CN102719397B - 间充质干细胞及其在抗hiv-1中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞及其在抗HIV-1中的应用，具体涉及一种分泌表达高浓度角质形成细胞生长因子（KGF）的间充质干细胞，其通过微载体培养系统生产。本发明的间充质干细胞可以促进胸腺发育及其功能维持，并通过增加T淋巴细胞向外周血中的输出，增强特异性T细胞的免疫功能，达到治疗HIV-1感染的效果，为艾滋病的临床治疗提供了一种有效的新策略。

Description

间充质干细胞及其在抗HIV-1中的应用

技术领域

本发明涉及干细胞治疗领域，具体地说是一种间充质干细胞免疫调节剂，其主要成分是分泌表达角质形成细胞生长因子的间充质干细胞，可用于HIV-1感染的治疗。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是间质组织来源的具有亚全能分化潜能干细胞，既有调节外周免疫系统的功能，也能修复受损的中枢免疫系统，在免疫系统的发生和功能的维持中起着至关重要的作用。在自身免疫性疾病中，MSCs注射到体内后，不仅能够迁移到受伤组织，抑制前炎症因子的释放，促进受伤细胞的存活，诱导外周免疫耐受，降低异常的免疫反应，更能够修复受损的胸腺组织，从而减少自身反应性T细胞的产生，阻止疾病的进展。

角质形成细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）是Rubin 等（1989）从胚胎肺成纤维细胞培养上清中发现的，为FGF 家族成员，即FGF-7。KGF 由间质细胞产生，通过旁分泌机制分泌，与上皮细胞上的特异性受体相结合，与上皮创伤愈合、胚胎发育、肿瘤形成与发展及免疫重建关系密切。

KGF在同种异体造血干细胞移植、自体造血干细胞移植及同种骨髓移植中能够预防移植物抗宿主疾病和保持移植物抗白血病效应，保护胸腺上皮细胞，增强胸腺重建，改善移植后胸腺和外周血T 淋巴细胞重建。KGF促进胸腺生成素生成，增加外周幼稚CD4⁺ T淋巴细胞和T淋巴细胞依赖性抗体的数量，诱导胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells，TECs）数目增加和胸腺内IL-7生成，重组皮质和髓质结构。KGF诱导体内幼稚TECs扩增、成熟和促进晚期各型细胞分化的信号途径，包括p53和NF-κB途径，导致与TECs 功能和T淋巴细胞发育有关的靶基因转录，包括BMP-2、BMP-4、Wnt5b和Wnt10b。应用KGF 能够降低细菌活力，抑制细菌生长，改善皮炎和胃肠道炎症。

在感染HIV-1病毒的患者中，缺乏抗病毒治疗时，可导致胸腺细胞增殖、输出数量和功能等降低。HIV-1可导致胸腺的破坏，降低了T淋巴细胞免疫的重构和功能恢复，而使感染的患者加速了疾病的进程。病毒之所以很难清除，也和病毒对胸腺的破坏，减低了机体对病毒的特异免疫功能有关。以前治疗艾滋病的药物只是针对病毒感染，而不能修复受损的胸腺功能。

发明内容

发明人惊奇地发现，利用发明人独创的微载体高密度培养技术生产的间充质干细胞能够分泌表达高浓度的细胞因子KGF。

发明人将上述MSCs输注到裸鼠体内后，发现萎缩的裸鼠胸腺体积增大，胸腺实质增大，胸腺的组织结构向正常的皮髓质结构发育，同时胸腺内的胸腺细胞增多，并发育为成熟的T淋巴细胞，因此MSCs能够促进胸腺的发育及其功能的维持。

迄今应用最为广泛的艾滋病灵长类动物模型是SIVmac或SHIV感染的印度恒河猴模型。发明人的实验表明，MSCs能够使感染了SIVmac239病毒的恒河猴体内CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞均回升到一个较高的水平。MSCs联合PMPA治疗HIV-1感染的恒河猴，可降低病毒颗粒体在机体内存在，促进CD4⁺T细胞的增加，提高HIV-1感染者的生存率。

因此，分泌表达KGF的间充质干细胞联合药物治疗艾滋病，能够在针对HIV感染的同时，修复受损胸腺的功能，增加成熟T细胞的输出，此为本发明的优势所在。故而，间充质干细胞作为一种新型的免疫调节剂，在艾滋病的治疗中，通过重建被HIV-1感染的胸腺，增加T细胞向外周血中的输出，增强特异性T细胞的免疫功能，达到抗病毒的效果，为艾滋病的临床治疗提供了一种有效的新策略。

本发明一方面提供了一种分泌表达高浓度KGF的间充质干细胞，优选地，其为脐带间充质干细胞。

另一方面，本发明提供了一种制备所述分泌表达高浓度KGF的间充质干细胞的方法，其采用微载体培养系统。

在一个特定的实施方案中，该方法包括以下步骤：

(1)    以1.2×10⁵细胞/ml终体积的接种量将种子细胞接种到培养容器中，其中所述培养容器中包含经DMEM/F-12完全培养液包被的微载体和培养最终体积一半量的经过5% CO₂，饱和湿度，37 ℃培养箱平衡的DMEM/F-12完全培养液；

(2)    接种后静置于5% CO₂，饱和湿度，37 ℃培养箱内，每隔30min以35rpm搅拌微载体2min，其中该2min从所有微载体均已悬浮开始计算，如此重复间歇式的搅拌培养持续8h；

(3)    间歇式搅拌培养后进行8天的连续搅拌培养，其中搅拌转速为：第1～5天40rpm，第6～8天60rpm；

(4)    接种24小时后，用经过平衡的DMEM/F-12完全培养液将培养容器内培养液补至最终体积；

(5)    从接种后的第4天开始，每天吸出40%培养容器中的上清，用经过平衡的新鲜DMEM/F-12完全培养液补足系统中培养液的体积，经过无菌操作所取出的上清收集于无菌容器中，置于-20 ℃低温保存；

(6)    培养至第8天后，将培养容器从培养箱中取出，静置，待微载体全部沉降后，取出上清，并与培养过程中所有取出的上清一并收集于无菌容器中，置于-20℃低温保存；

(7)    加入200mL D-Hank’s缓冲液对微载体进行清洗，在60rpm的转速下，搅拌微载体3min，后静置，吸去缓冲液，如此重复3遍；

(8)    待吸去全部缓冲液后，加入1%胶原酶溶液40mL，轻轻晃动培养容器，使微载体与胶原酶溶液混匀，静置于5% CO₂，饱和湿度，37℃培养箱内15min；

(9)    消化结束后，取出培养瓶，加入100mL D-Hank’s缓冲液，并用移液管反复轻轻吹打微载体，使细胞全部脱落，静置5min，待微载体全部沉降后，用移液管吸出上层细胞溶液至离心管中，如此重复3遍；

(10)   将离心管于1000rpm离心5min，弃去上清，沉淀即为所述间充质干细胞。

本发明在第三方面提供了一种免疫调节剂，其活性成分包括分泌表达高浓度KGF的间充质干细胞。优选地，所述免疫调节剂还含有人血白蛋白和抗聚集剂，更优选地，所述抗聚集剂为肝素钙。

本发明公开了分泌表达高浓度KGF的间充质干细胞在制备促进胸腺发育及其功能维持的药物中的用途。

同时，本发明还公开了分泌表达高浓度KGF的间充质干细胞在制备治疗HIV-1感染的药物中的用途。其中，所述间充质干细胞通过重建被HIV-1感染的胸腺，增加T淋巴细胞向外周血中的输出达到抗病毒效果，优选地，所述T淋巴细胞为CD4⁺ T淋巴细胞。

在优选的实施方案中，分泌表达高浓度KGF的间充质干细胞和抗HIV病毒药物（PMPA）联合用于HIV-1感染的治疗。

本发明采用微载体培养技术高密度培养间充质干细胞，提供的极大的培养表面积/体积比提供了很高的细胞产量，从而富集了其分泌的细胞因子。相对于其他类型的单层培养而言，微载体培养需要相当少的空间，就可生产大量的细胞或细胞产物。

微载体系统使培养参数如pH、气体压力等极好控制，这就使得贴壁依赖型细胞能够在一个拥有所有悬浮培养优点的系统中生长，改进的控制能够使各种过程设计的培养系统环境均一。微载体培养的监测和取样比其他任何一种用于大量贴壁依赖型细胞生产的技术都简单，从而为细胞的大规模培养和获得高浓度的分泌物提供了可能。

微载体培养系统在一定程度上克服了传统平面培养和转瓶培养的不足，具有很多优点：(1) 兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相融合；(2) 细胞所处环境均一；(3) 环境条件如温度、pH和CO₂等容易测量与监控；(4) 具有较高的比表面积；(5) 培养操作可系统化、自动化，降低了污染发生的机会。

尤其令人预料不到的是，采用本发明的培养方法生产的间充质干细胞分泌表达高浓度的KGF，在促进胸腺发育及其功能维持，以及治疗HIV-1感染中具有显著效果。

附图说明

图1 根据ELISA方法检测培养液中KGF的含量。

图2 各组裸鼠的新鲜未固定胸腺照片。

图3 各组裸鼠6周时胸腺组织冰冻切片的苏木精和伊红染色（H&E staining）结果。

图4 治疗组和未治疗组在H&E染色中的胸腺实质面积随时间变化情况。

图5 治疗组和未治疗组的UEA-1表达随时间变化情况。显微镜放大倍率为200×，照片中，蓝色为DAPI染色，红色为UEA-1免疫荧光。

图6 各组裸鼠不同时间的胸腺组织冰冻切片的CD4和CD8免疫荧光情况。显微镜放大倍率为200×，照片中，红色为CD4免疫荧光，绿色为CD8免疫荧光。

图7 实验期间各组动物体重变化情况。

图8 实验期间每组各4只动物血浆SIV病毒RNA载量的测定结果。

图9 实验期间各组动物外周血淋巴细胞百分比变化的测定结果。

具体实施方式

实施例1 脐带间充质干细胞的高密度培养

1. 脐带间充质干细胞高密度培养的种子细胞来源于天津和泽干细胞科技有限公司生产的脐带间充质干细胞，批号：G2012098，代次：P3代。

2. 细胞高密度培养过程需要用到的材料

(1)   D-MEM/F-12培养基

(2)   D-Hank’s缓冲液

(3)   胎牛血清

(4)   微载体：选用GE Healthcare公司生产的Cytodex3型微载体。其出厂标准为：微载体基质为交联葡聚糖，载体表面覆盖一层较薄的变性胶原；密度为1.04g/ml；颗粒大小d₅₀=175μm，d_5-95=141μm-211μm；所提供培养面积为2700cm²/g干重；每克干重约含微载体数量为3.0×10⁶，膨胀因子为15ml/g干重。

(5)   高密度培养容器：选用CORNING公司生产的附带取样侧臂的磁力搅拌悬浮培养瓶。

3. 脐带间充质干细胞的种子细胞的复苏与扩增

(1)   查询需复苏细胞冻存位置后，从液氮罐中相应位置迅速取出冻存的细胞。

(2)   核查冷冻盒上的条码，确认后立即于37 ℃水浴中迅速融化。

(3)   用75％酒精棉球擦拭冻存管盖周围，旋开管盖。

(4)   在洁净工作台内将冻存管内的细胞移入到无菌离心管内。

(5)   缓慢逐滴加入10 ml DMEM/F-12培养液，轻轻混匀，尽量不要产生气泡。

(6)   离心，1000 rpm×5min，弃上清。

(7)   加入适量DMEM/F-12完全培养液，重悬，接种，置5% CO₂，饱和湿度，37 ℃培养箱培养。

(8)   第二天换液，以后每3-4天换液。

(9)   当细胞80-90%融合时，即可接种高密度培养。

4. 培养容器内壁的硅化处理

为了防止微载体粘附在玻璃容器内壁，高密度培养细胞所使用的玻璃容器需要进行硅化处理。向干净的培养容器内加入硅化剂sigmacote^TM，润湿所有可能接触到微载体的表面，将多余的硅化剂从容器中倒出，然后把容器晾干。晾干后，使用蒸馏水彻底冲洗容器3次，备用。硅化处理过的容器经过3次培养后需要再次硅化。

5. 培养液使用前的处理

所有高密度培养所用到的DMEM/F-12完全培养液，在使用前，都需要在5% CO₂，饱和湿度，37 ℃培养箱内平衡至少8h，以使pH、温度能够在其使用时即可达到培养细胞的最佳条件。

6. 微载体使用前的处理

(1)   微载体的称量：根据培养体系称取相应质量的微载体，微载体的使用量为3g/L培养液。

(2)   微载体的水化：干燥的微载体在D-Hank’s缓冲液（每克Cytodex3微载体加50ml-100ml）中在室温下浸泡膨胀至少3小时。弃去上清液，用新配制的D-Hank’s缓冲液（每克Cytodex3微载体加30ml-50ml）洗涤微载体10分钟。弃去上清液，换上新的D-Hanks缓冲液（每克Cytodex3微载体加30ml-50ml）。

(3)   微载体的灭菌：将微载体溶液转移至已处理好的高密度培养容器中，对整个培养容器进行高压蒸汽灭菌：121℃，30min，15psi。

(4)   微载体的再次包被：高压蒸汽灭菌后，在无菌条件下倒出培养容器内的液体，留下微载体，向容器内加入适量DMEM/F-12完全培养液，使其完全浸泡微载体，置5% CO₂，饱和湿度，37 ℃培养箱静置8h，这样可以使有利于细胞贴壁的各种蛋白结合到微载体表面。

7. 接种细胞

(1)   从培养箱中取出高密度培养容器，将容器在无菌条件下吸出培养液，留下经过再次包被的微载体。

(2)   加入经过培养箱平衡的DMEM/F-12完全培养液，加入量为培养最终体积的一半。

(3)   打开磁力搅拌系统，将转速调至35rpm，使微载体可以均匀的悬浮于培养液中。

(4)   按照脐带间充质干细胞培养与传代的操作，将组织培养瓶内达到80-90%融合的细胞进行D-Hank’s缓冲液清洗、胰酶-EDTA消化、离心、重悬、计数等操作处理，准备相应数量的细胞进行接种。

(5)   接种细胞的重悬要均匀，成为均一单个的细胞悬液，否则会影响接下来的高密度培养。

(6)   在微载体搅拌的状态下，向培养容器内加入种子细胞，接种量为1.2×10⁵细胞/ml终体积，保持搅拌状态3min，使接种的细胞与微载体充分混合均匀。

8. 间歇式培养

将高密度培养容器静置于5% CO₂，饱和湿度，37 ℃培养箱内，稍微旋松侧臂盖，每隔30min以35rpm搅拌微载体2min（该2min从所有微载体均已悬浮开始计算），如此重复间歇式的搅拌培养持续8h。

9. 连续搅拌培养

(1)   经过8h的间歇式培养后，将转速保持为35rpm进行连续搅拌。

(2)   接种24h后，用经过平衡的DMEM/F-12完全培养液将培养容器内培养液补至最终体积。

(3)   随着培养时间的增加，搅拌速度随之改变，连续搅拌培养时间为8天。

(4)   相应搅拌转速为：第1～5天40rpm，第6～8天60rpm。

10. 培养过程中的换液

从接种后的第4天开始，每天吸出40%培养容器中的上清，用经过平衡的新鲜DMEM/F-12完全培养液补足系统中培养液的体积。经过无菌操作所取出的上清收集于无菌容器中，置于-20 ℃低温保存。

11. 脐带间充质干细胞高密度培养的终止

培养至第8天后，将培养容器从培养箱中取出，静置，待微载体全部沉降后，取出上清，并与培养过程中所有取出的上清收集在一起。加入200mL D-Hank’s缓冲液对细胞进行清洗，在60rpm的转速下，搅拌微载体3min，后静置，吸去缓冲液，如此重复3遍。待吸去全部缓冲液后，加入1%胶原酶溶液40mL，轻轻晃动培养容器，使微载体与胶原酶溶液混匀，静置于5% CO₂，饱和湿度，37 ℃培养箱内15min。消化结束后，取出培养瓶，加入100mL D-Hank’s缓冲液，并用移液管反复轻轻吹打微载体，使细胞全部脱落，静置5min，待微载体全部沉降后，用移液管吸出上层细胞溶液至离心管中，如此重复3遍。将离心管于1000rpm离心5min，弃去上清。

经过上述过程的培养，收获的细胞数可以达到接种细胞数的约20倍，增殖倍数为传统二维细胞培养方法增值倍数的7倍。培养过程中，含有高浓度蛋白因子KGF分泌物的培养上清可连续地获得（如图1所示），连续补加新鲜的培养液使得获取细胞分泌物的过程具有连续性、稳定性、可控性。

实施例2脐带间充质干细胞促进裸鼠胸腺发育

1. 实验方案

将200只正常3周龄裸鼠随机分为治疗组和未治疗组，各100只，SPF级饲养，治疗组腹腔注射0.5ml 实施例1得到的脐带间充质干细胞（UC-MSCs）悬液，2×10⁶细胞/只，未治疗组腹腔注射0.5ml D-Hank’s液，均为2次/周。注射后每两周处死裸鼠6只/组，取胸腺组织，称重，追踪裸鼠胸腺增大的起始时间，记录随着时间变化裸鼠体重和胸腺重量的变化。所取胸腺标本，其中3只裸鼠的胸腺做冰冻切片，用免疫组化/免疫荧光检测胸腺内由胸腺上皮细胞组成的网状结构的变化和胸腺中的胸腺细胞分布；另外3只用流式细胞仪检测随着时间变化裸鼠胸腺中总T细胞、成熟T细胞相对量的变化。将每组3只裸鼠的整个胸腺标本用4%的多聚甲醛固定，做冰冻切片，做免疫组化/免疫荧光，检测胸腺上皮细胞构成的胸腺网状结构的变化（UEA-1和anti-K5、anti-K8）、（CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞）的量及在胸腺实质中的分布有无差别。将每组另外3只裸鼠的胸腺用流式细胞仪检测随着时间变化裸鼠胸腺中总T细胞（CD3⁺）、成熟T细胞（CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞）的量变化。

2. 实验结果

(1) 裸鼠状态

治疗组裸鼠腹腔注射UC-MSCs后，较未治疗组强壮，未治疗组裸鼠从第10周开始共死亡15只，而治疗组裸鼠从第15周开始出现死亡。

(2) 胸腺重建情况

如图2所示，正常小鼠胸腺位于胸骨柄后方，紧贴气管，心脏腹面，呈乳白色脂肪状，分左右两叶（对照组）；腹腔注射D-Hank’s液的未治疗组裸鼠无胸腺，在原胸腺部位处见一团暗黄色组织，不分叶，内有脂肪样组织（未治疗组）；腹腔注射UC-MSCs的治疗组裸鼠的原胸腺部位见乳白色脂肪状组织，分为两叶（治疗组），质地软，但组织的体积显著小于正常小鼠胸腺。治疗组和未治疗组胸腺部位组织的重量无显著性差异。

正常小鼠胸腺是有结缔组织包被的实体性器官细微结构。如图3所示，胸腺实质由外层皮质及内层髓质组成，表面的被膜结缔组织伸入胸腺实质成为胸腺隔，把胸腺分成许多不完全分隔的小叶（6 wk 对照组）。未治疗组裸鼠胸腺实质没有明显的皮髓质之分，细胞排列紊乱无规律（6wk未治疗组）；而治疗组裸鼠出现典型的胸腺小叶结构，内层髓质结构外围包绕外层皮质（6wk治疗组）。由图4可以看出，治疗组胸腺组织实质的面积较未治疗组显著增大。

UEA-1是髓质上皮细胞表面标志物，UEA-1⁺的髓质上皮细胞与髓质组织结构有关，是Foxn1基因维持出生后胸腺组织微环境的靶分子。裸鼠由于Foxn1基因缺失，因此无UEA-1⁺的髓质上皮细胞。而治疗组裸鼠胸腺的髓质区域出现了UEA-1⁺的髓质上皮细胞（图5），这就说明胸腺的髓质结构发育趋于正常，进而能够促进胸腺细胞的发育。

(3) CD4⁺/CD8⁺淋巴细胞在胸腺中分布的免疫荧光结果

如图6所示，治疗组裸鼠胸腺中的CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数量明显增加，表明MSCs不仅能够刺激胸腺的发育，还能促进其功能的维持，在胸腺的发育过程中起着至关重要的作用，因此MSCs是中枢免疫器官的发育和结构功能维持必不可少的调节者，并在体内免疫系统平衡状态的维持中起着至关重要的作用。

实施例3脐带间充质干细胞对感染SIVmac239病毒恒河猴的治疗作用

1. 实验方案

选择16只健康成年中国恒河猴作为模型动物，其中12只雄性、4只雌性。用分子克隆标准毒株SIVmac239作为感染毒株，按照每只动物接种100TCID₅₀/ml经静脉途径接种感染。动物在感染病毒10天和56天时，按照动物的病毒载量、体重和性别随机分为4组，每组动物3只雄性、1只雌性。分别为：模型组（CP）、PMPA治疗组（TA）、干细胞治疗组（TB）、干细胞+PMPA联合治疗组（TC）。按照分组的情况进行对照品和供试品的给药，其中模型对照组：静脉注射给予等体积的PBS，给药体积2mL/kg体重；PMPA治疗组：皮下注射给予剂量30mg/kg，给药体积0.33mL/kg体重；干细胞治疗组静脉注射给予1×10⁶细胞/kg体重，给药体积2mL/kg体重；干细胞+PMPA联合治疗组：静脉注射给予1×10⁶细胞/kg体重干细胞悬液，同时皮下注射给予30mg/kg的PMPA，给药体积2mL/kg体重。给药频率和期限：模型对照组给予PBS为1次/周，给药4周；干细胞治疗组为1次/周，连续4周； PMPA治疗组为1次/天，给药8周；干细胞+PMPA组，分别按同时MSCs为1次/周，连续4周，PMPA为1次/天，连续8周。对感染后各治疗组的动物观察其临床表现，测定血液学、血浆病毒载量、CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞数结果，并对疾病进展情况进行观察与分析。

2. 实验结果：

(1) 动物体重的测定结果：

各组动物在病毒感染0天、10天、56天，90天、120天、150天、180天，以及供试品治疗期间——攻毒后64天、71天、78天、105天和145天（动物在病毒感染后56天开始进行治疗），对动物进行体重的测定。病毒感染0天，各试验组动物平均体重在4.0Kg左右，其中较高的为对照组4.61±0.95Kg，较低的为PMPA治疗组3.88±0.48Kg。攻毒56天开始治疗期间到100天左右，动物体重基本维持不变，其中干细胞组动物体重略有下降趋势；在治疗8周后，动物体重开始回升，其中干细胞+PMPA组动物的体重增加较明显。（图7）

(2) 病毒学指标测定结果：

病毒感染后14天，四组动物的血浆病毒载量均达到高峰，均值分别为：对照组5.45×10⁷拷贝/ mL、PMPA治疗6.65×10⁷拷贝/ mL、干细胞治疗组5.80×10⁷拷贝/ mL和干细胞+PMPA联合治疗组1.08×10⁸拷贝/ mL，干细胞+PMPA联合治疗组略高于其他三个试验组。从感染后14天开始，病毒载量从高峰期快速下降。至感染后56天时，根据动物病毒载量并结合动物体重进行分组，分组后各试验组病毒载量的均分别为4.79×10⁴、2.69×10⁶、1.87×10⁶和2.28×10⁷拷贝/ mL。除模型对照组外，其余三组开始进行供试品治疗。从病毒感染后56天开始治疗到180天试验结束，各实验组动物血浆RNA病毒载量虽然有所下降，但仍然在维持在一个较高的范围内平台期。其中干细胞+PMPA联合治疗组是呈现缓慢降低的趋势。（图8）

(3) 免疫学指标测定结果：

干细胞+PMPA联合治疗感染了SIVmac239病毒的恒河猴，能够改善受感染动物的精神、食欲等临床症状，改善动物生存状况，降低其体内的病毒载量的趋势；在试验观察的后期，即给药后90天左右时，受病毒感染的动物体内CD4+和CD8+T淋巴细胞均开始回升到一个较高的水平（图9）。在病毒感染后180天时，各实验组动物CD4+/CD8+比值均值恢复到＞1.0. （对照组，1.26±0.43；PMPA组，2.08±0.46；细胞组，2.09±0.16；PMPA+细胞组，1.69±0.51）。

Claims (1)

1.一种分泌表达角质形成细胞生长因子（KGF）的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)以1.2×10⁵细胞/ml终体积的接种量将种子细胞接种到培养容器中，其中所述培养容器中包含经DMEM/F-12完全培养液包被的微载体和培养最终体积一半量的经过5%CO₂，饱和湿度，37℃培养箱平衡的DMEM/F-12完全培养液；

(2)接种后静置于5%CO₂，饱和湿度，37℃培养箱内，每隔30min以35rpm搅拌微载体2min，其中该2min从所有微载体均已悬浮开始计算，如此重复间歇式的搅拌培养持续8h；

(3)间歇式搅拌培养后进行8天的连续搅拌培养，其中搅拌转速为：第1～5天40rpm，第6～8天60rpm；

(4)接种24小时后，用经过平衡的DMEM/F-12完全培养液将培养容器内培养液补至最终体积；

(5)从接种后的第4天开始，每天吸出40%培养容器中的上清，用经过平衡的新鲜DMEM/F-12完全培养液补足系统中培养液的体积，经过无菌操作所取出的上清收集于无菌容器中，置于-20℃低温保存；

(6)培养至第8天后，将培养容器从培养箱中取出，静置，待微载体全部沉降后，取出上清，并与培养过程中所有取出的上清一并收集于无菌容器中，置于-20℃低温保存；

(7)加入200mL D-Hank’s缓冲液对微载体进行清洗，在60rpm的转速下，搅拌微载体3min，后静置，吸去缓冲液，如此重复3遍；

(8)待吸去全部缓冲液后，加入1％胶原酶溶液40mL，轻轻晃动培养容器，使微载体与胶原酶溶液混匀，静置于5％CO₂，饱和湿度，37℃培养箱内15min；

(9)消化结束后，取出培养瓶，加入100mL D-Hank’s缓冲液，并用移液管反复轻轻吹打微载体，使细胞全部脱落，静置5min，待微载体全部沉降后，用移液管吸出上层细胞溶液至离心管中，如此重复3遍；

(10)将离心管于1000rpm离心5min，弃去上清，沉淀即为所述间充质干细胞。

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