CN106916780B - 高密度悬浮培养的bhk21细胞克隆株 - Google Patents

高密度悬浮培养的bhk21细胞克隆株 Download PDF

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Abstract

本发明提供高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株，所述高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：叙利亚仓鼠肾细胞BHK21‑XF‑C02，保藏编号为：C2016148。本发明通过单细胞克隆培养和筛选，得到了一株高密度悬浮培养的BHK21克隆株（培养物名称：叙利亚仓鼠肾细胞BHK21‑XF‑C02，保藏编号C2016148），为BHK21细胞敏感病毒的研究和疫苗生产提供高密度悬浮培养的细胞株。

Description

高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株
技术领域
本发明涉及一株高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株。
背景技术
BHK21细胞即叙利亚仓鼠肾细胞（Baby Hamster Kidney cell，BHK-21或BHK-21）于1961年由Macpherson IA、Stoker MGP建系，源自5只未辨性别的1日龄仓鼠肾，该细胞广泛用于增殖病毒生产疫苗。原始的BHK21细胞株为贴壁生长型细胞，驯化成悬浮培养型细胞系可用生物反应器悬浮培养进行病毒大规模增殖，由于生物反应器的使用在提高疫苗产量的同时还可以提高疫苗的质量，1965年Capstick等在生物反应器中用驯化的悬浮培养型BHK21 细胞培养生产了口蹄疫疫苗，开启了BHK21细胞悬浮培养应用的新篇章，此后该细胞悬浮培养技术在多个领域得到了广泛应用。在我国，薛英等将贴壁培养型BHK21细胞用胰酶消化后在MEM培养基中添加8%和20%新生牛血清直接在生物反应器中100r/m培养驯化，24h细胞倍增可达到2～3倍。李荣等用驯化的低血清悬浮细胞在生物反应器中培养至2×106个/mL后接种口蹄疫病毒再培养20～30h时细胞密度可达4×106个/mL。井莲娜等通过低血清贴壁、低血清悬浮和无血清悬浮三个阶段驯化了适应无血清全悬浮培养的BHK21细胞，驯化的细胞在无血清培养基密度可达4.5×106个/mL以上，细胞活力在90%以上，倍增时间为18h。2011年参与本发明的研究团队依次使用MEM、DMEM/F12和无血清培养基适应培养，血清浓度也从10%逐步降至无血清的方法驯化了BHK21全悬浮培养型细胞，在低血清和无血清生物反应器培养时细胞密度可达5-6×106个/mL，该细胞株时至今日仍在国内多家口蹄疫疫苗企业生产中广泛使用，它的发明推动了我国口蹄疫疫苗的生产规模和产品质量均有了明显的提升（ZL201110050597.7、ZL201110066205.6）。但是，我国口蹄疫疫苗整体生产工艺和产品质量与发达国家仍有一定的差距，其中没有高密度培养和高产量的细胞株是制约我国口蹄疫疫苗行业工艺改进和产品技术升级的关键因素之一。
发明内容
本发明提供了一株高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株。本发明将对口蹄疫病毒敏感的BHK21悬浮培养型细胞进行单细胞克隆筛选，得到了一株能够在无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK21克隆株，细胞培养密度比目前生产用的克隆前的细胞提高近一倍：在生物反应器培养密度可达1.0×107个/mL以上，并将该单细胞克隆株在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行了保藏，保藏编号为：C2016148，分类命名：叙利亚仓鼠肾细胞BHK21-XF-C02，保藏日期为：2016年7月27日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
本发明的第一个目的是提供高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株，所述高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：叙利亚仓鼠肾细胞BHK21-XF-C02，保藏编号为：CCTCC NO：C2016148。
本发明的第二个目的是提供上述高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株在对BHK21细胞敏感病毒的培养中的应用。
作为优选，所述敏感病毒为口蹄疫病毒。
作为优选，所述BHK21细胞克隆株作为细胞基质在口蹄疫病毒疫苗培养中的应用。
作为优选，所述BHK21细胞克隆株细胞的培养密度达到1.0×107个/ml以上。
本申请人通过单细胞克隆培养和筛选，得到了一株高密度悬浮培养的BHK21细胞株（分类命名：叙利亚仓鼠肾细胞BHK21-XF-C02，保藏编号为：C2016148），为我国开展口蹄疫等病毒的研究和疫苗生产提供高密度悬浮培养的细胞株。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为悬浮培养型BHK21单细胞克隆生长过程；其中，A.第4天（20X），B.第5天（20X），C.第11天（4X）。
图2为BHK21-XF-C02细胞克隆株；
图3为悬浮培养型BHK21细胞克隆前后批培养对比图；
图4为悬浮培养型BHK21细胞克隆前后生物反应器培养对比图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1.材料
1.1 BHK21悬浮细胞株，由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供，目前应用于国内多家口蹄疫疫苗企业的生产中。
1.2 BFLM-BHK21无血清培养基，兰州百灵生物技术有限公司，批号：20160317。
1.3胎牛血清，兰州民海生物工程有限公司，批号：20141003。
1.4U型96孔细胞培养板：批号140029，货号163320；
24孔细胞培养板：批号7193630，货号142475；
冻存管1.5ml（货号：5000-1020，批号1115432）。
均为ThermoFisher生产。
1.5 细胞培养瓶
T25货号：430639，批号：12814601；
T75货号：430641，批号：08514601；
均为corning生产。
2.主要仪器设备
2.1生物显微镜，CKX-41，日本，OLYMPUS。
2.2 CO2培养箱，3111，美国，ThermoFisher。
2.3 摇床，ZHWY-2102C，上海智城分析仪器制造有限公司
2.4细胞计数仪，CASY TT，美国，INNOVATIS。
2.5 细胞生物反应器，BIOSTATEOR B plus，B.Braun，培养罐体积5L。
2.6 液氮贮存罐，YDS-100B-200F，乐山市东亚机电工贸有限公司。
2.7其它：锥形细胞培养瓶（150ml）和各种规格的移液管、移液器等。
3.方法
3.1细胞复苏与培养
从液氮中取出冻存有BHK21悬浮细胞的冻存管置于38-40℃水浴中快速溶解，将全部细胞接种到锥形细胞培养瓶（150ml锥形细胞培养瓶的培养液体积为40ml）中，培养液为：40ml在无血清培养基中加体积百分含量20%胎牛血清制成的培养液，置于110r/min ，37℃摇床培养48小时。用40ml在无血清培养基中加体积百分含量10%胎牛血清制成的培养液再培养48小时，用培养液直接调整细胞初始密度为5-7×105个/ml，弃去多余的细胞，培养条件同前述。
3.2 单细胞悬浮制备
采用有限稀释法制备单细胞悬液。取复苏后传代培养了一代的BHK21悬浮细胞，计数后用在无血清培养基中加体积百分含量10%胎牛血清制成的培养液按以下方法稀释制备单细胞悬液。
细胞计数浓度→100×104个/ml→10×104个/ml→1×104个/ml→1×103个/ml。
3.3 单细胞的克隆培养
吸取上述3.2制备的1×103个/ml的单细胞悬液500μl至100ml培养基（培养基为在BFLM-BHK21无血清培养基中加体积百分含量10%胎牛血清）中混合均匀。用12道移液器加到U型96孔细胞培养板中，每孔加200μl（即每孔加1个细胞），共加5块培养板并于 37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养。培养2h后取出细胞板，在显微镜下逐孔观察，标记出只有1个细胞的孔，再放回培养箱继续培养。每天观察只接种了一个细胞的孔内的中生长情况，培养到第7天挑选其中30株生长较快的单克隆细胞进行换液，以后每2天换液一次。换液的培养液是在无血清培养基中加体积百分含量10%胎牛血清制成，每次换液量为200μl/孔。
3.4 单克隆细胞的扩大培养
（1）待单克隆细胞生长至U型96孔培养板底部60%以上生长面时进行扩大培养。单克隆细胞每次培养操作时要逐孔依次进行，防止细胞间交叉污染，如同时操作多个孔，有细胞间交叉污染的风险。从第一次传代的先后顺序编号，依次为BHK21-XF-C01、
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。在传代扩大培养期间可淘汰生长不良的细胞株。由于克隆使用的细胞是本身经过悬浮培养驯化的细胞，细胞在静止培养时在培养基质（培养板、培养瓶）上的贴附性已经弱化，传代时只轻轻吹打后细胞便可完全悬浮。
（2）单细胞细胞的传代放大流程如下：
1孔U型96孔培养板→1孔24孔培养板→3孔24孔培养板→1个T25培养瓶→1个T75培养瓶→1个150ml锥形细胞培养瓶。
（3）传代培养方法
第一次传代培养后待细胞长满培养容器底部90%以上生长面时用移液器和吸管轻轻吹打待传代的细胞，连同培养液一起转移到下一级培养容器中，再补加在无血清培养基中加体积百分含量10%胎牛血清制成的培养液至培养体积。其中，24孔培养板的培养体积为1ml/孔、T25培养瓶为10ml/瓶、T75培养瓶为20ml/瓶。
上述在培养板和培养瓶培养阶段是在37℃，5%CO2的培养箱中培养，每2天换液一次，换液的培养基仍为在无血清培养基中加体积百分含量10%胎牛血清制成的培养液，换液量为该容器的培养体积量。
待细胞在T75培养瓶中生长至80%以上生长面时，全部转移到1个150ml锥形细胞培养瓶中补加在无血清培养基中加体积百分含量5%胎牛血清制成培养液至40ml，置于110r/min ，37℃摇床培养，每天计数细胞的密度和活力。
3.5 单克隆细胞株原始细胞库的建立
（1）根据培养过程中细胞的长势和形态情况，挑选优势克隆株进行保种冻存。
（2）将150ml锥形细胞培养瓶中的细胞密度达到3×106个/ml以上、细胞活力在90%以上的每株冻存10支建立原始细胞库。
（3）冻存方法：取细胞悬浮以1000rpm离心10min后弃上清，用细胞冻存液重新悬浮离心后的细胞并调整细胞浓度为1-2×107个/ml，每支冻存管按1ml分装，贴标签后按常规方法在液氮中保存，标签要标记细胞编号、细胞株名称、克隆株号、细胞代次和冻存日期等信息，建立原始细胞库，保存种子细胞。
细胞冻存液的组成：10%DMSO（二甲基亚砜）+20%胎牛血清+70%无血清培养基（均为体积百分数）。
3.6挑选高密度悬浮培养的单克隆细胞株，建立主细胞库
（1）按3.1方法从原始细胞库中复苏单克隆细胞株并培养，第一次传代时使用在无血清培养基中加入体积百分含量10%胎牛血清制成的培养液，第二次传代时血清浓度再降至5%，再后期传代用不加血清的无血清培养基。从血清浓度5%开始，每培养72小时传代一次，每次传代时调整细胞初始密度为5-7×105个/ml，弃去多余的细胞。
（2）通过传代适应培养，在10代内以5-7×105个/ml接种培养，能在72小时细胞密度达到7.5×106个/ml以上的单克隆株冻存500支建立主细胞库。冻存方法同3.5（3）。
3.7高密度悬浮培养单克隆细胞株的生长曲线
按3.6（1）的方法从主细胞库中复苏培养单克隆株，无血清适应培养3代后5-7×105个/ml的初始密度接种，连续计数3个代次的细胞在每个生长周期内的细胞密度，绘制细胞的生长曲线。同期也按上述方法复苏克隆前的BHK21悬浮型细胞进行培养比较。
3.8高密度悬浮培养单克隆细胞株的生物反应器培养
取3.7经无血清适应培养3代以上的高密度悬浮培养单克隆细胞株，用生物反应器无血清培养基流加培养方式连续培养两批，绘制细胞在生物反应器中的生长曲线。同期用克隆前的BHK21悬浮细胞进行培养比较。初始接种细胞密度1.0×106个/ml，初始培养体积为2.0L，生物反应器培养的控制参数如表1所示。
表1 生物反应器培养参数
Figure DEST_PATH_IMAGE003
3.9保藏
取生物反应器培养密度达到1.0×107个/ml以上的主细胞库冻存的细胞，用加干冰的包装快运至中国典型培养物保藏中心（武汉）进行保藏，以防单一地方保藏时发生意外造成资源的丢失。
4结果
4.1 通过单细胞克隆筛选，最后保存了12株优势细胞株建立了原始细胞库，细胞均为均匀的悬浮型细胞，细胞编号和冻存信息见表2：
表2 单克隆细胞株的冻存信息表
Figure DEST_PATH_IMAGE005
4.2从原始细胞库中复苏后适应培养和挑选，其中，BHK21-XF-C02克隆株在第7代时
培养72小时细胞密度为7.6×106个/ml，冻存了500支建立主细胞库。
4.3从主细胞库中复苏BHK21-XF-C02克隆株，以经无血清培养基适应培养3代后以6.5×105个/ml接种培养，在72h时平均细胞达83.8 ×105个/ml，而克隆前的该细胞在72h时平均为60.5 ×105个/ml，克隆株的细胞密度提高了23.3 ×105个/ml，并且克隆株在96h时细胞平均密度还在74.0 ×105个/ml，而此时克隆前该细胞平均细胞密度下降到52.0×105个/ml。细胞计数结果见表3。
表3 锥形细胞培养瓶无血清批培养的计数结果表
Figure DEST_PATH_IMAGE007
4.4 挑选的BHK21-XF-C02克隆株在用无血清培养基在生物反应器流加培养时96h时细胞平均密度达到110.6×105个/ml，而在克隆前的该细胞96h时平均为55.7 ×105个/ml，克隆株的细胞密度提高了近一倍，并且克隆株在120h时细胞平均密度还在103.4×105个/ml，而此时克隆前该细胞平均细胞密度只有58.5×105个/ml。细胞计数结果见表4。
表4生物反应器无血清流加培养的计数结果表
Figure DEST_PATH_IMAGE009
4.从主细胞库中取BHK21-XF-C02单克隆细胞株，用加干冰的包装快运至中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行保藏，分类命名：叙利亚仓鼠肾细胞BHK21-XF-C02，保藏编号为：C2016148，保藏日期为：2016年7月27日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
经实验，本发明的细胞株叙利亚仓鼠肾细胞BHK21-XF-C02是悬浮培养型，适应无血清高密度培养。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株，其特征在于：所述的高密度悬浮培养的BHK21细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：叙利亚仓鼠肾细胞BHK21-XF-C02，保藏编号为：CCTCC NO: C2016148。
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