JP7154546B2 - 網膜組織の製造方法 - Google Patents
網膜組織の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7154546B2 JP7154546B2 JP2021076738A JP2021076738A JP7154546B2 JP 7154546 B2 JP7154546 B2 JP 7154546B2 JP 2021076738 A JP2021076738 A JP 2021076738A JP 2021076738 A JP2021076738 A JP 2021076738A JP 7154546 B2 JP7154546 B2 JP 7154546B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- medium
- retinal
- cell
- production method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 title claims description 275
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 102
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 538
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 255
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 166
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 139
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 111
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 81
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 81
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 78
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 75
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 74
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 68
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 66
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 claims description 60
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 claims description 60
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 claims description 59
- 230000008410 smoothened signaling pathway Effects 0.000 claims description 49
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 42
- KKVYYGGCHJGEFJ-UHFFFAOYSA-N 1-n-(4-chlorophenyl)-6-methyl-5-n-[3-(7h-purin-6-yl)pyridin-2-yl]isoquinoline-1,5-diamine Chemical compound N=1C=CC2=C(NC=3C(=CC=CN=3)C=3C=4N=CNC=4N=CN=3)C(C)=CC=C2C=1NC1=CC=C(Cl)C=C1 KKVYYGGCHJGEFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 101100381978 Mus musculus Braf gene Proteins 0.000 claims description 39
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 claims description 19
- LLJJDLHGZUOMQP-UHFFFAOYSA-N 3-[1-[3-(dimethylamino)propyl]-5-methoxy-3-indolyl]-4-(1H-indol-3-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical group C1=CC=C2C(C3=C(C(NC3=O)=O)C3=CN(CCCN(C)C)C4=CC=C(C=C43)OC)=CNC2=C1 LLJJDLHGZUOMQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 claims description 17
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 16
- MLSAQOINCGAULQ-QFMPWRQOSA-N (E)-SB-590885 Chemical group C1=CC(OCCN(C)C)=CC=C1C1=NC(C=2C=CN=CC=2)=C(C=2C=C3CCC(/C3=CC=2)=N\O)N1 MLSAQOINCGAULQ-QFMPWRQOSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 13
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 claims description 7
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 claims description 7
- 101100310657 Mus musculus Sox1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 claims description 6
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 claims description 6
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 claims description 5
- 101710140697 Tumor protein 63 Proteins 0.000 claims description 5
- JLOXTZFYJNCPIS-FYWRMAATSA-N (z)-3-amino-3-(4-aminophenyl)sulfanyl-2-[2-(trifluoromethyl)phenyl]prop-2-enenitrile Chemical compound C=1C=CC=C(C(F)(F)F)C=1C(\C#N)=C(/N)SC1=CC=C(N)C=C1 JLOXTZFYJNCPIS-FYWRMAATSA-N 0.000 claims description 4
- QFWCYNPOPKQOKV-UHFFFAOYSA-N 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)chromen-4-one Chemical compound COC1=CC=CC(C=2OC3=CC=CC=C3C(=O)C=2)=C1N QFWCYNPOPKQOKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GFMMXOIFOQCCGU-UHFFFAOYSA-N 2-(2-chloro-4-iodoanilino)-N-(cyclopropylmethoxy)-3,4-difluorobenzamide Chemical compound C=1C=C(I)C=C(Cl)C=1NC1=C(F)C(F)=CC=C1C(=O)NOCC1CC1 GFMMXOIFOQCCGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DVEXZJFMOKTQEZ-JYFOCSDGSA-N U0126 Chemical compound C=1C=CC=C(N)C=1SC(\N)=C(/C#N)\C(\C#N)=C(/N)SC1=CC=CC=C1N DVEXZJFMOKTQEZ-JYFOCSDGSA-N 0.000 claims description 4
- ACWZRVQXLIRSDF-UHFFFAOYSA-N binimetinib Chemical compound OCCONC(=O)C=1C=C2N(C)C=NC2=C(F)C=1NC1=CC=C(Br)C=C1F ACWZRVQXLIRSDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 claims description 3
- 101150092239 OTX2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 3
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 70
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 63
- 210000001164 retinal progenitor cell Anatomy 0.000 description 51
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 50
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 43
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 39
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 38
- VFSUUTYAEQOIMW-YHBQERECSA-N 3-chloro-N-[trans-4-(methylamino)cyclohexyl]-N-[3-(pyridin-4-yl)benzyl]-1-benzothiophene-2-carboxamide Chemical group C1C[C@@H](NC)CC[C@@H]1N(C(=O)C1=C(C2=CC=CC=C2S1)Cl)CC1=CC=CC(C=2C=CN=CC=2)=C1 VFSUUTYAEQOIMW-YHBQERECSA-N 0.000 description 35
- 102100031262 Deleted in malignant brain tumors 1 protein Human genes 0.000 description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 26
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 25
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 24
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 24
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 description 24
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 description 24
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 21
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 20
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 17
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 12
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 12
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 12
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 12
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 12
- 108010038862 laminin 10 Proteins 0.000 description 12
- 101150116978 RPE65 gene Proteins 0.000 description 11
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 11
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 11
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000018471 Proto-Oncogene Proteins B-raf Human genes 0.000 description 10
- 108010091528 Proto-Oncogene Proteins B-raf Proteins 0.000 description 10
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 9
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 9
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 9
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 8
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 8
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 210000002287 horizontal cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 8
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 8
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 7
- 238000011276 addition treatment Methods 0.000 description 7
- 210000000411 amacrine cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 7
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 7
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 6
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 6
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004240 ciliary body Anatomy 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 6
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 6
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 6
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 5
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 5
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 5
- 101150101169 Rx gene Proteins 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 5
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 5
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 101710173438 Late L2 mu core protein Proteins 0.000 description 4
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 4
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 4
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 4
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 4
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 4
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 3
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 102100035363 Growth/differentiation factor 7 Human genes 0.000 description 3
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000899361 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 7 Proteins 0.000 description 3
- 101001023968 Homo sapiens Growth/differentiation factor 7 Proteins 0.000 description 3
- 101000729271 Homo sapiens Retinoid isomerohydrolase Proteins 0.000 description 3
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 3
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 3
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 3
- 230000005723 MEK inhibition Effects 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101100070645 Mus musculus Hint1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 3
- 102100031176 Retinoid isomerohydrolase Human genes 0.000 description 3
- 102000015933 Rim-like Human genes 0.000 description 3
- 108050004199 Rim-like Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 3
- -1 Synthmax Proteins 0.000 description 3
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 3
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 3
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 3
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N fasudil Chemical compound C=1C=CC2=CN=CC=C2C=1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000009459 hedgehog signaling Effects 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 3
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229940125374 mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 3
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- JNDVEAXZWJIOKB-JYRVWZFOSA-N 3-[(3-(2-carboxyethyl)-4-methylpyrrol-2-yl)methylene]-2-indolinone Chemical compound CC1=CNC(\C=C/2C3=CC=CC=C3NC\2=O)=C1CCC(O)=O JNDVEAXZWJIOKB-JYRVWZFOSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DDLZLOKCJHBUHD-WAVHTBQISA-N 6-bromoindirubin-3'-oxime Chemical compound O=C/1NC2=CC(Br)=CC=C2C\1=C\1/C(=N/O)/C2=CC=CC=C2N/1 DDLZLOKCJHBUHD-WAVHTBQISA-N 0.000 description 2
- 108010052946 Activin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000018918 Activin Receptors Human genes 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 2
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 2
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 2
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 2
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 2
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 101150041192 Otx1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 101150035427 RDH10 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 102000006757 Wnt Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010047118 Wnt Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101100459258 Xenopus laevis myc-a gene Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 2
- 108010023079 activin B Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 101150087532 mitF gene Proteins 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 2
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 description 2
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 2
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 210000002444 unipotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 1
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- ACCBNXMBIMNJHD-UHFFFAOYSA-N 3-chloro-n-[4-(methylamino)cyclohexyl]-n-[(3-pyridin-2-ylphenyl)methyl]-1-benzothiophene-2-carboxamide Chemical compound C1CC(NC)CCC1N(C(=O)C1=C(C2=CC=CC=C2S1)Cl)CC1=CC=CC(C=2N=CC=CC=2)=C1 ACCBNXMBIMNJHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VRQMAABPASPXMW-HDICACEKSA-N AZD4547 Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(CCC=2NN=C(NC(=O)C=3C=CC(=CC=3)N3C[C@@H](C)N[C@@H](C)C3)C=2)=C1 VRQMAABPASPXMW-HDICACEKSA-N 0.000 description 1
- 206010054881 Acquired pigmented retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QADPYRIHXKWUSV-UHFFFAOYSA-N BGJ-398 Chemical compound C1CN(CC)CCN1C(C=C1)=CC=C1NC1=CC(N(C)C(=O)NC=2C(=C(OC)C=C(OC)C=2Cl)Cl)=NC=N1 QADPYRIHXKWUSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010028326 Calbindin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021849 Calretinin Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710146526 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023266 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710146529 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100023275 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 239000012824 ERK inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 101150099612 Esrrb gene Proteins 0.000 description 1
- 208000009331 Experimental Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000027355 Ferocactus setispinus Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 241000197200 Gallinago media Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 description 1
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001115394 Homo sapiens Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101001051777 Homo sapiens Protein kinase C alpha type Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000288903 Lemuridae Species 0.000 description 1
- 241000288986 Lorisidae Species 0.000 description 1
- ACFGRWJEQJVZTM-LEJBHHMKSA-L Magnesium L-ascorbic acid-2-phosphate Chemical compound [Mg+2].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP([O-])([O-])=O)=C1O ACFGRWJEQJVZTM-LEJBHHMKSA-L 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000687343 Mus musculus PR domain zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101150111110 NKX2-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000009507 Nervous System Mercury Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- SUDAHWBOROXANE-SECBINFHSA-N PD 0325901 Chemical compound OC[C@@H](O)CONC(=O)C1=CC=C(F)C(F)=C1NC1=CC=C(I)C=C1F SUDAHWBOROXANE-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101150008375 Pou4f1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102100024924 Protein kinase C alpha type Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000018210 Recoverin Human genes 0.000 description 1
- 108010076570 Recoverin Proteins 0.000 description 1
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100040756 Rhodopsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000168914 Strepsirrhini Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 108700020987 Wnt-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000052547 Wnt-1 Human genes 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016200 Zinc Finger Protein GLI1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 210000002867 adherens junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 102000014823 calbindin Human genes 0.000 description 1
- 108060001061 calbindin Proteins 0.000 description 1
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002435 fasudil Drugs 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000046148 human BMP4 Human genes 0.000 description 1
- 108010046591 human laminin-511 Proteins 0.000 description 1
- 102000007573 human laminin-511 Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010019691 inhibin beta A subunit Proteins 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001955 intestinal smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N kenpaullone Chemical compound C1C(=O)NC2=CC=CC=C2C2=C1C1=CC(Br)=CC=C1N2 QQUXFYAWXPMDOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108076 lin28a gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002935 phosphatidylinositol 3 kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003197 protein kinase B inhibitor Substances 0.000 description 1
- FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N purmorphamine Chemical compound C1CCCCC1N1C2=NC(OC=3C4=CC=CC=C4C=CC=3)=NC(NC=3C=CC(=CC=3)N3CCOCC3)=C2N=C1 FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004258 retinal degeneration Effects 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- HVAKSLUOHARFLM-UHFFFAOYSA-N selenium;sodium Chemical compound [Se][Na] HVAKSLUOHARFLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5058—Neurological cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
Description
これらの製造法の出発材料である多能性幹細胞は、特に霊長類多能性幹細胞の場合、フィーダー細胞存在下で、未分化維持因子が添加され未分化状態が維持される条件(未分化維持培養法)で培養されていた。近年、未分化維持培養法の改良が進み、霊長類多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下(フィーダーフリー条件下)で、未分化維持因子添加条件にて培養する手法が報告されている(非特許文献7、非特許文献8及び非特許文献9)。
また、多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下(フィーダーフリー条件下)に、(1)未分化維持因子と、(2)MAPキナーゼキナーゼ阻害物質(MEK阻害物質)、並びに(3)PKC阻害物質又はB-Raf阻害物質、を含有する培地中で培養してから、浮遊培養に付すことにより、網膜細胞を含む細胞凝集体を高効率で形成できることを見出した。そしてこの細胞凝集体を用いれば、網膜細胞及び網膜組織を高い効率で誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下に関する:
(1)哺乳動物の多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)未分化維持因子、及び2)MEK阻害物質を含む培地で、30日を超えない期間培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜細胞又は網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。
[2]第一工程において、培地が、更にPKC阻害物質又はB-Raf阻害物質を含む、[1]の製造方法。
[3]第一工程が、無血清条件下で行われる、[1]又は[2]の製造方法。
[4]第一工程において、培養期間が0.5日間~8日間である、[1]~[3]のいずれかの製造方法。
[5]第一工程において、培養期間が1日間~6日間である、[4]の製造方法。
[6]第一工程において、培養期間が4日間~6日間である、[5]の製造方法。
[7]第一工程が接着培養法で行われる、[1]~[6]のいずれかの製造方法。
[8]未分化維持因子が、FGFシグナル伝達経路作用物質である、[1]~[7]のいずれかの製造方法。
[9]FGFシグナル伝達経路作用物質が、bFGFである、[8]の製造方法。
[10]MEK阻害物質が、PD0325901である、[1]~[9]のいずれかの製造方法。
[11]PKC阻害物質が、Go6983である、[2]~[10]のいずれかの製造方法。
[12]B-Raf阻害物質が、SB590885である、[2]~[11]のいずれかの製造方法。
[13]第一工程において、ROCK阻害物質の存在下で細胞を培養することを特徴とする、[1]~[12]のいずれかの製造方法。
[14]ROCK阻害物質が、Y-27632である、[13]の製造方法。
[15]第二工程において、細胞をソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地中で浮遊培養することを特徴とする、[1]~[14]のいずれかの製造方法。
[16]ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質がSAGである、[15]の製造方法。
[17]BMPシグナル伝達経路作用物質がBMP2、BMP4、BMP7及びGDF7からなる群から選ばれる1以上の蛋白質である、[1]~[16]のいずれかの製造方法。
[18]BMPシグナル伝達経路作用物質がBMP4である、[17]の製造方法。
[19]第二工程における培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質濃度がSAG 10nM~700nMのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達作用に相当する濃度である、[1]~[18]のいずれかの製造方法。
[20]第三工程において、第二工程の開始後1日目から9日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質が培地に添加される、[1]~[19]のいずれかの製造方法。
[21]第三工程において、第二工程開始後3日目から6日目の間にBMPシグナル伝達経路作用物質が培地に添加される、[20]に記載の製造方法。
[22]第二工程において、均一な凝集体を形成する、[1]~[21]のいずれかの製造方法。
[23]浮遊培養が、基底膜調製物非存在下で行われる、[1]~[22]のいずれかの製造方法。
[24]多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、[1]~[23]のいずれかの製造方法。
[25]人工多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、[24]の製造方法。
[26][1]~[25]のいずれかの方法により製造される網膜細胞又は網膜組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜細胞若しくは網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法。
[27]網膜細胞若しくは網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための、[1]~[25]のいずれかの方法により製造される網膜細胞又は網膜組織。
[28][1]~[25]のいずれかの方法により製造される網膜細胞又は網膜組織を有効成分として含有する、医薬組成物。
[29]網膜細胞が網膜前駆細胞及び/又は網膜層特異的神経細胞である、[28]の医薬組成物。
[30][1]~[25]のいずれかの方法により製造される網膜細胞又は網膜組織に被検物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
本発明において、「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能(特に自己複製能)を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉(外胚葉、中胚葉、内胚葉)に属する細胞系列すべてに分化し得る能力(分化多能性(pluripotency))を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はLIFを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。ES細胞の製造方法は、例えば、WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はATCCより、入手可能である。
人工多能性幹細胞は、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された(Cell, 2006, 126(4) pp.663-676)。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する(Cell, 2007, 131(5) pp.861-872;Science, 2007, 318(5858) pp.1917-1920;Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp.101-106)。人工多能性幹細胞の誘導方法についてはその後も様々な改良が行われている(例えば、マウスiPS細胞:Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76、ヒトiPS細胞: Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72)。
遺伝子発現による直接初期化で人工多能性幹細胞を製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる(Science, 2013, 341 pp. 651-654)。
また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞、Ff-I01細胞又はQHJI01細胞等のヒト人工多能性細胞株が、国立大学法人京都大学又はiPSアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞と細胞が面接着する。浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞の凝集体では、内在の細胞-基質間結合が凝集塊の内部に存在するが、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。
細胞と細胞が面接着(plane attachment)するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1%以上、好ましくは3%以上、より好ましくは5%以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬(例えばDiI)による染色や、細胞接着因子(例えば、E-cadherinやN-cadherin)の免疫染色により、観察できる。
接着培養を行う際に用いられる培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理(例えば、基底膜調製物、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、シンセマックス、ビトロネクチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工)されたものが挙げられる。
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679に記載の方法により調製することができる。血清代替物として市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KnockoutTM Serum Replacement(Life Technologies社製:以下、KSRと記すこともある。)、Chemically-defined Lipid concentrated(Life Technologies社製)、GlutamaxTM(Life Technologies社製)、B27(Life Technologies社製)、N2(Life Technologies社製)が挙げられる。
例えば、「未分化維持因子を含む培地」とは、外来性の未分化維持因子が添加された培地又は外来性の未分化維持因子を含む培地である。
本発明において、「均一な凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させ浮遊培養する際に、「一定数の分散した細胞を迅速に凝集」させることで大きさが均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
分散とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片(2細胞以上100細胞以下、好ましくは50細胞以下)又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
多能性幹細胞を分散する際、又は分散した細胞が凝集塊を形成するまでの間に、細胞保護剤で処理することにより、凝集塊を形成していない多能性幹細胞の細胞死を抑制してもよい。細胞保護剤処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ROCK(Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ)阻害物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ROCK阻害物質が挙げられる。ROCK阻害物質としては、Y-27632、Fasudil又はH-1152が挙げられる。ROCK阻害物質の濃度は、当業者であれば適宜設定できるが、例えばY-27632約50nM~200μMに相当するROCK阻害活性を示す濃度の範囲から設定できる。
例えば、多能性幹細胞を分散させる方法として、多能性幹細胞のコロニーを、細胞保護剤としてROCK阻害物質の存在下、細胞分散液(TrypLE Select)で処理し、さらにピペッティングにより分散させる方法が挙げられる。
視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞及び網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞及び網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
本発明における「網膜細胞」には、上述の網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞及び網膜層特異的神経細胞の前駆細胞が包含される。
本発明の製造方法は、下記工程を含む、網膜細胞又は網膜組織の製造方法である:
(1)哺乳動物の多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)未分化維持因子、及び2)MEK阻害物質を含む培地で30日を超えない期間培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜細胞又は網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。
第一工程における好ましい多能性幹細胞として、人工多能性幹細胞、更に好ましくはヒト人工多能性幹細胞が挙げられる。ここで人工多能性幹細胞の製造方法には特に限定はなく、上述のとおり当業者に周知の方法で製造することができるが、人工多能性幹細胞の作成工程(すなわち、体細胞を初期化し多能性幹細胞を樹立する工程)もフィーダーフリー条件下で行うことが望ましい。
第一工程で用いられる多能性幹細胞を得るための維持培養・拡大培養は、上述のとおり当業者に周知の方法で実施することができる。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は、接着培養でも浮遊培養でも実施することができるが、好ましくは接着培養で実施される。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は、フィーダー存在下で実施してもよいしフィーダーフリー条件下で実施してもよいが、好ましくはフィーダーフリー条件下で実施される。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、ヘパリン、血清、又は血清代替物を挙げることができる。また、分散により誘導される細胞死(特に、ヒト多能性幹細胞の細胞死)を抑制するために、分散の際に、Rho-associated coiled-coilキナーゼ(ROCK)の阻害物質を添加してもよい。ROCK阻害物質としては、Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152等を挙げることができる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Life Technologies社製)やTrypLE Express (Life Technologies社製)を用いることもできる。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
分散された多能性幹細胞を、新たな培養容器に播種し、第一工程に供する。
分散により誘導される細胞死(特に、ヒト多能性幹細胞の細胞死)を抑制するために、多能性幹細胞を、新たな培養容器に播種した後に、ROCK阻害物質存在下で、フィーダーフリー条件下の維持培養を継続し、その後第一工程を開始してもよい。ROCK阻害物質処理の期間は、分散により誘導される細胞死が抑制できる限り特に限定されないが、通常、12~24時間程度である。
当業者に汎用されている未分化維持因子としては、プライムド多能性幹細胞(Primed pluripotent stem cells)(例えば、ヒトES細胞やヒトiPS細胞)の場合、FGFシグナル伝達経路作用物質、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質等を挙げることができる。FGFシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子(例えば、bFGF、FGF4やFGF8)が挙げられる。また、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、TGFβシグナル伝達経路作用物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばTGFβ1、TGFβ2が挙げられる。Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質としては、例えばNodal、Activin A、Activin Bが挙げられる。ヒト多能性幹細胞(ヒトES細胞、ヒトiPS細胞)を培養する場合、未分化維持因子は好ましくはbFGFである。
また、一態様において、第一工程に用いる培地中へ、単離された未分化維持因子を外来性(又は外因性)に添加する工程を含む。あるいは、第一工程に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。具体的には、前述の基礎培地に未分化維持因子を添加した培地、又は、市販されている、未分化維持因子を含む幹細胞若しくはiPS細胞等の未分化細胞培養用の培地を第一工程において用いることができる。
本発明の方法において、培地中に含まれるMEK阻害物質の濃度は、本発明の方法により哺乳動物の網膜細胞又は網膜組織を製造し得る限り特に限定されず、MEK阻害物質の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、MEK阻害物質の濃度として、PD0325901の0.001~10μM、好ましくは0.005~5μM、特に好ましくは0.01~2.5μMのMEK阻害活性に相当する濃度の範囲が挙げられる。
本発明の方法において、第一工程の培地がPKC阻害物質を含む場合、培地中に含まれるPKC阻害物質の濃度は、本発明の方法により哺乳動物の網膜細胞又は網膜組織を製造し得る限り特に限定されず、PKC阻害物質の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、PKC阻害物質の濃度として、Go6983 0.05~10μM、好ましくは0.25~5μM、より好ましくは、0.5~2.5μMのPKC阻害活性に相当する濃度の範囲が挙げられる。
本発明の方法において、第一工程の培地がB-Raf阻害物質を含む場合、培地中に含まれるB-Raf阻害物質の濃度は、本発明の方法により哺乳動物の網膜細胞又は網膜組織を製造し得る限り特に限定されず、B-Raf阻害物質の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、B-Raf阻害物質の濃度として、SB590885 0.05~10μM、好ましくは0.25~5μM、より好ましくは、0.5~2.5μMのB-Raf阻害活性に相当する濃度の範囲が挙げられる。
(i)未分化維持因子及びMEK阻害物質を含み、PKC阻害物質及びB-Raf阻害物質を含まない培地、
(ii)未分化維持因子及びMEK阻害物質を含み、PKC阻害物質、B-Raf阻害物質、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地、
(iii) 未分化維持因子、MEK阻害物質、及びPKC阻害物質若しくはB-Raf阻害物質を含む培地、
(iv)未分化維持因子、MEK阻害物質、及びPKC阻害物質若しくはB-Raf阻害物質を含み、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地、
等が用いられる。
第一工程の後に第二工程において浮遊培養に付すことにより、多能性幹細胞の状態が変わり、細胞凝集体を高効率で製造することができる。例えば、第一工程の後に第二工程において浮遊培養に付すことにより、多能性幹細胞の状態が変わり、凝集体の質が向上し、丸く、表面が滑らかで、凝集体の内部が密な細胞凝集体を高効率で製造することが期待できる。第一工程に用いる培地は、本発明の製造方法による網膜細胞若しくは網膜組織の製造効率を著しく(例えば、第一工程を行わない場合の効率と同程度又はそれ以下まで)低減させない限り、さらなる成分(例えば、任意のシグナル伝達経路の作用又は阻害物質)を含むことができる。
一態様において、第一工程における培地が、未分化維持因子、MEK阻害物質、及びPKC阻害物質若しくはB-RAF阻害物質を含む場合、第一工程における多能性幹細胞の培養時間を1~6日間(例、1~5日間)とする。
上記の当該接着培養は、好ましくは、ラミニン511又はラミニン511のE8フラグメントで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。
このようにして第一工程により得られる細胞は、少なくとも網膜組織、網膜細胞、網膜前駆細胞、又は網膜層特異的神経細胞へ分化する能力を有する。好ましくは、第一工程により得られる細胞は、少なくとも網膜組織、網膜細胞、網膜前駆細胞、又は網膜層特異的神経細胞へ分化する能力を有する幹細胞を含む。
第一工程で得られた細胞を培地中で浮遊培養することにより細胞の凝集体を形成させる第二工程について説明する。
第一工程で得られた細胞の分散操作は、前述した、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理を含んでよい。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞保護剤添加処理と同時に、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、ヘパリン、血清、又は血清代替物を挙げることができる。また、分散により誘導される細胞死(特に、ヒト多能性幹細胞又はヒト多能性幹細胞から派生した細胞の細胞死)を抑制するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ(ROCK)の阻害物質を第二工程培養開始時から添加してもよい。ROCK阻害物質としては、Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152等を挙げることができる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Life Technologies社製)やTrypLE Express (Life Technologies社製)を用いることもできる。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
分散された細胞は上記培地中に懸濁される。
ある時点で、特定の成分を添加する場合、例えば、終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度で含む新しい培地を半量程度加える操作(半量培地交換操作)を行ってもよい。
ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば、培地交換操作を、1日に複数回、好ましくは1時間以内に複数回(例えば2~3回)行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞又は凝集体を別の培養容器に移してもよい。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャンネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルピペットマンを使ってもよい。
SAGのソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性は、当業者に周知の方法、例えばGli1遺伝子の発現に着目したレポータージーンアッセイにて決定することができる(Oncogene (2007) 26, 5163-5168)。
培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。SAGは、通常、1~2000nM、好ましくは1~1000nM、好ましくは10nM~700nM、20nM~500nM、更に好ましくは100nM~500nMの濃度で使用される。SAG以外のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上記SAGの濃度と同等のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
培地中のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、第二工程の期間中変動させてもよい。例えば、第二工程の開始時において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を上記範囲とし、2~4日間につき、40~60%減の割合で、徐々に又は段階的に該濃度を低下させてもよい。
また、基底膜調製物非存在下に凝集体を浮遊培養することも、本発明の範疇である。
(1)哺乳動物の多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)未分化維持因子、及び2)MEK阻害物質を含み、3) PKC阻害物質及びB-RAF阻害物質のいずれも含まない(例えば、分化誘導に影響を与え得る他の因子を含まない)培地で、30日を超えない期間、好ましくは0.5~8日間、より好ましくは1~6日間培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜細胞又は網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。
(1)哺乳動物の多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)未分化維持因子、及び2)MEK阻害物質を含み、3) PKC阻害物質及びB-RAF阻害物質を含まない(例えば、分化誘導に影響を与え得る他の因子を含まない)培地で、4~6日間(例、5日間)培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜細胞又は網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。
(1)哺乳動物の多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)未分化維持因子、2)MEK阻害物質、及び3)PKC阻害物質若しくはB-RAF阻害物質のいずれかを含む培地(例、1)未分化維持因子、2)MEK阻害物質、及び3)PKC阻害物質若しくはB-RAF阻害物質のいずれかを含み、かつ4)他の分化誘導に影響を与え得る因子を含まない培地)で、30日を超えない期間培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた細胞を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(例えば、SAG)を含む又は含まない無血清培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
(3)第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜細胞又は網膜組織を含む凝集体を得る第三工程。
第一工程で得られた、網膜細胞(網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞及びその前駆細胞を含む)又はこれを含む網膜組織へ分化する能力を有する細胞を第二工程で用いることにより、網膜細胞(網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞及びその前駆細胞を含む)又はこれを含む網膜組織へ分化する能力を有する細胞を含む凝集体を得ることができる。第二工程で得られる凝集体は高い品質を有しているため、当該凝集体を、適切な分化条件下で培養することにより、種々の網膜細胞や網膜組織を高い効率で誘導することが出来る。
第二工程で得られた凝集体から、網膜細胞又は網膜組織を含む凝集体を誘導する第三工程について説明する。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地(例えば、IMDMとF-12の1:1の混合液に10%KSR、450μM 1-モノチオグリセロール及び1 x Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地)を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒト多能性幹細胞(例、iPS細胞)由来の細胞の場合は、通常約1%から約20%であり、好ましくは約2%から約20%である。
第三工程で用いられる培地(好ましくは、無血清培地)は、第二工程で用いた培地(好ましくは、無血清培地)をそのまま用いることもできるし、新たな培地(好ましくは、無血清培地)に置き換えることもできる。第二工程で用いた、BMPシグナル伝達経路物質を含まない培地をそのまま第三工程に用いる場合、BMPシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加すればよい。
BMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上記の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばヒトBMP4の場合は、約0.01nMから約1μM、好ましくは約0.1nMから約100nM、より好ましくは約1.5nM(55ng/mL)の濃度となるように培地に添加する。BMP4以外のBMPシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上記BMP4の濃度と同等のBMPシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
ある時点で特定の成分(例えば、BMP4)を添加する場合、例えば、終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度で含む新しい培地を半量程度加える操作(半量培地交換操作)を行ってもよい。
ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば、培地交換操作を、1日に複数回、好ましくは1時間以内に複数回(例えば2~3回)行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞又は凝集体を別の培養容器に移してもよい。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャネルマイクロピペットを使ってもよい。
一方、Shhシグナル伝達経路作用物質の濃度が比較的高濃度(例えば、SAGについては700nM超、好ましくは1000nM以上、他のShhシグナル伝達経路作用物質については、前記濃度のSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を示す濃度)の場合には、BMPシグナル伝達経路作用物質添加時に残存するShhシグナル伝達経路作用物質の影響を抑制するために、BMPシグナル伝達経路作用物質(例、BMP4)を含む新鮮な培地に交換することが望ましい。
また、一態様において、第二工程で得られる凝集体において、第二工程開始から、18日~25日目、例えば22日目において、Pax6及び/又はChx10が発現している凝集体の割合が、例えば60%以上、好ましくは80%以上である。
また、網膜細胞及び/又は網膜組織を製造する上での別の好ましい態様において、第一工程にて、ヒト多能性幹細胞(例、ヒトiPS細胞)を、フィーダー細胞非存在下で、bFGF、MEK阻害物質(例、PD0325901)、及びB-Raf阻害物質(例、SB590885)を含有する無血清培地で、30日を越えない期間、好ましくは0.5日間~8日間、更に好ましくは1日間~6日間接着培養し、第二工程にて、第一工程で得られた細胞をソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質(例、SAG)を含有する無血清培地で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、第三工程にて、第二工程で得られた凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質(例、BMP4)を含有する無血清培地で浮遊培養する。
凝集体の表面に存在する網膜組織を、ピンセット等を用いて、凝集体から物理的に切り出すことも可能である。この場合、各凝集体の表面には、網膜組織以外の神経組織が形成される場合もあるため、凝集体から切り出した神経組織の一部を切り取り、これを用いて後述の免疫染色法等により確認することにより、その組織が網膜組織であることを確認することが出来る。
一態様において、第三工程で得られる凝集体は、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない。網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体では、例えば、上述の凝集体凍結切片の免疫染色像において、Rx陽性の組織が観察され、その外側にRx陰性の組織が観察されない。
第三工程の実施態様の一つとして、第二工程で形成された凝集体を、Rx又はPax6遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得て、該網膜前駆細胞を含む凝集体を網膜組織が形成されるまで、引き続き無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜組織を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。網膜前駆細胞を含む凝集体を網膜組織が形成されるまで、引き続き無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する際、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地による培地交換により、網膜前駆細胞を誘導するために培地中に含まれていたBMPシグナル伝達経路作用物質濃度を、2~4日につき、40~60%減の割合で、徐々に又は段階的に低下させてもよい。一態様において、凝集体に含まれる細胞の20%以上(好ましくは、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上)が、Chx10を発現する状態となるまで、網膜前駆細胞を含む凝集体の浮遊培養が実施される。
得られた網膜組織を含む凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜組織を含む凝集体を分散処理(例えば、トリプシン/EDTA処理)し、得られた細胞をFACS又はMACSを用いて選別することにより、高純度な網膜組織構成細胞、例えば高純度な視細胞を得ることも可能である。
ここで、工程(A)の好ましい培養としては、浮遊培養を挙げることができる。
工程(A)で用いる無血清培地としては、基礎培地にN2又はKSRが添加された無血清培地を挙げることができ、より具体的には、DMEM/F12培地にN2 supplement(Life Technologies社)が添加された無血清培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地を挙げることができる。
工程(A)の無血清培地又は血清培地に含まれるWntシグナル経路作用物質の濃度としては、CHIR99021等の通常のWntシグナル経路作用物質の場合には、例えば、約0.1μMから約100μMの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約1μMから約30μMの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、3μM前後の濃度を挙げることができる。
工程(A)の無血清培地又は血清培地に含まれるFGFシグナル経路阻害物質の濃度は、凝集体の毛様体周縁部様構造への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばSU-5402の場合、約0.1μMから約100μM、好ましくは約1μMから約30μM、より好ましくは約5μMの濃度で添加する。
このような特定な期間を設定するには、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」を試料として、当該試料中に含まれるRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を、通常の遺伝子工学的手法又は生化学的手法を用いて測定すればよい。具体的には例えば、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」の凍結切片をRPE65タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色する方法を用いてRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を調べることができる。
工程(A)の「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」の日数はWntシグナル経路作用物質及び/又はFGFシグナル経路阻害物質の種類、無血清培地又は血清培地の種類、他培養条件等に応じて変化するが、例えば、14日間以内を挙げることができる。より具体的には、無血清培地(例えば、基礎培地にN2が添加された無血清培地)が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、10日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、3日間から6日間を挙げることができる。血清培地(例えば、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地)が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、12日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、6日間から9日間を挙げることができる。
工程(B)で好ましい培養としては、例えば、浮遊培養を挙げることができる。
工程(B)の無血清培地としては、基礎培地にN2又はKSRが添加された培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎児血清が添加された培地を挙げることができ、より具体的には、DMEM/F12培地に牛胎児血清が添加された血清培地を挙げることができる。
工程(B)の前記無血清培地又は血清培地に、既知の増殖因子、増殖を促進する添加剤や化学物質等を添加してもよい。既知の増殖因子としては、EGF、FGF、IGF、insulin等を挙げることができる。増殖を促進する添加剤として、N2 supplement(Life Technologies社製)、B27 supplement(Life Technologies社製)、KSR(Life Technologies社製)等を挙げることができる。増殖を促進する化学物質としては、レチノイド類(例えば、レチノイン酸)、タウリンを挙げることができる。
工程(B)の培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定すればよい。培養温度としては、例えば、約30℃から約40℃の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約37℃前後を挙げることができる。また、CO2濃度としては、例えば、約1%から約10%の範囲を挙げることができ、好ましくは、例えば、約5%前後を挙げることができる。
工程(B)の「毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」を得られるまでの上記の培養日数は無血清培地又は血清培地の種類、他培養条件等に応じて変化するが、例えば、100日間以内を挙げることができる。前記培養日数として、好ましくは、例えば、20日間から70日間を挙げることができ、より好ましくは、例えば、30日間から60日間を挙げることができる。
工程(C)で用いる無血清培地としては、基礎培地にN2又はKSRが添加された無血清培地を挙げることができ、より具体的には、DMEM/F12培地にN2 supplement (Life Technologies社)が添加された無血清培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地を挙げることができる。
工程(C)で用いる無血清培地に、前述のWntシグナル経路作用物質に加えて、前述のNodal/Activinシグナル経路作用物質、及び/又は、前述のFGFシグナル経路阻害物質を含んでもよい。
ここで、工程(C)の好ましい培養としては、浮遊培養を挙げることができる。
工程(D)で用いられるActivinシグナル経路作用物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばRecombinant Human/Mouse/Rat Activin A (R&D systems社 #338-AC)の場合、約1ng/mlから約10μg/ml、好ましくは約10ng/mlから約1μg/ml、より好ましくは約100ng/mlの濃度となるように添加する。
Activinシグナル経路作用物質は、工程(D)の開始から例えば18日以内、好ましくは6日目に添加する。
工程(D)において、培養基質で表面処理された培養器材上で接着培養を行うことが好ましい。工程(D)における培養器材の処理に用いられる培養基質としては、凝集体由来細胞の接着培養と網膜色素上皮シートの形成を可能とする細胞培養基質が挙げられる。
本発明の製造方法により製造された、網膜細胞又はこれを含む網膜組織は、網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニングや、毒性評価における、疾患研究材料、創薬材料として有用であるので、被検物質の毒性・薬効評価用試薬とすることができる。例えば、網膜組織の障害に基づく疾患、特に遺伝性の障害に基づく疾患のヒト患者から、iPS細胞を作成し、このiPS細胞を用いて本発明の方法により、網膜細胞又はこれを含む網膜組織を製造する。網膜細胞又はこれを含む網膜組織は、その患者が患っている疾患の原因となる網膜組織の障害をインビトロで再現し得る。そこで、本発明は、本発明の製造方法により製造される網膜細胞又はこれを含む網膜組織に被検物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法を提供する。
例えば、本発明の製造方法により製造された、特定の障害(例、遺伝性の障害)を有する網膜細胞又はこれを含む網膜組織を、被検物質の存在下又は非存在下(ネガティブコントロール)で培養する。そして、被検物質で処理した網膜細胞又はこれを含む網膜組織における障害の程度を、ネガティブコントロールと比較する。その結果、その障害の程度を軽減した被検物質を、当該障害に基づく疾患の治療薬の候補物質として、選択することができる。例えば、本発明の製造方法で製造した網膜細胞又はこれを含む網膜組織の生理活性(例えば、生存促進又は成熟化)をより向上させる被検物質を、医薬品の候補物質として探索することができる。あるいは、網膜組織の障害を有する疾患等の特定の障害を呈する遺伝子変異を有する体細胞から人工多能性幹細胞を調製し、当該細胞を本発明の製造方法で分化誘導させて製造した網膜前駆細胞若しくは網膜層特異的神経細胞に被検物質を添加し、前記障害を呈するか否かを指標として当該障害の治療薬・予防薬として有効な被検物質の候補を探索することができる。
すなわち、本発明は、以下の工程を含む、毒性評価方法を包含する。
(工程1)本発明の製造方法により製造された網膜細胞又はこれを含む網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被検物質の存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
(工程2)本発明の製造方法により製造された網膜細胞又はこれを含む網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被検物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
(工程3)(工程1)及び(工程2)において測定した結果の差異に基づき、工程1における被検物質が有する毒性を評価する工程。
ここで、「被検物質の非存在下」とは、被検物質の代わりに培養液、被検物質を溶解している溶媒のみを添加することを包含する。また、「ポジティブコントロール」とは、毒性を有する既知化合物を意味する。細胞の傷害の程度を測定する方法としては、生存する細胞数を計測する方法、例えば細胞内ATP量を測定する方法、又は、細胞染色(例えば細胞核染色)と形態観察により生細胞数を計測する方法等が挙げられる。
工程3において、被検物質が有する毒性を評価する方法としては、例えば、工程1の測定値と工程2におけるネガティブコントロールの測定値を比較し、工程1の細胞の傷害の程度が大きい場合に当該被検物質が毒性を有すると判断できる。また、工程1の測定値と工程2におけるポジティブコントロールの測定値を比較し、工程1の細胞の傷害の程度が同等以上の場合に当該被検物質が毒性を有すると判断できる。
本発明は、本発明の製造方法により製造される網膜細胞又はこれを含む網膜組織の有効量を含む医薬組成物を提供する。
該医薬組成物は、本発明の製造方法により製造される網膜細胞又はこれを含む網膜組織の有効量、及び医薬として許容される担体を含む。
医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒(生理食塩水、緩衝液、無血清培地等)を用いることが出来る。必要に応じて、移植医療において、移植する組織や細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
本発明の医薬組成物は、製造方法により製造される網膜細胞又はこれを含む網膜組織を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することにより、懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して、凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いても良い。
本発明の製造方法で得られる網膜組織を、ピンセット等を用いて適切な大きさに細切し、シート剤とすることもできる。
また、本発明の製造方法で得られる細胞は、分化誘導を行う第三工程で接着培養を行うことにより、シート状の細胞に成形し、シート剤とすることもできる。
本発明の製造方法により製造される網膜細胞又はこれを含む網膜組織の障害に基づく(起因する)疾患の移植医療に有用である。そこで、本発明は、本発明の製造方法により製造される網膜細胞又はこれを含む網膜組織を含む、当該網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬及び当該治療薬を患者に投与することを含む治療方法を提供する。当該網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬として、或いは、当該網膜組織の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明の製造方法により製造された網膜細胞又はこれを含む網膜組織を用いることが出来る。移植を必要とする、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態の患者に、本発明の製造方法により製造された網膜細胞又はこれを含む網膜組織を移植し、障害を受けた網膜組織自体を補充することにより、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態を治療することが出来る。網膜組織の障害に基づく疾患としては、例えば、網膜変性症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、緑内障、糖尿病性網膜症又は新生児網膜症などが挙げられる。
また、レシピエントと免疫が適合する(例えば、HLA型やMHC型の一部又は全部が適合する)他者の体細胞から樹立した多能性幹細胞(例、人工多能性幹細胞)から、アロの網膜組織又は網膜細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植されてもよい。
Cell Applications, Inc.のhuman dermal fibroblasts(HDF)から樹立したヒト真皮線維芽細胞由来iPS細胞(201B7株、京都大学)、及び、Cellular Technology LimitedのePMBC(登録商標)から樹立したヒト末梢血由来単核球由来iPS細胞(1231A3株、京都大学)を使用した。これらiPS細胞のフィーダー細胞フリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03培地(味の素)、培養基質にはiMatrix-511(ニッピ)を使用した。
MEK阻害物質、及びPKC阻害物質又はB-Raf阻害物質で培養する工程を含む網膜組織の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたヒトiPS細胞を0.5 x TrypLE select [TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合]で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり1.2 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質としてY-27632(和光純薬)(最終濃度10 μM)を含有するStemFit培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種翌日に、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)及びPKC阻害物質としてGo6983(SIGMA)(最終濃度2 μM)を添加し6日間培養、又は、播種2日後に、PD0325901(最終濃度1 μM)及びGo6983(最終濃度2 μM)を添加し5日間培養、或いは、播種6日後に、PD0325901(最終濃度1 μM)とB-Raf阻害物質としてSB-590885(SIGMA)(最終濃度0.5 μM)を添加し1日間培養した(工程1終了)。上記阻害物質を含む培地で培養した細胞を、0.5 x TrypLE selectで処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、96穴培養プレート(PrimeSurface 96V底プレート、住友ベークライト)に1穴あたり1.2 x 104細胞になるようY-27632(最終濃度20 μM)を含んだ100 μlのgfCDM+KSR培地[45% IMDM(Life Technologies)、45% F12(Life Technologies)、10% KSR(Life Technologies)、1% Chemically defined lipid concentrate(Life Technologies)、450 μM 1-Thioglycerol(SIGMA)]に播種し、37℃、5% CO2条件下で浮遊培養した。浮遊培養開始後2日目(すなわち、浮遊培養開始2日後)までに細胞凝集体が形成された(工程2終了)。浮遊培養開始後3日目(すなわち、浮遊培養開始3日後)に、ROCK阻害物質を含まず、ヒト組み換えBMP4(R&D Systems)(4.5 nM)を含むgfCDM+KSR培地を用いて、外来性のヒト組み換えBMP4の終濃度が1.5 nM(55 ng/ml)になるように、1穴あたり50 μl追加した(工程3開始)。浮遊培養開始後6日目(すなわち、浮遊培養開始6日後)、9日目(9日後)、12日目(12日後)、15日目(15日後)には、ROCK阻害物質、及び、ヒト組み換えBMP4を含まないgfCDM+KSR培地を用いて半量培地交換し、浮遊培養開始後18日目(浮遊培養開始18日後)に、細胞凝集体を15 ml DMEM/F12+N2培地(DMEM/F-12, GlutaMAX(Life Technologies)、1 x N2 supplement(Life Technologies)、100 U/ml ペニシリン-100 μg/mlストレプトマイシン)を含んだ90 mm培養皿(浮遊培養用シャーレ、住友ベークライト)に移し、37℃、5% CO2条件下で浮遊培養を続けた。浮遊培養開始後20日目(浮遊培養開始20日後)、又は、21日目(21日後)に、細胞凝集体を4% パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、網膜前駆細胞マーカーであるChx10に対する免疫染色を、抗Chx10抗体(Exalpha)を用いて行った結果、Chx10陽性細胞が確認された(図1)。
Cellular Technology LimitedのePMBC(登録商標)から樹立したヒト末梢血由来単核球由来iPS細胞(1231A3株、京都大学)を使用した。これらiPS細胞のフィーダー細胞フリー条件下での未分化維持培養は、「Nakagawa, M. et. al., Sci. Rep. 2014 Jan 8; 4: 3594」に記載の方法に従い行った。培地は「StemFit(登録商標)」AK03培地(味の素)、培養基質にはiMatrix-511(ニッピ)を使用した。
MEK阻害物質、PKC阻害物質、又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で培養する工程を含む網膜組織の製造は以下の通り行った。未分化維持培養していたヒトiPS細胞を0.5 x TrypLE select [TrypLE select(Life Technologies)と0.5 mM EDTA/PBS(-)を等量混合]で処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、iMatrix-511(0.5 μg/cm2)でコーティングした6穴培養プレートに、1穴あたり1.2 x 104細胞播種し、ROCK阻害物質としてY-27632(和光純薬)(最終濃度10 μM)を含有するStemFit培地で、37℃、5% CO2条件下で培養した。播種2日後に、MEK阻害物質としてPD0325901(SIGMA)(最終濃度1 μM)及びPKC阻害物質としてGo6983(SIGMA)(最終濃度2 μM)を添加し5日間培養、又は、播種6日後に、PD0325901(最終濃度1 μM)を添加し1日間培養した(工程1終了)。上記阻害物質を含む培地で培養した細胞を、0.5 x TrypLE selectで処理後、セルスクレーパーを用いて剥離し、ピペッティングで単一分散後、96穴培養プレート(PrimeSurface 96V底プレート、住友ベークライト)に1穴あたり1.0 x 104細胞になるようY-27632(最終濃度20 μM)を含んだ100 μlのgfCDM+KSR培地[45% IMDM(Life Technologies)、45% F12(Life Technologies)、10% KSR(Life Technologies)、1% Chemically defined lipid concentrate(Life Technologies)、450 μM 1-Thioglycerol(SIGMA)]に播種(第二工程SAG(-))又は、gfCDM+KSR培地にSAG(Enzo)(最終濃度30 nM)を添加した培地に播種(第二工程SAG(+))し、37℃、5% CO2条件下で浮遊培養した。浮遊培養開始2日後までに細胞凝集体が形成された(工程2終了)。浮遊培養開始3日後に、ROCK阻害物質、及び、SAGを含まず、ヒト組み換えBMP4(R&D Systems)(4.5 nM)を含むgfCDM+KSR培地を、外来性のヒト組み換えBMP4の終濃度が1.5 nM(55 ng/ml)になるように、1穴あたり50 μl追加した(工程3開始)。浮遊培養開始6日後、9日後、12日後、15日後、及び18日後には、ROCK阻害物質、SAG、及びヒト組み換えBMP4を含まないgfCDM+KSR培地を用いて半量培地交換を実施した。浮遊培養開始10日後、細胞凝集体を顕微鏡で観察した結果(図2)、無処理、及び、MEK阻害物質1日処理では、第二工程SAG(-)で凝集体の崩れが見られたのに対し、第二工程SAG(+)では凝集体の崩れはほとんど見られなかった。MEK阻害物質5日処理、及び、MEK阻害物質+PKC阻害物質5日処理では、第二工程のSAG有無に関わらず凝集体の崩れは見られなかった。浮培養開始22日後に、細胞凝集体を4% パラホルムアルデヒドで固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、網膜前駆細胞マーカーであるPax6、及び、Chx10に対する免疫染色を、抗Pax6抗体(Covance)、抗Chx10抗体(Exalpha)を用いて行った結果、Pax6、Chx10共陽性細胞が確認された(図3)。
Claims (21)
- 下記工程(1)、(2)及び(3)を含む、Oct3/4、Sox1、Sox2、N-cadherin、TP63、Nestin及びOtx2からなる群から選択される1以上を発現する細胞を含む細胞凝集体の製造方法;
(1)哺乳動物の多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含みMEK阻害物質を含まない培地で、維持培養又は拡大培養する第一工程、
(2)第一工程で得られた多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1)未分化維持因子、及び2)MEK阻害物質を含む培地で、4日間~6日間培養する第二工程、及び
(3)第二工程で得られた細胞を、無血清培地にて12時間~72時間浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第三工程。 - 第二工程において、培地が、更にPKC阻害物質又はB-Raf阻害物質を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 第二工程が、無血清条件下で行われる、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 第二工程が接着培養法で行われる、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 未分化維持因子が、FGFシグナル伝達経路作用物質及び/又はTGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質である、請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 未分化維持因子が、FGFシグナル伝達経路作用物質である、請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
- FGFシグナル伝達経路作用物質が、bFGFである、請求項5又は6に記載の製造方法。
- MEK阻害物質が、PD0325901、PD184352、PD98059、U0126、MEK162及びSL327からなる群から選ばれる1以上の物質である、請求項1~7のいずれか一項に記載の製造方法。
- MEK阻害物質が、PD0325901である、請求項1~7のいずれか一項に記載の製造方法。
- PKC阻害物質が、Go6983である、請求項2~9のいずれか一項に記載の製造方法。
- B-Raf阻害物質が、SB590885である、請求項2~10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第二工程において、ROCK阻害物質の存在下で細胞を培養することを特徴とする、請求項1~11のいずれか一項に記載の製造方法。
- ROCK阻害物質が、Y-27632である、請求項12に記載の製造方法。
- 第三工程において、第二工程で得られた細胞を分散させてから浮遊培養することを特徴とする、請求項1~13のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第三工程において、細胞をソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地中で浮遊培養することを特徴とする、請求項1~14のいずれか一項に記載の製造方法。
- ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質がSAGである、請求項15に記載の製造方法。
- 第三工程において、培養期間が12時間~48時間である、請求項1~16のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第三工程において、均一な凝集体を形成する、請求項1~17のいずれか一項に記載の製造方法。
- 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項1~18のいずれか一項に記載の製造方法。
- 多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、請求項1~19のいずれか一項に記載の製造方法。
- 細胞凝集体が、網膜細胞又は網膜組織へ分化する能力を有する細胞凝集体である、請求項1~20のいずれか一項に記載の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015176897 | 2015-09-08 | ||
JP2015176897 | 2015-09-08 | ||
JP2017538523A JP6884354B2 (ja) | 2015-09-08 | 2016-09-08 | 網膜組織の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017538523A Division JP6884354B2 (ja) | 2015-09-08 | 2016-09-08 | 網膜組織の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021118733A JP2021118733A (ja) | 2021-08-12 |
JP7154546B2 true JP7154546B2 (ja) | 2022-10-18 |
Family
ID=58240839
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017538523A Active JP6884354B2 (ja) | 2015-09-08 | 2016-09-08 | 網膜組織の製造方法 |
JP2021076738A Active JP7154546B2 (ja) | 2015-09-08 | 2021-04-28 | 網膜組織の製造方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017538523A Active JP6884354B2 (ja) | 2015-09-08 | 2016-09-08 | 網膜組織の製造方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180245039A1 (ja) |
EP (1) | EP3348631B1 (ja) |
JP (2) | JP6884354B2 (ja) |
CA (1) | CA2998091A1 (ja) |
WO (1) | WO2017043604A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11241460B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-02-08 | Astellas Institute For Regenerative Medicine | Photoreceptors and photoreceptor progenitors produced from pluripotent stem cells |
CN113564123A (zh) | 2014-10-24 | 2021-10-29 | 大日本住友制药株式会社 | 神经组织的制备方法 |
CN113528443B (zh) | 2014-10-24 | 2023-11-03 | 住友制药株式会社 | 视网膜组织的制备方法 |
SG11201809201UA (en) | 2016-04-22 | 2018-11-29 | Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd | Method for producing retinal tissue |
JP7360583B2 (ja) * | 2017-09-14 | 2023-10-13 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 網膜組織の製造方法 |
US20210071137A1 (en) * | 2017-11-24 | 2021-03-11 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Production method for cell mass including neural cells/tissue and non-neural epithelial tissue, and cell mass from same |
CA3086765A1 (en) * | 2017-12-28 | 2019-07-04 | Tract Pharmaceuticals, Inc. | Stem cell culture systems for columnar epithelial stem cells, and uses related thereto |
WO2022138803A1 (ja) * | 2020-12-24 | 2022-06-30 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 視細胞を含む層状の網膜組織の促成製造方法 |
CN112831461B (zh) * | 2021-02-26 | 2023-08-08 | 澳门大学 | 一种诱导干细胞分化成中胚层谱系或滋养细胞谱系的方法及药物 |
CN114717178A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-07-08 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012519005A (ja) | 2009-02-27 | 2012-08-23 | セルラー ダイナミクス インターナショナル, インコーポレイテッド | 多能性細胞の分化 |
WO2013077425A1 (ja) | 2011-11-25 | 2013-05-30 | 住友化学株式会社 | 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法 |
WO2014121077A2 (en) | 2013-02-01 | 2014-08-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | METHOD FOR GENERATING RETINAL PIGMENT EPITHELIUM (RPE) CELLS FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS (IPSCs) |
WO2015025967A1 (ja) | 2013-08-23 | 2015-02-26 | 住友化学株式会社 | 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法 |
WO2015068505A1 (ja) | 2013-11-11 | 2015-05-14 | 住友化学株式会社 | 網膜色素上皮細胞の製造方法 |
WO2015178498A1 (ja) | 2014-05-23 | 2015-11-26 | 国立大学法人東京大学 | 中皮細胞の製造方法、及び癒着防止用細胞シート |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3640326A1 (en) * | 2007-04-18 | 2020-04-22 | Hadasit Medical Research Services & Development Limited | Stem cell-derived retinal pigment epithelial cells |
US9732319B2 (en) * | 2010-12-22 | 2017-08-15 | Fate Therapeutics, Inc. | Cell culture platform for single cell sorting and enhanced reprogramming of iPSCs |
CA2937129A1 (en) * | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for manufacturing ciliary margin stem cells |
CN113564123A (zh) * | 2014-10-24 | 2021-10-29 | 大日本住友制药株式会社 | 神经组织的制备方法 |
CN113528443B (zh) * | 2014-10-24 | 2023-11-03 | 住友制药株式会社 | 视网膜组织的制备方法 |
-
2016
- 2016-09-08 CA CA2998091A patent/CA2998091A1/en active Pending
- 2016-09-08 WO PCT/JP2016/076523 patent/WO2017043604A1/ja active Application Filing
- 2016-09-08 JP JP2017538523A patent/JP6884354B2/ja active Active
- 2016-09-08 US US15/758,255 patent/US20180245039A1/en active Pending
- 2016-09-08 EP EP16844465.1A patent/EP3348631B1/en active Active
-
2021
- 2021-04-28 JP JP2021076738A patent/JP7154546B2/ja active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012519005A (ja) | 2009-02-27 | 2012-08-23 | セルラー ダイナミクス インターナショナル, インコーポレイテッド | 多能性細胞の分化 |
WO2013077425A1 (ja) | 2011-11-25 | 2013-05-30 | 住友化学株式会社 | 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法 |
WO2014121077A2 (en) | 2013-02-01 | 2014-08-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | METHOD FOR GENERATING RETINAL PIGMENT EPITHELIUM (RPE) CELLS FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS (IPSCs) |
WO2015025967A1 (ja) | 2013-08-23 | 2015-02-26 | 住友化学株式会社 | 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法 |
WO2015068505A1 (ja) | 2013-11-11 | 2015-05-14 | 住友化学株式会社 | 網膜色素上皮細胞の製造方法 |
WO2015178498A1 (ja) | 2014-05-23 | 2015-11-26 | 国立大学法人東京大学 | 中皮細胞の製造方法、及び癒着防止用細胞シート |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Nature, 2008, Vol.453, pp.519-523, Supplementary information |
第33回日本分子生物学会年会第83回日本生化学会大会合同大会講演要旨集, 2010, 4P-0894 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20180245039A1 (en) | 2018-08-30 |
CA2998091A1 (en) | 2017-03-16 |
JPWO2017043604A1 (ja) | 2018-06-28 |
EP3348631A1 (en) | 2018-07-18 |
WO2017043604A1 (ja) | 2017-03-16 |
JP2021118733A (ja) | 2021-08-12 |
EP3348631A4 (en) | 2019-03-06 |
EP3348631B1 (en) | 2023-11-29 |
JP6884354B2 (ja) | 2021-06-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7088496B2 (ja) | 網膜組織の製造方法 | |
JP7154546B2 (ja) | 網膜組織の製造方法 | |
JP7397448B2 (ja) | 神経組織の製造方法 | |
KR102388863B1 (ko) | 망막 조직의 제조 방법 | |
JP7150281B2 (ja) | 連続的な上皮を含む網膜組織の成熟化方法 | |
WO2019054514A1 (ja) | 網膜組織の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210527 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220419 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220616 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220906 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220927 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7154546 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |