CN113981007A - 基于hek293t克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，包括以下步骤：S1适合慢病毒包装的HEK293T贴壁细胞的克隆筛选，筛选出侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，S2对筛选的HEK293T贴壁细胞进行快速悬浮驯化，得到细胞活率93～98%，且细胞分散性较好、无明显聚集的悬浮驯化成功的HEK293T细胞；S3悬浮HEK293T高滴度慢病毒包装克隆细胞的筛选，筛选侵染效率高的病毒上清，所对应的克隆细胞即为慢病毒高产的悬浮HEK293T细胞克隆。本发明提供的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，能快速获得生产高滴度慢病毒的悬浮HEK293T细胞克隆，所获得的悬浮HEK293T细胞克隆能无血清悬浮培养和病毒包装，病毒滴度高，纯化效率高，易于放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法。
背景技术
慢病毒常用于嵌合抗原受体-T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)，其具有转导效率高、可整合T细胞基因组并持续表达目标蛋白等优势。现如今，CAR-T生产大多基于慢病毒载体介导的CAR基因转移。当前，用于生产慢病毒的工艺大多基于依赖胎牛血清(FBS)的贴壁细胞工艺（如HEK293T），其具有慢病毒表达滴度高、硬件投入少等优点。然而，其依赖胎牛血清(FBS)，这与当前的法规不相适宜，因此必须对FBS的生产厂商进行严格审计，此外还需对去除进行评估和检测。其次，胎牛血清(FBS)批次及产地差异也可能导致所表达的慢病毒存在批间差异。另一个关键问题是，目前使用贴壁细胞工艺多数为细胞工厂，因此较难进行放大生产。目前，基于细胞工厂的慢病毒生产通常为10层细胞工厂（CF-10）或40层细胞工厂（CF-40），一般10～20个，这对于操作和人力提出了较大挑战。
悬浮细胞可以在不依赖于胎牛血清(FBS)的化学成分明确的培养基(CD media)中高密度生长，利用细胞培养摇瓶可很方便放大至生物反应器中（如2 L、15 L、50L、200 L、2000L）进行生产，因此易于放大生产。
当前，适用于慢病毒生产的商业化悬浮细胞系统为ThermoFisher公司的LV-MAX系统，其病毒包装滴度高，但其培养基和转染试剂包昂贵，且包装的慢病毒上清HCP(通常达200 μg/mL)和HCD(通常达20 μg/mL)含量高，给后续的纯化造成极大挑战。
现有技术中公开了部分HEK293T贴壁细胞的悬浮驯化工艺，这种悬浮驯化工艺是采用逐渐降低培养基中的胎牛血清(FBS)用量的方案，使HEK293T贴壁细胞逐渐驯化为不需要胎牛血清(FBS)的培养基的悬浮驯化方案，这种方案的缺点在于耗时很长，通常驯化时间至少需要一个月，且得到的驯化的悬浮HEK293T细胞经过质粒包装后的慢病毒滴度较低，而且其中HCP含量较高，使后续的纯化过程难度很大。
发明内容
本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的HEK293T贴壁细胞存在的依赖胎牛血清(FBS)，慢病毒存在批间差异，难以放大生产以及悬浮驯化细胞系统存在的培养基和转染试剂包昂贵，驯化时间长，通常至少要一个月，且包装的慢病毒上清HCP和HCD含量很高，给后续的纯化造成极大的困难等问题，提供一种能够解决前述问题的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，包括以下步骤：
S1、适合慢病毒包装的HEK293T贴壁细胞的克隆筛选，其具体包括以下步骤：
A1、复苏贴壁培养的HEK293T细胞，使用DEME培养基+10%FBS进行贴壁培养；
A2、将对数生长期的细胞以VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基进行贴壁培养；
A3、将对数生长期的细胞进行96孔细胞培养板铺板，每孔补加VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基；
A4、培养5～7天后进行克隆观察，并更换一部分的VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基，继续培养，待细胞克隆扩大至所需的量时使用胰酶进行消化，将一部分细胞作为种子细胞，另一部分细胞进行携带EGFP基因的慢病毒转移质粒和包装质粒共转染，并进行细胞克隆标记；筛选出侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，扩大培养时使用的培养基为VP-SFM+1%FBS培养基；
S2、对筛选的HEK293T贴壁细胞进行快速悬浮驯化，具体包括以下步骤：
B1、使用VP-SFM+2 mM GlutaMax+1%FBS培养基复苏冻存的EGFP慢病毒包装滴度高的克隆细胞，静置培养2～3天后消耗细胞；然后仅以VP-SFM+2 mM GlutaMax进行扩大静置培养，继续静置培养2～3天后收集细胞；
用VP-SFM +1%FBS完全培养基培养至状态良好后，使用不含FBS的VP-SFM培养基进行扩大培养，收集扩大培养的细胞进行活细胞密度计数；
B2、使用Transpro CD01+4 mM GlutaMax+0.1% Anti-clumping agent完全培养基于细胞培养摇瓶进行振荡培养，复悬细胞后使用细胞培养摇床进行振荡培养，然后进行适应性传代培养，直至细胞活率为93～98%，且细胞分散性较好、无明显聚集，此即为悬浮驯化成功的HEK293T细胞，将若干悬浮驯化好的克隆细胞扩大培养并进行冻存；
S3、悬浮HEK293T高滴度慢病毒包装克隆细胞的筛选，具体步骤为：使用TransproCD01+4 mM GlutaMax+0.1% Anti-clumping agent完全培养基复苏冻存的HEK293T悬浮细胞克隆，使用EGFP慢病毒转移质粒和包装质粒共转染各悬浮HEK293T细胞克隆，48 h后收获各细胞克隆含EGFP慢病毒的上清液，1500 g离心15 min去除细胞及其碎片，然后以此上清进行不同倍数稀释，并将稀释的病毒液侵染96孔板贴壁的HEK293T细胞，以荧光显微镜和流式细胞术(FACS)检测并筛选侵染效率高的病毒上清，所对应的克隆细胞即为慢病毒高产的悬浮HEK293T细胞克隆。
作为上述的HEK293T细胞悬浮驯化方法的进一步改进，步骤A3中，采用有限稀释法按5-20 cells/mL进行96孔细胞培养板铺板，每孔添加50-100 μL稀释的细胞液，然后每孔补加50-100μL的VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基。
作为上述的HEK293T细胞悬浮驯化方法的进一步改进，步骤A4中，待细胞克隆扩大至96孔底的2/3时使用胰酶进行消化，将一部分细胞在新的96孔培养板继续培养作为种子细胞，另一部分细胞于另一个新的96孔板进行携带EGFP基因的慢病毒转移质粒转染，并进行细胞克隆标记；在进行转染时，培养24 h后进行EGFP慢病毒转移质粒转染，48 h后使用荧光显微镜进行绿色荧光观察，将绿色荧光发光点亮度高的前若干个克隆细胞进行扩大培养，扩大培养过程中进行细胞冻存备份；然后将扩大培养的克隆细胞进行24孔细胞培养板铺板，培养24 h后使用慢病毒包装质粒进行EGFP慢病毒包装，继续培养48 h后，收集携带EGFP的慢病毒上清液，并按不同稀释倍数侵染铺板的HEK293T细胞， 48～72 h后收集侵染的HEK293T细胞，使用荧光显微镜和FACS进行侵染效率检测，从而确定侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，培养基为VP-SFM培养基+10%FBS完全培养基，待细胞状态良好后，使用VP-SFM +1%FBS完全培养基进行适应性培养，从而为悬浮驯化做准备。
作为上述的HEK293T细胞悬浮驯化方法的进一步改进，步骤A4中，进行EGFP慢病毒转移质粒转染时，质粒用量为0.1-0.6μg/cm2，转染试剂PEIpro与质粒的V/W比为1-3：1。
作为上述的HEK293T细胞悬浮驯化方法的进一步改进，步骤A4中，在进行EGFP慢病毒包装质粒转染时，将EGFP慢病毒转移质粒转染时筛选出的转染效率高的前若干个克隆细胞进行24孔细胞培养板铺板，铺板密度为5-9E+04 cell/cm2。
作为上述的HEK293T细胞悬浮驯化方法的进一步改进，步骤A4中，使用慢病毒包装质粒进行EGFP慢病毒包装时，质粒用量为0.1-0.6 μg/cm2，质粒比为EGFP转移质粒:Pol/gag：VSV-g：Rev=2:1:1:1,转染试剂PEIpro:质粒DNA 的V/W比为1-3:1。
作为上述的HEK293T细胞悬浮驯化方法的进一步改进，步骤A4中，按不同稀释倍数侵染铺板的HEK293T细胞时，铺板的HEK293T细胞的铺板密度为5-9E+04 cell/cm2，铺板的HEK293T细胞的培养基为DMEM+10%FBS培养基。
作为上述的HEK293T细胞悬浮驯化方法的进一步改进，步骤B2中，复悬细胞时，复悬细胞密度为5-9E+05 cells/mL，后续传代培养时，细胞密度按5～8E+05 cells/mL进行适应性传代培养。
作为上述的HEK293T细胞悬浮驯化方法的进一步改进，步骤B2中，将活率达到93-98%的细胞接种至24孔板，24 h后进行EGFP慢病毒包装，进行EGFP慢病毒包装时，慢病毒包装细胞密度为1-3E+06 cells/mL，质粒用量为1-5 μg/mL，质粒比为EGFP转移质粒:Pol/gag：VSV-g：Rev=2:1:1:1,转染试剂PEIpro:质粒DNA的 V/W 比为1-3:1，继续培养48 h后，收集携带EGFP的慢病毒上清液，并按不同稀释倍数侵染铺板的HEK293T细胞，48～72 h后收集侵染的HEK293T细胞，使用荧光显微镜和FACS进行侵染效率检测，从而确定侵染效率最高的克隆细胞进行扩大培养并建库，得到悬浮驯化的HEK293T细胞。
上述的种子细胞就是克隆扩增出来的细胞，在确定哪个克隆是最好的克隆前需保留每一个克隆细胞作为种子。种子细胞是用于将来细胞建库用的，不能进行转染操作。
上述的冻存备份的目的是把这些挑选出来的高表达克隆在不同细胞代次进行细胞冻存备份，一是防止后面细胞操作污染造成细胞丢失，二是冻存不同代次的细胞，代次越早的细胞，可能有些性能表现越好。
本发明的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法具有以下的优点： 1）本发明的HEK293T细胞悬浮驯化方法与现有的逐渐降低培养基中的胎牛血清(FBS)含量的驯化方法相比，驯化时间从现有的至少1个月，缩短至1～2周，大大缩短了驯化时间，提高了生产效率；2）本发明的HEK293T细胞悬浮驯化方法，对慢病毒包装条件进行了摸索和优化，如培养基、细胞密度、质粒用量、转染试剂与质粒比等，其所获得的慢病毒滴度产量高，HCP相对于商业化系统显著降低，且可使用国产培养基替代CD培养基，且易于大规模扩大生产；3）本发明的HEK293T细胞悬浮驯化方法，能使驯化后的HEK293T细胞的培养基中不需要添加胎牛血清(FBS)，可以使用国产培养基培养，因而可大大降低成本；转染试剂使用PEIpro法进行转染，不仅操作简单，而且大大降低成本，悬浮细胞易于放大培养，适合大规模生产，本发明的悬浮HEK293T细胞，进行慢病毒包装后，上清液中病毒感染滴度达1E+07 TU/mL以上，且上清液中HCP含量下降至10 μg/mL以下，远低于现有商业化的慢病毒悬浮细胞包装系统的上清液中HCP含量200 μg/mL，能大大降低后续的纯化处理的难度；4）本发明的HEK293T细胞悬浮驯化方法，在HEK293T贴壁细胞的克隆筛选的过程中，在步骤A4中进行EGFP慢病毒转移质粒和包装质粒共转染，将转染效率最高的若干个细胞筛选出来，进行扩大培养，能使后续得到的悬浮驯化后的HEK293T细胞进行慢病毒包装后具有高的侵染效率，以提高转染细胞的滴度；5）在对克隆筛选的HEK293T贴壁细胞进行快速悬浮驯化时，细胞活率达93-98%后，进行EGFP慢病毒转移质粒和包装质粒共转染，再次筛选出转染效率最高的前若干个克隆细胞进行扩大培养并建库，通过这种筛选，使最后得到的悬浮驯化的细胞克隆的转染效率进一步提高，使后续的慢病毒包装后得到的细胞上清液中病毒滴度更高；通过步骤S3进行悬浮HEK293T高滴度慢病毒包装克隆细胞的筛选，能筛选出侵染效率高的病毒上清，得到慢病毒高产的悬浮HEK293T细胞克隆；6）本发明的HEK293T悬浮驯化方法，在培养过程中，步骤A4中分出一半的细胞作为种子细胞，将转染效率最高的前若干个细胞进行扩大培养，并在扩大培养的过程中进行细胞冻存备份，能使筛选前后的细胞都进行备份保存，以便于后续对种子细胞和冻存备份的细胞进行进一步的培养驯化；7）本发明对筛选的HEK293T贴壁细胞进行悬浮驯化时，使用化学成本限定的悬浮培养基Transpro CD01+0.1% Anti-clumping agent复悬细胞，通过大量的试验表明，悬浮培养基Transpro CD01+0.1% Anti-clumping agent与现有的其他同类CD培养基相比，能极大地提高EGFP转移质粒转染效率，使得到的悬浮驯化的HEK293T细胞进行慢病毒包装后具有更高的滴度和更低的HCP含量。
附图说明
图1a为步骤A4中慢病毒转移质粒转染时高转染效率的克隆细胞荧光图。
图1b为步骤A4中慢病毒转移质粒转染时低转染效率的克隆细胞荧光图。
图2a为步骤A5中EGFP慢病毒包装后高滴度的EGFP慢病毒侵染效率的荧光图。
图2b为步骤A5中 EGFP慢病毒包装后低滴度的EGFP慢病毒侵染效率的荧光图。
图3a为步骤B2中采用Dynamis培养基复悬细胞和进行细胞传代培养，进行EGFP转移质粒转染后的荧光图。
图3b为步骤B2中采用LV-MAX培养基复悬细胞和进行细胞传代培养，进行EGFP转移质粒转染后的荧光图。
图3c为步骤B2中采用SFM4HEK293培养基复悬细胞和进行细胞传代培养，进行EGFP转移质粒转染后的荧光图。
图3d为步骤B2中采用Transpro CD01培养基复悬细胞和进行细胞传代培养，进行EGFP转移质粒转染后的荧光图。
图4为应用例中的采用项目一的包装条件制备的慢病毒转导活化的T细胞CAR阳性率数据图。
图5为应用例中的采用项目二的包装条件制备的慢病毒转导活化的T细胞CAR阳性率数据图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种适用于慢病毒生产的HEK293T悬浮驯化方法，包括以下步骤：
S1、HEK293T贴壁细胞的克隆筛选，其具体包括以下步骤：
A1、复苏贴壁培养的HEK293T细胞，使用DEME培养基+10%FBS进行贴壁培养。
A2、待细胞状态良好后，使用VP-SFM+2 mM GlutMax+10%FBS完全培养基进行贴壁培养。
A3、待其状态良好后，使用有限稀释法按5-20 cells/mL进行96孔细胞培养板铺板，优选10 cells/mL进行铺板，每孔添加50-100μL稀释的细胞液，例如添加100μL稀释的细胞液，然后每孔补加50-100μL的VP-SFM +10%FBS完全培养基，例如补加100μLVP-SFM +2 mMGlutMax+10%FBS完全培养基。
A4、培养5-7天后进行克隆观察，例如培养5天后进行克隆观察，并更换一部分的VP-SFM培养基+10%FBS完全培养基，优选更换一半的VP-SFM培养基+10%FBS完全培养基，继续培养，待细胞克隆扩大至所需的量时使用胰酶进行消化，通常细胞克隆扩大至96孔底的2/3时即可使用胰酶进行消化，将一部分细胞在新的96孔培养板继续培养作为种子细胞，通常可以取一半细胞作为种子细胞，另一部分细胞于另一个新的96孔板进行携带EGFP基因的慢病毒转移质粒转染，并进行细胞克隆标记；在进行转染时，培养24 h后进行EGFP慢病毒转移质粒转染，质粒用量为0.1-0.6 μg/cm2，例如质粒用量为0.4μg/cm2，转染试剂PEIpro与质粒的V/W比为1-3：1，例如转染试剂PEIpro与质粒的V/W比为2：1，48 h后使用荧光显微镜进行绿色荧光观察，将绿色荧光发光点亮度高的前若干个克隆细胞进行扩大培养，通常可以选取前10个-前100个克隆细胞进行扩大培养，例如优选前50个克隆细胞进行扩大培养，扩大培养过程中进行细胞冻存备份。如图1a和图1b所示分别为使用荧光显微镜观察EGFP慢病毒转移质粒转染时低转染效率的克隆细胞和高转染效率的克隆细胞的荧光图，通过图1a和图1b可以看出，高转染效率的克隆细胞的亮度远高于低转染效率的克隆细胞，因而很容易从中筛选出高转染效率的克隆细胞。
A5、将步骤A4中扩大培养的克隆细胞按5-9E+04 cell/cm2的铺板密度进行24孔细胞培养板铺板，例如按8E+04 cell/cm2的铺板密度进行24孔细胞培养板铺板，培养24 h后使用慢病毒包装质粒进行EGFP慢病毒包装，慢病毒包装时，质粒用量为0.1-0.6μg/cm2，例如质粒用量为0.4μg/cm2，质粒比为EGFP转移质粒:Pol/gag：VSV-g：Rev=2:1:1:1,转染试剂PEIpro:质粒DNA 的V/W比为1-3:1，例如转染试剂PEIpro:质粒DNA 的V/W比为2：1。继续培养48 h后，收集携带EGFP的慢病毒上清液，并按不同稀释倍数侵染铺板的HEK293T细胞，HEK293T细胞的铺板密度可以为5-9E+04 cell/cm2，例如铺板密度为8 E+04 cell/cm2，铺板的HEK293T细胞的培养基为DMEM+10%FBS培养基，48～72 h后收集侵染的HEK293T细胞，使用荧光显微镜和FACS进行侵染效率检测，从而确定侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，通常可以选取前10个-前50个克隆细胞进行扩大培养，例如优选前10个克隆细胞进行扩大培养，培养基为VP-SFM培养基+10%FBS完全培养基，待细胞状态良好后，使用VP-SFM +2 mM GlutMax+1%FBS完全培养基进行适应性培养，从而为悬浮驯化做准备。如图2a和2b所示分别为使用荧光显微镜观察EGFP慢病毒包装后低滴度的EGFP慢病毒侵染结果和高滴度的EGFP慢病毒侵染结果。通过图2a和图2b可以看出，高滴度的克隆细胞的亮度远高于低滴度的克隆细胞，因而很容易从中筛选出高滴度的克隆细胞。
S2、对筛选的HEK293T贴壁细胞进行悬浮驯化，具体包括以下步骤：
B1、步骤A5中转染效率较高的前10个克隆细胞用VP-SFM +2 mM GlutMax+1%FBS完全培养基培养至状态良好后，使用不含FBS的VP-SFM培养基进行扩大培养，收集扩大培养的细胞进行活细胞密度计数。
B2、使用化学成本限定的悬浮培养基Transpro CD01+2 mM GlutMax+0.1% Anti-clumping agent按5-9E+05 cells/mL的细胞密度复悬细胞，例如按8 E+05 cells/mL的细胞密度复悬细胞，然后使用细胞培养摇床以125 rpm的速率进行振荡培养，然后按5～8E+05cells/mL的细胞密度进行适应性传代培养，直到细胞活率达95%。
B3、将活率达到95%的细胞接种至24孔板，24 h后进行EGFP慢病毒包装，进行EGFP慢病毒包装时，慢病毒包装细胞密度为2E+06 cells/mL，质粒用量为1-3 μg/mL，例如质粒用量为2μg/mL，质粒比为EGFP转移质粒:Pol/gag：VSV-g：Rev=2:1:1:1,转染试剂PEIpro:质粒DNA的 V/W 比为1-3:1，转染试剂PEIpro:质粒DNA的 V/W 比优选2：1；继续培养48 h后，收集携带EGFP的慢病毒上清液，并按不同稀释倍数侵染铺板的HEK293T细胞，48～72 h后收集侵染的HEK293T细胞，使用荧光显微镜和FACS进行侵染效率检测，从而确定侵染效率最高的克隆细胞进行扩大培养并建库，得到适用于慢病毒生产的悬浮驯化的HEK293T细胞，并将悬浮驯化的细胞克隆命名为HEK293TG2S。
S3、悬浮HEK293T高滴度慢病毒包装克隆细胞的筛选，具体步骤为：使用TransproCD01+4 mM GlutaMax+0.1% Anti-clumping agent完全培养基复苏冻存的HEK293T悬浮细胞克隆，使用EGFP慢病毒转移质粒和包装质粒共转染各悬浮HEK293T细胞克隆，48 h后收获各细胞克隆含EGFP慢病毒的上清液，1500 g离心15 min去除细胞及其碎片，然后以此上清进行不同倍数稀释，并将稀释的病毒液侵染96孔板贴壁的HEK293T细胞，以荧光显微镜和流式细胞术(FACS)检测并筛选侵染效率高的病毒上清，所对应的克隆细胞即为慢病毒高产的悬浮HEK293T细胞克隆。
通过上述的实施例可以看出，本发明的HEK293T悬浮驯化方法与现有技术中逐渐降低培养基中的胎牛血清FBS的方案相比，能将驯化时间从原有的至少1个月缩短至7-14天，而且驯化过程中培养基的用量也能大幅度降低，降低生产成本。
对比例
如图3a-3d分别为步骤B2中采用Dynamis培养基、LV-MAX培养基、SFM4HEK293、Transpro CD01培养基复悬细胞和进行细胞传代培养，进行EGFP转移质粒转染后的荧光图，通过附图3a-3d可以看出，采用Transpro CD01培养基复悬细胞和进行细胞传代培养，进行EGFP转移质粒转染时，荧光亮度最高，转染效率最高，因而慢病毒包装后得到的慢病毒滴度最高。
应用例1
复苏上述实施例中悬浮驯化的HEK293TG2S细胞，使用Transpro CD01+0.1% Anti-clumping agent进行悬浮振荡培养，将细胞培养状态良好的细胞按1E+06 cells/mL进行稀释，继续振荡培养24 h后进行病毒包装。
病毒包装条件为：慢病毒包装细胞密度为2E+06 cells/mL，质粒用量为2 μg/mL，转移质粒:Pol/gag：VSV-g：Rev=2:1:1:1，转染试剂PEIpro:质粒DNA=2:1(V/W)，转染48 h后收集细胞培养上清液送测感染滴度(FACS)和HCP，感染滴度1.28E+07 TU/mL以上(以CAR针对的目标抗原荧光标记后进行检测)，HCP为2.7μg/mL。使用此条件进行1L规模慢病毒制备，经纯化后病毒滴度为1.29E+08 TU/mL，HCP 722.1 ng/mL。如图4a、4b、4c所示，使用纯化的病毒转导活化的T细胞，感染复数MOI 分别为1.3、3.9、6.5时，对应的CAR阳性率分别为69.99%、79.86%和79.99%。
通过该应用例可以看出，采用本发明的悬浮驯化的HEK293TG2S细胞，进行质粒包装后得到的病毒上清液中，感染滴度高，能达到1.28E+07 TU/mL以上，且其中HCP含量很低，为2.7μg/mL，与现有的同类产品相比，本发明在保障高的病毒滴度的前提下，大大降低了HCP含量低，经过纯化后，转导活化的T细胞，阳性率很高，能使CAR的治疗效果明显增强。
应用例2
复苏上述实施例中悬浮驯化的HEK293TG2S细胞，使用Transpro CD01+0.1% Anti-clumping agent进行悬浮振荡培养，将细胞培养状态良好的细胞按1E+06 cells/mL进行稀释，继续振荡培养24 h后进行病毒包装。
病毒包装条件为：慢病毒包装细胞密度为2E+06 cells/mL，质粒用量为2 μg/mL，转移质粒:Pol/gag：VSV-g：Rev=3:1:1:1，转染试剂PEIpro:质粒DNA=2:1(V/W)，转染48 h后收集细胞培养上清液送测感染滴度(FACS)和HCP，感染滴度1.08E+08 TU/mL以上（以CAR针对的目标抗原荧光标记后进行检测），HCP为7.6 μg/mL，如图5a、5b、5c、5d所示，使用纯化的病毒转导活化的T细胞，感染复数MOI分别为 1、3、5、10时，CAR阳性率分别为7.32%、27.08%、56.48%和82.48%。
通过该应用例可以看出，采用本发明的悬浮驯化的HEK293TG2S细胞，进行质粒包装后得到的病毒上清液中，感染滴度高，能达到1.08E+08 TU/mL以上，HCP含量较低，为7.6μg/mL，随着感染复数的升高，CAR阳性率快速升高，能使CAR的治疗效果显著增强。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、适合慢病毒包装的HEK293T贴壁细胞的克隆筛选，其具体包括以下步骤：
A1、复苏贴壁培养的HEK293T细胞，使用DEME培养基+10%FBS进行贴壁培养；
A2、将对数生长期的细胞以VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基进行贴壁培养；
A3、将对数生长期的细胞进行96孔细胞培养板铺板，每孔补加VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基；
A4、培养5～7天后进行克隆观察，并更换一部分的VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基，继续培养，待细胞克隆扩大至所需的量时使用胰酶进行消化，将一部分细胞作为种子细胞，另一部分细胞进行携带EGFP基因的慢病毒转移质粒和包装质粒共转染，并进行细胞克隆标记；筛选出侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，扩大培养时使用的培养基为VP-SFM+1%FBS培养基；
S2、对筛选的HEK293T贴壁细胞进行快速悬浮驯化，具体包括以下步骤：
B1、使用VP-SFM+2 mM GlutaMax+1%FBS培养基复苏冻存的EGFP慢病毒包装滴度高的克隆细胞，静置培养2～3天后消耗细胞；然后仅以VP-SFM+2 mM GlutaMax进行扩大静置培养，继续静置培养2～3天后收集细胞；
用VP-SFM +1%FBS完全培养基培养至状态良好后，使用不含FBS的VP-SFM培养基进行扩大培养，收集扩大培养的细胞进行活细胞密度计数；
B2、使用Transpro CD01+4 mM GlutaMax+0.1% Anti-clumping agent完全培养基于细胞培养摇瓶进行振荡培养，复悬细胞后使用细胞培养摇床进行振荡培养，然后进行适应性传代培养，直至细胞活率为93～98%，且细胞分散性较好、无明显聚集，此即为悬浮驯化成功的HEK293T细胞，将若干悬浮驯化好的克隆细胞扩大培养并进行冻存；
S3、悬浮HEK293T高滴度慢病毒包装克隆细胞的筛选，具体步骤为：使用Transpro CD01+4 mM GlutaMax+0.1% Anti-clumping agent完全培养基复苏冻存的HEK293T悬浮细胞克隆，使用EGFP慢病毒转移质粒和包装质粒共转染各悬浮HEK293T细胞克隆，48 h后收获各细胞克隆含EGFP慢病毒的上清液，1500 g离心15 min去除细胞及其碎片，然后以此上清进行不同倍数稀释，并将稀释的病毒液侵染96孔板贴壁的HEK293T细胞，以荧光显微镜和流式细胞术(FACS)检测并筛选侵染效率高的病毒上清，所对应的克隆细胞即为慢病毒高产的悬浮HEK293T细胞克隆。
2.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤A3中，采用有限稀释法按5-20 cells/mL进行96孔细胞培养板铺板，每孔添加50-100 μL稀释的细胞液，然后每孔补加50-100μL的VP-SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基。
3.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤A4中，待细胞克隆扩大至96孔底的2/3时使用胰酶进行消化，将一部分细胞在新的96孔培养板继续培养作为种子细胞，另一部分细胞于另一个新的96孔板进行携带EGFP基因的慢病毒转移质粒转染，并进行细胞克隆标记；在进行转染时，培养24 h后进行EGFP慢病毒转移质粒转染，48 h后使用荧光显微镜进行绿色荧光观察，将绿色荧光发光点亮度高的前若干个克隆细胞进行扩大培养，扩大培养过程中进行细胞冻存备份；然后将扩大培养的克隆细胞进行24孔细胞培养板铺板，培养24 h后使用慢病毒包装质粒进行EGFP慢病毒包装，继续培养48 h后，收集携带EGFP的慢病毒上清液，并按不同稀释倍数侵染铺板的HEK293T细胞， 48～72 h后收集侵染的HEK293T细胞，使用荧光显微镜和FACS进行侵染效率检测，从而确定侵染效率较高的前若干个克隆细胞，进行扩大培养并建库，培养基为VP-SFM培养基+10%FBS完全培养基，待细胞状态良好后，使用VP-SFM +1%FBS完全培养基进行适应性培养，从而为悬浮驯化做准备。
4.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤A4中，进行EGFP慢病毒转移质粒转染时，质粒用量为0.1-0.6μg/cm2，转染试剂PEIpro与质粒的V/W比为1-3：1。
5.根据权利要求3所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤A4中，在进行EGFP慢病毒包装质粒转染时，将EGFP慢病毒转移质粒转染时筛选出的转染效率高的前若干个克隆细胞进行24孔细胞培养板铺板，铺板密度为5-9E+04 cell/cm2。
6.根据权利要求3所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤A4中，使用慢病毒包装质粒进行EGFP慢病毒包装时，质粒用量为0.1-0.6 μg/cm2，质粒比为EGFP转移质粒:Pol/gag：VSV-g：Rev=2:1:1:1,转染试剂PEIpro:质粒DNA 的V/W比为1-3:1。
7.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤A4中，按不同稀释倍数侵染铺板的HEK293T细胞时，铺板的HEK293T细胞的铺板密度为5-9E+04 cell/cm2，铺板的HEK293T细胞的培养基为DMEM+10%FBS培养基。
8.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤B2中，复悬细胞时，复悬细胞密度为5-9E+05 cells/mL，后续传代培养时，细胞密度按5～8E+05 cells/mL进行适应性传代培养。
9.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法，其特征在于：步骤B2中，将活率达到93-98%的细胞接种至24孔板，24 h后进行EGFP慢病毒包装，进行EGFP慢病毒包装时，慢病毒包装细胞密度为1-3E+06 cells/mL，质粒用量为1-5 μg/mL，质粒比为EGFP转移质粒:Pol/gag：VSV-g：Rev=2:1:1:1,转染试剂PEIpro:质粒DNA的 V/W 比为1-3:1，继续培养48 h后，收集携带EGFP的慢病毒上清液，并按不同稀释倍数侵染铺板的HEK293T细胞，48～72 h后收集侵染的HEK293T细胞，使用荧光显微镜和FACS进行侵染效率检测，从而确定侵染效率最高的克隆细胞进行扩大培养并建库，得到悬浮驯化的HEK293T细胞。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114591885A (zh) * | 2022-03-05 | 2022-06-07 | 河南普华基因科技有限公司 | 一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法和应用 |
| CN114591889A (zh) * | 2022-04-06 | 2022-06-07 | 湖南远泰生物技术有限公司 | 一种hek293t细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用 |
| CN115505559A (zh) * | 2022-09-30 | 2022-12-23 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 用于病毒载体生产的hek293悬浮细胞系的开发方法 |
| CN115747137A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-03-07 | 青岛万明赛伯药业有限公司 | Hek293单克隆细胞群的培养方法 |
| WO2023072178A1 (en) * | 2021-10-27 | 2023-05-04 | Porton Advanced Solutions Ltd. | Methods for developing a cell line for producing virus in suspension cell culture |
| CN117247972A (zh) * | 2023-11-20 | 2023-12-19 | 恺佧生物科技(上海)有限公司 | 一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法 |
| CN117646034A (zh) * | 2023-10-31 | 2024-03-05 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 重组mIL13慢病毒悬浮无血清稳定细胞株的构建及蛋白纯化方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108004202A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-08 | 广东铱科基因科技有限公司 | 一种用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液 |
| CN110713971A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-01-21 | 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 | 一种无血清悬浮培养型293t细胞、其制备方法以及病毒的包装方法 |
| CN113265425A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-08-17 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 基于悬浮细胞的car-cd19慢病毒制备工艺 |
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2021
- 2021-10-27 CN CN202111258035.1A patent/CN113981007B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108004202A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-08 | 广东铱科基因科技有限公司 | 一种用于无血清悬浮培养293t细胞的培养液 |
| CN110713971A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-01-21 | 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 | 一种无血清悬浮培养型293t细胞、其制备方法以及病毒的包装方法 |
| CN113265425A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-08-17 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 基于悬浮细胞的car-cd19慢病毒制备工艺 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李群;钱钟;范娟;李玉和;: "动物细胞悬浮培养技术在兽用疫苗生产领域中的应用", 中国畜牧兽医, no. 06, pages 236 - 240 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023072178A1 (en) * | 2021-10-27 | 2023-05-04 | Porton Advanced Solutions Ltd. | Methods for developing a cell line for producing virus in suspension cell culture |
| CN114591885A (zh) * | 2022-03-05 | 2022-06-07 | 河南普华基因科技有限公司 | 一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法和应用 |
| CN114591885B (zh) * | 2022-03-05 | 2024-02-23 | 河南普华基因科技有限公司 | 一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法和应用 |
| CN114591889A (zh) * | 2022-04-06 | 2022-06-07 | 湖南远泰生物技术有限公司 | 一种hek293t细胞的悬浮驯化方法及其在慢病毒生产中的应用 |
| CN115505559A (zh) * | 2022-09-30 | 2022-12-23 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 用于病毒载体生产的hek293悬浮细胞系的开发方法 |
| CN115747137A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-03-07 | 青岛万明赛伯药业有限公司 | Hek293单克隆细胞群的培养方法 |
| CN115747137B (zh) * | 2022-11-07 | 2024-03-08 | 青岛万明赛伯药业有限公司 | Hek293单克隆细胞群的培养方法 |
| WO2024051022A1 (zh) * | 2022-11-07 | 2024-03-14 | 青岛万明赛伯药业有限公司 | Hek293单克隆细胞群的培养方法 |
| CN117646034A (zh) * | 2023-10-31 | 2024-03-05 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 重组mIL13慢病毒悬浮无血清稳定细胞株的构建及蛋白纯化方法 |
| CN117247972A (zh) * | 2023-11-20 | 2023-12-19 | 恺佧生物科技(上海)有限公司 | 一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法 |
| CN117247972B (zh) * | 2023-11-20 | 2024-02-13 | 恺佧生物科技(上海)有限公司 | 一种快速高成功率筛选Expi293稳转细胞株的方法 |
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