (5): 449-450). Therefore, in case of differentiation into cardiovascular cells using induced pluripotent stem cells, the use of cardiac-derived primary culture cells may act as an important factor to increase the differentiation efficiency.
  • the method of specimen acquisition should be noninvasive, if possible, rather than invasive through biopsy that poses the risk of infection. could be.
  • iPSC primary cultured cells should be: First, sample acquisition should be easy. It should be possible to secure a large number of cells easily and safely during acquisition. Second, it must be sensitive to external gene influx and expression, and third, it must be a cell that can be separated regardless of donor's age, gender, ethnicity, and physical condition, and when it is separated, it can represent the genetic information of the donor. do. Fourth, if stemness is present, iPSC production efficiency can be increased, and epigenetic memory must be the same cell to take advantage of differentiation efficiency when differentiating into target cells.
  • the present inventors have made intensive studies for obtaining and verifying primary cultured cells optimized for the production of induced pluripotent stem cells that can be used for cardiovascular cell therapy.
  • the present invention was completed by establishing a method for producing pluripotent stem cells with efficiency and successfully differentiating the prepared pluripotent stem cells into endothelial cells, smooth muscle cells, and cardiomyocytes, which are cardiovascular cells.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing induced pluripotent stem cells using endocardial derived adult stem cells, and an induced pluripotent stem cell produced thereby.
  • Another object of the present invention is to provide a method for differentiating endothelial cells, smooth muscle cells, and cardiomyocytes from the induced pluripotent stem cells, and endothelial cells, smooth muscle cells, and cardiomyocytes differentiated thereby.
  • Another object of the present invention is to provide a cell therapy agent for treating cardiovascular diseases, which comprises endothelial cells, smooth muscle cells, or cardiomyocytes differentiated by the differentiation method as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for producing induced pluripotent stem cells, including the following steps.
  • the endocardial derived adult stem cells are seeded by suspending peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from peripheral blood in EGM-2MV medium, It may be obtained by culturing by removing T cells while changing medium every day for 8 days.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the support cell may be a mouse-derived embryonic fibroblast line.
  • the ES medium is knockout serum replacement, L-glutamine, non essential amino acids, 2-mercaptoethanol (2- mercaptoethanol), penicillin / streptomycin, and DMEM / f12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) treated with bFGF.
  • the present invention also provides an induced pluripotent stem cell prepared by the above method.
  • the induced pluripotent stem cells may exhibit the following characteristics.
  • (a) shows positive immunological properties for Alkaline phosphatase (ALP), OCT4, Nanog homeobox (NANOG), and TRA-1-81;
  • the present invention provides a method for differentiating induced pluripotent stem cells into endothelial cells, comprising the following steps.
  • (C) subculture the CD34 positive cells for 10 to 20 days while reprocessing the growth factor and changing medium daily.
  • the GSK-3 inhibitor is CHIR99021 (6-[[2-[[4- (2,4-Dichlorophenyl) -5- (5-methyl-1H-imidazol-2-yl)- 2-pyrimidinyl] amino] ethyl] amino] -3-pyridinecarbonitrile).
  • the Akt inhibitor may be PD98059 (2- (2-Amino-3-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one).
  • the growth factor may be VEGF (Vascular endothelial growth factor) and bFGF (Basic fibroblast growth factor).
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • bFGF Basic fibroblast growth factor
  • the present invention also provides endothelial cells differentiated by the differentiation method.
  • the present invention provides a method of differentiating induced pluripotent stem cells into smooth muscle cells, comprising the following steps.
  • the GSK-3 inhibitor is CHIR99021 (6-[[2-[[4- (2,4-Dichlorophenyl) -5- (5-methyl-1H-imidazol-2-yl)- 2-pyrimidinyl] amino] ethyl] amino] -3-pyridinecarbonitrile).
  • the PI3K inhibitor may be LY294002 (2- (4-morpholino) -8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one).
  • the growth factors may be platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) and transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ).
  • PDGF-BB platelet-derived growth factor-BB
  • TGF- ⁇ transforming growth factor-beta
  • the present invention also provides smooth muscle cells differentiated by the differentiation method.
  • the present invention provides a method for differentiating induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes comprising the following steps.
  • A the induced pluripotent stem cell medium containing a GSK-3 (Glycogen synthase kinase 3) inhibitor, BMP4 (Bone morphogenetic protein 4), vitamin C, activin A (Activin A), and insulin-free B27 supplement Incubating for 20 to 30 hours at differentiation into mesodermal cells;
  • the cultured cells were cultured for 1 to 2 days in a medium containing insulin-free B27 supplement and cultured for 1 to 3 days with the addition of a Wnt (Wingless-type MMTV integration site family) signaling inhibitor. , Further culturing in a medium containing B27 supplement containing insulin.
  • the GSK-3 inhibitor is CHIR99021 (6-[[2-[[4- (2,4-Dichlorophenyl) -5- (5-methyl-1H-imidazol-2-yl)- 2-pyrimidinyl] amino] ethyl] amino] -3-pyridinecarbonitrile).
  • the growth factor may be VEGF (Vascular endothelial growth factor).
  • the Wnt signaling inhibitor is IWP2 (N- (6-Methyl-2-benzothiazolyl) -2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno [3,2-d] pyrimidin-2-yl) thio] -acetamide).
  • the present invention also provides cardiomyocytes differentiated by the differentiation method.
  • the present invention also provides a cell therapeutic agent for treating cardiovascular diseases comprising the differentiated endothelial cells, smooth muscle cells, or cardiomyocytes as an active ingredient.
  • the cardiovascular disease may be a disease selected from the group consisting of angina pectoris, myocardial infarction, ischemic heart disease, hyperlipidemia, stroke, arteriosclerosis, hypertension, arrhythmia, cerebrovascular disease, and coronary artery disease .
  • the present invention also provides a method for preventing or treating cardiovascular disease, comprising administering the differentiated endothelial cells, smooth muscle cells, or cardiomyocytes to a subject.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic use of the cardiovascular diseases of the differentiated endothelial cells, smooth muscle cells, or cardiomyocytes.
  • Endocardial derived adult stem cells the primary cultured cells for the production of induced pluripotent stem cells of the present invention, can be easily isolated and cultured even with a small amount of peripheral blood, and have high proliferative capacity, so that they can be stored without genetic variation and used for cell therapy. You can quickly get enough cells to use.
  • the cardiovascular cells differentiated from the induced pluripotent stem cells can be used for screening libraries of therapeutic substances for the development of therapeutic agents for cardiovascular diseases and for studying the mechanisms for the treatment of cardiovascular diseases, and also directly manipulate and proliferate the cells. It is expected to be widely used in various fields, such as injecting it back into a patient and using it as a cell therapy.
  • Figure 1a is a time course of culturing endometrial derived adult stem cells (CiMS) transduced with Yamanaka factor (SOX2, c-MYC, OCT4, and KLF4) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from human blood It is shown as a picture according to.
  • CiMS endometrial derived adult stem cells
  • SOX2, c-MYC, OCT4, and KLF4 Yamanaka factor
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells isolated from human blood It is shown as a picture according to.
  • 1B is a result showing that the CiMS transduced with Yamanaka factor was placed on support cells, and then gradually exchanged with ES medium was effective for the production of iPSCs.
  • CiMS (left) cultured by separating from donor peripheral blood, colonies formed after 8 days of transduction of Yamanaka factor (central), and CiMS-derived pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) cultured on support cells (right) ) Is a micrograph.
  • Figure 2a is a result of confirming the protein expression of undifferentiated marker gene through alkaline phosphatase (ALP) staining and immunofluorescence staining to verify the undifferentiated ability of CiMS-derived induced pluripotent stem cells (CiMS-iPSC).
  • ALP alkaline phosphatase
  • Figure 2b is a result of confirming the mRNA expression level of undifferentiated marker genes through RT-PCR to verify the undifferentiated ability of CiMS-derived induced pluripotent stem cells (CiMS-iPSC).
  • Figure 2c is a result of comparing the overall gene expression pattern through a microarray to verify the differentiation capacity of CiMS-derived induced pluripotent stem cells (CiMS-iPSC).
  • Figure 3a is a result of confirming the protein expression of the trioderm marker genes through immunofluorescence staining in order to verify the trigeminal differentiation of CiMS-derived induced pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) in vitro .
  • Figure 3b is the result of comparative analysis of mRNA expression levels of the trioderm marker genes in undifferentiated or differentiated CiMS-iPSC to verify the trigeminal differentiation of CiMS-derived pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) in vitro .
  • Figure 3c is a result of confirming the in vivo trigeminal differentiation ability through teratoma formation of CiMS-derived induced pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) in vivo.
  • 4A is a result of transducing retrovirus expressing GFP into CiMS, dermal fibroblasts, and 293T cells and comparing the efficiency thereof.
  • Figure 4b is a result of comparing the efficiency of iPSC production by performing alkaline phosphatase (ALP) staining 9 days after transduction of Yamanaka factor in CiMS and skin fibroblasts.
  • ALP alkaline phosphatase
  • Figure 5 shows the step-by-step process of constructing CiMS derived pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) bank.
  • CiMS-derived pluripotent stem cells CiMS-derived pluripotent stem cells
  • endothelial cells CiMS-derived pluripotent stem cells
  • Figure 6b is the result of comparing the morphology of endothelial cells differentiated from CiMS-derived pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) and the form of human control umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a positive control under a microscope.
  • CiMS-iPSC CiMS-derived pluripotent stem cells
  • HAVEC human control umbilical vein endothelial cells
  • Figure 6c is a result of comparing and measuring the nitric oxide (nitric oxide) concentration of endothelial cells differentiated from CiMS-derived pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) and human control umbilical vein endothelial cells (HUVEC) positive control.
  • CiMS-iPSC CiMS-derived pluripotent stem cells
  • HAVEC human control umbilical vein endothelial cells
  • 6d shows the expression of endothelial cell expression markers PECAM and VE-Cadherin, matrigel tube formation, and LDL uptake in endothelial cells differentiated from CiMS-derived induced pluripotent stem cells (CiMS-iPSC).
  • FIG. 7a graphically illustrates the differentiation process and differentiation protocol from CiMS-derived pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) to smooth muscle cells.
  • Figure 7b is the result of confirming the protein expression of smooth muscle cell markers (Calponin, SMA) through immunofluorescence staining in smooth muscle cells differentiated from CiMS-derived induced pluripotent stem cells (CiMS-iPSC).
  • Figure 7c shows the protein expression levels of smooth muscle cell markers (Calponin, SMA) through Western blotting on smooth muscle cells differentiated from CiMS-derived pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) and human gastric vascular smooth muscle cells (hVSMC), a positive control group. The result is a comparison.
  • smooth muscle cell markers Calponin, SMA
  • CiMS-iPSC CiMS-derived pluripotent stem cells
  • hVSMC human gastric vascular smooth muscle cells
  • FIG. 7D shows mRNA expression of smooth muscle cell markers (Calponin, SMA, SM22 ⁇ ) through RT-PCR in smooth muscle cells differentiated from CiMS-derived pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) and human gastric vascular smooth muscle cells (hVSMC), a positive control group. This is a result of comparing the levels.
  • smooth muscle cell markers Calponin, SMA, SM22 ⁇
  • hVSMC human gastric vascular smooth muscle cells
  • CiMS-derived pluripotent stem cells CiMS-derived pluripotent stem cells
  • CiMS-iPSCs CiMS-derived induced pluripotent stem cells
  • the present invention provides a method for producing induced pluripotent stem cells by using endocardial derived adult stem cells isolated from peripheral blood as primary cells, and a method for differentiating induced pluripotent stem cells prepared by the above method into cardiovascular cells. , And uses thereof.
  • the present invention provides a method for producing induced pluripotent stem cells comprising the following steps.
  • stem cell refers to a cell that is the basis of a cell or tissue constituting an individual.
  • the stem cell may repeatedly divide and self-renewal, and have a specific function according to an environment. It means a cell having a multipotent ability to differentiate into a cell having. It occurs in all tissues during the development of the fetus, and is found in some tissues, such as bone marrow and epithelial tissue, which are actively replaced even in adulthood.
  • Stem cells are totipotent stem cells that form when the fertilized egg begins its first division, depending on the type of cells that can differentiate, and pluripotent stem cells in the endoplasmic linings where these cells continue to divide. It is classified as multipotent stem cells in mature tissues and organs.
  • pluripotent stem cells are cells that can only differentiate into cells specific to the tissues and organs in which they are contained, as well as the growth and development of the tissues and organs of the prenatal, neonatal, and adult stages as well as the adult tissues. It is involved in maintaining homeostasis and inducing regeneration in tissue damage. These tissue specific pluripotent cells are collectively referred to as adult stem cells.
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • iPSC inverted pluripotent stem cell
  • OCT4 embryonic stem cell
  • KLF4 Yamanaka factor
  • Endocardial-derived adult stem cells of step (a) are seeded by suspending peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from peripheral blood in EGM-2MV medium for 5 to 8 days. It can be obtained by culturing by removing T cells with daily medium exchange.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CiMS Circulating Multipotent Stem Cell
  • peripheral blood refers to blood drifting through the body in a mammal including a human, and may be variously extracted using arteries, veins, and peripheral blood vessels.
  • peripheral blood mononuclear cell is a mononuclear cell present in peripheral blood, and is a B cell, a T cell, a macrophage, a dendritic cell, a natural killer cell. cells; immune cells such as NK cells, basophil, eosinophil, granulocytes such as neutrophil, and the like.
  • the peripheral blood mononuclear cells can be separated by a conventional manufacturing method, such as specific gravity acupuncture using Ficoll-Paque, but is not limited thereto.
  • the term “gene introduction” means an operation of artificially introducing a gene or group of genes into a cell to express the group of genes or adding another gene (group) to the genome of the cell.
  • Gene introduction can be carried out via a method using a non-viral transporter such as liposome nanoparticles or cationic polymer, a method using a virus transporter, or a physical method such as electropermeation method, more preferably a viral transporter. It may be used, and more preferably, a gene may be introduced using a retrovirus, but is not limited thereto. Retroviruses can be prepared according to conventional methods using conventional cells known in the art.
  • the term "Feeder cells” used in the present invention is known to be associated with an undifferentiated maintenance mechanism that secretes nutrients that contribute to maintaining the undifferentiated state of embryonic stem cells and mediates cell contact.
  • Signaling substances secreted from support cells contribute to the maintenance of undifferentiated or initiation of differentiation of embryonic stem cells.
  • Substances secreted from supporting cells include Wnt (Wingless-type MMTV integration site family), BMPs (Bone morphogenetic proteins), TGF- ⁇ (Transforming growth factor-beta), and extracellular matrix (Extracellular matrix).
  • the ES medium may be DMEM / f12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) medium, and preferably knockout serum replacement and L-glutamine in DMEM / f12 medium.
  • DMEM / f12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
  • knockout serum replacement and L-glutamine in DMEM / f12 medium L-glutamine
  • non-essential amino acids amino acids
  • 2-mercaptoethanol penicillin and streptomycin
  • bFGF may be added, but are not limited thereto. no.
  • SOX2, c-MYC, OCT4, and KLF4 genes were introduced into endocardial adult stem cells according to the above method and cultured with daily exchange of EGM-2MV medium, resulting in epithelial cells from about 2 days.
  • the morphology changed to similar cells and colonies formed between 8 and 12 days.
  • induced pluripotent stem cell colonies began to form from about 15 days after the gene introduction, and after culturing by culturing with ES medium after colonies were formed, stabilized induced pluripotent stem cells were obtained. (See Example 2-2).
  • the induced pluripotent stem cells As a result of observing the characteristics of the induced pluripotent stem cells, it was confirmed that the growth and attachment, having morphological characteristics and genetic characteristics of embryonic stem cells. In addition, as a result of verifying undifferentiated ability, it was confirmed that undifferentiated genes such as ALP (alkaline phosphatase), OCT4, NANOG (Nanog homeobox), and TRA-1-81 are expressed at mRNA and protein levels, and are very similar to embryonic stem cells. Gene expression patterns were shown (see Example 3). In addition, the induced pluripotent stem cells were confirmed to have the ability to differentiate into trioderm in vitro and in vivo (see Example 4).
  • endometrial-derived adult stem cells are skin fibroblasts conventionally used for production of induced pluripotent stem cells and The transduction efficiency of the virus was higher than that of 293T cells with high gene transduction efficiency, and it was confirmed that induced pluripotent stem cells were produced at higher efficiency than dermal fibroblasts using endocardial adult stem cells by ALP staining. (See Example 5).
  • the present inventors have a high efficiency to differentiate the induced pluripotent stem cells prepared from endocardial derived adult stem cells into endothelial cells, smooth muscle cells, and cardiomyocytes in order to differentiate into cardiovascular cells of the same origin as primary cultured cells. Methods were established and their effectiveness was verified.
  • the present invention provides a method for differentiation of induced pluripotent stem cells into endothelial cells comprising the following steps.
  • (C) subculture the CD34 positive cells for 10 to 20 days while reprocessing the growth factor and changing medium daily.
  • the GSK-3 inhibitor of step (a) may be treated with CHIR99021 (6-[[2-[[4- (2,4-Dichlorophenyl) -5- (5-methyl-1H-imidazol-2) in order to increase the reverse differentiation efficiency. -yl) -2-pyrimidinyl] amino] ethyl] amino] -3-pyridinecarbonitrile), preferably, CHIR99021 can be treated by diluting in RPMI1640 medium containing B27, but is not limited thereto.
  • the differentiated mesodermal endothelial cells may preferably be Brachyury T positive cells.
  • the Akt inhibitor of step (b) may be preferably PD98059 (2- (2-Amino-3-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one), and the growth factor is preferably VEGF (Vascular). endothelial growth factor (bFGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF), and the growth factor may be appropriately adjusted to increase the number of CD34 positive cells, but is preferably 7 to 10 days, more preferably 7 to 8 days. Can be.
  • the step (c) may further comprise the step of separating only the CD34 positive cells.
  • the process may be performed by a method selected from the group consisting of Magnetic-activated cell sorting (MACS), Fluorescent activated cell sorting (FACS), IsoRaft, and DEPArray, preferably through the MACS method, Any method capable of separating only CD34 positive cells can be carried out by a person skilled in the art in a conventional manner.
  • MCS Magnetic-activated cell sorting
  • FACS Fluorescent activated cell sorting
  • IsoRaft IsoRaft
  • DEPArray preferably through the MACS method
  • CD34 positive cells may be cultured by inoculating on Matrigel-coated plates by floating in endothelial cell growth media (EGM) medium retreated with VEGF and bFGF.
  • EMM endothelial cell growth media
  • the mature endothelial cells can be obtained by subculture for 10 to 20 days, more preferably 10 to 15 days with daily medium exchange.
  • the endothelial cells differentiated from induced pluripotent stem cells prepared from endocardial adult stem cells through the method are human umbilical vein endothelial cells HUVEC) showed similar morphology and total nitrogen monoxide levels, and expressed endothelial cell expression markers, PECAM and VE-Cadherin, and differentiated into endothelial cells through Matrigel tube formation and low density lipoprotein (LDL) uptake. (See Examples 7-1 and 7-2).
  • the present invention also provides a method of differentiating induced pluripotent stem cells into smooth muscle cells, comprising the following steps.
  • the step (a) of differentiating mesenchymal endothelial cells from the induced pluripotent stem cells may be performed in the same manner as in the method of differentiation into endothelial cells, and the mesodermal endothelial cells may be Brachyury T positive cells.
  • the PI3K inhibitor may be preferably LY294002 (2- (4-morpholino) -8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one), but is not limited thereto.
  • the growth factor may be preferably platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) and transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ), and type smooth muscle progenitor cells differentiated after growth factor treatment.
  • PDGF-BB platelet-derived growth factor-BB
  • TGF- ⁇ transforming growth factor-beta
  • Mature smooth muscle cells can be obtained by inoculation with a dish coated with II collagen and passaged for 12-16 days, more preferably 14-16 days.
  • the present invention provides a method for differentiating induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes comprising the following steps.
  • Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) inhibitors Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) inhibitors, Bone morphogenetic protein 4 (BMP4), vitamin C, Activin A, and insulin
  • GSK-3 inhibitors Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) inhibitors
  • BMP4 Bone morphogenetic protein 4
  • vitamin C Activin A
  • insulin Incubating for 20 to 30 hours in a medium containing the removed B27 supplement to differentiate into mesodermal cells
  • the cultured cells were cultured for 1 to 2 days in a medium containing insulin-free B27 supplement and cultured for 1 to 3 days with the addition of a Wnt signaling inhibitor, followed by the B27 supplement containing insulin. Further incubation in the prepared medium.
  • the induced pluripotent stem cells may proceed in embryonic form.
  • the induced pluripotent stem cells were removed from the support cells using a dispase, and then insulin-depleted B27 supplement, GSK-3 (Glycogen synthase kinase 3) inhibitor, BMP4 (Bone morphogenetic protein 4), vitamin C, and It may be differentiated into mesoderm cells by incubating for 20-30 hours, more preferably 24 hours in RPMI1640 medium (primary medium) containing Activin A (Activin A).
  • the GSK-3 inhibitor may be preferably CHIR99021, but is not limited thereto.
  • the mesoderm cells differentiated through step (a) are cultured for 2 to 4 days, preferably 3 days in RPMI1640 medium (secondary medium) to which B27 supplement is removed from insulin, lowered BMP4, and growth factor is added.
  • the growth factor may preferably be Vascular endothelial growth factor (VEGF), but is not limited thereto.
  • the cells cultured through step (b) are rinsed with RPMI1640 medium (tertiary medium) containing B27 supplement from which insulin is removed in step (c), and cultured for 1 to 2 days, preferably 1 day, and Wnt signaling.
  • Beating cardiomyocytes can be obtained by incubating for 1 to 3 days, preferably 2 days, followed by exchange with RPMI1640 medium (quaternary medium) containing B27 supplement containing insulin and further culture.
  • the Wnt signaling inhibitor of step (c) is preferably IWP2 (N- (6-Methyl-2-benzothiazolyl) -2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno [ 3,2-d] pyrimidin-2-yl) thio] -acetamide), but is not limited thereto.
  • cardiomyocytes differentiated from induced pluripotent stem cells prepared from endocardial-derived adult stem cells were obtained by the above method, and microscopic observation confirmed beating embryos (Example 7-4). Reference).
  • the present invention provides a cell therapy agent for treating cardiovascular diseases comprising endothelial cells, smooth muscle cells, or cardiomyocytes differentiated by the above method as an active ingredient.
  • the cardiovascular disease may be a disease selected from angina pectoris, myocardial infarction, ischemic heart disease, hyperlipidemia, stroke, arteriosclerosis, hypertension, arrhythmia, cerebrovascular disease, and coronary artery disease, but is not limited thereto.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • CMS endometrial-derived adult stem cells
  • CMS circulating multipotent adult stem cells
  • 293T cells were cultured in high glucose DMEM medium containing 10% FBS and antibiotics to 90% of the culture area.
  • 800 ⁇ l of basal DMEM medium was dispensed in a 1.5 ml eppendorf tube and one of the four genes prepared therein was cloned with plasmids and packaging vectors (pVSV-G, pGag-Pol) for each plasmid. 10 ⁇ g each was added and 1 mg / ml polyethyleneimine (PEI) stock was added to 60 ⁇ l and mixed well, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • PEI polyethyleneimine
  • 293T cells were washed twice with 5 ml of basal DMEM medium and 10 ml of high glucose DMEM medium (with 10% FBS) containing no antibiotics was removed. Stored in C incubator. Thirty minutes after the preparation of the plasmid DNA-PEI mixture, 293T cells from which antibiotics were removed were removed, and each plasmid DNA-PEI mixture was gently mixed with a pipette once for each of the four genes, and then dropped on the 293T cells. Transfection.
  • transfected 293T cells were removed from the incubator and rinsed twice with 5 ml of basal DMEM medium warmed to 37 ° C to remove excess plasmid DNA-PEI mixture and 10 ml of high glucose DMEM with 10% FBS and antibiotics. After the new addition was incubated in a 37 °C incubator, and the cells were careful not to fall. In order to recover the retrovirus produced after 48 hours, only the medium of 293T cells was collected in a 15 ml tube and centrifuged at 2500 rpm for 15 minutes to collect only the supernatant so that no fallen cells and debris deposited on the bottom were included.
  • the retrovirus contained in the supernatant was concentrated by filtering with a 0.22 ⁇ m filter and performing ultracentifuge at 25000 rpm for 1 hour and 30 minutes at 4 ° C.
  • Retroviruses expressing each of the four genes submerged in pellets were resuspended in 100 ⁇ l of EBM-2 medium and stored at ⁇ 70 ° C. until use.
  • Example 2-2 Cims origin Induction Production and culture of stem cells
  • CiMS cells obtained according to the method of Example 1 were treated with 0.05% trypsin to remove from the culture vessel and dispensed 5 X 10 5 per well into 6 well plates. Then, the next day was changed to 2 ml medium. After 4 hours of medium exchange, the retroviruses prepared in Example 2-1 and polybrene were treated to a concentration of 10 ⁇ g / ml and transduction was performed at 37 ° C. for 18 hours or more. Thereafter, it was exchanged with fresh EGM-2MV medium and observed with changing medium every day.
  • CiMS cells were gradually changed into epithelial like cells, and colonies were formed between 8-12 days. While viewing the colonies under a microscope, pick them up on a new support cell treated with mitomycin C, or remove the entire transduced CiMS cells with 0.05% trypsin and put them on top of 5 x 10 4 cells per well. Incubation was continued. The medium was changed daily with EGM-2MV medium until epithelial cell like cells regenerated colonies. The time flow from obtaining the CiMS from PBMC and culturing the CiMS colonies onto the supporting cells is shown in Figure 1a.
  • mice treated with STO cells derived from mouse embryonic fibroblasts were treated with mitomycin C at a concentration of 10 ⁇ g / ml, and after 2 hours and 30 minutes, STO cells were washed with phosphate buffer (PBS) and 0.05. % Trypsin was treated and removed from the culture vessel. After the cells were removed by centrifugation at 4 °C at 5 min 900 rpm for was prepared by 0.1% gelatin (gelatin) dividing the two 2.6 X 10 5 cells per well in 6 well plates that are coated. Rinse with EBM-2 medium and exchange with EGM-2MV medium before loading CiMS cells into which four genes were introduced onto the support cells.
  • PBS phosphate buffer
  • ES embryonic stem cell
  • EGM-2MV epidermal growth factor
  • the composition of ES medium was based on DMEM / f12 medium with 20% knockout serum replacement, 2 mM L-glutamine, 1 X 10 -4 M non essential amino acids, 1 X 10 -4 M 2-mercaptoethanol, and 50 units. It consists of 50 mg / ml penicillin / streptomycin and 10 ng / ml of basic fibroblast growth factor (bFGF) was added.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • CiMS colonies transfected with four genes on the support cells were exchanged daily with ES medium. As soon as 15 days after transduction, CiMS-derived induced pluripotent stem cells (CiMS-iPSC) colonies began to appear. The moderately sized CiMS-iPSC colonies were removed under a microscope and then placed on top of new STO cells treated with mitomycin C and pipetted into 1 ml pipettes to split colonies into the appropriate size. On the first day of passage, ROCK inhibitor Y-27632 ( trans- 4-[(1R) -1-Aminoethyl] -N-4-pyridinylcyclohexanecarboxamide dihydrochloride) was added to the media to increase the concentration of colonies. . Subsequent passage until the CiMS-iPSC colony is stabilized by the above method can obtain a stabilized CiMS-iPSC colony as shown in FIG. 1C micrograph.
  • Example 2-3 Cims - iPSC Freeze stock making
  • freezestocks were produced for various passages. To this end, securing more than 3 wells (more than 30 colonies / well) of 6 well plates and proceeding with the freezestock was more efficient.
  • dispase was mixed to a concentration of 0.5 mg / ml in ES medium without bFGF, and the dispase solution was made by filtration with a 0.22 ⁇ m filter. After that, the culture medium was removed from CiMS-iPSC cells, and 1 ml of dispase solution was added thereto. After 30 minutes to 1 hour of incubation in a 37 ° C.
  • the colonies were collected in 15 ml tubes by sweeping them with 1 ml of ES medium so that the colonies were not suspended from the support cells. Additional ES medium was added to collect the remaining CiMS-iPSC colonies, and then centrifuged at 300 xg for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed and the CiMS-iPSC pellet was suspended in a stock tube (cryovial) with 1 ml of mFreSRTM (Stemcell technologies) cooled at room temperature in order to prevent colonies from breaking as much as possible. The tube containing the cells was transferred to a freezing container containing isopropanol and stored overnight at -70 ° C, and then liquid nitrogen was transferred to a tank (LN 2 tank) the next day for long-term storage.
  • a stock tube containing the cells was transferred to a freezing container containing isopropanol and stored overnight at -70 ° C, and then liquid nitrogen was transferred to a tank (LN 2 tank) the next day for
  • Alkaline phosphatase (ALP) staining was performed to verify the differentiation capacity of CiMS-iPSCs prepared according to the methods of Examples 1 and 2, and the immunodifferentiation markers Oct4, Nanog, and Tra- Protein expression of 1-81 gene was attempted.
  • ALP Alkaline phosphatase
  • staining was performed using DAKO's BCIP / NBT substrate system. Specifically, the dishes incubated with CiMS-iPSC were rinsed twice with PBS, and 2 ml of a 1% paraformaldehyde solution diluted in PBS was placed in the dish and left at room temperature for 10 minutes to fix cells. After rinsing twice with PBS, the BCIP / NBT substrate system was dropped to cover the cells, and then reacted while mixing for 30 minutes so as not to dry on a rocker at room temperature.
  • the dishes incubated with CiMS-iPSC were rinsed twice with PBS, cold 100% methanol stored at -20 ° C was added to 1 ml dish, and the cells were immediately transferred to -20 ° C. The cells were fixed by standing for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were taken out, discarded methanol, washed three times with 0.05% TBS-T (1XTBS: Tris-Buffered Saline, 0.05% tween 20) three times for 5 minutes, and then circled with Dako pen on the area to be stained.
  • TBS-T Tris-Buffered Saline, 0.05% tween 20
  • a blocking solution prepared by dissolving 1% BSA (Bovine Serum Albumin) and 0.05% Triton X-100 in PBS, filtered with a 0.22 ⁇ m filter, was covered with the cells that were markedly dried, and then blocked at room temperature for 30 minutes. The procedure was carried out. Next, after diluting the primary antibody against the undifferentiated markers Oct4, nanog, and Tra-1-81 by 1: 100 in a diluent to prepare a primary antibody solution, the blocking solution was removed and the primary antibody solution was treated. The reaction was reacted overnight at 4 ° C.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • a secondary antibody solution (1: 100) corresponding to each antibody was prepared so as not to dry, and then treated to each cell, followed by shading at room temperature for 2 hours. Reacted.
  • 1 mg / ml of DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) solution was mixed in the diluent to 1: 1000 for nuclear staining. After putting the cells in the shade and reacted for 10 minutes at room temperature. After confirming that DAPI was stained in the nucleus by fluorescence microscope, rinsed three times with 0.05% TBS-T, and then mounted with a fluorescence mounting medium (DAKO) using a cover slip.
  • DAPI fluorescence mounting medium
  • CiMS-iPSC As a result of observing with an optical microscope, as shown in FIG. 2A, when ALP staining was performed, CiMS-iPSC was found to be dark purple. Oct4 and Nanog in the CiMS-iPSC colony nucleus through green fluorescence as a result of immunofluorescence staining. was expressed and it was confirmed that Tra-1-81 is expressed in the cell membrane.
  • RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
  • microarray were performed to confirm the expression of more diverse undifferentiated genes in CiMS-iPSC.
  • CiMS-iPSCs expressed high levels of undifferentiated genes almost the same as embryonic stem cells (ES), but it was confirmed that the genes are not expressed in the primary culture cells CiMS.
  • CiMS-iPSC1, CiMS-iPSC2, and CiMS-iPSC3 three types of CiMS-iPSCs
  • ES1, ES2, and ES3 three types of embryonic stem cells
  • CiMS1, CiMS2, RNA was extracted from CiMS3 and microarray was performed to compare and analyze overall gene expression patterns.
  • CiMS-iPSC showed a gene expression pattern that was not identical to that of embryonic stem cells (ES), but CiMS, a primary cultured cell, showed a gene expression pattern opposite to those of the two cells. It was confirmed.
  • Undifferentiated cells such as embryonic stem cells are capable of differentiating into three germ layers of endoderm, mesoderm and ectoderm in vitro and in vivo , and especially teratoma in vivo. There is ability. Therefore, to determine whether CiMS-iPSC produced in Examples 1 and 2 has a differentiation ability to the trioderm.
  • CiMS-iPSC was made into an embryonic body (EB) using 0.5 U / ml of dispase and maintained spontaneously in different ES mediums without bFGF. Induced. Cells incubated with embryos were incubated for one week in suspension, attached to a dish coated with 0.5% gelatin, incubated for two more weeks, and then subjected to immunofluorescence staining to give the endoderm marker AFP (Alpha-FetoProtein) and the mesoderm marker ⁇ -.
  • AFP Alpha-FetoProtein
  • SA ⁇ -sarcomeric actin
  • SMA Smooth muscle actin
  • ectoderm markers Nestin
  • GFAP Glial fibrillary acidic protein
  • ⁇ -III tubulin was observed by confocal microscopy.
  • CiMS-derived induced pluripotent stem cells like embryonic stem cells, have pluripotency capable of differentiating into three germ cells.
  • the expression levels of the star differentiation markers endoderm: AFP, GATA4, mesoderm: TnTc, Brachyury T, ectoderm: BMP4, Ncam1 were observed.
  • teratoma formation experiments in vivo 0.5 U / ml of dispase was treated to remove CiMS-iPSC from the support cells, collected in a 15 ml tube, and centrifuged to obtain pellets. The pellets were mixed with Matrigel on ice and then Matrigel-CiMS-iPSC was injected into the abdominal cavity of the left and right embryos of NOD-SCID mice and observed for at least 12 weeks. When teratomas grew more than a certain size, the teratomas were removed from the mouse, cut into appropriate sizes, fixed in 4% paraformaldehyde, fixed, and then cut into tissue slide sections.
  • the cut tissue sections were dissolved in 100% xylene twice for 10 minutes to dissolve paraffin, and then immersed in 100% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol for 5 minutes and rinsed with water at the end. Paraffin-free tissue slides were observed under a microscope by H & E (Hematoxyrin & Eosin) staining.
  • CiMS-derived pluripotent stem cells have the ability to differentiate into trioderm in vitro and in vivo .
  • CiMS-iPSC produced by the method of Examples 1 and 2
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • CiMS the 13.3 X 10 3 TU / ⁇ l whereas the virus titer (Transduction Units / ⁇ l), skin fibroblasts is 8.3 X 10 3 TU / ⁇ l, transduced 293T cells, known as the cell that the well is 11.3 Titers of X 10 3 TU / ⁇ l are shown. This result showed a difference in transduction efficiency (CiMS: 93.8%, skin fibroblasts: 49.4%, 293T cells: 76.4%) of GFP expressing retroviruses as shown in FIG. 4A.
  • CiMS showed 66% ALP-positive colonies, which was 1.5 times higher than 44% of dermal fibroblasts. Increased ratio was shown.
  • the results show that CiMS can produce iPSC with 1.5 times higher efficiency than dermal fibroblasts, the primary cultured cells that are widely used when producing induced pluripotent stem cells using retrovirus expressing Yamanaka factor. .
  • CiMS-iPSC bank prepared according to the method of Examples 1 and 2, the human-derived induced pluripotent stem cell (iPSC) bank through the process shown in Figure 5 was able to build itself.
  • CiMS-derived iPSCs were mainly prepared by separating CiMS from blood of healthy volunteers from the age of 0 (umbilical cord blood) and 77-year-old patients with cardiovascular diseases such as cardiomyopathy, heart transplant patients, and dysplastic angina patients.
  • Myotrophic lateral sclerosis (ALS) made from fibroblasts, iPSC from patients with Kenndey syndrome, iPSC made from cells obtained from urine, and dermal papilla cells from patients with Alopecia.
  • the iPSCs produced by) were also made up of 55 ciMS-derived iPSC stocks, such as manufactured and preserved for comparison with CiMS-derived iPSCs.
  • CiMS-derived iPSC The efficiency of CiMS-derived iPSC production was not affected by the age and sex of the volunteers.
  • stored CiMS-iPSC has many applications, such as the study of the mechanism of cardiovascular disease and the differentiation into patient-specific cells used as a disease model used in drug screening.
  • Matrigel was diluted in ES medium without Knockout serum replacement and bFGF so that the concentration of 1 mg per well of the 6 well plate was coated and placed in a 37 ° C. incubator for 30 minutes. After 30 minutes the matrigel solution was removed and the plate 1 was rinsed with the same ES medium as above. Meanwhile, 1 ml of mTeSRTM1 (Stem cell Technologies) was cut and mixed with CiMS-iPSC, which was cut to a suitable size, and 1 ml of new mTeSRTM1 was added with 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y27632, followed by mixing with CiMS-iPSC to coat the Matrigel. Inoculated into 6 well plates.
  • CiMS-iPSCs were incubated with mTeSRTM1 medium for 7 days every day in the absence of support cells. After the 7th day remove mTeSRTM1 medium, washed twice with PBS to StemPro r Accutase r cell dissociation reagent ( Life Technologies) to put every 500 ⁇ l to each well to stand at 37 °C 5 minutes to ensure that the single cells the CiMS-iPSC . Thereafter, 1 ml of mTeSR1 containing 10 ⁇ M of Y27632 was added to the wells, and all cells were recovered in a 15 ml tube. The tube was filled with a medium, centrifuged at 300 xg for 3 minutes, and the supernatant was removed.
  • Single cell pellets were released with 1 ml of mTeSR1 containing 10 ⁇ M of Y27632 and 10 ⁇ l was taken to determine the cell number. Thereafter, the cells were inoculated with 1.5 X 10 5 ⁇ 2 X 10 5 cells per well on a plate coated with Matrigel.
  • differentiation was carried out in three different conditions from early mesodermal endothelial cells differentiated with high efficiency of about 75% to endothelial cells, smooth muscle cells and cardiomyocytes sequentially.
  • the cells have progenitors (pEC, pVSMC, and pCMC), so they undergo a series of stages of maturation, resulting in the development of authentic cardiovascular cells (aEC, aVSMC). , aCMC).
  • Example 7-2 Cims - iPSC Confirmation of Differentiation into Endothelial Cells
  • Akt inhibitor PD98059 was treated for 2 days to allow differentiation into mesodermal cells. Thereafter, 100 ng / ml of VEGF and 50 ng / ml of bFGF were changed every day for 7-10 days to adjust the treatment period to increase the number of CD34 expressing cells. Then, CD34 MACS was performed to uniformly obtain only cells expressing CD34.
  • CD34 positive cells were suspended in EGM medium to which 100 ng / ml VEGF and 50 ng / ml bFGF were added to inoculate the plate coated with Matrigel to obtain progenitor EC (pEC). Subsequently, the EGM medium was subdivided daily for differentiation into mature endothelial cells (authentic EC; aEC). The differentiated cells were then compared with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), a positive control, to verify the function and morphology of endothelial cells.
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • the differentiated endothelial cells (Normal control) were found to be very similar in shape to HUVEC, and the total nitric oxide content of FIG. 6C was almost similar to that of HUVEC. It was.
  • PECAM endothelial cell adhesion markers
  • VE-Cadherin which are markers of endothelial cell expression
  • Example 7-3 Cims - iPSC To smooth muscle cells Eruption confirmation
  • Example 7-1 mesodermal endothelial cells differentiated from CiMS-iPSC by the method of Example 7-1 in the same manner as the endothelial cell differentiation of Example 7-2.
  • 100 ng / ml of BMP4 and PI3K inhibitor LY294002 were treated to 10 ⁇ M in the mesoderm cells, and 2 ng / ml of TGF- ⁇ in EGM medium the next day.
  • 20 ng / ml of PDGF-BB was added and incubated for 14 days.
  • pVSMC progenitor VSMC
  • Matrigel after further incubation were type 2-3 collagen.
  • Subculture with coated dishes yielded mature contractile smooth muscle cells (authentic VSMC; aVSMC: contractile VSMC).
  • hVSMC human gastric vascular smooth muscle cells
  • the protein expression level of the smooth muscle cell marker gene was observed by immunofluorescence staining and Western blotting. As shown in FIGS. 7B and 7C, the protein of the smooth muscle cell marker gene of CNN1 (calponin) and SMA was positively controlled (hVSMC) and It was confirmed that they are expressed at about the same level, and the RT-PCR results of FIG. 7D also confirmed that the expression levels of CNN1 (calponin), SMA, and SM22 ⁇ marker gene mRNA were expressed at a higher level than the positive control group.
  • Example 7-4 Cims - iPSC Into cardiomyocytes Eruption confirmation
  • CiMS-iPSC Differentiation into cardiomyocytes was carried out according to the protocol shown in FIG. 8A in the form of an embryonic body of CiMS-iPSC. Specifically, the ES medium of CiMS-iPSC in culture was removed, 0.5 mg / ml of dispase was dissolved in ES medium without bFGF, and treated with 1 ml, and then cultured at 37 ° C. for 1 hour, and the CiMS-iPSC colony was cultured. It was allowed to fall from supporting cells. Suspended CiMS-iPSC colonies were collected and transferred to a 15 ml tube, and washed CiMS-iPSC twice with ES medium without bFGF.
  • IWP2 a low molecular substance that inhibits the Wnt signaling pathway

Abstract

본 발명은 말초혈액에서 분리된 심장내막 유래 성체줄기세포로부터 유도만능 줄기세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 유도만능 줄기세포로부터 심혈관계 세포로의 분화방법, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 유도만능 줄기세포 제조를 위한 초대배양세포인 심장내막 유래 성체줄기세포는 소량의 말초혈액만으로도 쉽게 분리 및 배양이 가능하고, 높은 증식력을 가지므로 유전적 변이 없이 보관할 수 있고, 세포치료에 쓰일 수 있는 정도의 세포수를 빠르게 확보할 수 있다. 또한, 줄기세포능(stemness)을 가지고 있어 종래에 사용하던 피부 섬유아세포보다 4가지 야마나카 인자의 형질도입을 통한 유도만능 줄기세포의 제작효율이 높고, 심장내막 기원을 가지므로 심혈관계세포의 후생학적 기억을 가지고 있기 때문에 유도만능 줄기세포를 제작한 후 높은 효율로 내피세포, 평활근세포, 심근세포 등의 심혈관계 세포로 분화시킬 수 있는 장점이 있다. 따라서 상기 유도만능 줄기세포로부터 분화된 심혈관계 세포는 심혈관계 질환 치료제 개발을 위한 치료물질의 라이브러리 스크리닝 및 심혈관계 질환의 치료를 위한 기전 연구에 이용될 수 있으며, 또한 직접 세포에 조작을 가하고 증식시켜 환자에게 다시 주입함으로써 세포치료제로써 이용하는 등 다양한 분야에 널리 활용될 것으로 기대된다.

Description

심장내막 유래 성체줄기세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포의 심혈관계 세포로의 분화방법 및 이의 용도
본 발명은 말초혈액에서 분리된 심장내막 유래 성체줄기세포의 유도만능 줄기세포로의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 유도만능 줄기세포의 심혈관계 세포로의 분화방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
2006년 일본의 야마나카 교수에 의해 개발된 4가지 유전자를 이용한 유도만능 줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell; iPSC) 제작 방법의 개발로 환자 맞춤형 세포치료 시장과 질병발생 기작연구에 새로운 발전 가능성이 제시되었다. 이에 유전적 변형을 야기하지 않는 방법으로 유도만능 줄기세포 제작 방법을 모색하는 부분에 비약적인 발전이 이루어졌으며, 또한 iPSC 제작을 위해 사용되는 여러 가지 환자유래 초대배양세포(primary cell)의 종류도 함께 모색되어 왔다.
피부 섬유아세포는 iPSC 제작에 가장 광범위하게 사용되는 세포로써 접근이 용이하고 배양이 쉬운 장점이 있다. 현재까지 보고된 연구결과들을 살펴보면 성체세포보다 조금 더 어린 단계의 세포들이 증식력이 높고, 줄기세포능(stemness)을 가진 특수한 유전적 구성 때문에 iPSC 제작 시 제공하는 야마나카 인자의 수를 줄일 수 있었다. 특히 신경줄기세포의 경우는 SOX2와 c-MYC을 자체적으로 발현하고 있기 때문에 OCT4와 KLF4의 두 가지 인자를 도입하는 것만으로도 iPSC 제작이 가능하기도 했다. 그러므로 체세포보다 stemness를 가지고 있는 더 어린 단계의 세포를 찾아 초대배양세포로 이용하면 iPSC 제작에 들어가는 시간을 단축시키면서 제작효율성을 높일 수 있다. 더욱이, 그 유전자 발현을 조사하여 적은 수의 야마나카 인자로도 iPSC를 확립할 수 있다면 이는 상기 세포를 타깃세포로 분화시켜 치료에 이용할 때 암의 유발위험을 낮출 수 있는 장점이 될 수 있다.
또한, 마우스와 인간세포를 이용한 여러 연구를 통한 결과, 초대배양세포에 따라 iPSC로부터 타깃세포로의 분화 효율에 차이가 존재한다고 보고된 바 있다. 이는 원래의 체세포가 가지고 있는 후생학적 기억(epigenetic memory)이 역분화 후에도 남아있기 때문으로 여겨진다. 따라서 유도만능 줄기세포의 제작 초기부터 타깃세포로의 분화 시 효율, 분화 후의 세포 기능 및 안정성을 염두에 두고 발생학적 기원을 고려하여 초대배양세포를 선택해야 한다.
2014년에 보고된 바에 따르면, 심장 전구세포(cardiac progenitor cell) 유래의 iPSC (CPC-iPSC)와 섬유아세포(fibroblast) 유래의 iPSC(Fib-iPSC)에서 심근세포로 분화를 진행하였을 때 CPC-iPSC를 사용한 경우 Fib-iPSC 보다 분화효율이 높았으며, 동일세포를 이용한 내피세포와 평활근세포로의 분화를 통한 비교에 있어서도 CPC-iPSC를 이용한 경우 분화효율이 더 높게 나타났다(Sanchez-Freire et al. 2014, JACC, 64(5):449-450). 따라서 유도만능 줄기세포를 이용한 심혈관계 세포로의 분화가 목적인 경우 심장유래의 초대배양세포를 사용하는 것이 분화효율을 높이는 중요한 요소로 작용할 수 있다.
또한, 기본적으로 초대배양세포의 보관까지 고려할 때 보관 전후의 세포의 구성에 변화가 없어야 한다. 그리고 여러 가지 응용가능성을 고려하였을 때 검체 획득의 방법이 감염에 대한 위험을 안고 있는 생검을 통한 침습적인 방법보다는 가능하면 비침습적인 방법이어야 연령별, 성별, 질환별 등 다양한 배경의 초대배양세포를 얻을 수 있을 것이다.
상기 내용을 종합하면, iPSC의 초대배양세포가 되기 위한 이상적인 조건은 첫째, 샘플 획득이 용이해야 한다. 획득 시 쉽고 안전하게 많은 수의 세포를 확보할 수 있어야 한다. 둘째, 외부 유전자 유입과 그 발현에 민감해야 하며, 셋째, 기증자의 연령, 성별, 민족, 신체 상태와 상관없이 분리될 수 있는 세포여야 하고 분리되었을 때 그 기증자의 유전정보를 대표할 수 있는 세포이어야 한다. 넷째, stemness가 있으면 iPSC의 제작효율을 높일 수 있고, 후생학적 기억이 동일한 세포이어야 타깃세포로의 분화 시 분화효율의 이점을 살릴 수 있다.
그러나 현재까지 iPSC 제작에 사용되었다고 보고된 다양한 세포들을 분석한 결과 이러한 모든 조건을 충족시키는 세포는 존재하지 않았다. 이를 보완하기 위해 한 기증자에게서 다양한 세포를 확보하는 쪽으로 선회하기도 하나 이는 분리, 배양, 보관에 너무 많은 인력, 시간, 및 자원이 낭비되는 일이기에, 본 발명자들은 분야를 제한하여 심혈관계 세포치료에 한정해서 사용될 수 있는 iPSC 제작에 이용될 초대배양세포를 발굴하고자 하였다.
본 발명자들은 심혈관계 세포치료에 사용될 수 있는 유도만능 줄기세포 제작에 최적화된 초대배양세포의 획득과 그 검증을 위해 예의 연구한 결과, 인간 말초혈액으로부터 분리된 심장내막 유래 성체줄기세포를 이용하여 높은 효율로 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법을 확립하고, 상기 제조된 유도만능 줄기세포를 심혈관계 세포인 내피세포, 평활근세포, 및 심근세포로 성공적으로 분화시킴으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 심장내막 유래 성체줄기세포를 이용하여 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법, 및 이에 의해 제조된 유도만능 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유도만능 줄기세포로부터 내피세포, 평활근세포, 및 심근세포를 분화시키는 방법, 및 이에 의해 분화된 내피세포, 평활근세포, 및 심근세포를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 분화방법으로 분화된 내피세포, 평활근세포, 또는 심근세포를 유효성분으로 포함하는, 심혈관 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
(a) 심장내막 유래 성체줄기세포에 SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2), c-MYC(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog), OCT4(Octamer-binding transcription factor 4), 및 KLF4(Kruppel-like factor 4) 유전자를 도입하는 단계;
(b) 상기 유전자가 도입된 세포를 EGM-2MV(Microvascular Endothelial Cell Growth Media-2) 배지로 8 내지 12일 동안 매일 교환하면서 배양하여 상피세포 유사 세포를 얻는 단계; 및
(c) 상기 세포를 지지세포 위로 올리고 EGM-2MV 배지로 3 내지 7일 동안 배양 후 ES(Embryonic stem cell) 배지로 교환하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 심장내막 유래 성체줄기세포는 말초혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 EGM-2MV 배지에 현탁하여 씨딩(seeding)한 후, 5 내지 8일 동안 매일 배지를 교환하면서 T세포를 제거하여 배양함으로써 수득되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 지지세포는 마우스 유래 배아 섬유아세포주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ES 배지는 넉아웃 혈청 대체제(knockout serum replacement), L-글루타민(L-glutamine), 비필수 아미노산(non essential amino acids), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 및 bFGF가 처리된 DMEM/f12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 유도만능 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 유도만능 줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타낼 수 있다.
(a) ALP(Alkaline phosphatase), OCT4, NANOG(Nanog homeobox), 및 TRA-1-81에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
(b) in vitro 및 in vivo에서 삼배엽으로의 분화능을 나타냄; 및
(c) 부착되어 성장하며, 배아줄기세포의 형태학적 특성과 유전적 특성을 나타냄.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포로부터 내피세포로의 분화방법을 제공한다.
(a) 상기 유도만능 줄기세포에 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제를 처리하고 1 내지 3일간 배양하여 중배내엽세포로 분화시키는 단계;
(b) 상기 중배내엽세포에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4)와 Akt(Protein kinase B; PKB) 억제제를 처리하여 중배엽세포로 분화시킨 후 성장인자를 처리하고 매일 배지를 교환하며 7 내지 10일 동안 배양하여 CD34 양성세포를 얻는 단계; 및
(c) 상기 CD34 양성세포에 상기 성장인자를 재처리하고 매일 배지를 교환하면서 10 내지 20일 동안 계대배양하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 Akt 억제제는 PD98059(2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성장인자는 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 bFGF(Basic fibroblast growth factor)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분화방법에 의해 분화된, 내피세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포로부터 평활근세포로의 분화방법을 제공한다.
(a) 상기 유도만능 줄기세포에 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제를 처리하고 1 내지 3일간 배양하여 중배내엽세포로 분화시키는 단계;
(b) 상기 분화된 중배내엽세포에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4)와 PI3K(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase) 억제제를 처리하고 1 내지 2일 동안 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 중배내엽세포에 성장인자를 처리하고 12 내지 16일 동안 계대배양하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 PI3K 억제제는 LY294002(2-(4-morpholino)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성장인자는 PDGF-BB(Platelet-derived growth factor-BB) 및 TGF-β(Transforming growth factor-beta)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분화방법에 의해 분화된, 평활근세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포로부터 심근세포로의 분화방법을 제공한다.
(a) 상기 유도만능 줄기세포를 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), 비타민 C, 액티빈 A(Activin A), 및 인슐린이 제거된 B27 보충제가 포함된 배지에서 20 내지 30시간 동안 배양하여 중배엽세포로 분화시키는 단계;
(b) 상기 분화된 중배엽세포를 BMP4, 성장인자, 및 인슐린이 제거된 B27 보충제가 첨가된 배지에서 2 내지 4일 동안 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 세포를 인슐린이 제거된 B27 보충제가 포함된 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하고 Wnt(Wingless-type MMTV integration site family) 신호전달 억제제를 첨가하여 1 내지 3일 동안 배양한 후, 인슐린을 함유하는 B27 보충제가 포함된 배지에서 추가 배양하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 성장인자는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Wnt 신호전달 억제제는 IWP2(N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분화방법에 의해 분화된, 심근세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분화된 내피세포, 평활근세포, 또는 심근세포를 유효성분으로 포함하는, 심혈관 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 심혈관 질환은 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 고지혈증, 뇌졸중, 동맥경화, 고혈압, 부정맥, 뇌혈관 질환, 및 관상동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분화된 내피세포, 평활근세포, 또는 심근세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분화된 내피세포, 평활근세포, 또는 심근세포의 심혈관 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명의 유도만능 줄기세포 제작을 위한 초대배양세포인 심장내막 유래 성체줄기세포는 소량의 말초혈액만으로도 쉽게 분리 및 배양이 가능하고, 높은 증식력을 가지므로 유전적 변이 없이 보관할 수 있고, 세포치료에 쓰일 수 있는 정도의 세포수를 빠르게 확보할 수 있다. 또한, 줄기세포능(stemness)을 가지고 있어 종래에 사용하던 피부 섬유아세포보다 4가지 야마나카 인자의 형질도입을 통한 유도만능 줄기세포의 제작효율이 높고, 심장내막 기원을 가지므로 심혈관계세포의 후생학적 기억을 가지고 있기 때문에 유도만능 줄기세포를 제작한 후 높은 효율로 내피세포, 평활근세포, 및 심근세포 등의 심혈관계 세포로 분화시킬 수 있는 장점이 있다. 따라서 상기 유도만능 줄기세포로부터 분화된 심혈관계 세포는 심혈관계 질환의 치료제 개발을 위한 치료물질의 라이브러리 스크리닝 및 심혈관계 질환의 치료를 위한 기전 연구에 이용될 수 있으며, 또한 직접 세포에 조작을 가하고 증식시켜 환자에게 다시 주입함으로써 세포치료제로 이용하는 등 다양한 분야에 널리 활용될 것으로 기대된다.
도 1a는 사람 혈액에서 분리한 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 야마나카 인자(SOX2, c-MYC, OCT4, 및 KLF4)가 형질도입된 심장내막 유래 성체줄기세포(CiMS)를 배양하는 과정을 시간 흐름에 따라 그림으로 도시하여 나타낸 것이다.
도 1b는 야마나카 인자가 형질도입된 CiMS를 지지세포 위에 올린 후 점차적인 ES 배지로의 교환이 유도만능 줄기세포(iPSC)의 제작에 효율적임을 보여주는 결과이다.
도 1c는 기증자의 말초혈액에서 분리하여 배양한 CiMS(좌), 야마나카 인자의 형질도입 8일 후 형성된 콜로니(중앙), 및 지지세포 위에서 배양중인 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)(우)의 현미경 사진이다.
도 2a는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)의 미분화능을 검증하기 위하여 알카라인 포스파타제(ALP) 염색 및 면역형광염색을 통해 미분화 마커 유전자의 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 2b는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)의 미분화능을 검증하기 위하여 RT-PCR을 통해 미분화 마커 유전자들의 mRNA 발현수준을 확인한 결과이다.
도 2c는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)의 미분화능을 검증하기 위하여 마이크로어레이를 통해 전체적인 유전자 발현패턴을 비교분석한 결과이다.
도 3a는 in vitro에서 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)의 삼배엽 분화능을 검증하기 위하여 면역형광염색을 통해 삼배엽 마커 유전자들의 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 3b는 in vitro에서 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)의 삼배엽 분화능을 검증하기 위하여 미분화 또는 분화된 CiMS-iPSC에서 삼배엽 마커 유전자들의 mRNA 발현수준을 비교분석한 결과이다.
도 3c는 in vivo에서 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)의 기형종(teratoma) 형성을 통해 생체 내 삼배엽 분화능을 확인한 결과이다.
도 4a는 CiMS, 피부 섬유아세포, 및 293T 세포에 GFP를 발현하는 레트로바이러스를 형질도입시켜 그 효율성을 비교한 결과이다.
도 4b는 CiMS와 피부 섬유아세포에 야마나카 인자를 형질도입한 후 9일째에 알카라인 포스파타제(ALP) 염색을 수행하여 iPSC 제작 효율을 비교한 결과이다.
도 5는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC) 은행 구축과정을 단계별로 나타낸 것이다.
도 6a는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 내피세포로의 개략적인 분화 과정 및 분화 프로토콜을 그림으로 도시한 것이다.
도 6b는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 분화된 내피세포와 양성대조군인 사람 배꼽 정맥 내피세포(HUVEC)의 형태를 현미경하에서 관찰하여 비교한 결과이다.
도 6c는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 분화된 내피세포와 양성대조군인 사람 배꼽 정맥 내피세포(HUVEC)의 일산화질소(nitric oxide) 농도를 측정하여 비교한 결과이다.
도 6d는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 분화된 내피세포에서 내피세포 발현 마커인 PECAM 및 VE-Cadherin의 발현, 마트리겔 튜브 형성, LDL 흡수능 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 평활근세포로의 개략적인 분화 과정 및 분화 프로토콜을 그림으로 도시한 것이다.
도 7b는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 분화된 평활근세포에서 면역형광염색을 통해 평활근세포 마커(Calponin, SMA)의 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 7c는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 분화된 평활근세포와 양성대조군인 사람 위 혈관 평활근세포(hVSMC)에서 웨스턴 블롯팅을 통해 평활근세포 마커(Calponin, SMA)의 단백질 발현수준을 비교한 결과이다.
도 7d는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 분화된 평활근세포와 양성대조군인 사람 위 혈관 평활근세포(hVSMC)에서 RT-PCR을 통해 평활근세포 마커(Calponin, SMA, SM22α)의 mRNA 발현수준을 비교한 결과이다.
도 8a는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 심근세포로의 개략적인 분화 과정 및 분화 프로토콜을 그림으로 도시한 것이다.
도 8b는 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(CiMS-iPSC)로부터 심근세포로 분화된 beating 배아체의 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
본 발명은 말초혈액에서 분리된 심장내막 유래 성체줄기세포를 초대배양세포(primary cell)로 하여 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 유도만능 줄기세포를 심혈관계 세포로 분화시키는 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
(a) 심장내막 유래 성체줄기세포에 SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2), c-MYC(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog), OCT4(Octamer-binding transcription factor 4), 및 KLF4(Kruppel-like factor 4) 유전자를 도입하는 단계;
(b) 상기 유전자가 도입된 세포를 EGM-2MV(Microvascular Endothelial Cell Growth Media-2) 배지로 8 내지 12일 동안 매일 교환하면서 배양하여 상피세포 유사 세포를 얻는 단계; 및
(c) 상기 세포를 지지세포 위로 올리고 EGM-2MV 배지로 3 내지 7일 동안 배양 후 ES(Embryonic stem cell) 배지로 교환하는 단계.
본 발명에서 사용되는 용어 “줄기세포(stem cell)”란, 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서, 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells), 이 세포들이 계속 분열해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기, 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)”는 역분화 줄기세포로써 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌린, 배아 줄기세포처럼 만능성을 유도해낸 세포를 의미한다. 2006년 교토대 야마나카 신야 교수는 생쥐의 피부 섬유아세포에 몇 가지 유전자를 도입하여 배아줄기세포처럼 만능성을 가진 줄기세포를 만들었으며, 2007년 성인의 피부세포에 유전자를 도입하여 유도만능 줄기세포를 만드는데 성공했다. 상기 유전자들은 야마나카 인자라고도 불리는 SOX2, c-MYC, OCT4, 및 KLF4이며, 본 발명에서도 심장내막 유래 성체줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하기 위하여 상기 4가지 유전자를 도입하였다.
상기 (a) 단계의 심장내막 유래 성체줄기세포는 말초혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 EGM-2MV 배지에 현탁하여 씨딩(seeding)한 후, 5 내지 8일 동안 매일 배지를 교환하면서 T세포를 제거하여 배양함으로써 수득될 수 있다. 본 발명에서는 상기 방법으로 수득된 심장내막 유래 성체줄기세포를 CiMS(Circulating Multipotent Stem Cell)으로 명명하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, “말초혈액”이란, 인간을 포함한 포유동물에서 신체를 떠도는 혈액을 말하는 것으로 동맥, 정맥, 말초혈관 등을 이용하여 다양하게 추출가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어, “말초혈액단핵세포”란, 말초혈액 내에 존재하는 단핵의 세포로서, B 세포, T 세포, 대식세포(Macrophage), 수지상세포(Dendritic cell), 자연 살해 세포(natural killer cell; NK cell) 등의 면역세포, 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구세포(granulocytes) 등을 포함한다. 상기 말초혈액단핵세포는 통상의 제조방법, 예컨대 Ficoll-Paque을 이용한 비중 원침법으로 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “유전자 도입”은 유전자 또는 유전자군을 인위적으로 세포에 도입하여 그 유전자군을 발현시키거나 또는 그 세포의 게놈에 다른 유전자(군)을 부가하는 조작을 의미한다. 유전자 도입은 리포솜 나노입자 또는 양이온성 고분자와 같은 비바이러스성 수송체를 이용하는 방법, 바이러스 수송체를 이용하는 방법, 또는 전기투과법과 같은 물리적인 방법을 통해 수행될 수 있고, 보다 바람직하게는 바이러스 수송체를 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 레트로바이러스를 이용해 유전자를 도입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 레트로바이러스는 당업계에 알려진 통상적인 세포를 이용하여 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 야마나카 인자라고 불리는 상기 SOX2, c-MYC, OCT4, 및 KLF4 유전자가 각각 클로닝된 플라스미드와 바이러스 패키징 벡터를 293T 세포에 트랜스펙션 함으로써 상기 4가지 유전자를 각각 발현하는 레트로바이러스를 생산하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 “지지세포(Feeder cells)”란, 배아줄기세포의 미분화 상태를 유지하는데 기여하는 영양인자들을 분비하고, 세포 접촉으로 매개되는 미분화 유지기작과 연관되어 있다고 알려져 있다. 지지세포에서 분비되는 신호전달 물질들은 배아줄기세포의 미분화 유지 또는 분화 개시를 조절하는데 기여한다. 지지세포로부터 분비되는 물질들은 Wnt(Wingless-type MMTV integration site family), BMPs(Bone morphogenetic proteins), TGF-β(Transforming growth factor-beta), 세포외기질(Extracellular matrix) 등이 있다. 마우스 또는 인간 유래 다양한 지지세포를 이용하여 배아줄기세포 또는 유도만능 줄기세포로 분화시킨 보고들이 있다. 본 발명에서는 지지세포로 마우스 유래 배아 섬유아세포주를 사용하였고, 바람직하게는 STO 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계에서 ES 배지는 DMEM/f12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지일 수 있고, 바람직하게는 DMEM/f12 배지에 넉아웃 혈청 대체제(knockout serum replacement), L-글루타민(L-glutamine), 비필수 아미노산(non essential amino acids), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 페니실린과 스트렙토마이신(penicillin and streptomycin), 및 bFGF를 첨가하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 방법에 따라 심장내막 유래 성체줄기세포에 SOX2, c-MYC, OCT4, 및 KLF4 유전자를 도입하고 EGM-2MV 배지를 매일 교환하며 배양한 결과 약 2일째부터 상피세포 유사세포로 형태가 변화하였으며, 8 내지 12일 사이에 콜로니를 형성하였다. 상기 형성된 콜로니를 지지세포 위로 올려 배양한 결과 유전자 도입 후 약 15일째부터 유도만능 줄기세포 콜로니가 형성되기 시작하였으며, 콜로니가 형성된 후 ES 배지로 점차 교체하여 배양한 결과 안정화된 유도만능 줄기세포를 수득하였다(실시예 2-2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 유도만능 줄기세포의 특성을 확인하기 위해 관찰한 결과, 부착하여 성장하며, 배아줄기세포의 형태학적 특성과 유전적 특성을 가지고 있음을 확인하였다. 이에 더하여 미분화능을 검증 결과, ALP(alkaline phosphatase), OCT4, NANOG(Nanog homeobox), 및 TRA-1-81 등의 미분화 유전자가 mRNA 및 단백질 수준에서 발현되는 것을 확인하였으며, 배아줄기세포와 매우 유사한 유전자 발현패턴을 나타내었다(실시예 3 참조). 또한, 상기 유도만능 줄기세포는 in vitro 및 in vivo에서 삼배엽으로 분화할 수 있는 능력이 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 심장내막 유래 성체줄기세포를 이용한 유도만능 줄기세포의 제작 효율성을 검증한 결과, 심장내막 유래 성체줄기세포는 종래에 유도만능 줄기세포 제작에 이용되는 피부 섬유아세포 및 유전자 도입효율이 높은 293T 세포와 비교하여 바이러스의 형질도입 효율이 더 높았으며, ALP 염색을 통해 심장내막 유래 성체줄기세포를 이용한 경우 피부 섬유아세포보다 더 높은 효율로 유도만능 줄기세포가 제조되었음을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명자들은 상기 방법으로 심장내막 유래 성체줄기세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포를 초대배양세포와 같은 기원을 가진 심혈관계 세포로 분화시키기 위하여 내피세포, 평활근세포, 및 심근세포로 높은 효율로 분화시킬 수 있는 방법을 확립하고 그 효율을 확인하였다.
이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포로부터 내피세포로의 분화방법을 제공한다.
(a) 심장내막 유래 성체줄기세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포에 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제를 처리하고 1 내지 3일간 배양하여 중배내엽세포로 분화시키는 단계;
(b) 상기 중배내엽세포에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4)와 Akt(Protein kinase B; PKB) 억제제를 처리하여 중배엽세포로 분화시킨 후 성장인자를 처리하고 매일 배지를 교환하며 7 내지 10일 동안 배양하여 CD34 양성세포를 얻는 단계; 및
(c) 상기 CD34 양성세포에 상기 성장인자를 재처리하고 매일 배지를 교환하면서 10 내지 20일 동안 계대배양하는 단계.
상기 (a) 단계의 GSK-3 억제제는 역분화 효율을 증가시키기 위하여 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)을 이용할 수 있고, 바람직하게는 CHIR99021을 B27이 포함된 RPMI1640 배지에 희석하여 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 분화된 중배내엽세포는 바람직하게는 Brachyury T 양성세포 일 수 있다.
상기 (b) 단계의 Akt 억제제는 바람직하게는 PD98059(2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one)일 수 있고, 상기 성장인자는 바람직하게는 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 bFGF(Basic fibroblast growth factor)일 수 있으며, 성장인자의 처리는 CD34 양성세포 수가 증가될 수 있도록 적절히 조절할 수 있으나, 바람직하게는 7 내지 10일, 더욱 바람직하게는 7 내지 8일 일 수 있다.
상기 (c) 단계 전 CD34 양성세포만을 분리하는 과정을 더 포함할 수 있다. 상기 과정은 MACS(Magnetic-activated cell sorting), FACS(Fluorescent activated cell sorting), IsoRaft, 및 DEPArray로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 통해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 MACS 방법을 통해 수행될 수 있으나, CD34 양성세포만을 분리할 수 있는 방법이라면 통상적인 방법으로 당업자가 적절히 선택하여 수행 가능하다.
상기 (c) 단계에서 CD34 양성세포는 보다 구체적으로 VEGF 및 bFGF가 재처리된 EGM(Endothelial cell growth media) 배지에 부유시켜 마트리겔이 코팅된 플레이트에 접종하여 배양될 수 있으며, 내피전구세포로 분화되면 매일 배지를 교환하면서 10 내지 20일, 보다 바람직하게는 10 내지 15일 동안 계대배양함으로써 성숙한 내피세포를 수득할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 방법을 통해 심장내막 유래 성체줄기세포에서 제조된 유도만능 줄기세포로부터 분화된 내피세포를 수득하였으며, 상기 내피세포는 사람 배꼽 정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells; HUVEC)와 비교하였을 때 형태 및 총 일산화질소의 양이 유사하였고, 내피세포 발현 마커인 PECAM 및 VE-Cadherin을 발현하였으며, 마트리겔 튜브 형성법 및 저밀도지질단백질(LDL) 흡수능을 통해서도 내피세포로 분화되었음을 확인하였다(실시예 7-1 및 7-2 참조).
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포로부터 평활근세포로의 분화방법을 제공한다.
(a) 심장내막 유래 성체줄기세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포에 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제를 처리하고 1 내지 3일간 배양하여 중배내엽세포로 분화시키는 단계;
(b) 상기 분화된 중배내엽세포에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4)와 PI3K(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase) 억제제를 처리하고 1 내지 2일 동안 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 중배내엽세포에 성장인자를 처리하고 12 내지 16일 동안 계대배양하는 단계.
상기 유도만능 줄기세포로부터 중배내엽세포로 분화시키는 (a) 단계는 상기 내피세포로의 분화방법에서와 동일하게 수행될 수 있으며, 상기 중배내엽세포는 Brachyury T 양성세포일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 상기 PI3K 억제제는 바람직하게는 LY294002(2-(4-morpholino)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (c) 단계에서 성장인자는 바람직하게는 PDGF-BB(Platelet-derived growth factor-BB) 및 TGF-β(Transforming growth factor-beta)일 수 있고, 성장인자 처리 후 분화된 평활근 전구세포를 type II 콜라겐이 코팅되어 있는 디쉬로 접종하고 12 내지 16일, 보다 바람직하게는 14 내지 16일 동안 계대배양함으로써 성숙한 평활근세포를 수득할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 방법을 통해 심장내막 유래 성체줄기세포에서 제조된 유도만능 줄기세포로부터 분화된 평활근세포를 수득하였으며, 양성 대조군인 사람 위 혈관 평활근세포(human gastric vascular smooth muscle cell; hVSMC)와 비교하였을 때, 면역형광염색과 웨스턴 블롯팅을 통해 평활근세포 마커 유전자 발현을 검증한 결과 CNN1(calponin) 및 SMA 단백질이 양성 대조군세포와 거의 유사한 수준으로 발현되었으며, RT-PCR을 통해서도 상기 마커 유전자 및 SM22α 유전자 mRNA의 발현을 확인하였다(실시예 7-3 참조).
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 유도만능 줄기세포로부터 심근세포로의 분화방법을 제공한다.
(a) 심장내막 유래 성체줄기세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포를 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), 비타민 C, 액티빈 A(Activin A), 및 인슐린이 제거된 B27 보충제가 포함된 배지에서 20 내지 30시간 동안 배양하여 중배엽세포로 분화시키는 단계;
(b) 상기 분화된 중배엽세포를 BMP4, 성장인자, 및 인슐린이 제거된 B27 보충제가 첨가된 배지에서 2 내지 4일 동안 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 세포를 인슐린이 제거된 B27 보충제가 포함된 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하고 Wnt 신호전달 억제제를 첨가하여 1 내지 3일 동안 배양한 후, 인슐린을 함유하는 B27 보충제가 포함된 배지에서 추가 배양하는 단계.
상기 (a) 단계에서 유도만능 줄기세포는 배아체 형태로 진행될 수 있다. 상기 유도만능 줄기세포를 디스파제(dispase)를 이용하여 지지세포로부터 떼어낸 후 인슐린이 제거된 B27 보충제와 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), 비타민 C, 및 액티빈 A(Activin A)가 포함된 RPMI1640 배지(1차 배지)에서 20 내지 30시간, 보다 바람직하게는 24시간 동안 배양하여 중배엽세포로 분화시킬 수 있다.
상기 GSK-3 억제제는 바람직하게는 CHIR99021일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (a) 단계를 통해 분화된 중배엽세포는 인슐린이 제거된 B27 보충제, 농도를 낮춘 BMP4, 및 성장인자가 첨가된 RPMI1640 배지(2차 배지)에서 2 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 배양하여 심근전구세포로 분화를 유도할 수 있다. 상기 성장인자는 바람직하게는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계를 통해 배양된 세포는 (c) 단계에서 인슐린이 제거된 B27 보충제가 포함된 RPMI1640 배지(3차 배지)로 헹구어 1 내지 2일, 바람직하게는 1일 동안 배양하고 Wnt 신호전달 억제제를 첨가하여 1 내지 3일, 바람직하게는 2일 동안 배양한 후 인슐린을 함유하는 B27 보충제가 포함된 RPMI1640 배지(4차 배지)로 교환하고 추가배양하여 beating 심근세포를 수득할 수 있다.
상기 (c) 단계의 Wnt 신호전달 억제제는 바람직하게는 IWP2(N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 방법을 통해 심장내막 유래 성체줄기세포에서 제조된 유도만능 줄기세포로부터 분화된 심근세포를 수득하였으며, 현미경 관찰 결과 beating 배아체를 확인하였다(실시예 7-4 참조).
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 내피세포, 평활근세포, 또는 심근세포를 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
상기 심혈관 질환은 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 고지혈증, 뇌졸중, 동맥경화, 고혈압, 부정맥, 뇌혈관 질환, 및 관상동맥 질환에서 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 말초혈액을 이용한 CiMS 배양
사람 혈액으로부터 Ficoll-Paque를 이용해 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 분리하고 EGM-2MV 배지(Lonza; Basel, Switzerland)에 현탁한 후 10 ㎍/㎖의 피브로넥틴(fibronectin)이 코팅된 6 well 플레이트에 PBMC를 well당 4 X 106개/㎖이 되도록 분주하고 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 다음날 플레이트를 여러 번 강하게 흔들어 떠있는 세포들을 강한 suction을 통해 제거한 후, 새로운 배지로 갈아주고 배양하는 것을 7일간 반복하고 7일 이후에는 2일에 한 번 배지를 갈아주었다. 그 결과, 5-8일 사이에 심장내막 유래 성체줄기세포인 CiMS(circulating multipotent adult stem cell)의 출현을 확인할 수 있었으며, 2주 내에 CiMS가 콜로니를 형성하면서 증식하였다. 이 콜로니를 0.05% 트립신/EDTA를 이용하여 계대배양하거나 10% DMSO(dimethyl sulfoxide)가 포함되어 있는 FBS(Fetal bovine serum) stock 배지에 현탁하여 이소프로판올 프리징 컨테이너(isopropanol freezing container)에 넣어 -70℃에서 24시간 둔 다음 -190℃에서 동결보관하였다.
실시예 2. CiMS를 이용한 유도만능 줄기세포의 제작
2-1. 레트로바이러스 제작
야마나카 인자라고 불리는 4가지 유전자 즉, SOX2, c-MYC, OCT4, 및 KLF4를 각각 발현하는 레트로바이러스(retrovirus)를 제작하여 유도만능 줄기세포 제작에 이용하고자 하였다.
이를 위해, 293T 세포를 10% FBS와 항생제가 포함된 high glucose DMEM 배지에서 배양용기 면적의 90%가 될 때까지 배양하였다. 한편, 1.5 ㎖ eppendorf 튜브에 basal DMEM 배지를 800 ㎕씩 분주하고 여기에 준비된 상기 4가지 유전자 중 하나가 클로닝된 플라스미드와 패키징 벡터(packaging vector)들 즉, pVSV-G, pGag-Pol을 각 플라스미드 당 10 ㎍씩 섞어 넣고 1 ㎎/㎖의 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI) stock을 60 ㎕씩 첨가하여 잘 섞어준 후 실온에서 30분간 놓아두었다. 그 사이 트랜스펙션 효율을 높이기 위해 293T 세포를 basal DMEM 배지 5 ㎖로 2번 씻어내고 항생제가 포함되어있지 않은 high glucose DMEM 배지(10% FBS 포함) 10 ㎖을 넣어주어 항생제가 제거된 상태로 37℃ 인큐베이터에 보관하였다. 플라스미드 DNA-PEI 혼합액을 제조하고 30분 후에 항생제가 제거된 293T세포를 꺼내고, 4가지 유전자별로 각각의 플라스미드 DNA-PEI 혼합액을 파이펫으로 가볍게 한 번 섞어준 후 293T 세포 위에 방울로 떨어뜨려서 트랜스펙션(transfection)시켰다. 18시간 후 트랜스펙션된 293T 세포를 인큐베이터에서 꺼내어 37℃로 데워준 basal DMEM 배지 5 ㎖로 2번 헹구어 여분의 플라스미드 DNA-PEI 혼합액을 제거해주고 10% FBS와 항생제가 포함된 high glucose DMEM 10 ㎖을 새로 넣어준 후 37℃ 배양기에서 배양하였으며, 이때 세포가 떨어지지 않도록 주의하였다. 48시간 이후 생산된 레트로바이러스를 회수하기 위하여, 293T 세포의 배지만을 15 ㎖ 튜브에 모아 2500 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 바닥에 침전된 떨어진 세포들과 찌꺼기들이 포함되지 않도록 상층액만을 수거한 후 0.22 ㎛ 필터로 걸러주고 4℃에서 1시간 30분 동안 25000 rpm으로 초원심분리(ultracentifuge)를 수행하여 상층액에 포함되어있는 레트로바이러스를 농축시켰다. 펠렛(pellet) 상태로 가라앉은 4가지 각각의 유전자를 발현하는 레트로바이러스는 EBM-2 배지 100 ㎕에 재현탁시켜 -70℃에서 사용 전까지 보관하였다.
실시예 2-2. CiMS 유래 유도만능 줄기세포의 제작 및 배양
실시예 2-1에서 제작한 레트로바이러스를 처리하기 하루 전에, 실시예 1의 방법에 따라 얻어진 CiMS 세포를 0.05% 트립신을 처리하여 배양용기로부터 떼어내고 6 well 플레이트에 well 당 5 X 105개씩 분주한 후 다음날 2 ㎖의 배지로 갈아주었다. 배지 교환 4시간 후 실시예 2-1에서 제작한 레트로바이러스와 폴리브렌(polybrene)을 10 ㎍/㎖ 농도가 되도록 처리하고 37℃에서 18시간 이상 형질도입(transduction)을 진행하였다. 이후 새로운 EGM-2MV 배지로 교환해주고 매일 배지를 교환하면서 관찰하였다.
그 결과 형질도입 후 약 2일째부터 서서히 CiMS 세포가 상피세포 유사세포(epithelial like cell)로 형태가 변화하는 것을 볼 수 있었고, 8-12일 사이에 콜로니를 이루는 것을 확인하였다. 이 콜로니를 현미경으로 보면서 팁으로 따서 미토마이신 C(mitomycin C)가 처리된 새로운 지지세포위로 올리거나, 형질도입된 CiMS 세포 전체를 0.05% 트립신으로 떼어내어 well 당 5 X 104개씩 지지세포 위로 올려서 배양을 계속하였다. 배지는 상피세포 유사세포들이 콜로니를 다시 생성할 때까지 EGM-2MV 배지로 매일 갈아주었다. PBMC로부터 CiMS를 얻고 CiMS 콜로니를 지지세포 위로 올려 배양하기까지의 시간적 흐름을 도 1a에 그림으로 도시하였다.
한편, 지지세포는 4가지 유전자가 형질도입된 세포를 올리기 하루 전에 준비하였다. 이를 위해, 마우스 유래 배아 섬유아세포주(mouse embryonic fibroblast)인 STO 세포에 미토마이신 C를 10 ㎍/㎖의 농도가 되도록 처리하고 2시간 30분 후 STO 세포를 인산완충액(PBS)으로 씻어준 후 0.05% 트립신을 처리하여 배양용기로부터 떼어내었다. 떼어낸 세포를 4℃에서 5분 동안 900 rpm으로 원심분리한 후 0.1% 젤라틴(gelatin)이 코팅되어 있는 6 well 플레이트에 well 당 2.6 X 105개 세포를 분주하여 준비하였다. 지지세포 위로 4가지 유전자가 도입된 CiMS 세포를 올리기 전에 EBM-2 배지로 헹구어 주고 EGM-2MV 배지로 교환해주었다.
도면 1b에 나타낸 바와 같이, 지지세포 위에 올린 4가지 유전자가 형질도입된 CiMS 세포들이 모여서 상피세포 유사 세포 콜로니를 이루면 ES(embryonic stem cell) 배지와 EGM-2MV 배지를 1:1로 섞어서 교환해주었다. 다음날은 1.5:0.5로 ES 배지의 양을 늘려주면서 서서히 ES 배지에 적응시켰다. ES 배지의 조성은 DMEM/f12 배지를 기반으로 하여 20% knockout serum replacement, 2 mM L-glutamine, 1 X 10-4 M non essential amino acids, 1 X 10-4 M 2-mercaptoethanol, 및 50 units과 50 ㎎/㎖ penicillin/streptomycin으로 구성되어 있고 10 ng/㎖의 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 첨가해서 사용하였다.
지지세포위에 올린 4가지 유전자가 형질도입된 CiMS 콜로니를 ES 배지로 매일 교환해주면 형질도입 이후 빠르면 15일째부터 CiMS 유래 유도만능 줄기세포(이하 CiMS-iPSC) 콜로니가 나타나기 시작하였다. 적당하게 크기가 커진 CiMS-iPSC 콜로니는 현미경을 보면서 떼어낸 후 미토마이신 C가 처리된 새로운 STO 세포 위로 올려주고 1 ㎖ 피펫으로 피펫팅해서 콜로니를 적당한 크기로 쪼개어 주었다. 계대하는 첫날에는 배지에 ROCK 억제제인 Y-27632(trans-4-[(1R)-1-Aminoethyl]-N-4-pyridinylcyclohexanecarboxamide dihydrochloride)를 10 μM의 농도가 되도록 첨가하여 콜로니의 부착효율을 높여주었다. 상기 방법으로 CiMS-iPSC 콜로니가 안정화될 때까지 계속 계대배양 하면 도 1c 현미경 사진처럼 안정화된 CiMS-iPSC 콜로니를 획득할 수 있다.
실시예 2-3. CiMS - iPSC의 동결스탁 제작
CiMS-iPSC 라인이 확립되면 다양한 계대횟수(passage)별로 동결스탁을 제작하였다. 이를 위해서는 6 well plate의 3개 well(30개 콜로니 이상/well) 이상의 콜로니를 확보하고 진행하는 것이 나중에 동결스탁을 풀었을 때의 효율이 좋았다. 동결스탁 제작을 위해, bFGF가 포함되지 않은 ES 배지에 0.5 ㎎/㎖ 농도가 되도록 디스파제(dispase)를 섞고 0.22 μm 필터로 걸러 디스파제 용액을 만들어주었다. 그 후 배양중인 CiMS-iPSC 세포에서 배지를 제거하고 디스파제 용액을 1 ㎖씩 넣어주었다. 37℃ 배양기에서 30분 내지 1시간 배양하여 콜로니가 지지세포로부터 떨어져 부유하면 콜로니가 깨지지 않도록 ES배지 1 ㎖로 훑어서 15 ㎖ 튜브에 모아주었다. 추가적으로 ES 배지를 첨가해서 남아있는 CiMS-iPSC 콜로니를 훑어서 다 모은 후 실온에서 300 x g로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리후 상층액을 제거하고 CiMS-iPSC 펠렛을 실온에서 식혀둔 mFreSRTM(Stemcell technologies) 1 ㎖로 콜로니가 최대한 깨지지 않도록 부유시켜서 스탁용 튜브(cryovial)에 담았다. 세포를 담은 튜브는 이소프로판올이 담긴 프리징 컨테이너로 옮겨서 밤새 -70℃로 보관한 후 다음날 액체질소가 탱크(LN2 tank)로 옮겨서 장기보관하였다.
실시예 3. CiMS - iPSC의 미분화능 검증
3-1. 미분화 마커 유전자의 단백질 발현 확인
상기 실시예 1 및 2의 방법에 따라 제작된 CiMS-iPSC의 미분화능을 검증하기 위하여 알카라인 포스파타제(Alkaline phosphatase; ALP) 염색을 수행하고, 면역형광염색을 통해 미분화 마커인 Oct4, Nanog, 및 Tra-1-81 유전자의 단백질 발현을 확인하고자하였다.
ALP 염색을 위해, DAKO사의 BCIP/NBT substrate system을 이용하여 염색을 진행하였다. 구체적으로, CiMS-iPSC를 배양한 디쉬를 PBS로 2번 헹구고 PBS에 희석시킨 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액 2 ㎖을 디쉬에 넣고 실온에서 10분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 이후 PBS로 2번 헹구어주고 BCIP/NBT substrate system을 세포가 덮이도록 떨어뜨린 후 차광하여 실온에서 rocker 위에서 마르지 않도록 30분 동안 섞어주면서 반응시켰다.
다음으로, 면역형광염색을 수행하기 위하여 CiMS-iPSC를 배양한 디쉬를 PBS로 두 번 헹구어내고 -20℃에 보관한 차가운 100% 메탄올을 1 ㎖ 디쉬에 첨가한 후 즉시 -20℃로 세포를 옮겨 10분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 10분 후 세포를 꺼내어 메탄올을 버리고 0.05% TBS-T(1XTBS: Tris-Buffered Saline, 0.05% tween 20)로 5분씩 3번 씻어준 후 염색하고자 하는 부위에 Dako pen으로 동그랗게 표시를 하였다. 이후 1% BSA(Bovine Serum Albumin), 0.05% Triton X-100을 PBS에 녹이고 0.22 μm 필터로 걸러 준비한 블로킹 용액(blocking solution)을 세포가 마르지 않게 표시한 부분에 덮어준 후 실온에서 30분 동안 블로킹 과정을 실시하였다. 다음으로, 미분화 마커인 Oct4, nanog, Tra-1-81에 대한 1차 항체를 희석액에 1:100으로 희석해서 1차 항체 용액을 제조한 후 블로킹 용액을 제거하고 1차 항체 용액을 처리한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 0.05% TBS-T로 10분씩 3번 헹구어 준 후 세포가 마르지 않도록 각각의 항체에 상응하는 2차 항체 용액(1:100)을 제작하여 각각의 세포에 처리한 후 실온에서 차광하여 2시간 동안 반응시켰다. 이후 다시 0.05% TBS-T로 실온에서 10분간 3번 헹구어준 후 핵 염색을 위해 1 ㎎/㎖의 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 용액을 1:1000이 되도록 희석액에 섞어준 후 세포에 넣어주고 차광하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 형광현미경으로 DAPI가 핵에 염색이 된 것을 확인하고 0.05% TBS-T로 3번 헹구어낸 후 커버슬립(cover slip)을 이용하여 fluorescence mounting medium(DAKO사)으로 마운팅하였다.
광학현미경으로 관찰한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, ALP 염색을 수행한 경우 CiMS-iPSC가 짙은 보라색으로 염색된 것을 확인하였으며, 면역형광염색 결과 녹색 형광을 통해 CiMS-iPSC 콜로니 세포핵에서 Oct4와 Nanog가 발현되고 Tra-1-81이 세포막에서 발현되는 것을 확인하였다.
3-2. 미분화 마커 유전자의 mRNA 발현 확인
CiMS-iPSC에서 더욱 다양한 미분화 유전자의 발현을 확인하기 위하여 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 및 마이크로어레이를 수행하였다.
RT-PCR을 수행하기 위하여, CiMS-iPSC 4종류(CiMS-iPSC1, 2, 3, 및 4)와 배아줄기세포, 초대배양세포인 CiMS에서 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 수행하여 세포 내 Oct3/4, Sox2, KLF4, c-Myc, Nanog, Nodal, REX1, DNMT, ECAT4, ECAT15, FGF4, GABR3, GAL, GDF3, PH34, TDGF1, 및 UTF1 유전자의 mRNA 발현수준을 관찰하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, CiMS-iPSC는 배아줄기세포(ES)와 거의 동일하게 미분화 유전자들을 높은 수준으로 발현하였으나 초대배양세포인 CiMS에서는 상기 유전자들이 거의 발현되지 않는 것을 확인하였다.
다음으로, CiMS-iPSC 3종류(CiMS-iPSC1, CiMS-iPSC2, 및 CiMS-iPSC3), 배아줄기세포 3종류(ES1, ES2, 및 ES3), 및 초대배양세포인 CiMS 3종류(CiMS1, CiMS2, 및 CiMS3)에서 각각 RNA를 추출한 후 마이크로어레이를 수행하여 전체적인 유전자 발현패턴을 비교분석하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, CiMS-iPSC는 배아줄기세포(ES)와 동일하지는 않지만 거의 유사한 유전자 발현패턴을 보였으나, 초대배양세포인 CiMS는 상기 2가지 세포와 상반된 유전자 발현 패턴을 보이는 것을 확인하였다.
실시예 4. CiMS - iPSC의 삼배엽 분화능 검증
배아줄기세포와 같은 미분화 세포는 in vitro와 in vivo에서 내배엽, 중배엽, 외배엽의 세가지 배엽(three germ layer)을 이루는 세포들로 분화가 가능하고 특히 in vivo에서는 기형종(teratoma)을 형성할 수 있는 능력이 있다. 따라서 실시예 1 및 2를 통해 제작된 CiMS-iPSC가 삼배엽으로의 분화능을 가지는지 확인하고자 하였다.
4-1. In vitro 에서 CiMS - iPSC의 삼배엽 분화능 확인
In vitro에서 삼배엽 분화능을 확인하기 위하여, CiMS-iPSC를 0.5 U/㎖의 디스파제를 이용하여 배아체(embryonic body; EB)로 만들고 bFGF가 포함되어있지 않은 ES 배지에서 장기간 유지하면서 자발적인 분화를 유도하였다. 배아체로 배양중인 세포는 부유상태에서 일주일간 배양하고 0.5% 젤라틴이 코팅된 디쉬에 부착시켜 2주일간 더 배양한 후 면역형광염색법을 수행하여 내배엽 마커인 AFP(Alpha-FetoProtein), 중배엽 마커인 α-SA(α-sarcomeric actin)와 SMA(Smooth muscle actin), 및 외배엽 마커인 Nestin, GFAP(Glial fibrillary acidic protein), β-III tubulin의 발현 여부를 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, CiMS-iPSC에서 상기 내배엽, 중배엽, 및 외배엽 마커들이 모두 발현하고 있음을 확인하였다. 상기 결과를 통해 CiMS 유래 유도만능 줄기세포가 배아줄기세포와 마찬가지로 세 가지 배엽의 세포로의 분화가 가능한 전분화능(pluripotency)을 가지고 있음을 알 수 있었다.
이에 더하여, 상기와 동일한 방법으로 CiMS-iPSC 세포를 준비하고 세 가지 배엽으로 분화시키는 배양 조건하에서 분화(D)와 미분화 상태(U)의 CiMS-iPSC에서 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 통해 각 배엽별 분화마커(내배엽: AFP, GATA4, 중배엽: TnTc, Brachyury T, 외배엽: BMP4, Ncam1)의 발현량을 관찰하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 분화된 CiMS-iPSC에서 각 배엽별 분화마커들이 발현되는 것을 확인함으로써 유전적 발현을 통해 삼배엽으로의 분화능이 있음을 알 수 있었다.
4-2. In vivo 에서 CiMS - iPSC의 삼배엽 분화능 확인
In vivo에서 기형종(teratoma) 형성 실험을 실시하기 위하여, 0.5 U/㎖의 디스파제를 처리해 CiMS-iPSC를 지지세포에서 떼어내고 15 ㎖ 튜브에 수거한 후 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 상기 펠렛을 얼음 위에서 마트리겔과 섞은 후 마트리겔-CiMS-iPSC를 NOD-SCID 마우스의 좌우측 배의 복강에 주입하고 12주 이상 관찰하였다. 기형종이 일정크기 이상 성장하면 마우스로부터 기형종을 떼어내어 적당한 크기로 자르고 4% 파라포름알데히드에 담궈 고정시킨 후 파라핀 블록을 만들어서 조직 슬라이드 절편으로 컷팅하였다. 컷팅된 조직절편은 100% 자일렌(xylene)에 10분씩 2번 담궈 파라핀을 녹이고, 100% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올에 차례로 5분씩 담그고 마지막에 물로 헹구어 주었다. 파라핀이 제거된 조직 슬라이드는 H&E(Hematoxyrin & Eosin) 염색을 진행하여 현미경 하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 형태학적 차이를 통해 세 가지 배엽으로부터 분화되어 생성된 여러 조직들을 관찰하였다.
상기 결과들을 통해 CiMS 유래 유도만능 줄기세포가 in vitro와 in vivo에서 삼배엽으로 분화할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. CiMS - iPSC의 제작효율 비교
상기 실시예 1 및 2의 방법을 통해 제작된 CiMS-iPSC의 제작 효율을 비교하기 위하여, 실시예 2-1의 방법에 따라 GFP(Green Fluorescent Protein)를 발현하는 레트로바이러스를 제작한 후 CiMS, 피부 섬유아세포, 및 293T 세포로의 바이러스 형질도입 효율을 비교하였다.
그 결과, CiMS에서는 13.3 X 103 TU/㎕(Transduction Units/㎕)의 바이러스 역가를 보인 반면, 피부섬유아세포는 8.3 X 103 TU/㎕, 형질도입이 잘 되는 세포로 알려져 있는 293T 세포는 11.3 X 103 TU/㎕의 역가를 나타내었다. 이러한 결과는 도 4a에 나타낸 바와 같이 GFP를 발현하는 레트로바이러스의 형질도입 효율성의 차이(CiMS : 93.8%, 피부 섬유아세포 : 49.4%, 293T 세포 : 76.4%)를 가져왔다.
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, CiMS와 피부 섬유아세포에 야마나카 인자를 형질도입시킨 후 ALP 염색을 실시한 결과, CiMS의 경우 ALP 양성 콜로니가 66%로 피부 섬유아세포의 경우인 44%에 비하여 1.5배 증가한 비율을 나타내었다. 상기 결과를 통해 야마나카 인자를 발현하는 레트로바이러스를 사용하여 유도만능 줄기세포를 제작할 때 널리 사용되는 초대배양세포인 피부 섬유아세포에 비해 CiMS가 1.5배 더 높은 효율로 iPSC를 제작할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. CiMS - iPSC 은행의 제작
상기 실시예 1 및 2의 방법에 따라 제작한 CiMS-iPSC 은행을 제작하기 위하여, 도 5에 나타낸 과정을 통해 인간 유래 유도만능 줄기세포(iPSC) 은행을 자체적으로 구축할 수 있었다.
구체적으로, 0세(제대혈)부터 77세 연령의 건강한 자원자 및 심장근증, 심장이식환자, 이형성 협심증환자 등의 심혈관계 질환을 가진 환자들의 혈액에서 CiMS를 분리하여 CiMS 유래 iPSC들을 주로 제작하였고, 피부섬유아세포를 이용해서 만든 루게릭병 (Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 척수숨뇌근육위축(Kenndey syndrome) 환자의 iPSC나, 소변에서 획득한 세포로 만든 iPSC, 탈모(Alopecia) 환자의 모유두세포(Dermal Papilla Cell)를 이용해 제작한 iPSC 등도 CiMS유래 iPSC와의 제작효율 비교를 위해 제작하여 보존하는 등 약 55개주의 CiMS 유래 iPSC주로 구성하였다.
CiMS 유래 iPSC 제작 효율에는 혈액을 제공하는 자원자의 연령, 성별이 영향을 미치지는 않았다. 이렇게 보관중인 CiMS-iPSC는 심혈관 질환의 기작 연구 및 환자 맞춤형 세포로 분화시켜 질환모델로서 사용하여 신약 스크리닝에 사용되는 등의 많은 응용가능성이 있다.
실시예 7. CiMS - iPSC를 이용한 심혈관계 세포로의 분화
7-1. CiMS - iPSC로부터 중배내엽세포로의 분화
6 well 플레이트의 well 당 1 ㎎의 농도가 되도록 마트리겔을 넉아웃 혈청 대체제(Knockout serum replacement)와 bFGF가 포함되지 않은 ES 배지에 희석하여 플레이트를 코팅한 후 30분 동안 37℃ 인큐베이터에 넣어두었다. 30분 후 마트리겔 용액을 제거하고 상기와 동일한 ES 배지로 1번 플레이트를 헹구어주었다. 한편, mTeSRTM1(Stem cell Technologies) 1 ㎖을 적당한 크기로 잘라서 떼어낸 CiMS-iPSC와 섞어주고, 새로운 mTeSRTM1 1 ㎖에 10 μM ROCK 억제제인 Y27632를 첨가한 후 CiMS-iPSC와 혼합하여 앞서 마트리겔이 코팅된 6 well 플레이트에 접종하였다. 지지세포가 없는 조건에서 mTeSRTM1 배지를 이용하여 7일 동안 매일 갈아주면서 CiMS-iPSC를 배양하였다. 7일째에 mTeSRTM1 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척한 후 StemProⓡAccutaseⓡcell dissociation reagent(Life Technologies)를 각 well에 500 ㎕씩 넣고 37℃에서 5분간 방치하여 CiMS-iPSC를 단세포 상태가 되도록 하였다. 이후 10 μM의 Y27632이 포함된 mTeSR1 1 ㎖을 well에 넣고 15 ㎖ 튜브로 세포를 전부 회수한 후 배지로 튜브를 채워서 300 x g로 3분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 단세포 펠렛은 Y27632 10 μM이 포함된 mTeSR1 1 ㎖로 풀어주고 10 ㎕를 취하여 세포 수를 측정하였다. 이후 마트리겔이 미리 코팅되어 있는 플레이트에 well 당 1.5 X 105~2 X 105 개씩 세포를 접종하였다.
다음날, 중배내엽세포(Mesoendodermal cell)로의 분화를 위해 10 μM 농도의 CHIR99021을 B27이 포함된 RPMI1640 배지에 희석하여 세포에 처리하고 2일간 배양하였다. 그 결과 75.51%의 효율로 Brachyury T를 발현하는 세포(Brachyury T positive cell)들로 분화가 된 것을 확인하였다.
이후 상기 방법을 통해 약 75%의 높은 효율로 분화된 이른 중배내엽세포부터 순차적으로 내피세포, 평활근세포, 심근세포의 세 가지조건으로 분화를 진행하였다. 그러나 분화가 끝난 직후의 세포는 전구세포(progenitor : pEC, pVSMC, pCMC)의 형질을 가지고 있기 때문에 이 세포들을 성숙시키는 일련의 단계를 거쳐 최종적으로 분화된 심혈관계 세포(Authentic cardiovascular cell : aEC, aVSMC, aCMC)를 확보할 수 있었다.
실시예 7-2. CiMS - iPSC의 내피세포로의 분화 확인
상기 실시예 7-1의 방법으로 분화시킨 중배내엽세포로부터 내피세포로 분화시키기 위하여, 도 6a에 도시한 그림 및 분화 프로토콜에 따라 분화된 상기 중배내엽세포에 25 ng/㎖의 BMP4와 10 μM의 Akt 억제제인 PD98059를 2일 동안 처리하여 중배엽세포로 분화되도록 하였다. 이후 세포에 100 ng/㎖의 VEGF와 50 ng/㎖의 bFGF를 7-10일 동안 매일 배지를 갈아주면서 처리 기간을 조절하여 CD34를 발현하는 세포의 수가 증가되도록 하였다. 이후 CD34를 발현하는 세포만을 균일하게 획득하기 위해 CD34 MACS를 수행하였다. 구체적으로, 배양중인 세포의 상등액을 제거한 후, PBS로 2번 세척하고 0.05 % 트립신-EDTA를 처리하여 떼어낸 세포를 모아 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 PBS와 0.1% FBS가 포함된 MACS 세척 용액 500 ㎕로 풀어 준 후 CD34 MACS 항체(Milltary)를 50 ㎕ 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 30분 후 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 MACS LS 컬럼을 통과하는 과정을 진행하여 CD34 양성세포만을 획득하였다. CD34 양성세포를 100 ng/㎖의 VEGF와 50 ng/㎖의 bFGF가 첨가된 EGM 배지에 부유시켜 마트리겔이 코팅되어 있는 플레이트에 접종하여 내피전구세포(progenitor EC; pEC)를 얻었다. 이후 상기 EGM 배지를 매일 갈아주면서 계대배양하여 성숙내피세포(authentic EC; aEC)로 분화되도록 하였다. 이후 분화된 세포는 양성 대조군인 사람 배꼽 정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells; HUVEC)와의 비교를 통해 내피세포의 기능과 형태를 검증하고자 하였다.
현미경 관찰 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 분화된 내피세포(Normal control)는 HUVEC와 형태가 매우 유사함을 관찰하였고, 도 6c의 총 일산화질소(total nitric oxide) 양도 HUVEC와 거의 유사한 수준임을 확인하였다. 또한, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 분화된 내피세포에서 내피세포 발현 마커인 PECAM(platelet-endothelial cell adhesion molecule)과 VE-Cadherin이 발현되는 것을 관찰하였고, 마트리겔 튜브 형성(matrigel tube formation)법과 저밀도지질단백질(low density lipoprotein; LDL) 흡수능 또한 확인하였다.
상기 결과를 통해 CiMS 유래 유도만능 줄기세포로부터 내피세포로의 분화가 높은 효율로 이루어진 것을 알 수 있었다.
실시예 7-3. CiMS - iPSC의 평활근세포로의 분화 확인
평활근세포로의 분화는 상기 실시예 7-2의 내피세포 분화 방법과 동일하게 실시예 7-1의 방법으로 CiMS-iPSC로부터 분화시킨 중배내엽세포를 이용하였다. 도 7a에 도시한 그림 및 평활근세포 분화 프로토콜에 따라 상기 중배내엽세포에 100 ng/㎖의 BMP4와 PI3K 억제제인 LY294002를 10 μM이 되도록 처리하고, 다음날 EGM 배지에 2 ng/㎖의 TGF-β와 20 ng/㎖의 PDGF-BB를 첨가하여 14일 동안 배양하였다. 이 배양기간 동안 초기에 출현하는 세포들은 평활근 전구세포(progenitor VSMC; pVSMC)로서 인조적인(synthetic) 평활근세포의 형태를 보였으나, 추가 배양 후 마트리겔에서 자란 세포를 2-3 차례 type II 콜라겐이 코팅되어 있는 디쉬로 계대배양하여 성숙한 수축성의 평활근세포(authentic VSMC; aVSMC: contractile VSMC)를 얻을 수 있었다. 상기 분화된 평활근세포를 검증하기 위해 양성대조군인 사람 위 혈관 평활근세포(human gastric vascular smooth muscle cell; hVSMC)와 비교하였다.
면역형광염색과 웨스턴 블롯팅을 통해 평활근세포 마커 유전자의 단백질 발현량을 관찰한 결과, 도 7b 및 7c에 나타낸 바와 같이 CNN1(calponin) 및 SMA의 평활근세포 마커 유전자의 단백질이 양성대조군(hVSMC)와 거의 동일한 수준으로 발현되는 것을 확인하였으며, 도 7d의 RT-PCR 결과를 통해서도 CNN1(calponin), SMA, 및 SM22α 마커 유전자 mRNA의 발현량이 양성대조군보다 오히려 더 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 상기 방법으로 CiMS 유래 유도만능 줄기세포로부터 평활근세포가 높은 효율로 분화되었음을 확인하였다.
실시예 7-4. CiMS - iPSC의 심근세포로의 분화 확인
심근세포로의 분화는 CiMS-iPSC의 배아체(embryonic body) 형태에서 도 8a에 도시한 프로토콜에 따라 분화를 진행하였다. 구체적으로, 배양중인 CiMS-iPSC의 ES 배지를 제거하고 bFGF가 포함되지 않은 ES 배지에 0.5 ㎎/㎖의 디스파제를 녹여 1 ㎖씩 처리한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하여 CiMS-iPSC 콜로니가 지지세포로부터 떨어지도록 하였다. 부유된 CiMS-iPSC 콜로니를 수거하여 15 ㎖ 튜브로 옮겨 담고 bFGF가 포함되지 않은 ES 배지로 CiMS-iPSC를 2번 씻어내었다. 다음날 인슐린이 제거된 B27(B27 minus insulin)이 포함된 RPMI1640 배지(RPMI1640+B27 minus insulin)에 3 μM의 CHIR99021, 25 ng/㎖의 BMP4, 50 ㎍/㎖의 vitamin C, 및 100 ng/㎖의 Activin A를 첨가하고 상기 CiMS-iPSC 콜로니를 정확하게 24시간 동안 배양하였다. 이후 RPMI1640+B27 minus insulin 배지에 농도를 낮춘 10 ng/㎖ BMP4와 10 ng/㎖의 VEGF를 첨가하여 3일 동안 더 배양한 후, RPMI1640+B27 minus insulin 배지로 헹구어서 하루를 더 배양하였다. 다음날 Wnt 신호전달 경로를 억제하는 저분자 물질인 5 μM의 IWP2을 첨가하여 2일 동안 배양한 후 RPMI1640+B27 배지로 계속 배양하여 beating 심근세포(cardiomyocyte; CMC)를 얻었다.
상기 방법으로 분화시켜 얻은 심근세포를 현미경으로 관찰한 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, beating 배아체를 확인하였다. 상기 결과를 통해 상기 방법으로 CiMS 유래 유도만능 줄기세포로부터 심근세포로의 분화가 잘 이루어졌음을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (25)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포의 제조방법:
    (a) 심장내막 유래 성체줄기세포에 SOX2(SRY(sex determining region Y)-box 2), c-MYC(v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog), OCT4(Octamer-binding transcription factor 4), 및 KLF4(Kruppel-like factor 4) 유전자를 도입하는 단계;
    (b) 상기 유전자가 도입된 세포를 EGM-2MV(Microvascular Endothelial Cell Growth Media-2) 배지로 8 내지 12일 동안 매일 교환하면서 배양하여 상피세포 유사 세포를 얻는 단계; 및
    (c) 상기 세포를 지지세포 위로 올리고 EGM-2MV 배지로 3 내지 7일 동안 배양 후 ES(Embryonic stem cell) 배지로 교환하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 심장내막 유래 성체줄기세포는 말초혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 EGM-2MV 배지에 현탁하여 씨딩(seeding)한 후, 5 내지 8일 동안 매일 배지를 교환하면서 T세포를 제거하여 배양함으로써 수득되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 지지세포는 마우스 유래 배아 섬유아세포주인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 ES 배지는 넉아웃 혈청 대체제(knockout serum replacement), L-글루타민(L-glutamine), 비필수 아미노산(non essential amino acids), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 및 bFGF가 처리된 DMEM/f12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  5. 제1항의 제조방법에 의해 제조된, 유도만능 줄기세포.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 유도만능 줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 유도만능 줄기세포.
    (a) ALP(Alkaline phosphatase), OCT4, NANOG(Nanog homeobox), 및 TRA-1-81에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
    (b) in vitro 및 in vivo에서 삼배엽으로의 분화능을 나타냄; 및
    (c) 부착되어 성장하며, 배아줄기세포의 형태학적 특성과 유전적 특성을 나타냄.
  7. 하기의 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포로부터 내피세포로의 분화방법:
    (a) 제5항의 유도만능 줄기세포에 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제를 처리하고 1 내지 3일간 배양하여 중배내엽세포로 분화시키는 단계;
    (b) 상기 중배내엽세포에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4)와 Akt(Protein kinase B; PKB) 억제제를 처리하여 중배엽세포로 분화시킨 후 성장인자를 처리하고 매일 배지를 교환하며 7 내지 10일 동안 배양하여 CD34 양성세포를 얻는 단계; 및
    (c) 상기 CD34 양성세포에 상기 성장인자를 재처리하고 매일 배지를 교환하면서 10 내지 20일 동안 계대배양하는 단계.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)인 것을 특징으로 하는, 내피세포로의 분화방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 Akt 억제제는 PD98059(2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one)인 것을 특징으로 하는, 내피세포로의 분화방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 성장인자는 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 bFGF(Basic fibroblast growth factor)인 것을 특징으로 하는, 내피세포로의 분화방법.
  11. 제7항의 분화방법에 의해 분화된, 내피세포.
  12. 하기의 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포로부터 평활근세포로의 분화방법:
    (a) 제5항의 유도만능 줄기세포에 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제를 처리하고 1 내지 3일간 배양하여 중배내엽세포로 분화시키는 단계;
    (b) 상기 분화된 중배내엽세포에 BMP4(Bone morphogenetic protein 4)와 PI3K(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase) 억제제를 처리하고 1 내지 2일 동안 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 배양된 중배내엽세포에 성장인자를 처리하고 12 내지 16일 동안 계대배양하는 단계.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)인 것을 특징으로 하는, 평활근세포로의 분화방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 PI3K 억제제는 LY294002(2-(4-morpholino)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one)인 것을 특징으로 하는, 평활근세포로의 분화방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 성장인자는 PDGF-BB(Platelet-derived growth factor-BB) 및 TGF-β(Transforming growth factor-beta)인 것을 특징으로 하는, 평활근세포로의 분화방법.
  16. 제12항의 분화방법에 의해 분화된, 평활근세포.
  17. 하기의 단계를 포함하는, 유도만능 줄기세포로부터 심근세포로의 분화방법:
    (a) 제5항의 유도만능 줄기세포를 GSK-3(Glycogen synthase kinase 3) 억제제, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), 비타민 C, 액티빈 A(Activin A), 및 인슐린이 제거된 B27 보충제가 포함된 배지에서 20 내지 30시간 동안 배양하여 중배엽세포로 분화시키는 단계;
    (b) 상기 분화된 중배엽세포를 BMP4, 성장인자, 및 인슐린이 제거된 B27 보충제가 첨가된 배지에서 2 내지 4일 동안 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 배양된 세포를 인슐린이 제거된 B27 보충제가 포함된 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하고 Wnt(Wingless-type MMTV integration site family) 신호전달 억제제를 첨가하여 1 내지 3일 동안 배양한 후, 인슐린을 함유하는 B27 보충제가 포함된 배지에서 추가 배양하는 단계.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)인 것을 특징으로 하는, 심근세포로의 분화방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 성장인자는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)인 것을 특징으로 하는, 심근세포로의 분화방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 Wnt 신호전달 억제제는 IWP2(N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)인 것을 특징으로 하는, 심근세포로의 분화방법.
  21. 제17항의 분화방법에 의해 분화된, 심근세포.
  22. 제11항, 제16항, 또는 제21항 중 어느 한 항의 세포를 유효성분으로 포함하는, 심혈관 질환 치료용 세포치료제.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 심혈관 질환은 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 고지혈증, 뇌졸중, 동맥경화, 고혈압, 부정맥, 뇌혈관 질환, 및 관상동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는, 세포치료제.
  24. 제11항, 제16항, 또는 제21항 중 어느 한 항의 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료방법.
  25. 제11항, 제16항, 또는 제21항 중 어느 한 항의 세포의 심혈관 질환의 예방 또는 치료용도.
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