CN109439615A - 一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法 - Google Patents

一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）用胶原酶消化香猪睾丸组织块以获得细胞悬浮液：（2）0.25%Trypsin‑EDTA重复消化获得睾丸间质细胞；（3）差速离心法富集睾丸间质细胞：差速离心法至少包括3次离心，第一次800rpm‑1200rpm，时间3‑8min,第二次和第三次为600rpm‑1000rpm，时间为3‑8min；（4）差速贴壁法纯化睾丸间质细胞。本发明与现有的猪睾丸间质细胞原代培养及纯化方法相比，其操作更为简单高效，并且获得了数量多、活性强、纯度高的贵州香猪睾丸间质细胞。本发明可为深入研究贵州香猪性早熟性状及睾丸间质细胞相关功能提供有效的技术指导。

Description

一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法
技术领域
本发明属于原代细胞培养及纯化领域，具体地涉及一种获得高纯度香猪睾丸间质细胞原代培养的方法。
背景技术
睾丸间质细胞（Leydig cell,LC）分布于生精小管之间的结缔组织中，胞体呈椭圆形和不规则形状，主要负责合成分泌睾酮。睾酮是促进雄性动物内外生殖器官发育、精子发生、维持第二性征的重要雄激素，血清内睾酮的95%由睾丸间质细胞分泌，睾酮与相应的靶器官受体作用后发挥重要的生理功能。因此，建立一种方便快捷、稳定高效的睾丸间质细胞的原代培养及纯化方法，对深入研究动物睾丸间质细胞在动物生殖生理活动中的相关功能具有重要意义。
睾丸间质细胞的分离培养研究已有较多研究，例如在羊、牛、鼠及猪等动物上，主要的方法是采用胶原酶消化、Perco ll连续密度梯度法分离纯化培养原代睾丸间质细胞。本发明人前期也拟采用Percoll法培养纯化香猪睾丸间质细胞，结果显示，Percoll梯度离心柱难以稳定制备，离心后的间质细胞层主要集中在50%-70%Percoll浓度层，但台盼蓝染色后活率较低，细胞生长缓慢。
综上，本领域需要一种简单快速、稳定高效的培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，该方法获得的睾丸间质细胞不仅要数量多，活率强，而且要纯度高。建立这样的方法，可解决睾酮合成分泌的体外细胞模型建立的问题，为研究贵州香猪性早熟特性及相关生殖生理的分子机制提供良好的试验基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，该方法可以获得数量多、活性强、纯度高的贵州香猪原代睾丸间质细胞。
本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，包括以下步骤：
（1）用胶原酶消化香猪睾丸组织块以获得细胞悬浮液：
胶原酶选择I型胶原酶或II型胶原酶或IV型胶原酶；
胶原酶浓度为0.03%-0.3%之间；
胶原酶消化液与睾丸组织之间体积比为3：1到8：1；
胶原酶消化时间为15min-60min；
（2）0.25%Trypsin-EDTA重复消化获得睾丸间质细胞；
（3）差速离心法富集睾丸间质细胞：差速离心法至少包括3次离心，第一次800rpm-1200rpm，时间3-8min,第二次和第三次为600rpm-1000rpm，时间为3-8min；
（4）差速贴壁法纯化睾丸间质细胞：差速贴壁法培养包括两次细胞培养，其中第一次持续时间4-12h，第二次持续时间为12-24h；第一次、第二次细胞培养条件均为37℃，5%CO2；第一、第二次所采用的培养基均为DMEM/F12，胎牛血清含量均为DMEM/F12培养基体积的10%，双抗含量均为DMEM/F12培养基体积的1%。
上述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，所述步骤（1）之前：获得睾丸组织后，先剥离附睾、血管、结缔组织、白膜及明显的生精小管，然后将睾丸组织处理成尽可能小的碎块；可减少原代培养的污染问题及提高胶原酶消化组织的效率。
上述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，所述步骤（1）优选I型胶原酶消化睾丸组织；优选胶原酶浓度为0.1%；优选胶原酶消化液与睾丸组织之间体积比为5：1；优选37℃水浴消化50min。
上述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，所述步骤（2），首先采用纱布过滤消化后的细胞悬液，过滤后的细胞悬液经离心后加入0.25%Trypsin-EDTA置于细胞培养箱消化10min,充分把消化后的细胞团消化为单个悬浮细胞，进行终止消化；将细胞悬液依次过200目及400目细胞钢筛，去除尚未被消化或消化不完全的睾丸组织及其他组织，由此实现睾丸组织的充分消化及睾丸间质细胞的充分分离。
上述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，所述步骤（3）的差速离心法包括四次离心，第一次离心为1000rpm、8min，并在此步加入红细胞裂解液，冰浴裂解20min；第二次900rpm离心8min,第三次800rpm离心5min，第四次750rpm离心5min；细胞计数后以4x106个细胞/mL的密度接种培养。
上述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，所述步骤（4）差速贴壁法培养的第一次细胞培养持续时间为6h，第二次细胞培养持续时间为24h。
本发明与现有的猪睾丸间质细胞原代培养及纯化方法相比，其操作更为简单高效，并且获得了数量达、活性强、纯度高的贵州香猪睾丸间质细胞。本发明可为深入研究贵州香猪性早熟性状及睾丸间质细胞相关功能提供有效的技术指导。
具体实施方式
以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
实施例：一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法：包括：
1、 选择发育健康，体态健壮，精神状态好的贵州香猪公猪作为实验对象。
2、 将贵州香猪进行麻醉保定，对其全身进行消毒处理，并重点清洗消毒睾丸部位，手术法取出香猪两侧睾丸，小心剥离附睾、血管、副性腺等组织，放入4℃含3%双抗的PBS（不含Ca2+,Mg2+,PH 7.2-7.4）中清洗3-5遍。
3 、小心剥离睾丸白膜、明显的血管及生精小管，用无菌的剪刀将睾丸组织分为四等分，放入75%预冷的医用酒精中灭菌3-5min，取出后用4℃含3%双抗的PBS（不含Ca2+,Mg2+,PH 7.2-7.4）清洗2-3遍。
4、用无菌的剪刀、镊子、手术刀片等器械将睾丸组织处理为1mm3或者更小的碎块，加入2倍体积无血清培养液水浴15min,使组织更利于消化。
5 、小心吸去培养液，加入组织5倍体积的0.1% I型胶原酶消化液，37℃水浴锅中水浴消化50min,每10min颠倒混匀一次，使得消化液充分消化睾丸组织。
6、加入胶原酶消化液2倍体积的含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液终止消化。
7 、用3层无菌纱布过滤消化后的组织，去除较大块的、未被消化或者消化不完全的组织，将过滤后的悬液经1000rpm离心8min,去上清，得沉淀。
8 、加入沉淀1倍体积的0.25%Trypsin-EDTA置于细胞培养箱消化10min，充分把消化后的细胞团消化为单个悬浮细胞，并用2倍体积含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液终止消化。
9 、将0.25%Trypsin-EDTA消化后得到的细胞悬液依次用200目及400目得细胞钢筛过滤，达到让睾丸间质细胞的充分分离得效果。
10 、将细胞悬浮液1000rpm离心8min,弃去上清，加入沉淀1倍体积红细胞裂解液冰浴孵育20min，充分去除红细胞。
11、 将红细胞裂解液裂解后得到的细胞悬液吹打混匀，加入2倍体积的含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液，900rpm离心8min，弃上清。
12 、加入2倍体积的含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液吹打混匀，800rpm离心5min，弃上清。
13、加入2倍体积的含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液吹打混匀，750rpm离心5min，弃上清。
14、加入2倍体积的含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液吹打混匀，运用细胞计数板对细胞密度，按照以4x106个细胞/mL的密度接种培养，每个75T细胞培养瓶接种3mL。
15 、 5%CO2 37℃进行培养，6h后倒掉未贴壁细胞，用PBS清洗2-3次，加入含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液继续培养，24h后，倒掉培养液，用PBS清洗2-3次，加入含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液继续培养。
16、荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态，当细胞汇合度达到80%—100%时，倒掉培养液，PBS清洗2-3次，加入1ml 0.25%Trypsin-EDTA在细胞培养箱中消化，显微镜观察消化情况，待贴壁细胞脱落后加入3ml含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液终止消化，吹打混匀后，每个细胞培养瓶中加入2ml细胞悬液，再加入2ml10%胎牛血清及1%双抗的DMEM/F12培养液继续培养。重复上面传代操作，根据细胞生长状态、细胞形态等指标判断细胞能否继续传代培养。
17 、活率鉴定，取睾丸间质细胞悬液做适当比例稀释，以细胞悬液与0.4%台盼蓝染色液9：1比例混匀（台盼蓝终浓度0.04%）染色3-5min,吸取适量经染色的细胞悬液用细胞计数板计数，死细胞被染成蓝色、膨胀无光泽，活细胞不被染色且透明。共计数500个细胞，重复5次，细胞存活率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）x 100%。
18、 3β-HSD染色法鉴定睾丸间质细胞纯度：
3β-HSD染色液配置：A液：1mg氯化硝基四氮唑蓝（NBT）与0.5mg去氢表雄酮（DHEA）溶于0.5ml二甲基亚砜；B液：10mg辅酶I（NAD）溶于9.5ml PB磷酸盐缓冲液中。将0.5ml A液和9.5ml B液充分混合后至于4℃备用。由于睾丸间质细胞内含有3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD），可以被3β-HSD染色液特异性染成蓝色。在本发明中，选取第二代睾丸间质细胞进行6孔板铺板，当细胞生长至80%左右，倒掉细胞培养液，用PB磷酸盐缓冲液清洗2遍，取2ml染色液加入细胞培养板中，放入细胞培养箱中继续孵育2-8h，显微镜下选取5-8个视野计数染色细胞和总细胞数，计算睾丸间质细胞纯度。
本发明与现有的哺乳动物睾丸间质细胞的培养及纯化方法相比，具有下列有益效果：目前对于猪睾丸间质细胞的原代培养对采用Percoll连续密度梯度离心法及一些较为粗放的胰蛋白酶消化后直接培养法，或者有的研究者以两种技术结合运用，有文献报道采用Percoll梯度分离培养及胰蛋白酶消化培养都可获得猪高纯度的睾丸间质细胞，但本发明前期通过以上几种方法的预实验。结果表明，胰蛋白酶消化培养的猪睾丸间质细胞数量少，贴壁后增殖困难，Percoll梯度离心法离心柱难以稳定配置，费时费力，长时间的离心导致大量细胞活性降低。然而通过本发明的方法，得到了活性强、纯度高的睾丸间质细胞。因此本发明为贵州香猪性早熟特性的研究及睾丸间质细胞功能提供了良好的试验材料。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）用胶原酶消化香猪睾丸组织块以获得细胞悬浮液：
胶原酶选择I型胶原酶或II型胶原酶或IV型胶原酶；
胶原酶浓度为0.03%-0.3%之间；
胶原酶消化液与睾丸组织之间体积比为3：1到8：1；
胶原酶消化时间为15min-60min；
（2）0.25%Trypsin-EDTA重复消化获得睾丸间质细胞；
（3）差速离心法富集睾丸间质细胞：差速离心法至少包括3次离心，第一次800rpm-1200rpm，时间3-8min,第二次和第三次为600rpm-1000rpm，时间为3-8min；
（4）差速贴壁法纯化睾丸间质细胞：差速贴壁法培养包括两次细胞培养，其中第一次持续时间4-12h，第二次持续时间为12-24h；第一次、第二次细胞培养条件均为37℃，5%CO2；第一、第二次所采用的培养基均为DMEM/F12，胎牛血清含量均为DMEM/F12培养基体积的10%，双抗含量均为DMEM/F12培养基体积的1%。
2.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）之前：获得睾丸组织后，先剥离附睾、血管、结缔组织、白膜及明显的生精小管，然后将睾丸组织处理成尽可能小的碎块。
3.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）优选I型胶原酶消化睾丸组织；优选胶原酶浓度为0.1%；优选胶原酶消化液与睾丸组织之间体积比为5：1；优选37℃水浴消化50min。
4.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2），首先采用纱布过滤消化后的细胞悬液，过滤后的细胞悬液经离心后加入0.25%Trypsin-EDTA置于细胞培养箱消化10min,充分把消化后的细胞团消化为单个悬浮细胞，进行终止消化；将细胞悬液依次过200目及400目细胞钢筛，去除尚未被消化或消化不完全的睾丸组织及其他组织，由此实现睾丸组织的充分消化及睾丸间质细胞的充分分离。
5.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）的差速离心法包括四次离心，第一次离心为1000rpm、8min，并在此步加入红细胞裂解液，冰浴裂解20min；第二次900rpm离心8min,第三次800rpm离心5min，第四次750rpm离心5min；细胞计数后以4x106个细胞/mL的密度接种培养。
6.如权利要求1所述的一种培养高纯度贵州香猪原代睾丸间质细胞的方法，其特征在于：所述步骤（4）差速贴壁法培养的第一次细胞培养持续时间为6h，第二次细胞培养持续时间为24h。
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