CN104027798B

CN104027798B - 一种全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原的方法

Info

Publication number: CN104027798B
Application number: CN201410313057.7A
Authority: CN
Inventors: 何海蓉; 孙石静; 王正春; 董彦鹏; 何叶峰; 胡芳; 张志华; 缪芬芳; 刘怡; 姜冲
Original assignee: Jiangsu Nannong High Science Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Nannong High Science Co Ltd
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2034-07-02
Also published as: CN104027798A

Abstract

本发明涉及一种应用反应器全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的方法，本发明使用生物反应器全悬浮无血清培养生产PCV2抗原，制备灭活疫苗。该发明方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原成本降低90％以上，投入产出比提高4～10倍，较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低50％～70％，产量提高3～5倍，此发明无需载体，无血清残留，生产的疫苗安全性更高，同时制品的批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高制品的产量及质量。

Description

一种全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原的方法

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器全悬浮细胞培养技术生产猪圆环病毒2型疫苗抗原的方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

目前，国内猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)的疫苗抗原生产主要采用转瓶培养方法，少数采用微载体悬浮培养方法。转瓶工艺生产半成品抗原效价较低，仅为10^4.5～^6.0TCID₅₀/ml，不能稳定提供合格的抗原(合格抗原每毫升抗原含量应≥10^5.5TCID₅₀)，需要进行高倍浓缩。且转瓶工艺劳动强度大，生产一批需要100～200个大转瓶，需多人同时进行长时间的消化传代操作，增加污染风险；生产周期长，需要10天；效率较低，只能收获一次；因培养基中含有一定浓度的血清，其制备的抗原中杂蛋白比较多，易造成免疫动物的应激反应；生产成本较高，人工、场地及原料费用大；对环境要求较高，需要较大的场地和符合GMP要求的高级别的净化厂房；不同生产批次及同一生产批次的转瓶之间生产的抗原效价存在较大差异，容易造成批内及批间的抗原质量差异，进而影响疫苗质量的稳定性；转瓶清洗需要大量水，并且产生的含毒废水需要专门处理，容易对环境造成污染，如处理不当会造成生物安全和公共卫生问题。

而微载体悬浮培养工艺，较转瓶工艺虽有提高，仍存在较大改进空间，其生产周期仍需6～7天，依靠转瓶提供带毒细胞，无法避免转瓶清洗产生的带毒废水，另微载体昂贵，可重复利用次数较少，厂商建议重复利用2～3次，因此微载体成本占疫苗成本比例较高，此外，微载体扩大培养时的球转球工艺相对较难。转瓶工艺及传统的反应器微载体悬浮培养工艺，其生产的抗原中存在较高含量的血清，所产疫苗，仍会使动物机体产生不同程度的不良反应。

发明内容

本发明的目的在于克服现有转瓶培养法及微载体悬浮培养法的不足之处，提供一种应用反应器全悬浮培养技术大规模高密度生产猪圆环病毒2型疫苗抗原的方法。该方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80～90％，较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低50～70％，无需载体，且该工艺占地小，可迅速进行规模化生产，对环境要求较低，自动化程度高，人工成本少，生产批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高产品的产量及质量。

为了实现上述指标，本发明采取了如下技术方案：

一种全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原的方法，包括如下步骤：

(1)种子细胞在摇瓶中的培养及传代在摇瓶中培养种子细胞PK-15B1，取样进行细胞计数，当细胞密度达到1～3×10⁶个/ml时，静置摇瓶，待悬浮细胞自然沉降至瓶底后，用吸管吸去1/2～2/3上清，轻轻反复吹打细胞，加入种子细胞生长液后，按照1～3×10⁵个/ml的密度等量分装入数个摇瓶，并在37℃，80～120r/min转速的条件下继续培养；

(2)种子细胞的接毒将前述培养所得的种子细胞PK-15B1悬液，2000～4000r/min离心5min后，弃去上清，用反应器最终培养液体积3％～5％的PCV2种毒液将细胞重悬起来，并在37℃，80～120r/min的条件下在摇瓶或反应器中维持1h，将接毒后的细胞注入反应器中，并加入细胞生长液(细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM85％～93％，NBCS5％～10％，双抗1％，D-氨基葡萄糖0.5％～2％，硫酸葡聚糖0.5％～2％)，使细胞达到1～3×10⁵个/ml的密度，并设定反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO20％～80％，搅拌速度100～150r/min；

(3)病毒的收获和含量测定待细胞在前述条件下培养了48～72h后取样，进行细胞密度测定，如细胞密度达到1～3×10⁶个/ml，静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，排出1/2～2/3上清，并将细胞维持液(细胞维持液的成份(V/V)为：低糖DMEM93％～97.5％，硫酸葡聚糖0.5～2％，伴刀豆球蛋白A0.5％～2％，水解酪蛋白0.5％～2％，双抗1％)补足至培养终培养体积，设定反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO20％～80％，搅拌速度100～150r/min，在该条件下继续培养48～72h后，取样进行细胞活力测定并静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，收获上清，并根据细胞活力测定结果决定补液策略如死细胞数百分比在90％以下时，则继续补加新鲜细胞维持液至培养终体积，并在pH7.0～7.4，DO20％～80％，搅拌速度100～150r/min的条件下继续培养48～72h，重复上述过程，直至死细胞数量达到90％以上，将细胞全部收获，将收获的抗原反复冻融3次后再经过滤去除细胞碎片，作为半成品，进行病毒含量测定；

(4)用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗；

(5)用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗的方法，包括：将PCV2株在PK-15B1细胞中大量增殖，经灭活后加入佐剂进行乳化，制备疫苗。

本发明具体实施方式

采用搅拌式生物反应器作为培养设备；PK-15B1克隆细胞(CCTCC No.C200936，南京农业大学姜平教授提供)作为种细胞；猪圆环病毒2型SH株(南京农业大学姜平教授提供)作为种毒；含有硫酸葡聚糖和D-氨基葡萄糖的低糖DMEM作为细胞生长液；含有伴刀豆球蛋白A、硫酸葡聚糖和水解酪蛋白的无血清低糖DMEM作为细胞维持液；包括如下步骤：

(1)种子细胞在摇瓶中培养及传代

种子细胞PK-15B1在摇瓶中培养，取样进行细胞计数，当细胞密度达到1～3×10⁶个/ml时，静置摇瓶，待悬浮细胞自然沉降至瓶底后，用吸管吸去上清1/2～2/3，轻轻反复吹打细胞，加入种子细胞生长液(种子细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM87％～93.5％，新生牛血清(NBCS)5％～10％，双抗1％，硫酸葡聚糖0.5～2％)后，按照1～3×10⁵个/ml的密度等量分装入数个摇瓶，并在37℃，80～120r/min转速的条件下继续培养；

(2)种子细胞接毒

将前述培养所得的种子细胞悬液，以2000～4000r/min转速离心5min后，弃去上清，用设定培养终体积的3％～5％的PCV2CGMCC No.2389株(由南京农业大学姜平教授提供)种毒液将沉淀的细胞重悬起来，并在37℃，80～120r/min转速的条件下在摇瓶或反应器中维持1h，随后将接入病毒后的细胞悬浮液注入反应器中，并加入细胞生长液(细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM85～93％，NBCS5％～10％，双抗1％，D-氨基葡萄糖0.5％～2％，硫酸葡聚糖0.5％～2％)至设定培养的最终体积，使细胞达到1～3×10⁵个/ml的密度，反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO20％～80％，搅拌速度100～150r/min；

(3)病毒的收获和含量测定

待细胞在前述条件下培养48～72h后取样，进行细胞密度测定，如细胞密度达到1～3×10⁶个/ml，静置，待培养的悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，排出1/2～2/3的上清液(弃去)，加入细胞维持液(细胞维持液的成份(V/V)为：低糖DMEM93％～97.5％，硫酸葡聚糖0.5％～2％，伴刀豆球蛋白A0.5％～2％，水解酪蛋白0.5％～2％，双抗为1％)设定培养的最终体积，反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO20％～80％，搅拌速度100～150r/min，在该条件下继续培养48～72h后，取样进行细胞活力测定并静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，收获上清；根据细胞活力测定结果决定补液策略，如死细胞数百分比在90％以下时，继续补加新鲜细胞维持液至设定培养的最终体积，并在pH7.0～7.4，DO20％～80％，搅拌速度100～150r/min的条件下继续培养48～72h，重复上述过程，直至死细胞百分数达到90％，将收获全部细胞病毒培养液，与前各次收获的上清液混合，并经反复冻融3次后再经过滤去除细胞碎片，进行病毒含量测定后成为制苗用抗原(半成品)。

(4)用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗。

以上所述的生物反应器为搅拌式生物反应器，其可自动控制培养温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，容积为2L～3000L；培养温度为33～38℃、pH6.5～7.4、溶氧20％～80％、搅拌速度80～200r/min，生物反应器在使用前需调试，灭菌；

本发明所述种子细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM(AXF42461DC HYCLONE)87％～93.5％，NBCS(130502杭州天杭生物科技有限公司)5％～10％，双抗1％，硫酸葡聚糖(1C221C22生兴生物)0.5％～2％；

本发明所述细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM85～93％，NBCS5％～10％，双抗1％，D-氨基葡萄糖(C4875SIGMA)0.5％～2％，硫酸葡聚糖0.5％～2％；

本发明所述细胞维持液的成份(V/V)为：低糖DMEM93％～97.5％，硫酸葡聚糖0.5％～2％，伴刀豆球蛋白A(C5275SIGMA)0.5％～2％，水解酪蛋白(BCBL0573V FLUKA)0.5％～2％，双抗为1％；

本发明所述双抗为含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。

本发明所述细胞活力检测，采用Muse^TM Cell Analyzer(MERCK MILLIPORE)及Muse^TM Count&Viability Kit(14-0156MERCK MILLIPORE)。

微生物资源信息

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)SH株(保藏号为CGMCC No.2389，由南京农业大学姜平教授提供)；PK-15B1株细胞(保藏号：CCTCC No.C200936，由南京农业大学姜平教授提供)；该毒株和细胞为我国商品化猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)的生产用种毒和细胞，该疫苗由中华人民共和国农业部批准为二类新兽药(农业部公告1448号，2010.08.27发布)。

本发明积极意义

本发明涉及了一种应用反应器全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的方法，本发明使用生物反应器全悬浮无血清培养生产PCV2抗原，制备灭活疫苗。该发明方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原成本降低90％以上，投入产出比提高4～10倍，较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低50％～70％，产量提高3～5倍，此发明无需载体，无血清残留，生产的疫苗安全性更高，同时制品的批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高制品的产量及质量。

(1)本发明用生物反应器全悬浮培养工艺代替转瓶培养工艺生产猪圆环病毒2型抗原，可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低、成本高、成品苗不良反应强的问题，通过生产技术和工艺的改变，全面提高疫苗质量和产量，提升疫苗的安全性。

(2)本发明应用生物反应器进行疫苗生产，较转瓶工艺自动化水平高，降低人工成本，生产工艺简单稳定，操作简便易扩大，较传统生物反应器工艺，无需使用微载体，避免使用胰酶进行细胞传代，从而避免胰酶对细胞的损伤，无血清培养，提高病毒收获次数，并在细胞维持液中添加伴刀豆球蛋白A，提高了病毒效价，进而提高了抗原的产量及滴度，进一步降低制苗成本。

(3)本发明的产品病毒效价比传统转瓶细胞培养法提高10～30倍，病毒效价可以稳定在10^7.0TCID₅₀/ml以上；抗原质量稳定，每罐收获的病毒抗原一致均一，易于规模化生产，且整个生产工艺过程带毒部分均完全在密闭的罐体和管道中进行，为封闭状态，不涉及传统转瓶生产工艺及传统反应器生产工艺所存在的其他生物安全和公共卫生问题。

附图说明

图1本发明的制备工艺流程图。

实施例

以下结合说明书附图及具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例1

——全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原

1.猪圆环病毒2型抗原的制备(1)种子细胞在摇瓶中的培养及传代

种子细胞PK-15B1(CCTCC No.C200936，由南京农业大学姜平教授提供)在摇瓶中培养生长，取样进行细胞计数，细胞密度达到2×10⁶个/ml时，静置摇瓶，待悬浮细胞自然沉淀至瓶底后，用吸管吸去上清2/3，轻轻反复吹打细胞，加入种子细胞生长液(细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM88％，NBCS10％，硫酸葡聚糖1％，双抗1％)后，按照2×10⁵个/ml的密度等量分装入数个摇瓶，并在37℃，100r/min转速的条件下继续培养；

(2)种子细胞的接毒

将前述培养所得的种子细胞悬液，以3000r/min转速离心5min后，弃去上清，使用反应器培养终体积5％的PCV2CGMCC No.2389(由南京农业大学姜平教授提供)种毒液将细胞重悬起来，并在37℃，100r/min转速的条件下在摇瓶中维持1h，随后将接毒后的细胞注入反应器中，并加入细胞生长液(细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM87％，NBCS10％，双抗1％，D-氨基葡萄糖1％，硫酸葡聚糖1％)至设定培养终体积5L，细胞达到2×10⁵个/ml的密度，反应器控制条件为：pH7.2，DO50％，搅拌速度120r/min。

(3)病毒的收获和含量测定

待细胞在前述条件下，细胞生长液中培养48h后取样，进行细胞密度测定，细胞密度达到1.85×10⁶个/ml，静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，排出上清1/2(约2.5L)，并使用细胞维持液补足至设定的培养液最终体积5L，反应器控制条件为：pH7.2，DO40％，搅拌速度120r/min，在该条件下继续培养72h后，静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，收获上清(一收)，并取细胞进行细胞活力检测，死细胞百分比在30％左右，继续补加新鲜细胞维持液(制苗细胞维持液的成份(V/V)为：低糖DMEM97％，伴刀豆球蛋白A0.5％，蛋白水解物0.5％，硫酸葡聚糖1％，双抗1％)至设定培养液的最终体积5L，并在pH7.2，DO40％，搅拌速度120r/min的条件下继续培养72h，重复上述过程共3次收次，直至死细胞数量达到90％将收获全部细胞病毒培养液，与前2收次的上清液混合，并经反复冻融3次后经过滤去除细胞碎片，进行病毒含量测定后成为制苗用抗原(半成品)。

2.半成品检验

半成品病毒含量测定采用IFA测定法，即将PCV2病毒液作10^-1到10^-8倍用维持液比稀释后分别接种于长满单层的PK-15B1细胞，每个稀释度4个孔，每孔0.2ml，同时设立阴性对照，37℃含5％CO₂的温箱中培养48h后，无水乙醇固定细胞，用倒置荧光显微镜观察每个稀释度含有PCV2阳性细胞(绿色荧光)的孔数，按Karber氏法计算病毒含量。

(1)半成品病毒含量测定根据国家标准病毒含量应≥10^5.5TCID₅₀/ml，此实施例中猪圆环病毒2型抗原的病毒含量为10^7.33TCID₅₀/ml。

(2)无菌检验按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典。2010年版三部.中国农业出版社，2011年，本发明以下简称《中国兽药典》)，无菌生长。

3.疫苗制造、成品检验

(1)疫苗制造用以上所述的猪圆环病毒2型抗原半成品制备疫苗，包括：将PCV2株在PK-15B1细胞中大量增殖，经灭活后加入佐剂进行乳化，制备疫苗。

(2)成品检验按《猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)质量标准》(农业部公告1448号，2010.08.27发布，参见中国兽医药品监察所，农业部兽药评审中心组编.兽用生物制品质量标准汇编(2010)，中国农业出版社，2011)要求进行，抗体效价为1：6400，符合要求。

本实施例采用的技术方案中，生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于全悬浮培养细胞的生物反应器，容积为7.5L。

本技术方案中，所述双抗为含10000IU/ml青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。

本技术方案中,所述细胞活力检测，采用Muse^TM Cell Analyzer及Muse^TM Count&Viability Kit。

实施例2

——全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原

1.猪圆环病毒2型抗原的制备

(1)种子细胞在摇瓶中的培养及传代

取样进行细胞计数，细胞密度达到2.5×10⁶个/ml时，静置摇瓶，待悬浮细胞自然沉淀至瓶底后，用吸管吸去上清2/3，轻轻反复吹打细胞，加入种子细胞生长液后，按照4×10⁵个/ml的密度等量分装入数个摇瓶，并在37℃，100r/min转速的条件下继续培养；

(2)种子细胞的接毒

将前述培养所得的健康细胞悬液，以3000r/min转速离心5min后，弃去上清，使用培养终体积5％的PCV2CGMCC No.2389种毒液(3750ml)将细胞重悬起来，并在37℃，100r/min转速的条件下在反应器中维持1h，随后将接毒后的细胞注入反应器中，并加入细胞生长液至培养终体积75L，使细胞达到2×10⁵个/ml的密度，反应器控制条件为：pH7.2，DO50％，搅拌速度120r/min。

(3)病毒的收获和含量测定

待细胞在前述条件下，细胞生长液中培养72h后取样，进行细胞密度测定，细胞密度达到2.8×10⁶个/ml，静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，排出2/3上清(约50L)，并使用细胞维持液补足培养终体积75L，反应器控制条件为：pH7.2，DO50％，搅拌速度150r/min，在该条件下继续培养72h后，静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，收获上清液(一收)，并取细胞进行细胞活力检测，死细胞百分比在35％左右，继续补加新鲜细胞维持液至培养终体积75L，并在pH7.2，DO50％，搅拌速度150r/min的条件下继续培养72h，重复上述过程至4收，死细胞数量达到90％以上，将细胞病毒培养液全部收获，与前3收次的上清液混合，并经反复冻融3次后经过滤去除细胞碎片，进行病毒含量测定后成为制苗用抗原(半成品)。

2.半成品检验及疫苗制造、成品检验

(1)半成品病毒含量测定：根据国家标准病毒含量应≥10^5.5TCID₅₀/ml。此实施例中猪圆环病毒2型的病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml

(2)无菌检验：按《中国兽药典》附录301页进行，均无菌生长。

3.疫苗制造、成品检验

(2)成品检验成品检验按《猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)质量标准》要求进行，此实施例中的疫苗抗体效价为1∶5280，符合要求。

本实施例采用的技术方案中，生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于全悬浮细胞培养的生物反应器，容积为100L。

本技术方案中，所述种子细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM89％，NBCS10％，双抗1％。

本技术方案中，所述制苗细胞生长液的成份(V/V)为：低糖DMEM87％，NBCS10％，双抗1％，D-氨基葡萄糖1％，硫酸葡聚糖1％。

本技术方案中,所述制苗细胞维持液的成份(V/V)为：低糖DMEM97％，伴刀豆球蛋白A0.5％，蛋白水解物0.5％，硫酸葡聚糖1％，双抗1％。

本技术方案中，所述细胞活力检测，采用Muse^TM Cell Analyzer及Muse^TM Count&Viability Kit。

实施例3

——三种不同细胞培养工艺生产猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)的比较结果，见表1

表1不同细胞培养工艺对比表

在本说明书中所谈到的“实例1”、“实例2”，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点。进一步来说，结合任一实例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。

尽管这里参照本发明的实例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说,在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。

Claims

1.一种全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原的方法，该方法包括如下步骤：

(1)种子细胞在摇瓶中的培养及传代：在摇瓶中培养保藏号为CCTCC No.C200936的种子细胞PK-15B1，取样进行细胞计数，当细胞密度达到1～3×10⁶个/ml时，静置摇瓶，待悬浮细胞自然沉降至瓶底后，用吸管吸去1/2～2/3上清，轻轻反复吹打细胞，加入种子细胞生长液后，按照1～3×10⁵个/ml的密度等量分装入数个摇瓶，并在37℃，80～120r/min转速的条件下继续培养；

(2)种子细胞的接毒：将前述培养所得的种子细胞PK-15B1悬液，2000～4000r/min离心5min后，弃去上清，用反应器最终培养液体积3％～5％的保藏号为CGMCC No.2389的PCV2SH株种毒液将细胞重悬起来，并在37℃，80～120r/min的条件下在摇瓶或反应器中维持1h，将接毒后的细胞注入反应器中，并加入细胞生长液，使细胞达到1～3×10⁵个/ml的密度，反应器控制条件为：pH 7.0～7.4，DO 20％～80％，搅拌速度100～150r/min；

(3)病毒的收获和含量测定：待细胞在前述条件下培养了48～72h后取样，进行细胞密度测定，如细胞密度达到1～3×10⁶个/ml，静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，排出1/2～2/3上清，并将细胞维持液补足至培养终培养体积，设定反应器控制条件为：pH 7.0～7.4，DO 20％～80％，搅拌速度100～150r/min，在该条件下继续培养48～72h后，取样进行细胞活力测定并静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，收获上清，并根据细胞活力测定结果决定补液策略：死细胞数百分比在90％以下时，则继续补加新鲜细胞维持液至培养终体积，并在pH 7.0～7.4，DO 20％～80％，搅拌速度100～150r/min的条件下继续培养48～72h，重复上述过程，直至死细胞数量达到90％以上，将细胞全部收获，将收获的抗原反复冻融3次后再经过滤去除细胞碎片，作为半成品，进行病毒含量测定；

(4)用上述制备的猪圆环病毒2型抗原经灭活后加入佐剂进行乳化，制备成疫苗；

上述种子细胞生长液的成分按体积比为：低糖DMEM 87％～93.5％，NBCS 5％～10％，双抗1％，硫酸葡聚糖0.5％～2％；

上述细胞生长液的成分按体积比为：低糖DMEM 85％～93％，NBCS 5％～10％，双抗1％，D-氨基葡萄糖0.5％～2％，硫酸葡聚糖0.5％～2％；

上述细胞维持液的成分按体积比为：低糖DMEM 93％～97.5％，硫酸葡聚糖0.5～2％，伴刀豆球蛋白A0.5％～2％，水解酪蛋白0.5％～2％，双抗1％。