CN102228686B - 悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制造兽用狂犬灭活疫苗的新型工艺，具体为，悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺。该方法的核心是利用生物反应器大规模悬浮培养BHK21-C13细胞并接种狂犬种毒，通过流加、灌流技术使狂犬病毒大量繁殖，从而获得高浓度及高滴度的狂犬抗原，经浓缩灭活纯化后制备兽用狂犬灭活疫苗，克服了目前工艺繁琐、抗原含量低，效力低，剂量大、批间差大等技术难题。

Description

悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺

技术领域

本发明涉及一种制造兽用狂犬灭活疫苗的方法，具体来讲，涉及悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺。

背景技术

中国狂犬病病人约93％由家犬引起，6％由猫引起，另外还有为数不多的由猪和老鼠引起，因此实现兽用狂犬灭活疫苗的国产化和家养动物定期注射狂犬灭活疫苗是我国控制与消灭狂犬病的重要途径。中国目前兽用狂犬灭活疫苗的生产使用传统转瓶工艺，工艺繁琐、抗原含量低，不能满足质量需求，目前市场还没有供应，所有兽用狂犬灭活疫苗完全依赖进口，价格高、费用大，农村和经济落后地区难以推广使用，不利于动物狂犬病的预防与控制，所以研发安全、高效的兽用狂犬灭活疫苗，尽早实现兽用狂犬灭活疫苗的国产化，降低疫苗成本，才能控制和根除狂犬病。

目前，中国国内BHK21-C13细胞生产兽用狂犬疫苗仍使用传统的转瓶培养工艺，批量小、效率低、劳动强度大、占用场地多，即将狂犬病毒株(Flury毒株等)接种单层生长的BHK21-C13细胞，维持培养4～5日，一次性收获、冻融，制备成疫苗。因每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，而且操作劳动强度大，导致中国国产狂犬疫苗批间差大，隐性污染引起高内毒素等缺点。

反应器悬浮培养BHK21-C13细胞生产狂犬病毒工艺是解决上述问题的一个途径，但是目前还没有利用BHK21-C13细胞悬浮工艺制造兽用狂犬灭活疫苗的成熟方法，具体的工艺条件有待优化，以达到生产优质兽用狂犬灭活疫苗的目的。

发明内容

本发明的目的就是提供一种悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，以满足规模化生产优质兽用狂犬灭活疫苗的目的。

本发明提供的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，利用细胞悬浮工艺培养狂犬病毒，将收获的狂犬病毒液灭活纯化后制备兽用灭活狂犬疫苗。其中，所述细胞通过以下培养方法而制得：反应器按照0.2～0.5×10⁶细胞/ml接种BHK21-C13细胞，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH：7.20±0.1，DO(dissolved oxygen，即溶氧)：20％～60％，转速：60～110rpm；利用BHK21-C13细胞悬浮工艺培养狂犬病毒的方法为：使所述反应器内的BHK21-C13细胞培养密度大于2×10⁶细胞/ml，更换培养液以终培养体积的0.5～1.0％接入狂犬病毒生产种毒进行培养。设定狂犬病毒培养温度：34.0±1℃，pH：7.40-7.60，DO：20％～60％，转速：60～110rpm，累计培养96～120h，收获病毒液，-20℃保存备用，每0.03ml中病毒含量≥10^5.5。

较佳地，反应器接种的0.2～0.5×10⁶细胞/ml的BHK21-C13悬浮细胞通过以下方法获得：从液氮中取出一支冻存的BHK21-C13悬浮细胞株，贴壁培养1-3代，将贴壁培养BHK21-C13细胞消化，更换悬浮培养基，使接种密度在0.2～0.5×10⁶细胞/ml，悬浮培养1-3代，扩增至反应器所需体积和密度。

较佳地，所述狂犬病毒生产种毒利用BHK21-C13细胞悬浮培养狂犬贴壁生产种毒并连续传1～3代而得。

具体地讲，取长势良好的悬浮BHK21-C13细胞，更换培养液以终培养体积的0.5-1％接入狂犬贴壁生产种毒，设定病毒培养的pH值为7.40-7.60，DO：20％～60％，转速：60～110rpm，温度：34.0±1℃；累计悬浮培养96-120h，待细胞密度＜1×10⁶细胞/ml时收获病毒液，取样检测LD₅₀，连续传1-3代做为生产种毒，-20℃保存备用，每0.03ml中病毒含量≥10^5.5。

较佳地，所述狂犬种毒为Flury-LEP毒株。

较佳地，灭活纯化狂犬病毒液包括澄清、超滤浓缩、灭活、纯化和除菌步骤。

所述超滤浓缩可以通过750K的中空纤维超滤系统进行。

所述灭活纯化的方法为：按病毒液总量(总体积)的1/4000加入β-丙内酯，混合均匀；用Sepharose 4FF柱层析系统纯化，用0.2um的除菌滤器过滤。

较佳地，该方法中用到的培养基为低血清培养基或无血清培养基。

利用本发明提供的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，作为狂犬病毒宿主细胞的BHK21-C13细胞悬浮培养非常成功，培养体积已达1000L；细胞密度达4-8×10⁶细胞/ml。本发明能够实现病毒大量增殖，大大提高病毒滴度与抗原产量，实现工艺自动化，提高疫苗的质量。解决了传统转瓶培养BHK21-C13细胞生产狂犬病毒产量和滴度都非常低，疫苗效力低，免疫剂量大等技术难题。本发明不仅能提高BHK21-C13细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，疫苗质量稳定、批间差小。该发明将改变目前国产兽用狂犬疫苗价廉质低的形象。

附图说明

图1为本发明的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺的技术流程示意图。

具体实施方式

如图1所示，主要技术流程包括以下6个步骤：1、实验室摇瓶细胞培养，2、5L、50L、500L反应器BHK21-C13细胞悬浮培养，3、生产规模狂犬病毒培养，5、浓缩、灭活、纯化，6分装、冻干。

实施例一实验室摇瓶培养BHK21-C13细胞

1、种细胞复苏

从液氮中取出一支冻存的BHK21-C13悬浮细胞株，37℃快速融化，1000rpm离心5分钟。弃上清液，加入适量MEM营养液(含10％新生牛血清)重悬，转至75cm²细胞培养瓶中补MEM营养液液至30ml，37℃静置贴壁培养。

2、细胞传代

细胞培养48-72小时后弃去营养液，加入10ml消化液(0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶溶液)，消化约2分钟后，弃去消化液，静置3-5分钟，补加MEM营养液90ml，分装至3个新的培养瓶中，每瓶装量约30ml，37℃静置培养。

3、细胞摇瓶培养

细胞贴壁培养48-72小时后弃去营养液，加入10ml消化液，(0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶溶液)，消化约2分钟后，弃去消化液，静置3-5分钟，加入约100ml悬浮营养液，调节接种密度在0.2-0.5×10⁶细胞/ml，将细胞液转移至250ml或500ml摇瓶中，将摇瓶放在37℃摇床中，80-120rpm培养。培养48h后取样计数，若细胞密度≥2.0×10⁶细胞/ml时进行细胞传代，否则继续培养。取需要传代的细胞，加入悬浮营养液约900ml，将细胞液稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/ml，将稀释好的细胞液分装至8-10个摇瓶中悬浮培养1-3代，扩增至反应器所需体积和密度。

实施例二5L及生产规模反应器BHK21-C13细胞悬浮培养

1、5L反应器BHK21-C13细胞悬浮培养

将培养好的摇瓶细胞(细胞密度≥2.0×10⁶细胞/ml，活率大于90％)800-1000ml混合在专用接种瓶内，取样计数、无菌检验。将接种瓶内的细胞转移至5L反应器中，加入悬浮营养液约4000ml，稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/ml，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH：7.20±0.1，DO：20％-60％，转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-110rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/ml时将细胞液转至50L反应器内培养，否则继续培养至所需细胞密度。

2、50L反应器BHK21-C13细胞悬浮培养

加入悬浮营养液约45L，将细胞液稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/ml，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃、pH：7.20±0.1、DO：20％-60％、转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在110-140rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/ml时将细胞液转至500L反应器内培养，否则继续培养至所需细胞密度。

3、500L反应器BHK21-C13细胞悬浮培养

加入悬浮营养液约450L，将细胞液稀释至0.2-0.5×10⁶细胞/ml，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃、pH：7.20±0.1、DO：20％-60％、转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在110-140rpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度≥2.0×10⁶细胞/ml时进行病毒培养，否则继续培养至所需细胞密度。

表一5L反应器细胞培养的密度和活率

表二50L反应器细胞培养的密度和活率

表三500L反应器细胞培养的密度和活率

实施例三生产规模狂犬病毒培养

1、贴壁狂犬种毒培养

取长势良好的BHK21-C13贴壁细胞(175cm²克氏瓶)，加入约10ml消化液，消化约2分钟，弃去消化液，静置3-5分钟，补加MEM维持液(含1％新生牛血清)约720ml，接入狂犬贴壁种毒1％(v/v)，分装至8个175cm²克氏瓶中，34±1℃静置培养；培养至48-72h后添加7.5％碳酸氢钠约5-10ml调节pH值至7.4±0.5。继续培养至96-120h收获病毒液，-20℃冷冻保存，取样检测LD₅₀，每0.03ml中病毒含量≥10^5.5。

2、悬浮种毒培养

取5L反应器生长良好的悬浮BHK21-C13细胞(操作方式同实施例二)，弃掉悬浮营养液，加入1/3培养体积的悬浮维持液，按最终培养体积(5L)的0.5-1％接入狂犬贴壁种毒，设定病毒培养的pH值为7.40-7.60，DO：20％～60％，转速：110-140rpm，温度：34.0±1℃，病毒培养48h后流加2/3培养体积的悬浮维持液；72-120h期间，根据细胞密度和活率每日灌流0.5-2个培养体积；共计悬浮培养96-120h，待细胞密度＜1×10⁶细胞/ml时收获病毒液，-20℃冷冻保存。用收获的悬浮病毒液连续传2-3代做为生产种毒，-20℃保存备用。

3、悬浮生产毒培养

取长势良好的悬浮BHK21-C13细胞弃掉悬浮营养液，先加入2/3培养体积的悬浮维持液，按最终培养体积的0.5-1％接毒，设定病毒培养的pH值为7.4-7.6，DO：20％～60％，转速：110-140rpm，温度：34.0±1℃；病毒培养48h后流加1/3的悬浮维持液；72-120h期间，根据细胞密度和活率每日灌流0.5-2个培养体积；共计悬浮培养96-120h，待细胞密度＜1×10⁶细胞/ml时收获病毒液，-20℃冷冻备用。

表四狂犬种毒与生产毒的测毒结果

实施例四浓缩、灭活、纯化

1、澄清

将收获的悬浮生产毒液从冷库中提出，室温解冻，用0.45μm的已灭菌澄清过滤器预处理病毒液至带降温系统的中转储存罐内。

2、超滤浓缩

用纯化水冲洗中空纤维超滤系统至中性，连接中转储存罐与中空纤维超滤系统的进口，连接中空纤维超滤系统的废液口与废液罐；根据原始抗原的病毒含量做30-50倍浓缩。

3、灭活

按浓缩后病毒液总量的1/4000加入灭活剂β-丙内酯或BEI、4℃、灭活24h，期间每隔4小时摇动3-5min，灭活结束37℃放置2h，待纯化。

4、灭活检验

将灭活病毒液原液和10倍稀释液，分别脑内注射体重为11～13g小鼠各10只，0.03ml/只，观察14日，应全部健活。接种后48小时死亡的小鼠应不超过2只，否则应重检。若有小鼠未呈现狂犬病症状而于第5日后死亡，可将脑组织制成乳剂，接种健康小鼠，以观察其死亡的特征或分离病毒。若证明无狂犬病症状或分离不到狂犬病毒，判合格。

5、纯化

将灭活检验合格的病毒液通过Sepharose 4FF柱层析系统纯化，将收集的纯化狂犬病毒液加适量保护剂。

6、除菌

将纯化后的抗原灭活液用0.2um的已灭菌的除菌滤器除菌过滤，备用。

表五浓缩、纯化结果

表六灭活检验结果

实施例五分装、冻干

1、分装

将检验合格的半成品定量分装，每头份疫苗至少含1.0IU。分装后迅速进行冷冻真空干燥

2、冻干过程如下

产品预冻阶段：常温进箱，1-2h将制品降至-42℃并维持2h。

升华干燥阶段：1-2h将制品从-42℃升至-8℃并维持10h；0.5-1h将制品从-8℃升至0℃并维持0.5-1h。

解吸干燥阶段：1-2h将制品从0℃升至28℃并维持7h，冻干结束。

3、成品检验

对成品苗进行以下项目的检测：物理性状、无菌检验、剩余水分测定、真空度测定、安全检验、效力检验、热稳定性试验、细菌内毒素检查、异常毒性检查。相关检测方法及标准符合《中华人民共和国兽药典2005版第三部》之规定

a)物理性状：微红色或乳白色海绵状疏松体，加稀释液后迅速溶解，无异物。

b)无菌检验：无外源微生物污染

c)剩余水分测定：剩余水分应不超过4.0％

d)真空度测定：使用高频火花真空测定器进行测定，容器内出现白色、粉色和紫色辉光，真空度合格否则不合格。

e)安全性检验：用8～14周龄比格犬2只，每只皮下或肌肉注射疫苗2头份，观察21日，应无明显局部或全身反应

F)效力检验：采用NIH(National Institutes of Health)法检测。疫苗每使用剂量至少应含1.0个国际单位(1.0IU)。

g)热稳定性试验：将疫苗于37℃放置14日后进行效力检验，应≥1.0IU/ml

h)细菌内毒素检查：应≤50EU/ml·头份

i)异常毒性检查：

小鼠试验法：每批制品皮下注射18～22g小鼠5只，0.5ml/只(含1头份)。观察21日，应无局部和全身反应，制品判为合格。如不符合上述要求，可用10只小鼠复试一次，观察21日，应无局部和全身反应。

豚鼠试验法：每批制品皮下注射250～350g豚鼠2只，2.0ml/只(含2头份)。观察21日。应无局部和全身反应，制品判为合格。如不符合上述要求，可用4只豚鼠复试一次，观察21日，应无局部和全身反应。

表七成品检验结果

综合来看，悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺提高了单位制品产量，实现了细胞高密度培养及表达、降低了生产成本、劳动强度，保证了大规模生产制品的质量等方面都起到非常重要的作用。

	传统贴壁工艺	悬浮培养工艺
			细胞密度	1.5±0.5×106细胞/ml	7.0±1×106细胞/ml
LD50	≥104.0LD50/0.03ml	≥106.5LD50/0.03ml

Claims (5)

1.悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，该方法利用悬浮培养的高密度细胞，接种狂犬病毒，将收获的狂犬病毒液灭活纯化后制备兽用悬浮狂犬灭活疫苗。其特征在于，所述高密度悬浮细胞通过以下培养方法而制得：反应器按照0.2～0.5×10⁶细胞/ml接种BHK21-C13细胞，设定细胞培养温度：36.5±0.5℃，pH：7.20±0.1，DO：20％～60％，转速：60～110rpm；利用BHK21-C13细胞悬浮工艺培养狂犬病毒的方法为：使所述反应器内的BHK21-C13细胞培养密度大于2×10⁶细胞/ml，更换培养液以终培养体积的0.5～1.0％接入狂犬病毒生产种毒进行培养，设定狂犬病毒培养温度：34.0±1℃，pH：7.40-7.60，DO：20％～60％，转速：60～110rpm，累计培养96～120h，收获病毒液，-20℃保存备用，每0.03ml中病毒含量≥10^5.5，

反应器接种的0.2～0.5×10⁶细胞/ml的BHK21-C13悬浮细胞通过以下方法获得：从液氮中取出一支冻存的BHK21-C13悬浮细胞株，贴壁培养1-3代，将贴壁培养BHK21-C13细胞消化，更换悬浮培养基，使接种密度在0.2～0.5×10⁶细胞/ml，悬浮培养1-3代，扩增至反应器所需体积和密度，

所述狂犬种毒为Flury-LEP毒株，

所述狂犬病毒生产种毒利用BHK21-C13细胞悬浮培养狂犬贴壁生产种毒并连续传1～3代而得，

所述狂犬病毒生产种毒的制备方法为：取长势良好的悬浮BHK21-C13细胞，更换培养液以终培养体积的0.5-1％接入狂犬贴壁生产种毒，设定病毒培养的pH值为7.40-7.60，DO：20％～60％，转速：60～110rpm，温度：34.0±1℃；累计悬浮培养96-120h，待细胞密度＜1×10⁶细胞/ml时收获病毒液，取样检测LD₅₀，连续传1-3代做为生产种毒，-20℃保存备用，每0.03ml中病毒含量≥10^5.5。

2.根据权利要求1所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，灭活纯化狂犬病毒液包括澄清、超滤浓缩、灭活、纯化和除菌步骤。

3.根据权利要求2所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，所述超滤浓缩通过750K的中空纤维超滤系统进行。

4.根据权利要求2所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，所述灭活纯化的方法为：按病毒液总量的1/4000加入β-丙内酯，混合均匀；用Sepharose 4FF柱层析系统纯化，用0.2um的除菌滤器过滤。

5.根据权利要求1所述的悬浮培养细胞制造兽用狂犬灭活冻干疫苗工艺，其特征在于，该方法中用到的培养基为低血清培养基或无血清培养基。

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