CN114717178A - 一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用，该方法包括分离、纯化。本发明成功建立树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，确定了寨卡病毒（Zika virus，Zikv）对树鼩睾丸间质细胞的易感性和病毒增殖特性，为Zikv入侵生殖系统机制研究提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养及应用领域，尤其是一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用。
背景技术
寨卡病毒（Zika virus, Zikv）为单股正链RNA病毒,主要通过病毒感染的伊蚊类蚊媒叮咬传播,寨卡病毒能够靶向感染神经前体细胞，抑制神经干细胞增殖并引起其分化异常，并最终导致大脑皮层变薄、脑腔体积变大，出现小头症表现。此外，研究表明将寨卡病毒感染可导致小鼠睾丸发生炎症。严重时会引起睾丸内部结构受损及细胞大量死亡，对男性生殖健康带来潜在威胁，但其相关感染机制尚不明确。
睾丸间质细胞（Leydig cells，LCs）主要分布于生精小管之间，是睾丸主要细胞类型之一。LCs在毒理学、药理学及生殖遗传学等研究方面具有十分重要的应用意义，其功能主要是分泌睾酮，是睾丸中唯一能够分泌睾酮的细胞，可促进精子的发生和男性生殖器官发育，以及维持第二性征和性功能，大约95%的雄激素由其分泌，在生殖上具有不可替代的作用，研究发现LCs数量缺少会导致雄性激素缺乏，从而引起生殖上的问题，体外分离培养纯度高、活性强的LCs可更好的研究其相关机制和特性。
目前对LCs分离培养主要集中在大小鼠、牛羊等哺乳动物上，但对于新型实验动物树鼩的LCs分离培养鲜有报道。树鼩（Tree shrew，tupaia belangeri）在生理、生化、新陈代谢、解剖结构以及基因组等生物学特性比啮齿类更接近于非人灵长类，且由于体型小、繁殖快等特点，且对许多人类病毒易感而导致疾病，已广泛应用于人类疾病模型的研究，包括病毒感染模型、肿瘤模型、呼吸系统疾病模型和神经系统疾病模型等。
睾丸中主要有生精细胞、支持细胞和间质细胞等，其中LCs占睾丸细胞的2%~4%，数量较少且纯化难度较大，因此找到一种合适的分离纯化方法至关重要。目前对于睾丸间质细胞的分离培养主要有机械分离法、组织块贴壁法、酶消化法、percoll密度梯度离心法等几种方法，机械分离法对细胞损伤较大，组织块贴壁法杂细胞太多且周期较长，percoll密度梯度离心法得到的细胞仍存在其他杂细胞，还需要添加各种营养成分和生长因子。
如何提高分离效率，通过Zikv对LCs的感染特性研究，建立Zikv感染的睾丸细胞模型，为研究Zikv感染雄性生殖系统的相关研究提供实验基础，是值得研究的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法及其应用。
本发明是在对其他动物LCs培养与纯化方法的基础上，采用酶消化、percoll密度梯度离心及差异贴壁等分离纯化方式结合，建立树鼩LCs原代培养和纯化的高效、简单方法，为利用树鼩开展相关研究提供新的实验材料；通过Zikv对LCs的感染特性研究，建立Zikv感染的睾丸细胞模型，为研究Zikv感染雄性生殖系统的相关研究提供实验基础。
本发明的技术方案具体如下：
一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，按以下步骤进行：
步骤一：分离；
取出睾丸实质组织，清洗后将其剪碎后转入离心管内；加入1mg/mLIV胶原酶，放入CO2培养箱孵育30~35min，离心，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到离心管中，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，重复离心一次；
步骤二：纯化；
采用percoll密度梯度离心法：将分离得到的细胞悬液加于不同密度梯度的Percoll分离液上，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min离心30min；
收集37%和60%之间的细胞，后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1500r/min离心10min，沉淀加入含胎牛血清的培养液，摇匀得细胞悬液；将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1×106个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中CO2培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青-链霉素；
此时细胞中还含有少量支持细胞和其他杂细胞，根据间质细胞和支持细胞贴壁时间不同，在传代后6h更换培养液以去除杂细胞达到纯化目的，第2代和第3代的细胞仍按此步骤进一步纯化。
进一步地，分离之前还进行以下操作：
取3月龄的雄性树鼩，腹腔注射0.4ml 3%戊巴比妥钠麻醉处死后，无菌取出睾丸，75%乙醇中浸泡20 s，取出后用PBS冲洗两遍去乙醇。移入Heraguard ECO 超净工作台，去除睾丸的白膜、附睾及血管，小心取出睾丸实质组织，置于装有预冷D-Hanks液的无菌培养皿中，洗涤2遍，去除血迹。
进一步地，在percoll密度梯度离心纯化的基础上，根据支持细胞和睾丸间质细胞的贴壁速度不同，通过差异贴壁的方法，在原代细胞贴壁6~12h换液，此方法操作至第3代可得到纯度高达98%的睾丸间质细胞，并能够快速增殖，具备基础的睾酮分泌能力。
进一步地，步骤一中，加入1mg/mLIV胶原酶，放入37℃、5% CO2培养箱孵育30~35min，1000r/min离心5min，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入40目细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到15mL离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。
进一步地，步骤二中，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min离心30min；收集37%和60%之间的细胞，后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1500r/min离心10min，沉淀加入含胎牛血清的培养液，摇匀得细胞悬液；将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1×106个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中37℃，5%CO2培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青-链霉素。
本发明还涉及的上述的方法制备的物质在制备治疗Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育的药物中的应用。
本发明还涉及的一种治疗Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育的药物，其特征在于：包括上述的方法制备的物质。
与现有技术相比，本发明的有益效果具体如下：
本发明建立树鼩原代睾丸间质细胞（Leydig cells，LCs）分离培养方法，探究寨卡病毒（Zika virus，Zikv）对LCs的感染特性，为Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育提供研究基础方法3月龄的雄性树鼩0.4ml 3%戊巴比妥钠麻醉处死后采集睾丸，采用IV胶原酶和胰蛋白酶联合消化法获得单细胞悬液。
通过采用percoll 密度梯度离心结合差异贴壁法对细胞进行纯化，3β-HSD对细胞荧光染色鉴定，利用ELISA检测细胞分泌睾酮的能力；用Zikv感染树鼩LCs细胞，测定感染不同时间点的细胞及其培养上清液中病毒载量，并用对寨卡病毒易感的非洲绿猴肾细胞（vero）作为对比参照，显微镜下拍照观察细胞病变，ELISA检测细胞感染后睾酮分泌能力以确定Zikv对树鼩睾丸间质细胞的感染特性。
本发明分离培养的睾丸间质细胞纯度高，活性强，并具有连续分泌睾酮的功能；用Zikv感染树鼩睾丸间质细胞，可见典型的细胞病变，病变速度明显快于vero细胞，6h内病毒拷贝数可达2×105copies/mL，且感染后36~48h丧失睾酮分泌能力，表明Zikv可快速感染树鼩睾丸间质细胞并有效增殖;感染后可引起睾丸间质细胞功能缺失。
本发明成功建立树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，确定了Zikv对树鼩睾丸间质细胞的易感性和病毒增殖特性，为Zikv入侵生殖系统机制研究提供基础。
本发明中，睾丸间质细胞数量稀少，分离纯化难度大，本发明克服了上述技术偏见，提取纯度高，活度强，目前并未见树鼩睾丸间质细胞体外长期培养方法的报道，无可靠的方法可借鉴。
附图说明
图1为树鼩睾丸间质细胞形态学观察(10X)；其中，A为LCs培养第3天，B为培养第3代，C为培养第6代，D为培养第12代，标尺=100µm；
图2为树鼩睾丸间质细胞3β-HSD免疫荧光鉴定（10X）；
图3为树鼩睾丸间质细胞增殖曲线，其中，图为第1、2、3、4、5、6、7天与接种时细胞数量的比较，*p<0.05；
图4为不同代次LCs睾酮分泌能力测定；其中，图为第3代与第8代LCs在0~24h和24~48h内睾酮分泌量的比较；*p<0.05；
图5为寨卡感染树鼩睾丸间质细胞和vero细胞后形态学观察（20X）；其中，寨卡病毒感染树鼩睾丸间质细胞36h（A）、96h（B）和正常对照组96h细胞生长情况（C），寨卡病毒感染vero细胞36h（D）、96h（E）和正常对照组96h细胞生长情况（F）；标尺=100µm；
图6为寨卡感染睾丸间质细胞后病毒增殖曲线；其中，图为Zikv感染LCs后细胞和上清液病毒载量在6、12、24、36、48、72、96h与2h的比较；*p<0.05；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分号代表的均为质量分数。比例为质量比例，浓度为质量浓度。
材料与方法
1.1实验动物
2只3月龄普通级雄性中缅树鼩，体重95~110g，由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供。生产许可证号SCXK(滇)K2018-0002；使用许可证号SYXK(滇)K2018-0002，伦理审批号DWSP202008002，并遵循实验动物使用的3R和福利伦理原则。
1.2 主要试剂和仪器
DMEM/F12培养基（Gibco公司），胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries），IV型胶原酶（北京索莱宝），PBS（美国 Hyclone），0.25%trypsin-EDTA胰蛋白酶、青-链霉素（美国Gibco），无血清冻存液（美国Cyagen），Testosterone ELISA kit（上海碧云天），生物安全柜和CO2恒温培养箱（美国Forma），台式高速离心机（美国Beckman），细胞计数仪（美国Bio-Rad），倒置荧光相差显微镜（日本Nikon），3β-HSD小鼠单克隆IgG抗体（Santacruz），荧光标记的羊抗鼠Ig G(英国Abcam），病毒RNA提取试剂盒QIAamp®Viral RNA Mini Kit（德国Qiagen），One Step Prime Script TM RT-PCR Kit（日本TaKaRa）。
1.3病毒
Zikv GZ01株，由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心实验室-80℃冰箱保存。
1.4 树鼩睾丸间质细胞的分离、纯化
取3月龄的雄性树鼩，腹腔注射0.4ml 3%戊巴比妥钠麻醉处死后，无菌取出睾丸，75%乙醇中浸泡20 s，取出后用PBS冲洗两遍去乙醇。移入Heraguard ECO 超净工作台，用眼科剪和镊子去除睾丸的白膜、附睾及血管，小心取出睾丸实质组织，置于装有预冷D-Hanks液的无菌培养皿中，洗涤2遍，去除血迹。用眼科剪将其剪碎后转入离心管内。加入1mg/mLIV胶原酶，放入37 ℃、5% CO2培养箱孵育30min，1 000 r/min离心5 min，加入0.25%胰酶消化10min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入40目细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞。收集到15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，重复离心一次。
纯化方法采用percoll密度梯度离心法：将分离得到的细胞悬液加于不同密度梯度的Percoll分离液上，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3 000 r/min离心30 min。收集37%和60%之间的细胞,后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1 500 r/min离心10 min，沉淀加入含胎牛血清的培养液,摇匀得细胞悬液。将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1×106个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中37℃，5% CO2培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青-链霉素。此时细胞中还含有少量支持细胞和其他杂细胞，根据间质细胞和支持细胞贴壁时间不同，在传代后6h更换培养液以去除杂细胞达到纯化目的，第2代和第3代的细胞仍按此步骤进一步纯化。
1.5 树鼩睾丸间质细胞免疫荧光鉴定
间质细胞鉴定采用3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）鉴定法。将纯化后的第三代细胞接种在24孔板中，待细胞长满70%~80%时，吸去培养基，PBS洗3次，每次3min，加入4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗3次，每次3min，加入0.5%Triton X-100室温孵育2omin，PBS清洗3次，每次3min；5%山羊血清封闭30min,PBS清洗3次，每次3min，加入稀释好的鼠源性3β-HSD一抗（稀释比例1：50），同时设置对照孔（加PBS），4℃孵育过夜，将孔板用PBS清洗3次，每次3min；避光条件下加入羊抗鼠荧光二抗（1：400）室温孵育1h，PBS清洗3次，每次3min；加入DAPI染色液孵育2min，PBS清洗3次，每次3min，置于荧光显微镜下拍照观察。
1.6 间质细胞增殖曲线测定
将纯化后的第3代LCs消化成细胞悬液，按每孔1×1 05个接种于48孔板，设置1~7天共7个组，每组设置两个副孔，从接种时间起每隔24h吸去培养液并消化计数，取平均值，以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标绘制增殖曲线。
1.7 间质细胞分泌睾酮水平测定
采用Testosterone ELISA kit检测睾酮水平，将培养第3代和第8代的LCs按1×105个每孔接种于12孔板的培养皿上，之后每24h更换培养液，分别在培养 24、48h后收取培养液，测定睾酮含量。
1.8 寨卡病毒感染实验
将对数生长期的第3代树鼩睾丸间质细胞用0.25%胰蛋白酶消化重悬，以密度为1X105个/mL每孔接种于24孔板内，24h后将寨卡病毒（滴度1X106copies/mL）以MOI=1感染原代树鼩睾丸间质细胞，在感染后2、6、12、24、36、48、72、96h时间点收集细胞和上清液，QIAamp®Viral RNA Mini Kit试剂盒提取核酸，RT-qPCR检测病毒载量，显微镜下观察细胞形态变化，并以对寨卡病毒易感的vero细胞按相同步骤作对比实验。
细胞感染后睾酮水平测定：以上述方法感染细胞2h后，PBS洗掉未吸附的病毒，添加1mL细胞培养液，分别在12、24、36、48h收集感染组和对照组培养液（不同时间段感染组和对照组样品收集均为相应的同一个孔），同时补加1mL培养液，竞争法酶联免疫吸附测定检测睾酮水平。
1.9 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。数据用
表示，采用两两独立样本的t检验分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
2.1睾丸间质细胞形态学观察和鉴定
经percoll密度梯度离心分离后的细胞6h后开始贴壁，呈不规则的形态，培养至第5天后细胞开始长出触角，形成典型的拉网状，培养至7天进行第1次传代，待传代细胞培养6h后换液去除未贴壁的杂细胞，传至第3代时能够稳定增殖，之后根据密度1:3~5传代即可。传至第8代后，细胞形态略微有点变化，细胞长度稍微变短，宽度增加，但仍有触角伸出，且活性高。随着细胞数量的增多，细胞间的界限和触角不在明显，从无序状变为纹理状（图1）,且细胞可稳定传至15代以上。
细胞鉴定：3β-羟类固醇脱氢酶是睾酮合成的关键酶之一，特异性存在于睾丸间质细胞中，是公认的LCs鉴定指标。3β-HSD免疫荧光鉴定显示，细胞均为阳性表达，证明所分离培养的细胞为LCs，且细胞纯度高达98%以上。
2.2睾丸间质细胞增值曲线的测定
根据生长曲线结果显示，间质细胞在培养前3天增殖迅速，3天后增殖较为缓慢，可知间质细胞在培养前3天内活力较强，后续可选择第2天或者第3天的细胞进行实验。
2.3 睾丸间质细胞分泌睾酮活性检测
酶联免疫吸附测定法检测结果显示，第3代和第8代LCs在培养前24h内睾酮分泌量分别为为1.15ng/mL和0.619ng/mL，培养24~48h内分泌量分别为1.132ng/mL和0.454ng/mL，说明分离的LCs具有持续分泌睾酮的能力，并且分泌量随培养时间和传代次数逐渐下降。
2.4 睾丸间质细胞感染寨卡病毒后形态学观察
感染结果表明，36h时LCs已经大量病变，96h几乎观察不到活细胞，而96h时对照组细胞形态正常；vero细胞在感染96h后才能观察到轻微的细胞病变，初步说明LCs比vero更对Zikv易感。
2.5 细胞和上清液病毒载量测定
通过RT-qPCR，Zikv感染vero后细胞和上清液病毒载量在6、12、24、36、48、72、96h与2h的比较；以及Zikv感染LCs后细胞和上清液病毒载量在6、12、24、36、48、72、96h与2h的比较。
结果表明，感染2h后睾丸间质细胞中可检测到较高的病毒载量，且6h内持续上升达到峰值，36h后由于细胞死亡裂解病毒载量逐渐下降，上清中病毒载量在感染12h后迅速上升，在48h后达到峰值（图6）；
而vero细胞在感染36h后细胞中病毒载量才开始增加，48h后细胞中病毒拷贝数才开始增加，到96h病毒载量仍在上升，表明Zikv能够在LCs中迅速增殖并释放出子代病毒。
2.6 感染后细胞睾酮分泌能力测定
通过LCs在感染Zika后0~12、12~24、24~36、36~48h睾酮分泌含量与正常对照组的比较。
ELISA睾酮水平测定结果显示，睾丸间质细胞在感染寨卡病毒的0~12、12~24、24~36h内，其睾酮分泌量都小于相应的正常对照组，并且在感染36~48h内睾酮分泌量急剧下降，而对照组仍然具有正常分泌睾酮的能力。
基于上述结果，Zikv不仅能够感染神经系统，研究表明睾丸也是Zikv感染的主要靶器官，Zikv病毒能够在睾丸中大量增殖和复制，引起睾丸结构破坏及大量细胞死亡，从而导致雄性性功能受损。本实验利用分离培养的树鼩LCs作为Zikv感染的细胞模型，研究其感染特性，为探讨zikv入侵雄性生殖系统的作用机制提供基础。
睾丸中LCs的数量稀少，其分离纯化方法尤为关键。实验使用3~4月龄的树鼩作为实验材料，这段时期正处于树鼩的青春期，细胞活力旺盛，具备良好的睾酮分泌能力；其次，此时树鼩的睾丸白膜，血管易分离，能有效去除原代培养中成纤维细胞和血管内皮细胞污染，更容易成功分离细胞。
传统的percoll密度梯度法虽然能够去除大部分杂细胞，但仍然有支持细胞存在，本研究多次实验发现在支持细胞和睾丸间质细胞共同培养时支持细胞为优势细胞，单一的percoll密度梯度法虽然能够成功得到大部分LCs，但培养后期纯度逐渐降低，差异贴壁法能够有效去除杂细胞而达到进一步纯化目的。本实验通过percoll密度梯度离心得到较为纯化的LCs，根据睾丸间质细胞和支持细胞的贴壁速率不同，睾丸间质细胞先贴壁，待原代细胞培养6~7天时可进行第1次差速贴壁纯化，在传代6h后换一次液去除还没贴壁的细胞，按此操作传至第3代后基本无杂细胞，并且活力旺盛，增殖迅速，3β-HSD免疫荧光鉴定细胞结果表明纯度高达98%。此外，酶联免疫吸附测定结果表明所得到的LCs具备连续分泌睾酮能力，并随着培养时长而下降，与Risberidge等报道的结果一致。
本实验结合Percoll 密度梯度离心和差速贴壁法对LCs进行纯化，此方法与传统的Percoll 密度梯度纯化方法相比更能达到纯化目的，有效去除了杂细胞，使LCs在培养过程有效避免了优势贴壁细胞（支持细胞）的排挤，实现了LCs的长期培养；培养基采用DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青-链霉素，该培养基配制方法简单，与传统的LCs培养基相比无需添加生长因子及其他成分，节约了培养时间和成本。
多项研究表明LCs是寨卡感染的主要靶细胞，在Zikv感染免疫缺陷型小鼠的研究中，感染后可导致雄性小鼠睾丸萎缩、LCs数量减少、睾酮水平及与睾酮产生相关的基因表达水平下降，而睾酮主要由LCs产生；并且在寨卡病毒感染树鼩模型研究中睾丸免疫组化实验发现Zikv主要集中在LCs。本实验在Zikv感染树鼩LCs 6h内病毒迅速增殖和复制，36h后细胞开始大量死亡，证明LCs对寨卡病毒易感；ELISA结果表明感染后能导致LCs睾酮分泌能力下降甚至缺失，这些实验结果可与已报道的Zikv感染雄性睾丸的研究结论相辅证，提示Zikv感染LCs可能是引起雄性睾丸损伤及不育的主要原因之一，表明树鼩LCs可作为Zikv感染的体外细胞模型。
综上所述，本实验采用两步酶消化、Percoll 密度梯度离心结合差速贴壁法能够获得产量高、活性强并能稳定增殖的LCs，并且简化了培养基，这种方法较为简便、可靠、易于操作，为树鼩LCs体外分离培养进行了实验研究，成功建立树鼩LCs体外分离培养方法；并利用寨卡病毒感染树鼩LCs,以另一种对寨卡易感的vero细胞为对比参照，定量检测病毒增殖情况和睾酮分泌水平，证明Zikv可成功感染树鼩LCs，这些结果可为寨卡感染导致雄性睾丸损伤及不育的致病机制提供研究基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种树鼩睾丸间质细胞的分离培养方法，其特征在于：按以下步骤进行：
步骤一：分离；
取出睾丸实质组织，清洗后将其剪碎后转入离心管内；加入1mg/mLIV胶原酶，放入CO2培养箱孵育30~35min，离心，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到离心管中，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，重复离心一次；
步骤二：纯化；
采用percoll密度梯度离心法：将分离得到的细胞悬液加于不同密度梯度的Percoll分离液上，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min离心30min；
收集37%和60%之间的细胞，后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1500r/min离心10min，沉淀加入含胎牛血清的培养液，摇匀得细胞悬液；将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1×106个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中CO2培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青-链霉素；
此时细胞中还含有少量支持细胞和其他杂细胞，根据间质细胞和支持细胞贴壁时间不同，在传代后6h更换培养液以去除杂细胞达到纯化目的，第2代和第3代的细胞仍按此步骤进一步纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：分离之前还进行以下操作：
取3月龄的雄性树鼩，腹腔注射0.4ml 3%戊巴比妥钠麻醉处死后，无菌取出睾丸，75%乙醇中浸泡20 s，取出后用PBS冲洗两遍去乙醇；移入Heraguard ECO 超净工作台，去除睾丸的白膜、附睾及血管，小心取出睾丸实质组织，置于装有预冷D-Hanks液的无菌培养皿中，洗涤2遍，去除血迹。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在percoll密度梯度离心纯化的基础上，根据支持细胞和睾丸间质细胞的贴壁速度不同，通过差异贴壁的方法，在原代细胞贴壁6~12h换液，此方法操作至第3代可得到纯度高达98%的睾丸间质细胞，并能够快速增殖，具备基础的睾酮分泌能力。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一中，加入1mg/mLIV胶原酶，放入37℃、5% CO2培养箱孵育30~35min，1000r/min离心5min，加入0.25%胰酶消化10~15min后，用含血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，将细胞悬液放入40目细胞筛网中过滤，使之分散成单个细胞；收集到15mL离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二中，从分离管底部向上密度依次为60%、37%、26%、21%，4℃、3000r/min离心30min；收集37%和60%之间的细胞，后用DMEM/F12培养液稀释，再将悬液以1500r/min离心10min，沉淀加入含胎牛血清的培养液，摇匀得细胞悬液；将分离纯化得到的细胞悬液计数，后稀释成1×106个/m L浓度的细胞悬液，接种于培养瓶或培养板中37℃，5% CO2培养箱中培养，培养基配方为DMEM/F12培养基加10%FBS、1%青-链霉素。
6.权利要求1-5任一项所述的方法制备的物质在制备治疗Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育的药物中的应用。
7.一种治疗Zikv感染导致的雄性睾丸损伤及不育的药物，其特征在于：包括权利要求1-5任一项所述的方法制备的物质。
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